一種使含佐劑的疫苗組合物穩(wěn)定的方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使干態(tài)的含佐劑的疫苗組合物、佐劑化的疫苗組合物穩(wěn)定的方法，具體地講，一種使干態(tài)的流感疫苗組合物，特別是佐劑化的流感疫苗組合物穩(wěn)定的方法?！緦＠f明】一種使含佐劑的疫苗組合物穩(wěn)定的方法[0001]本申請是2009年3月2日提交的題為"一種使含佐劑的疫苗組合物穩(wěn)定的方法"的國家申請?zhí)枮?00980108363.4(PCT/EP2009/052460)的發(fā)明專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域：
[0002]本發(fā)明涉及一種使干態(tài)的含佐劑的疫苗組合物、佐劑化的疫苗組合物穩(wěn)定的方法，具體而言，一種使干態(tài)的流感疫苗組合物，特別是佐劑化的流感疫苗組合物穩(wěn)定的方法。【
背景技術(shù)：
】[0003]US3，655，838公開了通過在冷凍劑如液氮中冷凍溶液液滴，隨后凍干以獲得凍干的含試劑微粒、球珠或凍球（Iyosphere)來將分析或免疫試劑制粒的方法。EP0081913B1描述了通過在惰性液體冷凍劑中冷凍液滴(該惰性液體冷凍劑的密度高于液滴的密度），然后將冷凍顆粒從該液體冷凍劑表面移走來制備球狀冷凍顆粒的方法。WO94/25005公開了在凍球狀促性腺激素的穩(wěn)定化，一種制備這種凍球的方法及包含所述凍球的藥物制劑。EP0799613(US5,897,852)公開了一種疫苗包，所述疫苗包包括疫苗容器，所述疫苗容器容納一種或多種含所述疫苗組分的凍干體，所述疫苗組分的至少一種是直徑為至少0.2mm的凍球或微粒。WO2006/008006OJS2008/0060213)公開了一種制備裝填凍干產(chǎn)物的容器的方法，其中所述產(chǎn)物的液滴被凍成小球，所述小球經(jīng)過凍干、測定并裝入所述容器中。已知獲得冷凍顆?；蛐∏虻钠渌夹g(shù)可用于食品工業(yè)(例如US5,036,673或US2007/0281067Al)。[0004]凍干技術(shù)能改善許多產(chǎn)品的穩(wěn)定性，所述產(chǎn)品可為有佐劑或無佐劑的疫苗。例如，EP0475409公開了一種保存含緩沖劑和任選抗凍劑的微觀生物材料懸浮液的方法，其通過將所述懸浮液霧化成微液滴，在旋轉(zhuǎn)的低溫表面上冷凍所述液滴并干燥所述微液滴。優(yōu)選所述液滴的直徑約小于200M1。[0005]已在文獻(xiàn)中對流感抗原的凍干進(jìn)行研究，并有一篇詳細(xì)的綜述(Amorij等人，2008:DevelopmentofstableInfluenzavaccinepowderformulations:challengesandpossibilities(穩(wěn)定的流感疫苗粉末制劑的開發(fā)：挑戰(zhàn)與前景），PharmaceuticalResearch,Vol25,1256-1273)AS3674864公開了一種使流感病毒疫苗穩(wěn)定的方法，其基本上通過將所述病毒懸浮于含蔗糖的水溶液并凍干所得懸浮液進(jìn)行。也已在文獻(xiàn)中討論了破傷風(fēng)和白喉類毒素的穩(wěn)定化（參見例如S.P.Schwendemaη等人，Proc·NatI·Acad·Sci·USAVol·92，ρρ·11234-11238，1995)。最近，已提出了使破傷風(fēng)類毒素凍干的優(yōu)化制劑(P.Matejtschuk等人，Biologicals37(2009)1-7)。[0006]凍干通常是醫(yī)藥工業(yè)中的最后步驟，其在裝入小瓶、注射器或較大容器的步驟之后。這種情況下，干產(chǎn)品在使用前必須再水合化(此文獻(xiàn)中的同義詞:再生或溶解）。[0007]以微丸的形式凍干使得干態(tài)疫苗產(chǎn)品獲得與僅進(jìn)行凍干相同的穩(wěn)定效果或改善儲存穩(wěn)定性。此外，與現(xiàn)有凍干技術(shù)相比，微丸技術(shù)具有一些優(yōu)點，這是由于它能，例如：[0008]-在填充之前(或通過連續(xù)填充)混合干產(chǎn)品[0009]-在填充之前調(diào)節(jié)效價(其可用于產(chǎn)品堆積的情況下）[0010]-使得產(chǎn)品間的相互作用最小化(再水合后僅存在產(chǎn)品相互作用力），和[0011]-在一些情況下改善穩(wěn)定性。[0012]由于這些原因，微丸技術(shù)的優(yōu)點使得可用以下方法干燥佐劑化的疫苗：[0013]-將抗原與佐劑一起干燥(在同一階段）：通過將兩者(抗原和佐劑）限制在玻璃狀基質(zhì)中來使它們穩(wěn)定并使它們之間的相互作用穩(wěn)定，在所述基質(zhì)中所有分子運動和化學(xué)反應(yīng)受到嚴(yán)重阻礙。這種固態(tài)能在整個儲存過程中（甚至在較高溫度下）保持所述抗原的功效、所述佐劑的物理和免疫性能及兩者之間相互作用的性質(zhì)和效力。[0014]-干燥抗原和獨立干燥佐劑(抗原和佐劑在不同階段），然后在填充前將兩者混合或連續(xù)填充。一些情況下，在+5°C或更高或更低溫度下液態(tài)長期儲存的單獨佐劑的穩(wěn)定性可能是一個問題(乳液的化學(xué)穩(wěn)定性，鋁凝膠、脂質(zhì)體和其它物質(zhì)的物理穩(wěn)定性）。微丸技術(shù)能通過產(chǎn)生獨立的抗原和佐劑微丸來改善佐劑化的疫苗的穩(wěn)定性?？瑟毩⒌貎?yōu)化各抗原和佐劑的穩(wěn)定制劑。接著，抗原和佐劑的微丸可隨后填充到小瓶中或在填充到小瓶中之前混合。獨立的固體能在整個儲存過程中（甚至在較高溫度下）避免抗原和佐劑之間的相互作用，以保持抗原的功效和佐劑的物理和免疫性能。這種結(jié)構(gòu)中，小瓶中的容納物能比具有液態(tài)的抗原或佐劑之一的任何其它結(jié)構(gòu)或抗原和佐劑在同一顆粒中干燥時更穩(wěn)定?？乖妥魟┲g的相互作用是這樣標(biāo)準(zhǔn)化的，正如它們僅在用選定的稀釋劑使干組合物再水合后產(chǎn)生，所述稀釋劑可包含注射用水、緩沖劑和穩(wěn)定賦形劑。因此，僅在疫苗再水合和注射之間的短時間內(nèi)需要控制相互作用。[0015]因此，可能通過兩種產(chǎn)品干燥的分開改善這兩種產(chǎn)品的整體穩(wěn)定性(各產(chǎn)品配制的優(yōu)化而不是兩者一起的折中）和疫苗本身的穩(wěn)定性、在儲存后和填充之前調(diào)節(jié)兩者之一的效價，以方便制備過程。[0016]發(fā)明概述[0017]本發(fā)明提供了一種使含佐劑的疫苗組合物穩(wěn)定的方法，所述方法包括如下步驟：用包含穩(wěn)定劑的水溶液稀釋包含抗原或抗原制劑的液態(tài)原液組合物，處理稀釋的組合物以形成直徑接近約200μπι-約1500μπι的規(guī)則液滴，在冷凍劑中冷凍所述規(guī)則液滴以形成冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒，和干燥所得冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒以形成直徑為約200μπι-約1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒。[0018]合適的疫苗組合物有例如包含整個病毒或抗原，如流感病毒、輪狀病毒、巨細(xì)胞病毒、甲型和乙型肝炎病毒，整個細(xì)菌或細(xì)菌蛋白或多糖抗原（綴合或非綴合的）如流感嗜血桿菌、腦膜炎球菌多糖、破傷風(fēng)、白喉、細(xì)胞性和非細(xì)胞性百日咳、肉毒中毒、炭疽熱和艱難梭菌的組合物。[0019]可例如實現(xiàn)液滴的冷凍，其中將稀釋的組合物，即配制的液體產(chǎn)品制成小球以制得直徑為200μπι-1500μπι、粒度分布非常窄的校準(zhǔn)液滴。這些液滴落入低溫室，其中通過冷凍劑或通過液氮的直接注入/噴霧或逆流非常冷(T°〈_110°C)的氣體如氮氣、CO2或空氣來保持溫度在-11〇°C以下。所述液滴在落入過程中冷凍以形成校準(zhǔn)冷凍顆粒。[0020]獲得校準(zhǔn)液滴和隨后的標(biāo)準(zhǔn)冷凍顆粒的其它技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，如超聲波噴霧（SindayiheburaD.,DobreM.,BolleL·，1997-Experimentalstudyofthinliquidfilmultrasonicatomization(薄液膜超聲波噴霧的試驗研究）.ExHFT'97,Bruxelles.)