具有美白功效的竹葉黃酮復(fù)合納米粒子及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種竹葉黃酮復(fù)合納米粒子，該竹葉黃酮復(fù)合納米粒子由以下三種重量含量的組分構(gòu)成：6～13.5％的竹葉黃酮、70～86％的酸性多糖和0.5～24％陽離子交聯(lián)劑。竹葉黃酮為竹葉提取物，竹葉黃酮中總黃酮含量為20～80％；酸性多糖為植物來源的、含有酸性基團(tuán)的多糖；陽離子交聯(lián)劑為化妝品領(lǐng)域可接受的陽離子交聯(lián)劑。本發(fā)明還同時(shí)公開了上述竹葉黃酮復(fù)合納米粒子的制備方法。該竹葉黃酮復(fù)合納米粒子具有美白功效。
【專利說明】
具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于日化技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種納米粒子，尤其設(shè)及一種具有美白功效的竹 葉黃酬復(fù)合納米粒子及其制備方法，應(yīng)用于日化行業(yè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 在化妝品市場中，美白產(chǎn)品一直受到極大的關(guān)注與追捧。通過美白護(hù)膚品的使用， 東方人想要得到白暫、光潔的皮膚，而歐美消費(fèi)者希望減輕和消除老年斑、黃褐斑等色素沉 積。正常人體皮膚顏色主要取決于皮膚中的黑色素含量，黑色素的生成是發(fā)生在黑素細(xì)胞 中，在酪氨酸酶等的催化下，由酪氨酸逐步氧化為多己、多己釀，最終轉(zhuǎn)化為黑色素的酶促 反應(yīng)。黑素細(xì)胞將黑色素轉(zhuǎn)移至表皮基底層細(xì)胞，再上移至角質(zhì)層，最終隨角質(zhì)層脫落而排 泄。當(dāng)皮膚黑色素過速增長或分布不均時(shí)，就會(huì)引起色素沉著，導(dǎo)致皮膚變黑或形成色斑。
[0003] 目前市場上使用比較廣泛的美白添加劑主要有熊果巧、對苯二酪、曲酸及其衍生 物等，它們通常是通過抑制黑素細(xì)胞增殖、抑制酪氨酸酶等相關(guān)限速酶活性W及抑制黑色 素的轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到美白效果。
[0004] 由于傳統(tǒng)皮膚美白劑往往具有較強(qiáng)的致敏性和潛在的致癌性，隨著消費(fèi)者安全意 識(shí)不斷提高，純天然、無公害、且功效顯著的植物美白成分越來越受到追捧和青睞。因此，開 發(fā)安全性高、美白功效強(qiáng)、且易于添加到配方中的天然植物美白劑成為化妝品領(lǐng)域的研究 熱點(diǎn)。竹葉黃酬(Bamboo Leaf Flavonoids,BLF)是從剛竹屬(Phyllostachys)品種的葉子 中得到的、具有我國本±資源特色和自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的植物黃酬制劑，原料來源豐富、制劑品 質(zhì)穩(wěn)定、風(fēng)味清香平和，是一種安全無毒的天然化合物，具有清除自由基、抗氧化、抗福射、 抗炎、抗衰老、抑菌、抗病毒、提高免疫力等多種生物學(xué)功效。
[0005] 竹葉黃酬優(yōu)良的生物學(xué)功效尤其是出色的抗氧化、抗自由基能力使其在美白化妝 品領(lǐng)域具有巨大的潛在用途。但同其它黃酬類化合物一樣，竹葉黃酬存在溶解性較低、色澤 較深、不易被皮膚吸收等問題，限制了其在美白制劑中的應(yīng)用。采用藥物載體技術(shù)(如微膠 囊、脂質(zhì)體等)對竹葉黃酬進(jìn)行包裹是行之有效的方法。如公布號(hào)為CN 105342889 A的專利 文本公開了一種包含竹葉黃酬的美白保濕組合物，在常溫常壓下對竹葉黃酬進(jìn)行微膠囊化 處理，制備過程中使用了下二醇、丙二醇等有機(jī)溶劑。
[0006] 納米粒子(Nanoparticles)指的是生物活性物質(zhì)、藥物等吸附、附著于粒子表面， 或者溶解、包裹于粒子內(nèi)部，成為超微小球型載體的固狀膠態(tài)粒子，包括納米球 (Nanospheres)和納米囊(Nanocapsules )，直徑在1~lOOOnm之間。當(dāng)粒子進(jìn)入納米級(jí)時(shí)，由 于小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等，納米粒會(huì)表現(xiàn)出低烙點(diǎn)、高反應(yīng)活性、高膨 脹系數(shù)、高強(qiáng)度、高初性、高擴(kuò)散率、強(qiáng)吸收率等一系列不同于宏觀物質(zhì)的新特性。正是由于 運(yùn)些特性，納米粒子已成為化妝品、醫(yī)藥、功能食品等領(lǐng)域的應(yīng)用研究熱點(diǎn)。
[0007] 目前用于制備納米粒的材料主要有合成高分子材料和天然高分子材料，其中天然 高分子材料具有生物相容性好、生物降解性好、毒副作用小，并具有特殊生物學(xué)功效等優(yōu) 點(diǎn)，因而更受青睞。天然高分子納米粒的制備方法主要有離子交聯(lián)法、凝聚法、乳化交聯(lián)法、 溶劑蒸發(fā)法等，其中離子交聯(lián)法是通過相反電荷之間的相互作用發(fā)生物理交聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而 形成球狀的凝膠納米粒，具有反應(yīng)條件溫和、方便快捷、對天然成分破壞作用小等優(yōu)點(diǎn)，且 得到的納米粒粒徑均一、可設(shè)計(jì)，同時(shí)能避免有機(jī)溶劑的使用，是目前制備天然高分子納米 粒最具前景的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子及 其制備方法和用途，本發(fā)明采用離子交聯(lián)法，在常溫常壓、不使用有機(jī)溶劑的條件下制備竹 葉黃酬復(fù)合納米粒子，工藝簡單溫和，得到的納米粒子粒徑均一、質(zhì)量穩(wěn)定、美白功效極其 顯著;其美白功效顯著優(yōu)于熊果巧。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種竹葉黃酬復(fù)合納米粒子，該竹葉黃酬復(fù) 合納米粒子由W下Ξ種重量含量的組分構(gòu)成:6~13.5%的竹葉黃酬、70~86% (較佳為75 ~86% )的酸性多糖和0.5~24% (較佳為4.5~16% )陽離子交聯(lián)劑。
[0010] 作為本發(fā)明的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的改進(jìn):竹葉黃酬為竹葉提取物，所述竹葉 黃酬中總黃酬含量(W蘆下計(jì))為20~80% (w/w)。優(yōu)選40~60% (w/w)。
[0011] 作為本發(fā)明的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的進(jìn)一步改進(jìn):所述酸性多糖為植物來源 的、含有酸性基團(tuán)的多糖;所述陽離子交聯(lián)劑為化妝品領(lǐng)域可接受的陽離子交聯(lián)劑。
[0012] 作為本發(fā)明的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0013] 所述酸性多糖為完根多糖、竹茹多糖、海藻多糖中的至少一種；
[0014] 所述陽離子交聯(lián)劑為ε-多聚賴氨酸、氯化巧中的至少一種。
[0015] 本發(fā)明還同時(shí)提供了上述竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的制備方法，包括如下步驟：
[0016] 1)、在蒸饋水中加入竹葉黃酬和酸性多糖，加熱攬拌至竹葉黃酬和酸性多糖完全 溶解，得竹葉黃酬-酸性多糖溶液；
[0017] 所述竹葉黃酬與蒸饋水的質(zhì)量比為1:500~4000;
[0018] 2)、將陽離子交聯(lián)劑與蒸饋水Wl:400~1000的質(zhì)量比相溶，并攬拌至陽離子交聯(lián) 劑完全溶解；
[0019] 3)、在低速磁力攬拌的條件下將步驟2)所得溶液加入步驟1)所得的竹葉黃酬-酸 性多糖溶液中；繼續(xù)低速磁力攬拌10~30min，得到竹葉黃酬復(fù)合納米粒子溶液(為穩(wěn)定混 懸液）。
[0020] 備注說明：上述加入是指W每分鐘40~200滴的速度滴入。
[0021] 本發(fā)明所得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子溶液，粒徑在300~550nm之間，可4°C下保存 備用，也可凍干后保存。
[0022] 作為本發(fā)明的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的制備方法的改進(jìn)：
[0023] 所述竹葉黃酬復(fù)合納米粒子溶液經(jīng)干燥，得竹葉黃酬復(fù)合納米粒子粉末。
[0024] 作為本發(fā)明的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0025] 所述步驟3)中的低速磁力攬拌的轉(zhuǎn)速為100~3(K)r/min。
[0026] 作為本發(fā)明的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0027] 所述干燥為透析后冷凍干燥、或加入沉淀劑分離干燥。
[0028] 本發(fā)明還同時(shí)提供了上述竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的用途:具有美白功效。
[0029] 本發(fā)明中復(fù)合納米粒子的粒徑可通過改變酸性多糖與陽離子交聯(lián)劑的種類和配 比來調(diào)節(jié)。
[0030] 本發(fā)明的復(fù)合納米粒子的結(jié)構(gòu)和組成比例如圖1所示，復(fù)合粒子的粒徑在300~ 550nm之間（較佳為400~550nm)。