，或如上所述是食品工業(yè)已知的，通過如US5,036,673中所公開的特定冷凍轉(zhuǎn)鼓。[0021]所述方法可還包括將包含一種或多種佐劑和任選穩(wěn)定劑的水溶液加入所述液態(tài)原液抗原組合物中。[0022]或者，本發(fā)明方法還包括用包含穩(wěn)定劑的水溶液稀釋一種或多種佐劑的獨立液態(tài)原液溶液或乳液，處理該稀釋的佐劑或乳液以形成直徑接近約200M1-約1500μπι的規(guī)則液滴，在冷凍劑中冷凍所得規(guī)則液滴以形成冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒，干燥所得冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒以形成直徑為約200μπι-約1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒，及與含抗原的干態(tài)規(guī)則球狀微丸混合并一起填充到小瓶或其它合適容器中。[0023]所述液態(tài)原液組合物可還包含一種或多種其它抗原或抗原制劑，所述各抗原或抗原制劑源自一種不同的病原體或不同病原體血清型，以獲得干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒，各微丸或顆粒包含源自兩種或更多種不同病原體或不同病原體血清型的兩種或更多種抗原或抗原制劑。[0024]或者，所述液態(tài)原液組合物包含源自一種單一病原體或單一病原體血清型的抗原或抗原制劑，以獲得干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒，各微丸或顆粒包含源自相同病原體或相同病原體血清型的抗原或抗原制劑。這種情況下，所述方法可任選還包括將兩種或更多種干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒計量、混合和填充到小瓶或其它合適容器中，其特征在于各種微丸包含源自兩種或更多種不同病原體或不同病原體血清型的抗原或抗原制劑。[0025]本發(fā)明方法可還具有通過凍干法進(jìn)行干燥的特征（即冰的升華和結(jié)合水的解吸附）。合適的干燥方法還有常壓冷凍干燥、流化床干燥、真空轉(zhuǎn)鼓干燥、攪拌冷凍干燥、振動冷凍干燥和微波冷凍干燥。[0026]有利的是，所述穩(wěn)定劑包括單糖如甘露糖，寡糖如蔗糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖，或糖醇如山梨糖醇、甘露糖醇或肌醇，或兩種或更多種不同的這些上述穩(wěn)定劑的混合物，如蔗糖和海藻糖的混合物。[0027]有利的是，糖、糖醇和穩(wěn)定賦形劑的濃度為2%(w/v)至配制的液體產(chǎn)品中的溶解極限。一般而言，糖、糖醇和穩(wěn)定賦形劑的濃度為5%(w/v)-40%(w/v)，5%(w/v)-20%(w/v)或20%(w/v)-40%(w/v)。包含例如破傷風(fēng)或白喉類毒素和鋁凝膠(AlOOH)的配制液體產(chǎn)品中蔗糖和海藻糖的1:1混合物的濃度實例分別為18.1%(w/v)和17.5%(w/v)。[0028]本發(fā)明具體涉及一種使流感疫苗組合物穩(wěn)定的方法，所述方法包括如下步驟：用包含糖和/或糖醇或兩種或更多種不同糖和/或糖醇的混合物的水溶液稀釋包含源自季節(jié)性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制劑的液態(tài)原液組合物以獲得所得稀釋的組合物中糖和/或糖醇含量為2%(w/v)至溶解極限，處理已稀釋的組合物以形成直徑接近約200μπι-約1500μπι的規(guī)則液滴，在冷凍劑中冷凍所得規(guī)則液滴以形成冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒，和干燥所述冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒以形成直徑為約200μπι-約1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒。[0029]包含源自季節(jié)性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制劑的液態(tài)原液組合物可通過US6,048,537(W096/05294)中公開的方法獲得。[0030]所述干燥有利地通過凍干法（即冰的升華和結(jié)合水的解吸附)進(jìn)行。冷凍微丸的其它合適干燥方法有常壓冷凍干燥、流化床干燥、真空轉(zhuǎn)鼓干燥、攪拌冷凍干燥、振動冷凍干燥和微波冷凍干燥。[0031]有利的是，所述糖為二糖，特別是蔗糖。同樣合適的二糖有，例如乳糖、麥芽糖或海藻糖。同樣適合于使所述流感疫苗組合物穩(wěn)定的有單糖，如甘露糖，或糖醇如山梨糖醇、肌醇或甘露糖醇。[0032]有利的是，所配制的液體產(chǎn)品中所述糖或糖醇的濃度為5%-40%(w/v)，或者5%-20%(w/v)或20%-40%。所配制的液體產(chǎn)品中例如蔗糖的濃度的實例為2%(w/v)、10%(w/v)或15.4%(w/v)〇[0033]所述液態(tài)原液組合物可還包含一種或多種其它流感抗原或抗原制劑，各抗原或抗原制劑源自不同的季節(jié)性、大流行前或流行的流感病毒株，以獲得干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒，各微丸或顆粒包含源自兩種或更多種不同的季節(jié)性、大流行前或流行的流感病毒株的兩種或更多種流感抗原或抗原制劑。這種情況下，所述方法任選還包括將所述干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒計量和填充到小瓶或其它合適容器中。[0034]或者，所述液態(tài)原液組合物包含一種或多種源自季節(jié)性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制劑，以獲得干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒，各微丸或顆粒包含源自相同的季節(jié)性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制劑。這種情況下，所述方法可任選還包括將兩種或更多種干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒計量、混合并填充到小瓶或其它合適容器中，特征在于各種微丸包含源自不同于另一種的季節(jié)性、大流行前或流行的流感病毒株的流感抗原或抗原制劑。[0035]所述方法任選還包括將包含一種或多種佐劑和任選穩(wěn)定劑的水溶液加入所述液態(tài)原液抗原組合物中。[0036]或者，本發(fā)明方法還包括用包含穩(wěn)定劑的水溶液稀釋一種或多種佐劑的獨立的液態(tài)原液溶液或乳液，處理已稀釋的佐劑溶液或乳液以形成直徑接近約200μπι-約1500μπι的規(guī)則液滴，在冷凍劑中冷凍所得規(guī)則液滴以形成冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒，干燥所述冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒以形成直徑為約200μπι-約1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒，和與包含抗原的干態(tài)規(guī)則球狀微丸一起混合并填充到小瓶或其它合適容器中。[0037]特別合適的佐劑有，例如脂質(zhì)體、脂質(zhì)或去污膠束或其它脂質(zhì)顆粒、聚合物納米顆粒或微粒、可溶性聚合物、蛋白顆粒、礦物凝膠、礦物微粒或納米顆粒、聚合物/鋁納米雜化體、水包油或油包水乳液、皂角苷提取物、細(xì)菌細(xì)胞壁提取物、天然免疫受體的刺激劑，特別是天然或合成TLR激動劑、天然或合成NOD激動劑和天然或合成RIG激動劑。用于本發(fā)明方法的合適佐劑例如WO2007/006939中公開的那種。