[0031] 本發(fā)明的具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的制備方法，是通過離子交聯(lián)法 制備獲得。該方法反應(yīng)條件溫和、粒徑均勻可控、重現(xiàn)性好，不使用有機(jī)溶劑，簡便易行，具 有環(huán)保、高效、低成本的特點(diǎn)，同時(shí)可最大限度地保持天然物的活性成分。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的功效實(shí)驗(yàn)證明，所述竹葉黃酬復(fù)合納米粒子具有卓越的美白功效， 其對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性、黑色素合成量及黑素細(xì)胞活性的抑制率均顯著優(yōu)于熊果巧。
[0033] 本發(fā)明的具有卓越美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子，適合應(yīng)用于美白化妝品領(lǐng) 域中，將本發(fā)明所述的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子W-定比例加入到化妝品配方中（例如為 12.5-100yg/mL)，可W制備成不同劑型的化妝品，如乳液、霜、精華等;然后按照常規(guī)的化妝 品使用方式進(jìn)行使用即可。也可W直接將本發(fā)明制備而得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子溶液涂 抹于皮膚表面。
[0034] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0035] (1)發(fā)明了具有卓越美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子，其美白功效強(qiáng)于陽性對 照熊果巧。
[0036] (2)采用離子交聯(lián)法制備竹葉黃酬復(fù)合納米粒子，工藝簡便易行、條件溫和、重復(fù) 性好，制備過程完全在水溶液中完成，不設(shè)及任何有機(jī)試劑及表面活性劑的使用，避免了對 天然活性成分的破壞。
[0037] (3)所制備的納米粒子粒徑在300~550nm之間，外觀為乳光懸液，質(zhì)量和性能穩(wěn) 定。
[0038] (4)發(fā)明的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子具有優(yōu)異的酪氨酸酶活性抑制作用，能很好地 抑制黑素細(xì)胞的活性和黑色素的產(chǎn)生，效果顯著優(yōu)于陽性對照熊果巧。
[0039] (5)發(fā)明的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子均有天然物(或視同天然物)組成，制備過程不 使用有機(jī)交聯(lián)劑及表面活性劑，對皮膚無刺激，可作為美白功能因子應(yīng)用于日化產(chǎn)品，具有 廣闊的市場前景。
【附圖說明】
[0040] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0041] 圖1為本發(fā)明制得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的組成結(jié)構(gòu)示意；
[0042] 圖2為實(shí)施例1制得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的粒徑分析結(jié)果；
[0043] 圖3為實(shí)施例2制得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的粒徑分析結(jié)果；
[0044] 圖4為實(shí)施例3制得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的粒徑分析結(jié)果；
[0045] 圖5為實(shí)施例4制得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的粒徑分析結(jié)果；
[0046] 圖6為本發(fā)明制得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的電子顯微鏡表征；
[0047] 圖7為本發(fā)明制得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的透射電鏡表征。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不 應(yīng)限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件處，均按照本領(lǐng)域內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)所描 述的技術(shù)條件進(jìn)行。所用試劑未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0049] 本實(shí)施例中所述的竹茹多糖和完根多糖是發(fā)明人分別自竹茹和完根中提取的酸 性植物多糖，所述竹茹多糖可依據(jù)已經(jīng)公開發(fā)表于《食品工業(yè)科技》的《竹茹多糖提取工藝 優(yōu)化及其理化性質(zhì)分析》的方法制備而得；所述完根多糖可參照已經(jīng)公開發(fā)表于 《International Journal of Biological Μ曰cromolecules》的《Composition 曰η曰lysis and anti-hypoxia activity of polysaccharide from Brassica rapa L.》、專利CN 101524389A所述方法制備而得;經(jīng)硫酸-苯酪法測定其純度均在90%W上;竹葉黃酬和ε-聚 賴氨酸均為市售;竹葉黃酬總黃酬含量約為50%。