[0038]所述流感病毒株為，例如Η5Ν1、Η9Ν2、Η7Ν7、Η2Ν2、Η7Ν1和HlNl(EmergenceofmultiplegenotypesofH5NlavianinfluenzavirusesinHongKongSAR(香港特另Ij行政區(qū)出現(xiàn)多種基因型H5N1禽流感）：YGuan等人，8950-8955，PNAS-June25,2002-vol99n°13；H9N2InfluenzaAVirusesfromPoultryinAsiahaveHumanVirus-likeReceptorSpecificity(來自亞洲家禽的H9N2A型流感病毒具有人病毒樣受體特異性）：MNMatrosovich，SKrauss和RWebster，Virology281,156-162(2001)!EvolutionandEcologyofInfluenzaAViruses(A型流感病毒的演化和生態(tài)）：RWebster等人，MicrobiologicalReviewsMar1992，ρ·152-179)。或者，它可為選自季節(jié)性流感病毒株群的流感株。[0039]所述流感抗原可為選自純化的全流感病毒、滅活的流感病毒或流感病毒的亞單位組分或片段流感病毒的形式。[0040]所述流感抗原可來自細(xì)胞培養(yǎng)。或者，所述流感抗原產(chǎn)于胚蛋中。[0041]本發(fā)明還涉及穩(wěn)定的干態(tài)疫苗組合物，特別是可通過本發(fā)明方法獲得的直徑為約200μπι-約1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒形式的穩(wěn)定干態(tài)流感疫苗組合物或包含其它抗原的穩(wěn)定干態(tài)疫苗組合物，所述其它抗原如滅活的全病毒或病毒的抗原組分、流感病毒、輪狀病毒、巨細(xì)胞病毒和甲型和乙型肝炎，和全細(xì)菌或細(xì)菌蛋白或多糖抗原、綴合或非綴合的，如流感嗜血桿菌、腦膜炎球菌性多糖、破傷風(fēng)、白喉、細(xì)胞性和非細(xì)胞性百日咳、肉毒中毒、炭疽熱、艱難梭菌。[0042]有利的是，各規(guī)則球珠或顆粒包含僅一種抗原，例如源自僅一種流感病毒株的一種或多種流感抗原，或例如僅破傷風(fēng)或僅白喉抗原?；蛘?，各規(guī)則球珠或顆粒包含一種或多種抗原，例如源自一種或多種不同流感病毒株的流感抗原，或例如破傷風(fēng)和白喉抗原。[0043]所述組合物可還包含佐劑，所述佐劑任選包含于獨立的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒中。[0044]本發(fā)明還涉及制備疫苗的方法，所述方法包括干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒形式的穩(wěn)定的干態(tài)疫苗組合物，例如上述穩(wěn)定的干態(tài)流感疫苗組合物在水溶液中重組的步驟。所述水溶液可任選包含佐劑。[0045]本發(fā)明還涉及疫苗試劑盒，包括包含干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒形式的穩(wěn)定的干態(tài)疫苗組合物例如穩(wěn)定的干態(tài)流感疫苗組合物的第一容器和包含用于所述疫苗重組的水溶液的第二容器。所述試劑盒可還包括包含干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒的容器，所述微丸或顆粒中包含佐劑。或者，所述水溶液包含佐劑。[0046]本發(fā)明還涉及儲存穩(wěn)定的干態(tài)原液抗原的方法，其中所述抗原首先通過上述方法使之穩(wěn)定化，所得穩(wěn)定的干態(tài)疫苗組合物(例如流感、白喉或破傷風(fēng)疫苗組合物）用足夠的溶劑重組并任選在以直徑為約200μπι-約1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒形式儲存后、將液體填充到小瓶或注射器之前配制。【附圖說明】[0047]圖1所示為一般配制和干燥步驟流程圖。[0048]圖2所示為疫苗微丸的造粒、冷凍、干燥和填充。[0049]圖3所示為包括佐劑的一般配制、冷凍和干燥步驟流程圖。[0050]圖4所示為抗原微丸的生產(chǎn)。[00511圖5所示為佐劑微丸的生產(chǎn)。[0052]圖6所示為不同的微丸組合成完整的干態(tài)疫苗。[0053]圖7所示為實施例1中所述的配制和干燥步驟的流程圖。[0054]圖8所示為實施例1中獲得微丸的狹窄粒度分布。[0055]圖9所示為采用微丸技術(shù)在糖存在下磷酸鋁凝膠干燥后的粒徑分布結(jié)果圖。干燥之前(黑色曲線，右)和以微丸形式干燥并再水合后(灰色曲線，左)磷酸鋁凝膠的粒度分布。沒有觀察到聚集跡象。DLS測定。[0056]圖10所示為實施例2中所述的配制和干燥步驟的流程圖。[0057]圖11所示為微丸加工之前、之后氫氧化正鋁凝膠的粒度。SGl穩(wěn)定劑。[0058]圖12所示為:在37°C、45°C和55°C下熱穩(wěn)定孵育至少7天并用WFI溶解后氫氧化正鋁凝膠的粒度。[0059]圖13所示為用SGl穩(wěn)定劑作為實例的配制和干燥步驟原理的流程圖。[0060]圖14所示為微丸再水合之前（紅色曲線）和微丸溶解之后（綠色曲線）乳液的粒度比較。[0061]圖15所示為微丸溶解后乳液在室溫下的粒度穩(wěn)定性。剛?cè)芙夂蠛腿芙?、15、30、45和60min后乳液粒度分布曲線完全重合。[0062]圖16所示為實施例4a所得微丸的配制和干燥步驟的流程圖。[0063]圖17所示為在鋁凝膠存在下包含白喉Dt或破傷風(fēng)Tt的待干燥配制液體產(chǎn)品與穩(wěn)定劑混合獲得的兩種制劑的配制和干燥步驟的流程圖。[0064]圖18所示為不含鋁凝膠、包含白喉Dt或破傷風(fēng)Tt的待干燥配制液體產(chǎn)品與穩(wěn)定劑混合獲得的兩種制劑的配制和干燥步驟的流程圖。[0065]圖19所示為僅含鋁凝膠的待干燥配制液態(tài)產(chǎn)品和穩(wěn)定劑混合獲得的制劑的配制和干燥步驟的流程圖。具體實施方案[0066]下面對本發(fā)明微丸狀干疫苗的熱穩(wěn)定化方法進(jìn)行更詳細(xì)解釋。[0067]為了通過微丸技術(shù)進(jìn)行處理，需要配制生物物質(zhì)如抗原以保護(hù)其免受所述處理過程中經(jīng)受的物理和化學(xué)應(yīng)力影響。[0068]待干燥的配制液體產(chǎn)品通過如下方法獲得:將濃縮的疫苗原液(包含抗原)和包含至少一種糖和/或糖醇的穩(wěn)定化制劑混合，使得獲得的配制液體產(chǎn)品每ml包含目標(biāo)量的穩(wěn)定賦形劑和抗原。糖、糖醇和穩(wěn)定化賦形劑的濃度為2%(w/V)至在配制液體產(chǎn)品中的溶解極限。例如，20°C下蔗糖在水中的溶解極限的濃度為約66.7%(w/v)。[0069]圖1顯示了一般配制和干燥步驟流程圖。[0070]圖2中所述的過程用于產(chǎn)生干態(tài)微丸。[0071]制粒，也就是已知的層流射流破碎（jetbreak-up)技術(shù)，是通常用于生物催化劑和活細(xì)胞固定化領(lǐng)域中產(chǎn)生液體的校準(zhǔn)液滴（calibrateddroplet)的眾所周知的技術(shù)(Hulst等人，1985.Anewtechniquefortheproductionofimmobilizedbiocatalystandlargequantities(大量生產(chǎn)固定化的生物催化劑的新技術(shù)）.Biotechnol.Bioeng.27，870_876;Gotoh等人，1993.Massproductionofbiocatalyst-entrappingalginategelparticlesbyaforcedoscillationmethod(通過受迫振蕩法大規(guī)模生產(chǎn)生物催化劑包埋海藻鹽凝膠顆粒）·Chem.Eng.Commun·120，73-84.;Seifert和Philips，1997.Productionofsmall,monodispersedalginatebeadsforcellimmobilization(用于細(xì)胞固定化的單分散海藻鹽小珠的生產(chǎn)）.Biotechnol.Prog.13,562-568)DLordRayleigh是分析牛頓流體從噴嘴出來的毛細(xì)管射流的不穩(wěn)定性并提出描述它的模型的第一人(RayleighL，1978·0ηthestabilityofjets(關(guān)于射流穩(wěn)定性）.Proc.LondonMath.Soc.lO,4_13)。ffeber(ffeberCj1931.ZumZerfalleinesFlti881&1^;^881:瓜11168.2.4即6￥.]\&11:11.]\16(311.11，136-154)拓展了該分析，包括粘度的影響。最快增長擾動和射流間斷的最佳波長通過下式給出：[0072][0073]其中Acipt是射流破碎的最佳波長，dj是射流直徑，η是流體粘度，P是流體密度而σ是流體表面張力。形成的液滴的直徑d可通過下式計算：[0074][0075]用于流體以獲得所需結(jié)果的頻率f與射流速度（以及因此流體的流速)Uj和波長的關(guān)系為：[0076][0077]因此，如果知道處理參數(shù)和流體特征，則可計算最佳條件。然而，根據(jù)噴嘴直徑、流體的流變學(xué)和表面張力，存在大范圍的頻率和射流速度來形成均勻液滴(MeestersG.，1992.Mechanismsofdropletformation(液滴形成機理）.DelftUniversityPress,DeIft，NL)。合適的工作頻率也可通過視覺評價液滴形成的穩(wěn)定性來實驗地確定。標(biāo)準(zhǔn)的制粒設(shè)備裝備有閃光燈頻閃觀測儀以觀察液滴形成:就給定產(chǎn)品和給定工作條件而言，可手動調(diào)節(jié)頻率直到用頻閃閃光燈光觀察到穩(wěn)定而靜止的液滴鏈。[0078]此外，已為無菌造粒應(yīng)用開發(fā)多噴嘴系統(tǒng)(BrandenbergerH.等人，1998.Anewmultinozzleencapsulation/immobilizationsystemtoproduceuniformbeadsofalginates(用于生產(chǎn)海藻鹽均勾珠的新型多噴嘴封裝/固定化系統(tǒng)）.J.Biotechnol.63，73-80)〇[0079]總之，可根據(jù)現(xiàn)有工具和產(chǎn)品知識從理論上和實驗上確定工作頻率。[0080]所述造粒法適合于粘性液體和飽和的糖溶液。現(xiàn)有供應(yīng)商的最大可接受粘度接近300mPa.s。因此，制劑濃度可為非常低的濃度至室溫或處理溫度下選定賦形劑的溶解極限。此外，必須控制處理管和噴嘴中的溫度以避免糖或溶劑在液滴形成之前結(jié)晶。制劑領(lǐng)域中的技術(shù)人員會考慮賦形劑之間的最終相互作用來調(diào)節(jié)產(chǎn)品中不同賦形劑濃度以免超出給定限度的未控制結(jié)晶和粘度。[0081]將配制液體產(chǎn)品造粒以產(chǎn)生直徑為200μπι-1500μπι、粒徑分布非常窄的校準(zhǔn)液滴。這些液滴落入低溫室中，其中通過液氮的直接注入/噴霧或使非常冷(T°〈-I10°c)的氣體如氮氣、CO2或空氣逆流來將溫度保持在-IHTC以下。所述液滴在落入過程中冷凍以形成校準(zhǔn)冷凍顆粒。冷凍液滴（即固化小球的冰晶形成）的最低落下高度可通過限制超冷來最小化。超冷可通過直接接觸液氮霧或液滴(在所述室內(nèi)直接注入液氮)或采用微觀冰晶(冷室中水或超熱蒸汽的直接霧化)將冰核植入液滴中來降低。[0082]然后收集這些冷凍顆粒并轉(zhuǎn)移到_50°C預(yù)冷盤上，放置在凍干機(_50°C)的預(yù)冷擱板上以一直保持冷凍小球低于其低溫濃縮相的玻璃化轉(zhuǎn)變Tg'（Tg'值可為-10°C至-45°C)并避免所述顆粒的任何熔融或聚集。凍干機裝載好后，在凍干室內(nèi)抽真空以啟動本領(lǐng)域技術(shù)水平已知的小球常規(guī)凍干(冰的升華）。以下凍干參數(shù)是可用于Tg'為-30°c至-45°c的制劑的凍干參數(shù)實例：[0083]第一次干燥:擱板溫度等于-35°C，壓力等于50ybars，10小時。[0084]第二次干燥:擱板溫度等于20°C，壓力等于50ybars，3小時。[0085]必須設(shè)計冷凍干燥循環(huán)以使得殘留水分優(yōu)選低于3%。然而，根據(jù)具體情況，如果干態(tài)抗原的穩(wěn)定需要，水分含量可在較高值優(yōu)化。[0086]其它干燥技術(shù)如常壓冷凍干燥、流化床干燥、真空轉(zhuǎn)鼓干燥、攪拌冷凍干燥、振動冷凍干燥、微波冷凍干燥可用于干燥小球。[0087]接著收集原液干態(tài)小球以進(jìn)行分析和儲存。儲存條件適合于干態(tài)易脆的吸濕性顆粒。在分析之前用稀釋劑將干樣品再水合化，所述稀釋劑可包含注射用水、緩沖劑、穩(wěn)定賦形劑和佐劑。立刻溶解。[0088]然后采用干粉填充技術(shù)將原液干態(tài)小球填充到目前市場上出售的小瓶中。[0089]同樣，從儲存穩(wěn)定的干態(tài)抗原原液來看，可在將液體填充到小瓶或注射器之前將小球與足夠溶劑重組并配制（如果需要）。由于這種小球的穩(wěn)定性，囤積物的儲存可在+5°C或更高溫度進(jìn)行，該溫度比冷凍液體材料的溫度(-20°C或更低)更方便。最后，儲存干態(tài)原液材料比在最終容器中儲存填充的干態(tài)產(chǎn)品占用空間少很多。[0090]如果是佐劑化的疫苗，當(dāng)抗原和佐劑都是液態(tài)時，+5°C或更高和更低(冷凍)溫度下儲存時的穩(wěn)定性常常是個問題。例如，下表描述了通過動態(tài)光散射測定的_20°C下的凍融循環(huán)對氧羥基鋁凝膠的影響：[0092]根據(jù)具體情況，所述微丸技術(shù)通過三種不同策略能克服穩(wěn)定性問題：[0093]1.單獨干燥微丸狀的抗原并用佐劑(鋁凝膠、乳液等)溶解于稀釋劑中。當(dāng)抗原穩(wěn)定性在微丸形式下得到提高時和單獨佐劑是高度熱穩(wěn)定的時，這個策略是適合的[0094]->保存期內(nèi)無相互作用[0095]->當(dāng)獨立儲存時各相的穩(wěn)定性提高[0096]->通過用液態(tài)佐劑臨時溶解干態(tài)抗原使得吸附行為標(biāo)準(zhǔn)化[0097]2.干燥抗原和佐劑以在同一小球中使兩者穩(wěn)定并通過將它們限制在玻璃態(tài)基質(zhì)中使它們之間的相互作用穩(wěn)定，在所述基質(zhì)中所有分子運動和化學(xué)反應(yīng)大受阻礙。該固態(tài)能在整個儲存過程中（甚至在較高溫度下)保持抗原的功效、佐劑的物理和免疫性能及兩者之間相互作用的性質(zhì)和效力。[0098]3.干燥抗原和獨立干燥佐劑，然后在填充之前將兩者混合或連續(xù)填充。有些情況下，單獨佐劑在+5°C或更高溫度下以液態(tài)長期儲存時的穩(wěn)定性可能成為問題(乳液的化學(xué)穩(wěn)定性，鋁凝膠、脂質(zhì)體和其它物質(zhì)的物理穩(wěn)定性）。微丸技術(shù)能通過產(chǎn)生獨立的抗原和佐劑微丸來改善佐劑化的疫苗的穩(wěn)定性。各抗原和佐劑的穩(wěn)定化制劑可獨立地優(yōu)化。接著可將抗原和佐劑微丸填充到小瓶中。獨立的固態(tài)能避免儲存過程中（甚至在較高溫度下)抗原和佐劑之間的相互作用，以保持抗原的功效和佐劑的物理和免疫性能。這種結(jié)構(gòu)中，小瓶中的容納物比具有抗原之一或在液態(tài)佐劑中的任何其它結(jié)構(gòu)或抗原和佐劑在同一顆粒中干燥時更穩(wěn)定。抗原和佐劑之間的相互作用是這樣標(biāo)準(zhǔn)化的，正如它們僅在用選定的稀釋劑使干組合物再水合后產(chǎn)生，所述稀釋劑可包含注射用水、緩沖劑和穩(wěn)定賦形劑。因此，僅在再水合和疫苗注射之間的短時間（快的相互作用和非常短的老化時間）內(nèi)存在相互作用。因此，可能通過兩種產(chǎn)品干燥的分開來改善這兩種產(chǎn)品的整體穩(wěn)定性(各產(chǎn)品配制的優(yōu)化而不是兩者在一起的折中）和疫苗本身的穩(wěn)定性、在儲存后調(diào)節(jié)兩者之一的效價，以方便制備過程。[0099]為了用微丸技術(shù)進(jìn)行處理，需要配制生物物質(zhì)如抗原和佐劑以保護(hù)它們免受處理過程中的物理和化學(xué)應(yīng)力的影響。[0100]如果是佐劑，穩(wěn)定化制劑必須保持它們在加工(配制、造粒、干燥、儲存、填充和再水合)過程中的質(zhì)量。[0101]如果所述策略是在相同微丸中干燥抗原和佐劑，待干燥的配制液體產(chǎn)品通過如下方法獲得:將濃縮的疫苗原液(包含抗原）、濃縮的佐劑原液和包含至少一種糖和/或糖醇的穩(wěn)定化制劑混合，使得獲得的配制液體產(chǎn)品包含每ml目標(biāo)量的穩(wěn)定賦形劑、佐劑和抗原。穩(wěn)定賦形劑的濃度為2%(w/v)至在配制液體產(chǎn)品中的溶解極限。