[0050] 實(shí)施例1、一種具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子制備方法：
[0051] (1)將4mg的竹葉黃酬溶于2mL的蒸饋水中，加熱攬拌溶解；
[0052] (2)將24mg的竹茹多糖加入步驟（1)所得溶液并攬拌溶解，得竹葉黃酬-竹茹多糖 溶液；
[0053] (3)將2mg的ε-多聚賴氨酸溶于ImL的蒸饋水中；
[0054] (4)在W轉(zhuǎn)速為100~30化/min磁力攬拌的條件下將步驟（3)所得溶液用1分鐘 (即，約W200mL/h的流速)滴入竹葉黃酬-竹茹多糖溶液中；
[0055] (5)繼續(xù)低速（100~3(K)r/min)攬拌30min，得到的乳光懸液為具有美白功效的竹 葉黃酬復(fù)合納米粒子溶液(I)。
[0056] 實(shí)施例2、一種具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子制備方法：
[0057] (1)將4mg的竹葉黃酬溶于2mL的蒸饋水中，加熱攬拌溶解；
[0058] (2)將36mg的竹茹多糖加入步驟（1)所得溶液并攬拌溶解，得竹葉黃酬-竹茹多糖 溶液；
[0059] (3)將2mg的ε-多聚賴氨酸溶于2mL的蒸饋水中；
[0060] (4)在W轉(zhuǎn)速為100~30化/min磁力攬拌的條件下將步驟（3)所得溶液用1分鐘 (即，約W300mL/h的流速)滴入竹葉黃酬-竹茹多糖溶液中；
[0061] (5)繼續(xù)低速攬拌30min，得到的乳光懸液為具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒 子溶液(II)。
[0062] 實(shí)施例3、一種具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子制備方法：
[00創(chuàng) （1)將4mg的竹葉黃酬溶于16mL的蒸饋水中，加熱攬拌溶解；
[0064] (2)將50mg的完根多糖加入步驟（1)所得溶液并攬拌溶解，得竹葉黃酬-完根多糖 溶液；
[0065] (3)將lOmg的ε-多聚賴氨酸溶于4mL的蒸饋水中；
[0066] (4)在W轉(zhuǎn)速為100~30化/min磁力攬拌的條件下將步驟（3)所得溶液用6分鐘 (即，約W200mL/h的流速)滴入竹葉黃酬-完根多糖溶液中；
[0067] (5)繼續(xù)低速攬拌30min，得到的乳光懸液為具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒 子溶液(III)。
[0068] 實(shí)施例4、一種具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子制備方法：
[0069] (1)將6mg的竹葉黃酬溶于14mL的蒸饋水中，加熱攬拌溶解；
[0070] (2)將50mg的完根多糖加入步驟（1)所得溶液并攬拌溶解，得竹葉黃酬-完根多糖 溶液；
[0071] (3)將lOmg的ε-多聚賴氨酸溶于4mL的蒸饋水中；
[0072] (4)在W轉(zhuǎn)速為100~30化/min磁力攬拌的條件下將步驟（3)所得溶液用5分鐘 (即，約W200mL/h的流速)滴入竹葉黃酬-完根多糖溶液中；
[0073] (5)繼續(xù)低速攬拌30min，得到的乳光懸液為具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒 子溶液(IV)。
[0074] 上述實(shí)施例1~實(shí)施例4制備而得的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子溶液經(jīng)過真空冷凍干 燥至恒重，得竹葉黃酬復(fù)合納米粒子。
[0075] 實(shí)驗(yàn) 1
[0076] 利用Malvern Zetasizer化no Zs90納米粒徑及電位分析儀，對本發(fā)明中實(shí)施例 1-4中所得竹葉黃酬復(fù)合納米粒子進(jìn)行粒徑分析。結(jié)果如表1及圖2-5所示，由實(shí)施例1-4制 得具有美白功效的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子，平均粒徑介于400-550nm區(qū)間，粒徑分布指數(shù) PDI為0.2左右，說明其粒徑均一，分散度良好。
[0077] 表1、納米粒粒徑測定分析表 [007引
[0079] 實(shí)驗(yàn) 2
[0080] 利用透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope,TEM)和電子顯微鏡， 對本發(fā)明中實(shí)施例3所得竹葉黃酬復(fù)合納米粒子進(jìn)行形態(tài)表征。如圖6和圖7所示，包埋所得 的納米粒呈球形或類球形，粒徑較為均一，并沒有產(chǎn)生一些巨大的絲狀或無規(guī)則的納米粒。 [0081 ]實(shí)驗(yàn)3、竹葉黃酬復(fù)合納米粒子黃酬含量測定