[0102]圖3所示為包括佐劑的配制和干燥步驟流程圖。[0103]如果所述策略是在獨立的微丸中干燥抗原和佐劑，待干燥的配制液體產(chǎn)品（包含抗原)通過如下方法獲得:將濃縮的疫苗原液(包含抗原)和穩(wěn)定化制劑混合，使得獲得的配制液體產(chǎn)品包含每ml目標(biāo)量的穩(wěn)定賦形劑和抗原。糖和穩(wěn)定賦形劑的濃度為2%(w/v)至在配制液體產(chǎn)品中的溶解極限。[0104]對佐劑的方式相同，待干燥的配制液體產(chǎn)品通過如下方法獲得:將濃縮的佐劑原液與穩(wěn)定化制劑混合，使得獲得的配制液體產(chǎn)品包含每ml目標(biāo)量的穩(wěn)定賦形劑和佐劑。糖和穩(wěn)定賦形劑的濃度為2%(w/v)至在配制液體產(chǎn)品中的溶解極限。[0105]圖4所示為制備含抗原的微丸的配制和干燥步驟流程圖，圖5所示為制備含佐劑的微丸的配制和干燥步驟流程圖。圖6顯示了不同微丸的結(jié)合以得到干態(tài)疫苗。[0106]產(chǎn)生干態(tài)微丸的一般過程顯示于圖2中。它可獨立于選定的佐劑化的疫苗策略而應(yīng)用。[0107]微丸技術(shù)的快速冷凍機理也適合于干燥佐劑。例如，圖9顯示了采用微丸技術(shù)在糖存在下磷酸鋁凝膠干燥后的粒徑分布結(jié)果圖?？梢钥闯觯焊稍锖驮偎蠈ψ魟╊w粒的粒度分布無明顯負(fù)面影響。[0108]可考慮的合適佐劑示例如下：[0109]1)微粒狀佐劑如脂質(zhì)體，特別是陽離子脂質(zhì)體（如DC-Chol，參見例如US2006/0165717、D0TAP、DDAB和1,2-二鏈烷?；?sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(EthylPC)脂質(zhì)體，參見US7,344,720)、脂質(zhì)或去污膠束或其它脂質(zhì)顆粒(例如產(chǎn)自CSL或Isconova的Iscomatrix、病毒顆粒和蛋白螺旋體化1'(^60(30(31116316)、聚合物納米顆?；蛭⒘?例如?11^和?1^\納米顆?；蛭⒘?、PCPP顆粒、藻酸鹽/殼聚糖顆粒)或可溶聚合物(例如PCPP、殼聚糖）、蛋白顆粒如奈瑟菌屬腦膜炎球菌蛋白體、礦物凝膠(標(biāo)準(zhǔn)鋁佐劑:aiooh，aip〇4)、微?；蚣{米顆粒(例如Ca3(P〇4)2)、聚合物/鋁納米雜化體(例如PMAA-PEG/A100H和PMAA-PEG/A1P04納米顆粒)0/W乳液(例如產(chǎn)自Novartis的MF59、產(chǎn)自GlaxoSmithKlineBi〇Iogicals的AS03)和W/0乳液(例如產(chǎn)自Seppic的ISA51和ISA720,或WO2008/009309中公開的）。例如，適用于本發(fā)明方法的佐劑乳液為WO2007/006939中所公開的。[0110]2)天然提取物如:皂角苷提取物QS21及其半合成衍生物如Avantogen開發(fā)的那些、細(xì)菌細(xì)胞壁提取物(例如Corixa/GSK開發(fā)的micobacterium細(xì)胞壁骨架和micobaterium索狀因子及其合成衍生物、海藻糖二酶菌酸）。[0111]3)天然免疫受體的刺激劑如:天然或合成TLR激動劑(例如刺激TLR2/1或TLR2/6雜二聚體的合成脂肽、刺激TLR3的雙鏈RNA、刺激TLR4的LPS及其衍生物、刺激TLR4的E6020和RC-529、刺激TLR5的鞭毛蛋白、刺激TLR7和/或TLR8的單鏈RNA和3M'的合成咪唑喹啉、刺激TLR9的CpGDNA、天然或合成NOD激動劑(例如胞壁酰二肽）、天然或合成RIG激動劑(例如病毒核酸，特別是3'磷酸鹽RNA)。[0112]這些佐劑可組合使用。優(yōu)選的組合為微粒狀佐劑與天然提取物之間的組合和微粒狀佐劑與天然免疫受體的刺激劑之間的組合。[0113]就下面的實施例而言，米用產(chǎn)自Inotech(CH)的造粒裝置IE-50REncapsulatorResearch和300μηι噴嘴頭制備微丸。[0114]實施例1:微丸形式的含流感(Flu)抗原的熱穩(wěn)定干態(tài)疫苗的制備[0115]此研究將現(xiàn)有液態(tài)三價流感疫苗與用微丸技術(shù)加工的相同疫苗的干態(tài)制劑的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了比較。三價流感疫苗在疫苗緩沖劑中包含30μg/mlA/Salomon、B/Malaysia和A/Wisconsin株。通過將一體積的三價流感疫苗和一體積的包含至少一種糖的穩(wěn)定化制劑混合獲得待干燥的配制液體產(chǎn)品，所述糖的濃度為4%(w/v)至溶解極限。這對應(yīng)于待干燥的配制液體產(chǎn)品中2%-32%(重量/體積)的濃度范圍。對兩種制劑SGl和SG2進(jìn)行了評估，所述制劑的組成列于表1和2中：[0116]表1[0120]圖7顯示了配制和干燥步驟的流程圖。[0121]圖2顯示了用于產(chǎn)生制劑SG1和SG2的干態(tài)微丸的方法。[0122]將配制的液態(tài)產(chǎn)品SGl和SG2造粒以產(chǎn)生校準(zhǔn)液滴。該制劑和300μπι噴嘴頭的造粒參數(shù)為：[0123]-產(chǎn)品流速:8ml/min[0124]-噴嘴頻率:954Hz[0125]這些液滴落入低溫室內(nèi)，其中通過液氮的直接注入/噴霧或使非常冷(t°〈_110°C)的氣體逆流來保持溫度在-110°C以下。所述液滴在落入過程中冷凍并形成校準(zhǔn)冷凍顆粒。[0126]然后將這些冷凍顆粒轉(zhuǎn)移到-50°C預(yù)冷盤上，并放置在凍干機(-50°C)的預(yù)冷擱板上以一直保持冷凍小球低于其玻璃化轉(zhuǎn)變(其估計為-30°C至-40°C)并避免所述顆粒的任何熔融或聚集。凍干機裝載好后，在凍干室內(nèi)抽真空以啟動本領(lǐng)域技術(shù)水平已知的小球常規(guī)凍干。針對這些制劑，采用以下凍干參數(shù):第一次干燥:擱板溫度等于-35°C，壓力等于50μbars，10小時。第二次干燥:擱板溫度等于20°C，壓力等于50ybars，3小時。SGl和SG2制劑的所得微丸的殘留水分低于2%。[0127]圖8給出了采用這種造粒和干燥技術(shù)獲得的非常窄的粒度分布的概念。[0128]從而，有3種產(chǎn)品用于熱穩(wěn)定性研究：市售的三價流感疫苗(VAXIGRIP?,SanofiPasteur)、干態(tài)微丸SGl制劑(三價流感疫苗)和干態(tài)微丸SG2制劑(三價流感疫苗）。[0129]將這3種制劑的各樣品在37°C和45°C下暴露不同時間。然后通過SRD(SRID)法(M.S.Williams,VeterinaryMicrobiology，37(1993)253-262)測定各樣品功效（yg抗原/ml)。在分析前采用注射用水使干態(tài)樣品再水合。立刻溶解。表3、4和5匯總了所得結(jié)果。結(jié)果表示為抗原的平均值yg/m1。[0130]表3[0131]A/SaIomon[0142]這些結(jié)果表明：微丸形式的干態(tài)制劑SGl和SG2比現(xiàn)有液態(tài)制劑更加穩(wěn)定。37°C下3個月和45°C下1周后沒有測到明顯的抗原性損失。[0143]實施例2:微丸形式的含氫氧化正錯(aluminumoxyhydroxide)凝膠佐劑化的FluH5N1(印度尼西亞)抗原的熱穩(wěn)定干態(tài)疫苗的制備[0144]此研究將液態(tài)H5N1印度尼西亞流感疫苗與用本發(fā)明微丸技術(shù)加工的相同疫苗的干態(tài)制劑的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了比較。[0145]所述疫苗在疫苗緩沖劑中包含65.4μg/ml氫氧化正鋁凝膠佐劑化的H5N1印度尼西亞株。[0146]通過將一體積的H5N1疫苗和一體積的穩(wěn)定化制劑SGl混合獲得(SG1的組成參見實施例1)待干燥的配制液體產(chǎn)品。[0147]圖10顯示了配制和干燥步驟的流程圖。[0148]將配制液態(tài)產(chǎn)品SGl造粒以產(chǎn)生校準(zhǔn)液滴。該制劑和300μπι噴嘴頭的造粒參數(shù)為：[0149]-產(chǎn)品流速:8ml/min[0150]-噴嘴頻率:916Hz[0151]這些液滴落入低溫室內(nèi)，其中通過液氮的直接注入或使非常冷的氣體(t°〈-110°C)逆流來保持溫度在-IHTC以下。所述液滴在落入過程中冷凍并形成校準(zhǔn)冷凍顆粒。[0152]然后將這些冷凍顆粒轉(zhuǎn)移到-50°C預(yù)冷盤上并放置在凍干機(-50°C)的預(yù)冷擱板上以一直保持冷凍小球低于其玻璃化轉(zhuǎn)變(其估計為-30°C至-40°C)并避免所述顆粒的任何熔融或聚集。凍干機裝載好后，在凍干室內(nèi)抽真空以啟動本領(lǐng)域技術(shù)水平已知的小球常規(guī)凍干。針對這些制劑，采用以下凍干參數(shù):第一次干燥:擱板溫度等于_35°C，壓力等于50μbars，10小時。第二次干燥:擱板溫度等于20°C，壓力等于50ybars，3小時。所得微丸的殘留水分低于2%。[0153]將微丸樣品暴露在37°C和45°C下7天。然后通過SRD法測定功效(yg抗原/ml)。在分析前采用注射用水使干態(tài)樣品再水合。立刻溶解。表6匯總了所得結(jié)果。結(jié)果表示為抗原的平均值μg/ml;N.D.表示"檢測不到的抗原性"。[0154]表6[0156]這些結(jié)果表明：微丸形式的干態(tài)制劑SGl比現(xiàn)有液態(tài)制劑更穩(wěn)定。37°C下和45°C下1周后沒有測到明顯的抗原性損失。55°C下一周后觀察到接近15%的損失，所述值接近該分析本身的精度。[0157]通過采用粒度分析儀MalvernMasterSizer2000測定小球干燥前、溶解后配制的原液中氫氧化正鋁的粒度分布來評價該干燥過程和小球的再水合對佐劑性能的影響。結(jié)果顯示于圖11中。我們觀察到此過程沒有引起凝膠的聚集。[0158]圖12也表明：在37°C、45°C和55°C下熱穩(wěn)定孵育至少7天后，凝膠大小得以保持，展示了微丸形式鋁凝膠佐劑的穩(wěn)定性。[0159]本實施例證實了該技術(shù)可用于鋁凝膠佐劑化的流感抗原，更廣泛而言，證實了采用微丸技術(shù)干燥鋁凝膠佐劑化的抗原的可行性。[0160]實施例3:微丸形式的含未佐劑化的流感H5N1(印度尼西亞)抗原的熱穩(wěn)定干態(tài)疫苗的制備和用佐劑乳液進(jìn)行再水合[0161]此研究將液態(tài)H5N1印度尼西亞流感疫苗與用微丸技術(shù)加工的相同疫苗的干態(tài)制劑的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了比較。[0162]所述疫苗在疫苗緩沖劑中包含176μg/mlH5N1印度尼西亞株。[0163]通過將H5N1疫苗和穩(wěn)定化制劑SGl混合獲得待干燥的配制液體產(chǎn)品，以得到所需抗原濃度和穩(wěn)定劑含量。對制劑SGl進(jìn)行評價(SG1的組成參見實施例1)。[0164]圖13顯示了配制和干燥步驟的流程圖。[0165]將配制液態(tài)產(chǎn)品造粒以產(chǎn)生校準(zhǔn)液滴。該制劑和300μπι噴嘴頭的造粒參數(shù)為：[0166]-產(chǎn)品流速:8ml/min[0167]-噴嘴頻率:997Hz[0168]這些液滴落入低溫室內(nèi)，其中通過液氮的直接注入或使非常冷的氣體(t°〈-110°C)逆流來保持溫度在-IHTC以下。所述液滴在落入過程中冷凍并形成校準(zhǔn)冷凍顆粒。[0169]然后將這些冷凍顆粒轉(zhuǎn)移到-50°C預(yù)冷盤上并放置在凍干機(-50°C)的預(yù)冷擱板上以一直保持冷凍小球低于其玻璃化轉(zhuǎn)變(其估計為-30°C至-40°C)并避免所述顆粒的任何熔融或聚集。凍干機裝載好后，在凍干室內(nèi)抽真空以啟動本領(lǐng)域技術(shù)水平已知的小球常規(guī)凍干。針對這些制劑，采用以下凍干參數(shù):第一次干燥:擱板溫度等于_35°C，壓力等于50μbars，10小時。第二次干燥:擱板溫度等于20°C，壓力等于50ybars，3小時。所得微丸的殘留水分低于2%。[0170]平行地，制備相同的配制產(chǎn)品，填充到小瓶中并在標(biāo)準(zhǔn)凍干機中正常凍干。將填充好的小瓶放在5°C的預(yù)冷擱板上;然后以TC/min的速度將產(chǎn)品冷凍到-50°C并抽真空以開始升華。第一次干燥參數(shù)為:擱板溫度等于_18°C，壓力等于50ybarS，16小時。第二次干燥參數(shù):擱板溫度等于37°C，壓力等于50ybars，2小時。[0171]所得凍干產(chǎn)品的殘留水分也低于2%。[0172]將微丸和液態(tài)樣品在37°C、45°C和55°C下暴露不同時間。將凍干樣品暴露在37°C和55°C。然后通過SRD法測定各樣品的功效(yg抗原/ml)。在分析前采用注射用水(WFI)使干態(tài)樣品再水合。立刻溶解。表7、8和9匯總了標(biāo)準(zhǔn)液態(tài)制劑、干態(tài)微丸和凍干產(chǎn)品的所得結(jié)果。結(jié)果表示為抗原的平均值μg/mljo時的起始SRD效價對應(yīng)加工后微丸重組后的測定效價。[0173]表7[0179]這些結(jié)果表明：微丸形式的干態(tài)制劑SGl比現(xiàn)有液態(tài)制劑更穩(wěn)定。37°C、45°C和55°(：下3個月后沒有測到明顯的抗原性損失。表9中給出的結(jié)果證實了標(biāo)準(zhǔn)凍干也提供了良好的熱穩(wěn)定性。[0180]此外，表10中給出的數(shù)據(jù)表明：+5°C下9個月后沒有測到抗原性損失。這些結(jié)果對于+5°C下和室溫下在幾年時間內(nèi)的長期穩(wěn)定性非常有希望。[0181]已對用乳液使H5N1微丸再水合的可行性進(jìn)行了研究。用于此研究的乳液為專利申請TO2007/006939中描述的那種。進(jìn)行與表8中相同的實驗計劃，所不同的是采用乳液而不是注射用水使樣品再水合。結(jié)果列于表10和表11中：[0182]表1〇[0186]表10證實了用乳液作為佐劑來溶解微丸不會影響抗原的穩(wěn)定性及其恢復(fù)(recovery)。表11證實了在所述微丸熱穩(wěn)定性孵育后該結(jié)論也是正確的，因為所有測得的效價與用注射用水溶解后測得的效價相當(dāng)。[0187]圖14顯示了這些微丸再水合之前和溶解之后乳液粒度的比較。兩者粒度分布的重合證實：乳液的粒度及由此其完整性沒有被凍干基質(zhì)的再水合明顯地改變。粒度分布保持為單峰并集中在l〇〇nm。此外，圖15證實了所述微丸溶解并在室溫下保存一小時后乳液粒度的穩(wěn)定性。[0188]此研究證實：由于微丸技術(shù)，可能采用佐劑作為溶解緩沖劑并在產(chǎn)品保存期間避免佐劑和抗原之間的所有相互作用。[0189]實施例4a:微丸形式的含未佐劑化的流感H5N1(印度尼西亞)并用不同糖作為穩(wěn)定劑的熱穩(wěn)定干態(tài)疫苗的制備[0190]此研究顯示了3種穩(wěn)定的干態(tài)流感疫苗組合物的制備及用微丸技術(shù)加工的這些干態(tài)組合物的熱穩(wěn)定性，各疫苗組合物包含不同的二糖(分別為海藻糖、乳糖和麥芽糖）。[0191]所述疫苗在疫苗緩沖劑中包含131μg/mlH5N1印度尼西亞株。[0192]通過將H5N1疫苗分別與穩(wěn)定化制劑SG5、SG5、SG6和SG7混合獲得待干燥的配制的液體產(chǎn)品（參見表12a、12b和12c)，以得到所需抗原濃度和穩(wěn)定劑含量。[0193]表12a[0199]圖13用SGl穩(wěn)定劑作為實例顯示了配制和干燥步驟原理的流程圖。對SG5、SG6和SG7采用了相同的流程以使得造粒之前配制產(chǎn)品中的二糖濃度為15.4%(w/v)。[0200]對3種配制的液態(tài)產(chǎn)品的每種進(jìn)行造粒以產(chǎn)生校準(zhǔn)液滴。這些制劑和300μπι噴嘴頭的造粒參數(shù)為：[0201]-產(chǎn)品流速:8ml/min[0202]-噴嘴頻率:根據(jù)制劑，994Hz-l00IHz[0203]這些液滴落入低溫室內(nèi)，其中通過液氮的直接注入或使非常冷的氣體(t°〈-110°C)逆流來保持溫度在-IHTC以下。所述液滴在落入過程中冷凍并形成校準(zhǔn)冷凍顆粒。[0204]然后將這些冷凍顆粒轉(zhuǎn)移到-50°C預(yù)冷盤上并放置在凍干機(-50°C)的預(yù)冷擱板上，以一直保持冷凍小球低于其玻璃化轉(zhuǎn)變(其估計為-30°C至_40°C)并避免所述顆粒的任何熔融或聚集。凍干機裝載好后，在凍干室內(nèi)抽真空以啟動本領(lǐng)域技術(shù)水平已知的小球常規(guī)凍干。針對這些制劑，采用以下凍干參數(shù):第一次干燥:擱板溫度等于_35°C，壓力等于50μbars，10小時。