[0082] (一)實(shí)驗(yàn)原理
[0083] 竹葉黃酬復(fù)合納米粒子中的黃酬含量直接影響其美白功效，采用硝酸侶比色法對 實(shí)施例1-4中竹葉黃酬納米粒子中的總黃酬含量進(jìn)行測定。
[0084] (二)實(shí)驗(yàn)方法
[00化]1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0086] 精密稱取蘆下對照1 Omg于1 OOmL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，從中吸取溶液 ο、0.5、1.0、2.0、3.0、4.OmL分別于25mL比色管中，加入30%乙醇溶液稀釋至5mL，依次各加 5 %亞硝酸鋼溶液0.3mL，振搖后放置5min;加入10 %硝酸侶溶液0.3mL，振搖后放置6min;加 入1. Omol/L氨氧化鋼溶液4.0血，30%乙醇溶液稀釋至10.0血，搖勻后放置lOmin; W零號(hào)管 為空白，搖勻后用1cm的比色杯、在510nm的波長處測定吸光度，W吸收度為縱坐標(biāo)、濃度為 橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0087] 2、竹葉黃酬納米粒子黃酬含量的測定
[0088] 將已制備好的納米粒子混懸液高速離屯、（15000r/30min)，測定離屯、后上清液的體 積，取上清液1ml，按1中的方法測定其中的黃酬含量，進(jìn)而得到總上清液中的黃酬含量，從 而計(jì)算納米粒子中的黃酬含量。
[0089] 納米粒子黃酬含量（％ )=(加入的總黃酬含量-上清液中總黃酬含量)/加入的總 黃酬含量X100。
[0090] (立)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0091] 表2、竹葉黃酬復(fù)合納米粒子中的黃酬含量測定(n = 3，；：ts) Γ00921
[0093] 由于竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的組分中，具有美白功效的成分主要為竹葉黃酬，因 此復(fù)合納米粒子中竹葉黃酬的含量與其美白功效有密切關(guān)系。由表2可得，不同實(shí)施例所得 的竹葉黃酬復(fù)合納米粒子均對竹葉黃酬進(jìn)行了有效包埋，其中實(shí)施例3的黃酬含量達(dá)到最 高為45.27%，即，實(shí)施例3的包埋效果最佳。
[0094] 實(shí)驗(yàn)4美白功效評價(jià) [00巧](一)實(shí)驗(yàn)原理
[0096] 黑色素含量是決定皮膚顏色的關(guān)鍵因素，而黑色素的合成是發(fā)生在黑素細(xì)胞、在 酪氨酸酶等相關(guān)限速酶的催化下、由酪氨酸逐步氧化為多己、多己釀，最終轉(zhuǎn)化為黑色素的 酶促反應(yīng)，因此美白劑發(fā)揮功效的途徑通常有W下Ξ種:抑制黑素細(xì)胞增殖、抑制酪氨酸酶 活性和抑制黑色素的合成。
[0097] B-16黑素細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)，尤其是黑色素合成功能與人體正常的皮膚黑素細(xì)胞基 本一致，在人體原代皮膚黑色素細(xì)胞培養(yǎng)非常困難的情況下，B-16黑素瘤細(xì)胞成為醫(yī)藥部 口進(jìn)行色素病變研究和美白化妝品添加劑功效評價(jià)廣泛使用的細(xì)胞。
[0098] 本發(fā)明WB-16黑素細(xì)胞為受試細(xì)胞株，設(shè)立熊果巧為陽性對照，無藥物作用的黑 素細(xì)胞為陰性對照，從抑制黑素細(xì)胞增殖、抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素合成Ξ個(gè)方面，對 本發(fā)明所得實(shí)施例1-4竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的美白功效進(jìn)行評估。
[0099] (二)實(shí)驗(yàn)方法
[0100] 1、受試物處理
[0101] 設(shè)立本發(fā)明中實(shí)施例1-4所得竹葉黃酬復(fù)合納米粒子為實(shí)驗(yàn)組，濃度為12.5-100μ g/mL，W同濃度熊果巧溶液為陽性對照組，經(jīng)0.22WI1的濾膜過濾滅菌后備用。
[0102] 2、細(xì)胞的培養(yǎng)及受試物準(zhǔn)備
[0103] 無菌條件下，將B-16黑素瘤細(xì)胞接種于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基的培 養(yǎng)瓶中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C，5%C〇2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，并每天換液。當(dāng)細(xì)胞生長 至匯合度為80 %~90 %時(shí)，經(jīng)ο. 25 %膜蛋白酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0104] 3、受試物暴露
[0105] 待細(xì)胞生長至近融合狀態(tài)經(jīng)0.25%膜蛋白酶消化，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為5X104 個(gè)/mL，每孔10化L接種于96孔板，并補(bǔ)充培養(yǎng)液至20化L。在二氧化碳培養(yǎng)箱中37°C，5 %C〇2 飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，過夜，貼壁后更換新培養(yǎng)基，每孔加入2(Κ)化不同濃度的受試物溶液， DMSO的體積分?jǐn)?shù)小于0.5 %，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，空白對照組加入新鮮培養(yǎng)液代替受試 物溶液，每天換液。
[0106] 4、細(xì)胞增殖率的測定
[0107] 細(xì)胞接板及受試物暴露處理同上。采用ΜΤΤ法對細(xì)胞增殖率進(jìn)行測定。在培養(yǎng)44時(shí) 取出，每孔加入5mg/mL ΜΤΤ溶液20化，在在二氧化碳培養(yǎng)箱中37 °C，5 % C〇2飽和濕度環(huán)境中 解育地，然后棄去培養(yǎng)基和MTT，向各孔中加入15化L的DMSO, W溶解殘留的MTT-甲臘結(jié)晶， 震蕩lOmin，混勻后用酶標(biāo)儀測定各孔在570nm下的吸光值。
[0108] 計(jì)算細(xì)胞增殖率：
[0109] 細(xì)胞增殖率（％ ) = (0D日7〇(顯亂)一0D日7〇(注批）/(〇〇日7〇(注Μ亂)一0D日7〇(注抓）X 100
[0110] 5、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性相對抑制率的測定
[0111] 細(xì)胞接板及受試物暴露處理同上。采用多己氧化法對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性進(jìn)行測 定。將作用時(shí)間已到的細(xì)胞棄上清，PBS緩沖液洗2次，每孔加入1 %化i ton-XlOO水溶液50μ L，迅速放入-80°C冰箱內(nèi)凍存30min，取出后37°C融化使細(xì)胞完全破裂(約20min)，加入1 % L-D0PA溶液10化/孔，W不加美白劑培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照，37°C反應(yīng)化，置酶標(biāo)儀測定475nm 處〇〇4巧值。
[0112] 計(jì)算酪氨酸酶相對抑制率：
[0113] 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性相對抑制率（％) = (i-o^m/ODai?貓)/細(xì)胞增殖率X100
[0114] 6、細(xì)胞內(nèi)黑素含量測定
[0115] 細(xì)胞接板及受試物暴露處理同上。培養(yǎng)4她后傾去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗1次，加 入10化L的0.25%膜酶消化，再用PBS緩沖液(2-3mL)將沉淀細(xì)胞吹打成懸液后計(jì)數(shù)，將密度 調(diào)整至105個(gè)/mL左右備用。取備用細(xì)胞懸液力日PBS緩沖液，各吸取ImL細(xì)胞懸液分別置于離 屯、管中，150化/min離屯、lOmin后棄去上清液，先加入20化1 PBS緩沖液使細(xì)胞重新懸浮，然 后加入ImL乙醇：乙酸液(體積比為1:1) W溶解非黑素的不透明顆粒，在室溫下放置20min， 300化/min離屯、5min并棄去上清液，加入1血含10 %二甲基亞諷的Imol/L化0田容液，置于80 °C水浴45min，使細(xì)胞團(tuán)塊完全溶解。轉(zhuǎn)移入96孔板，每個(gè)濃度6個(gè)平行，用酶標(biāo)儀在405nm波 長處測定吸光度。
[0116] 計(jì)算相對黑素含量：
[0117] 單個(gè)細(xì)胞內(nèi)相對黑素含量（％ ) = (0晦驗(yàn)1/〇攻#,貓)/細(xì)胞增殖率X 100 [011引（S)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0119] 1、竹葉黃酬復(fù)合納米粒子對B-16細(xì)胞增殖率的影響
[0120] 皮膚黑色素細(xì)胞組織能將黑色素轉(zhuǎn)移到表皮基底層細(xì)胞中，從而引起局部皮膚過 黑及色素沉著，因此細(xì)胞增殖率是判斷美白效果的重要指標(biāo)。
[0121] 表3、不同美白劑對B-16細(xì)胞增殖率的影響(n = 3,云ts)
[0122]
[0123]
[0124] 注:a與陰性對照組相比，P<〇 . 05; b與陽性對照組相比，P<〇. 05。