第二次干燥:擱板溫度等于20°C，壓力等于50ybars，3小時。所得微丸的殘留水分低于2%。[0205]將微丸樣品在37°C和55°C下暴露不同時間。然后通過SRD法測定各樣品功效(yg抗原/ml)。在分析前采用注射用水(WFI)使干態(tài)樣品再水合。立刻溶解。表12d、12e和12f匯總了這3種干態(tài)微丸形式組合物各自的所得結(jié)果。結(jié)果表示為抗原的平均值μg/mlJo時的起始SRD效價對應(yīng)加工后微丸重組后的測定效價。[0206]表12dL0210J表12f[0212]這些結(jié)果證實很多糖賦形劑用作穩(wěn)定劑的類似穩(wěn)定性能。[0213]實施例4b:微丸形式的含未佐劑化的流感H5N1(印度尼西亞）的熱穩(wěn)定干態(tài)疫苗的制備，其中待加工的配制原液中含2%(w/v)鹿糖[0214]所述疫苗在疫苗緩沖劑中包含176μg/mlH5N1印度尼西亞株。[0215]通過將H5N1疫苗和穩(wěn)定化制劑SG8混合獲得待干燥的配制的液體產(chǎn)品，以得到所需抗原濃度和2%(w/V)的穩(wěn)定劑含量。表12g顯示了穩(wěn)定化制劑SG8的組成。[0216]表12g[0218]如實施例4a中所述采用含2%w/v蔗糖的配制液態(tài)原液(用SG8配制的液態(tài)原液)制得微丸。圖16顯示了配制和干燥步驟的流程圖。[0219]將微丸樣品在37°C和55°C下暴露不同時間。然后通過SRD法測定各樣品的功效(yg抗原/ml)。在分析前采用注射用水(WFI)使干態(tài)樣品再水合。立刻溶解。表12h顯示了該干態(tài)微丸的所得結(jié)果。結(jié)果表示為平均值μg/ml抗原。To時的起始SRD效價對應(yīng)加工后微丸重組后的測定效價。[0220]表12h[0222]實施例5:微丸加工對佐劑白喉類毒素(Dt)和破傷風(fēng)類毒素(Tt)疫苗的影響的研究[0223]此研究的第一部分評價了預(yù)吸附或不預(yù)吸附在鋁凝膠ALOOH上、以微丸狀凍干的破傷風(fēng)Tt和Dt抗原的穩(wěn)定性。如下所述制備5種制劑。[0224]在鋁凝膠存在下包含白喉Dt或破傷風(fēng)Tt的待干燥配制液體產(chǎn)品通過將給定體積的白喉或破傷風(fēng)類毒素濃縮原液與穩(wěn)定劑混合獲得，以得到以下組合物：[0225]-Dt(白喉類毒素)配制產(chǎn)品：200Lf/ml抗原和0.8mg/ml鋁凝膠[0226]-Tt(破傷風(fēng)類毒素)配制產(chǎn)品：40Lf/ml抗原和0.8mg/ml鋁凝膠[0227]圖17顯示了這兩種制劑的配制和干燥步驟的流程圖。[0228]不含鋁凝膠、包含白喉Dt或破傷風(fēng)Tt的待干燥配制液體產(chǎn)品通過將給定體積的白喉或破傷風(fēng)類毒素濃縮原液與穩(wěn)定劑混合獲得，以得到以下組合物：[0229]-Dt(白喉類毒素)配制產(chǎn)品：500Lf/ml抗原[0230]-Tt(破傷風(fēng)類毒素)配制產(chǎn)品：100Lf/ml抗原[0231]圖18顯示了這兩種制劑的配制和干燥步驟的流程圖。[0232]采用火箭免疫電泳法測定白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素的抗原含量，按照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。[0233]僅含鋁凝膠的待干燥配制液態(tài)產(chǎn)品通過將給定體積的鋁凝膠和穩(wěn)定劑混合獲得，以得到以下組合物：[0234]-鋁凝膠ALOOH配制產(chǎn)品：2.4mg/ml[0235]圖19顯示了這種制劑的配制和干燥步驟的流程圖。[0236]用于本實驗的穩(wěn)定劑稱為SDT-I，其組成在下表中列出：[0237]表13[0239]將配制的液態(tài)產(chǎn)品造粒以產(chǎn)生校準(zhǔn)液滴。這些制劑和300μπι噴嘴頭的造粒參數(shù)匯總于下表中：[0240]表14[0242]這些液滴落入低溫室內(nèi)，其中通過液氮的直接注入或使非常冷的氣體(t°〈-110°C)逆流來保持溫度在-IHTC以下。所述液滴在落入過程中冷凍并形成校準(zhǔn)冷凍顆粒。[0243]然后將這些冷凍顆粒轉(zhuǎn)移到-50°C預(yù)冷盤上并放置在凍干機(-50°C)的預(yù)冷擱板上以一直保持冷凍小球低于其玻璃化轉(zhuǎn)變(其估計為-30°C至-40°C)并避免所述顆粒的任何熔融或聚集。凍干機裝載好后，在凍干室內(nèi)抽真空以啟動現(xiàn)有技術(shù)水平已知的小球常規(guī)凍干。針對這些制劑，采用以下凍干參數(shù):第一次干燥：擱板溫度等于_35°C，壓力等于50μbars，10小時。第二次干燥:擱板溫度等于20°C，壓力等于50ybars，3小時。所得微丸的殘留水分低于2%。[0244]將微丸樣品暴露在37°C和55°C。采用火箭免疫電泳法測定各樣品的功效(Lf/ml)。在分析前采用注射用水(WFI)使干態(tài)樣品再水合。立刻溶解。白喉類毒素穩(wěn)定性結(jié)果：[0245]表15[0247]這些結(jié)果證實了37°C和55°C下長達(dá)1個月后無明顯損失，3個月后僅約13%損失，這是顯著性的界限。此外，含白喉類毒素和鋁凝膠的微丸的孵育表明：在所有時間點和所有測試溫度，溶解后100%的抗原保持吸附到凝膠上。溶解后凝膠粒度分布的觀察穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性研究顯示了與用鋁凝膠佐劑化的流感H5N1類似的結(jié)果(參見實施例2)。[0248]破傷風(fēng)類毒素穩(wěn)定性結(jié)果：[0249]表16[0251]這些結(jié)果證實了：37°C和55°C下長達(dá)3個月后無明顯損失。此外，含破傷風(fēng)類毒素和鋁凝膠的微丸的孵育表明：在所有時間點和所有測試溫度，溶解后100%的抗原保持吸附到凝膠上。溶解后凝膠粒度分布的觀察穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性研究顯示了與用鋁凝膠佐劑化的流感H5N1類似的結(jié)果(參見實施例2)。[0252]這些數(shù)據(jù)證實:微丸法能獲得熱穩(wěn)定的干態(tài)佐劑化或未佐劑化白喉和破傷風(fēng)類毒素疫苗，在正確配制時，55°C下保持長達(dá)3個月后功效、吸附狀態(tài)和佐劑質(zhì)量無明顯下降。此外，鋁凝膠能成功地采用所述微丸技術(shù)凍干，保持相當(dāng)?shù)牧６确植疾⒈苊獯髩K聚集。[0253]實施例6:微丸加工對鋁凝膠特征:與T(破傷風(fēng)類毒素)的相互作用的影響的研究[0254]在本實施例中，采用實施例5中制備的微丸。此研究的目標(biāo)是評價微丸加工對鋁凝膠A100H吸附能力的影響。[0255]在3ml小瓶中，將0.3mg恒定量的鋁凝膠A100H(最初為液態(tài)或微丸形式）與不同量的破傷風(fēng)類毒素(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.75mg總量，最初也為液態(tài)或微丸形式)混合。[0256]進(jìn)行5個實驗：[0257]-系列1:液態(tài)鋁凝膠A100H和原液破傷風(fēng)類毒素抗原的液態(tài)混合物，無穩(wěn)定劑[0258]-系列2:溶解的鋁凝膠AlOOH微丸和原液破傷風(fēng)類毒素抗原的液態(tài)混合物[0259]-系列3:液態(tài)鋁凝膠A100H、原液破傷風(fēng)類毒素抗原和穩(wěn)定劑的液態(tài)混合物[0260]-系列4:液態(tài)鋁凝膠A100H和溶解的破傷風(fēng)類毒素微丸的液態(tài)混合物[0261]-系列5:溶解的鋁凝膠A100H微丸和溶解的破傷風(fēng)類毒素微丸的液態(tài)混合物[0262]在微丸溶解前調(diào)節(jié)水和穩(wěn)定劑的含量以獲得在所有含穩(wěn)定劑制劑(系列2-5)中嚴(yán)格相同的再水合溶液。[0263]將液態(tài)產(chǎn)品混合后，室溫下在輪式攪拌器中孵育這些小瓶2小時，然后以3000rpm離心分離5分鐘。通過MicroBradford技術(shù)(Bi〇Rad蛋白測定)確定上清液中的未吸附破傷風(fēng)類毒素的量。測試各系列樣品的破傷風(fēng)類毒素對照物以進(jìn)行定量分析。