[0125] 如表3所示，用不同濃度的美白劑處理B-16黑素瘤細(xì)胞，隨著美白劑濃度的增大， 與陰性對照組相比，各組樣品對細(xì)胞增殖的抑制率增加，細(xì)胞活力逐漸降低，存活率下降。 陽性對照組熊果巧在所有受試濃度時(shí)細(xì)胞存活率降低但不明顯，細(xì)胞增殖率均在90%左 右；當(dāng)濃度達(dá)到50yg/mL時(shí)，各實(shí)施例所得竹葉黃酬復(fù)合納米粒子對B-16細(xì)胞增殖開始有抑 審IJ作用，其中實(shí)施例3抑制作用最明顯，細(xì)胞增殖率為（68.59 ±0.53)%;在lOOyg/mL濃度 下，細(xì)胞增殖率下降至(40.86±0.83) %，與陽性對照熊果巧組相比有顯著差異(P<0.05)。 因此，竹葉黃酬復(fù)合納米粒子可在一定程度上影響黑素瘤細(xì)胞的增殖;與陽性對照組熊果 巧相比，其量效關(guān)系更加明顯，即隨著濃度的增加，細(xì)胞存活率降低幅度顯著大于熊果巧， 在50yg/mL和10化g/mL時(shí)可顯著抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖，從而成為美白功效的可能途徑。
[0126] 2、竹葉黃酬復(fù)合納米粒子對B-16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響
[0127] 酪氨酸酶是黑素細(xì)胞合成黑色素過程中一種決定性的限速酶，其催化作用主要發(fā) 生在酪氨酸轉(zhuǎn)化成多己和多己轉(zhuǎn)化為多己釀運(yùn)兩個(gè)反應(yīng)中。大部分美白劑是通過抑制酪氨 酸酶活性或阻斷酪氨酸生成黑色素的氧化途徑，從而減少黑色素的生成達(dá)到美白功效，因 此美白劑對酪氨酸酶活性的抑制率是衡量美白功效的重要依據(jù)。
[012引表4、不同美白劑對B-16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶相對活性的影響(η = 3，i±s)
[01291
[0130] 注:a與陰性對照組相比，P<〇 . 05; b與陽性對照組相比，P<〇. 05。
[0131] 如表4所示，陽性對照熊果巧組和竹葉黃酬復(fù)合納米粒子對細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性 均有抑制作用，且具有劑量依賴關(guān)系，即隨劑量的增加對酪氨酸酶活性的抑制率提高;實(shí)施 例1-4中，實(shí)施例3、4所得竹葉黃酬復(fù)合納米粒子對酪氨酸酶活的抑制效果更明顯，當(dāng)濃度 為10化g/mL時(shí)酪氨酸酶活性分別為(30.32 ± 2.30) %和(38.45 ± 1.96) %，與陽性對照熊果 巧組相比有顯著差異(P<〇.05)。說明竹葉黃酬復(fù)合納米粒子組能顯著抑制B-16細(xì)胞內(nèi)酪氨 酸酶相對活性。
[0132] 3、竹葉黃酬復(fù)合納米粒子對B-16細(xì)胞黑素合成的影響
[0133] 黑素含量是決定皮膚顏色的主要因素，黑色素由黑素細(xì)胞合成后轉(zhuǎn)移至角質(zhì)細(xì)胞 再上移至角質(zhì)層，導(dǎo)致皮膚變黑或形成色斑。因此，黑素含量的多少是衡量美白劑美白功效 的直接依據(jù)。經(jīng)過不同種類及濃度的樣品處理過的細(xì)胞內(nèi)黑素含量如表5所示。
[0134] 表5、不同美白劑對B-16細(xì)胞相對黑素含量的影響(n = 3，^±s)
[0135]
[0136] 注:a與陰性對照組相比，P<0.05; b與陽性對照組相比，P<0.05。
[0137] 由表5可知，W空白對照的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)黑素含量為100%，則隨著濃度的增加，各美 白劑組黑素含量均有所降低，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；當(dāng)濃度為lOOyg/mL時(shí)，實(shí)施例1-4所得 竹葉黃酬復(fù)合納米粒子對黑素合成的抑制效果明顯，其中實(shí)施例3、4實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)相對黑 素含量分別降低至(37.65±3.14)%和(45.35±0.97)%，與陽性對照熊果巧組相比有顯著 差異(P<0.05)，說明竹葉黃酬復(fù)合納米粒子能顯著抑制B-16黑素細(xì)胞的黑素合成。
[0138] 結(jié)論:竹葉黃酬復(fù)合納米粒子具有顯著的美白功效，其美白作用是通過對B-16黑 色素細(xì)胞增殖、黑色素的合成、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶相對活性等多方面抑制來實(shí)現(xiàn)。此外，結(jié)合 比較表3-5和表2的結(jié)果可驗(yàn)證如下結(jié)論:竹葉黃酬納米粒子的美白功效與其中所含黃酬含 量呈正相關(guān)，即，包埋效果與美白功效成正比。
[0139] 對比例1-1、將實(shí)施例3中完根多糖的用量由50mg改成70mg，其余等同于實(shí)施例3。
[0140] 對比例1-2、將實(shí)施例3中完根多糖的用量由50mg改成30mg，其余等同于實(shí)施例3。
[0141] 對比例1-3、將實(shí)施例3中的完根多糖改成竹茹多糖，其余等同于實(shí)施例3。
[0142] 對比例2-1、將實(shí)施例3中ε-多聚賴氨酸的用量由lOmg改成15mg，其余等同于實(shí)施 例3。