所得結(jié)果匯總于下表中：[0264]表17[0266]這些結(jié)果證實:穩(wěn)定劑的存在不會對凝膠的吸附能力產(chǎn)生任何明顯負(fù)面影響。此外，當(dāng)用于破傷風(fēng)類毒素和/或鋁凝膠時，考慮所述方法的可變性，微丸加工不會明顯影響鋁凝膠的吸附能力?！局鳈?quán)項】1.一種使疫苗組合物穩(wěn)定的方法，所述方法包括如下步驟：-用包含單糖、寡糖和/或糖醇或其混合物的水溶液稀釋包含抗原或抗原制劑的液態(tài)原液組合物，以獲得所得稀釋的組合物中單糖、寡糖和/或糖醇含量為2%(w/v)至溶解極限，-使已稀釋的組合物制粒，所述制粒為層流射流破碎技術(shù)，以形成直徑為200μηι-1500μηι的規(guī)則液滴，-在冷凍劑或低溫室中冷凍所述規(guī)則液滴，以形成冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒，和-干燥所述冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒以形成直徑為200Μ?-1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述疫苗組合物包含佐劑。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其進(jìn)一步包含：-將包含一種或多種佐劑的水溶液加入所述液態(tài)原液抗原組合物，或-將包含一種或多種佐劑和穩(wěn)定劑的水溶液加入所述液態(tài)原液抗原組合物，其中所述穩(wěn)定劑包含單糖、寡糖和/或糖醇或其混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括：-用包含穩(wěn)定劑的水溶液稀釋一種或多種佐劑的獨立的液態(tài)原液溶液或乳液，其中所述穩(wěn)定劑包含單糖、寡糖和/或糖醇或其混合物，以獲得所得稀釋的佐劑溶液或乳液中單糖、寡糖和/或糖醇含量為2%(w/v)至溶解極限，-使已稀釋的佐劑溶液或乳液制粒，所述制粒為層流射流破碎技術(shù)，以形成直徑為200μm-1500ym的規(guī)則液滴，-在冷凍劑或低溫室中冷凍所述規(guī)則液滴，以形成冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒，-干燥所述冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒以形成直徑為200Μ?-1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒，和-與根據(jù)權(quán)利要求1獲得的包含抗原的干態(tài)規(guī)則球狀微丸混合并一起填充到小瓶或其它合適容器中。5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項所述的方法，其中所述佐劑選自脂質(zhì)體、脂質(zhì)和去污膠束、病毒顆粒、蛋白螺旋體、聚合物納米顆粒和微粒、可溶性聚合物、蛋白顆粒、礦物凝膠、礦物微粒和納米顆粒、聚合物/鋁納米雜化體、水包油和油包水乳液、皂角苷提取物、細(xì)菌細(xì)胞壁提取物和天然免疫受體的刺激劑。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，-其中所述液態(tài)原液組合物包含源自單一病原體或病原體血清型的抗原或抗原制劑，或-其中所述液態(tài)原液組合物包含兩種或更多種抗原或抗原制劑，所述各抗原或抗原制劑源自不同的病原體或病原體血清型。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述方法還包括將兩種或更多種微丸或顆粒計量、混合和填充到小瓶或其它合適容器中。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述干燥通過選自如下的方法進(jìn)行:凍干法、常壓冷凍干燥、流化床干燥、真空轉(zhuǎn)鼓干燥、攪拌冷凍干燥、振動冷凍干燥、微波冷凍干燥。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的組合物，其中所述抗原選自減毒活和滅活的全病毒，或病毒的抗原組分，所述病毒如脊髓灰質(zhì)炎、流感病毒、輪狀病毒、巨細(xì)胞病毒、甲型和乙型肝炎，全細(xì)菌、細(xì)菌蛋白或多糖抗原、綴合或非綴合的，如流感嗜血桿菌、腦膜炎球菌多糖、破傷風(fēng)、白喉、細(xì)胞性和非細(xì)胞性百日咳、肉毒中毒、炭疽熱和艱難梭菌。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的組合物，其中所述抗原選自源自流感嗜血桿菌的綴合或非綴合的多糖抗原或抗原制劑，和源自艱難梭菌的蛋白抗原或抗原制劑。11.一種包含一種或多種抗原的穩(wěn)定的干態(tài)疫苗組合物，所述組合物為通過權(quán)利要求1-10中一項或多項的方法獲得的直徑為200μπι-1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒形式。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中各規(guī)則球狀微丸或顆粒進(jìn)一步包含僅一種抗原，或其中各規(guī)則球狀微丸或顆粒包含一種或多種不同類型的抗原。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中各規(guī)則球狀微丸或顆粒還包含佐劑，或其中所述佐劑包含于獨立的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒中。14.一種制備疫苗的方法，所述方法包括在水溶液中將權(quán)利要求11-13中的組合物重組的步驟，其中所述水溶液任選包含佐劑。15.-種制備佐劑的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒的方法，其包括：-用包含單糖、寡糖和/或糖醇或其混合物的水溶液稀釋包含一種或多種佐劑的液態(tài)原液佐劑溶液或乳液，以獲得所得稀釋的佐劑溶液或乳液中單糖、寡糖和/或糖醇含量為2%(w/v)至溶解極限，-使已稀釋的佐劑溶液或乳液制粒，所述制粒為層流射流破碎技術(shù)，以形成直徑為200μm-1500ym的規(guī)則液滴，-在冷凍劑中或低溫室中冷凍所述規(guī)則液滴，以形成冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒，-干燥所述冷凍的規(guī)則球狀微丸或顆粒以形成直徑為200Μ?-1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒，和-任選將所述微丸或顆粒填充到小瓶或其它合適容器中。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述佐劑選自脂質(zhì)體、脂質(zhì)和去污膠束、病毒顆粒、蛋白螺旋體、聚合物納米顆粒和微粒、可溶性聚合物、蛋白顆粒、礦物凝膠、礦物微粒和納米顆粒、聚合物/鋁納米雜化體、水包油和油包水乳液、皂角苷提取物、細(xì)菌細(xì)胞壁提取物和天然免疫受體的刺激劑。17.-種穩(wěn)定的干態(tài)佐劑組合物，所述組合物為通過權(quán)利要求15或16的方法獲得的直徑為200μπι-1500μπι的干態(tài)規(guī)則球狀微丸或顆粒形式。18.-種試劑盒，其包括含有如權(quán)利要求17所述的穩(wěn)定的干態(tài)佐劑組合物的容器。19.一種疫苗試劑盒，所述疫苗試劑盒包括：-第一容器和第二容器，所述第一容器包含權(quán)利要求11-13所述的穩(wěn)定的干態(tài)疫苗組合物，所述第二容器包含用于重組的水溶液；-第一容器和第二容器，所述第一容器包含權(quán)利要求11-13所述的穩(wěn)定的干態(tài)疫苗組合物，所述第二容器包含用于重組的水溶液，所述水溶液包含佐劑;或-第一容器、第二容器和第三容器，所述第一容器包含權(quán)利要求11-13所述的穩(wěn)定的干態(tài)疫苗組合物，所述第二容器包含用于重組的水溶液，所述第三容器包含權(quán)利要求17所述的佐劑組合物?！疚臋n編號】A61P31/04GK105944095SQ201610217192【公開日】2016年9月21日【申請日】2009年3月2日【發(fā)明人】P.舒韋,A.弗朗孔【申請人】賽諾菲巴斯德有限公司