[0143] 對比例2-2、將實(shí)施例3中ε-多聚賴氨酸的用量由lOmg改成5mg，其余等同于實(shí)施例 3。
[0144] 對比例2-3、將實(shí)施例3中的ε-多聚賴氨酸改成氯化巧，其余等同于實(shí)施例3。
[0145] 對比例3-1、將實(shí)施例3中竹葉黃酬的用量由4mg改成8mg，其余等同于實(shí)施例3。
[0146] 對比例3-2、將實(shí)施例3中竹葉黃酬的用量由4mg改成2mg，其余等同于實(shí)施例3。
[0147] 對比例4-1、將實(shí)施例3中恒流累流速由200mLA改成400mL/h，即，滴入的時(shí)間由6 分鐘改成3分鐘;其余等同于實(shí)施例3。
[014引對比例4-2、將實(shí)施例3中恒流累流速由200mLA改成lOOmL/h，即，滴入的時(shí)間由6 分鐘改成12分鐘;其余等同于實(shí)施例3。
[0149] 將上述所有的對比例所得竹葉黃酬納米粒子進(jìn)行黃酬含量測定，所得結(jié)果如下：
[0150] 表6、不同對比例所得竹葉黃酬納米粒子的黃酬含量(n = 3j±s)
[0151]
[0152] 如表6所示，對上述所有對比例所得竹葉黃酬復(fù)合納米粒子的黃酬含量進(jìn)行測定， 由測定結(jié)果可得:所有對比例所得納米粒子均對竹葉黃酬進(jìn)行了有效包埋，其中黃酬含量 最高達(dá)到41.03 % (對比例1-1)，均小于實(shí)施例3所得竹葉黃酬納米粒子的黃酬含量 (45.27%)。由實(shí)驗(yàn)4結(jié)論可知，上述所有對比例所得竹葉黃酬復(fù)合納米粒子均具有美白功 效，但由于其包埋效果不如本發(fā)明的實(shí)施例3,因此，其美白功效均不如本發(fā)明的實(shí)施例3。
[0153] W上所述描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明不受上述實(shí)施例的 限制，凡在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下所做的任何修改、等同替換、組合、簡化、改進(jìn) 等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 竹葉黃酮復(fù)合納米粒子，其特征是該竹葉黃酮復(fù)合納米粒子由以下三種重量含量的 組分構(gòu)成:6~13.5%的竹葉黃酮、70~86%的酸性多糖和0.5~24%陽離子交聯(lián)劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹葉黃酮復(fù)合納米粒子，其特征是： 竹葉黃酮為竹葉提取物，所述竹葉黃酮中總黃酮含量為20~80%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的竹葉黃酮復(fù)合納米粒子，其特征是： 所述酸性多糖為植物來源的、含有酸性基團(tuán)的多糖； 所述陽離子交聯(lián)劑為化妝品領(lǐng)域可接受的陽離子交聯(lián)劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的竹葉黃酮復(fù)合納米粒子，其特征是： 所述酸性多糖為芫根多糖、竹茹多糖、海藻多糖中的至少一種； 所述陽離子交聯(lián)劑為ε_(tái)多聚賴氨酸、氯化鈣中的至少一種。5. 如權(quán)利要求1~4任一所述的竹葉黃酮復(fù)合納米粒子的制備方法，其特征是包括如下 步驟： 1 )、在蒸餾水中加入竹葉黃酮和酸性多糖，加熱攪拌至竹葉黃酮和酸性多糖完全溶解， 得竹葉黃酮-酸性多糖溶液； 所述竹葉黃酮與蒸餾水的質(zhì)量比為1:500~4000; 2) 、將陽離子交聯(lián)劑與蒸餾水以1:400~1000的質(zhì)量比相溶，并攪拌至陽離子交聯(lián)劑完 全溶解； 3) 、在低速磁力攪拌的條件下將步驟2)所得溶液加入步驟1)所得的竹葉黃酮-酸性多 糖溶液中；繼續(xù)低速磁力攪拌10~30min，得到竹葉黃酮復(fù)合納米粒子溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的竹葉黃酮復(fù)合納米粒子的制備方法，其特征是： 所述竹葉黃酮復(fù)合納米粒子溶液經(jīng)干燥，得竹葉黃酮復(fù)合納米粒子粉末。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的竹葉黃酮復(fù)合納米粒子的制備方法，其特征是： 所述步驟3)中的低速磁力攪拌的轉(zhuǎn)速為100~300r/min。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的竹葉黃酮復(fù)合納米粒子的制備方法，其特征是： 所述干燥為透析后冷凍干燥、或加入沉淀劑分離干燥。9. 如權(quán)利要求1~4任一所述的竹葉黃酮復(fù)合納米粒子的用途，其特征是：具有美白功 效。
【文檔編號(hào)】A61Q19/02GK105919864SQ201610380410
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】張英, 王楠
【申請人】浙江大學(xué)