牛蒡子提取物及其制備方法與在抑菌中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛蒡子提取物，其制備方法為：取牛蒡子，粉碎；按固液比1:6～10的比例加入65～80％乙醇溶液，60℃±5℃水浴中浸提1.5～2.5小時，抽濾，濾渣在同樣條件下再浸提1.5～2.5小時，抽濾；合并兩次的濾液，蒸發(fā)濃縮，加入無水乙醇，密封靜置18～24小時，再次抽濾，冷凍干燥得粉末，即為牛蒡子提取物。實驗證明，本發(fā)明的牛蒡子提取物對大腸桿菌O157：H7、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、耶爾森氏菌屬、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等各種食源性致病菌均具有顯著的抑制作用，可以用于制備抑菌制劑。
【專利說明】
牛蒡子提取物及其制備方法與在抑菌中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及牛蒡子提取物，及其制備方法，以及其在抑菌中的應用。
【背景技術】
[0002] 牛蒡作為一種在野外自然生長的稀有植物，之前很少有研究者去關注它，因此，幾 乎沒有被人研究其成分，也沒有人知道它的價值，對它的開發(fā)以及利用就更是少之又少了。 但是，隨著現(xiàn)代科學的發(fā)展，人們對牛蒡的研究也在不斷地深入，它的營養(yǎng)及藥理價值也逐 漸地被人們所了解，牛蒡也漸漸地得到了大面積的種植，在我國，牛蒡的種植面積已經(jīng)高達 2.33多萬公頃。
[0003] 牛蒡子是牛蒡成熟后經(jīng)過干燥的種子，最早在《本草圖經(jīng)》中曾有記錄，它有很多 別稱，如大力子、惡實、蝙蝠刺、夜叉頭等。牛蒡在東北三省的產(chǎn)量非常大，被人們稱為"關力 子"，它在全國各地均有銷售，甚至有的出口國外。產(chǎn)者質(zhì)佳的屬浙江桐鄉(xiāng)，稱作"杜大力"， 主要銷往浙江和江蘇。其它的產(chǎn)地大多是自產(chǎn)自銷。國外主要分布在歐洲、日本、阿富汗、印 度、伊朗等國。
[0004] 牛蒡子中含有多種營養(yǎng)成分，羅永明等對牛蒡子中的揮發(fā)油成分進行了詳細的實 驗研究以及分析，其結果顯示了其中含有66物質(zhì)，大約在揮發(fā)油總量的比例中占90.8%，主 要物質(zhì)組成是S-胡薄荷酮和R-胡薄荷酮，S-胡薄荷酮含量為7.59%，R-胡薄荷酮的含 量為17.38%。牛蒡子中含量最多的是木脂素，牛蒡苷、羅漢松酯素、牛蒡苷元以及拉帕酚素 等都屬于木脂素，這些成分中含量最高的是牛蒡子苷，其分解后的最多的物質(zhì)是牛蒡子苷 元。除了以上成分外，牛蒡子中的營養(yǎng)成分還有蛋白質(zhì)和油脂等成分，蛋白質(zhì)的含量大約有 24.7 %，油脂的含量大約有26.1 %。油脂中的成分也是多樣的，有棕櫚酸、油酸、硬脂酸、亞 麻酸、亞油酸等，這些成分物質(zhì)中，亞油酸的含量最高，其次是油酸和亞麻酸，并且這些油脂 中不飽和脂肪酸的含量非常高，就亞油酸而言已經(jīng)占一半以上了。
[0005] 現(xiàn)代科學研究表明，牛蒡子具有多種藥理作用和臨床應用，簡介如下：
[0006] ( - )抗腫瘤作用
[0007] (1)抗乳腺癌作用
[0008] Hirose等進行哺乳動物的乳腺癌誘發(fā)的實驗研究，其結果顯示，空白組和給使用 牛蒡子實驗組的哺乳動物相比較，在乳腺癌誘發(fā)率上的差異幾乎是有，但是對其有明顯的 降低作用的是在發(fā)病的多樣性和復雜性上。
[0009] (2)抗皮膚癌作用
[0010] Takasaki M等對牛蒡子進行了一系列的實驗，對其牛蒡子苷元和牛蒡子苷做了很 好的研究，尤其是對其抗癌效果及作用做了詳細的研究，最終得出的結論是牛蒡子苷不具 有生物活性，然而牛蒡子苷元卻具有生物活性。
[0011] (3)抗肝癌作用
[0012] Kato T等也對牛蒡子進行了一系列的實驗研究，最終研究結果顯示牛蒡子苷對肝 臟的癌變具有一定的保護作用，只不過其作用非常的微弱。然而Moritani S等也對抗肝癌 做過研究，它在實驗中得出對小鼠的肉瘤細胞以及人肝癌細胞，牛蒡子苷元和牛蒡子苷它 們兩個均表現(xiàn)出了很強的毒性，然而對肝腸的細胞而言，幾乎沒有表現(xiàn)出其毒性，通過體內(nèi) 試驗研究，結果表明，牛蒡子的浸膏所具有的活性和牛蒡子苷元的所具有的抗肝癌的活性 相互比較而言，他們幾乎是一樣的，對抗肝癌的效果研二，它們所具有的這種活性成分是非 常有用的。
[0013] ⑷抗白血病作用
[0014] 米靖宇等通過使用MTT的研究方法對牛蒡子苷元和牛蒡子苷的抗白血病是否具有 活性進行研究。最終的結論是牛蒡子苷對抗白血病沒有很好效果，然而牛蒡子苷元的實驗 結果與其恰好相反，它對白血病的細胞株的抑制活性非常好，和目前醫(yī)院所對白血病人使 用的一些抗白血病的藥物的藥性相比較，發(fā)現(xiàn)和他們的活性幾乎差不多。而且還做染色排 除的一些試驗研究，最終可發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元對HL-60細胞的生長的抑制，是以無毒的機理來 進行的，可能真正起作用的是它可以使白血病的細胞停止合成DNA和RNA以及相關蛋白質(zhì)。
[0015] (二)抗糖尿病作用
[0016] 賀學林等也對抗糖尿病做了相關的實驗，主要研究的是對患糖尿病大鼠腎臟的早 時期所存在的病變，牛蒡子是否對此具有一定的防治作用。研究最后看出對患糖尿病的大 鼠，牛蒡子可以對其的一些癥狀有非常顯著的緩解，腎重與質(zhì)量之間的比值都有所減少，而 且還減少了尿白蛋白的排出比率，對腎臟的病理性傷害有了很大程度上的降低。所有的實 驗數(shù)據(jù)分析顯示，在某種程度上對糖尿病早時期腎臟的防治有很好的效果。
[0017](三)免疫調(diào)節(jié)及抗炎的作用
[0018] 牛蒡子苷元對腫瘤壞死的因子的產(chǎn)生的研究分析，以及對淋巴的增殖和免疫的調(diào) 節(jié)作用的研究分析，發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元能夠?qū)Ω蓴_素-γ的信號所導致的NO釋放起到一定程 度的抑制作用，但是對脂多糖引起的產(chǎn)生的NO有非常的增大。最后的研究結論分析，牛蒡子 苷元對一些活性巨噬細胞以及一些淋巴細胞的增殖，可能是用調(diào)節(jié)其免疫應答來進行起作 用的。
[0019] (四）抗病毒的作用
[0020] (1)抗HIV-I 的作用
[0021]在體內(nèi)試驗時，最后結論顯示了對已經(jīng)感染了HIV-I病毒的人體細胞體系中的病 毒應答，牛蒡子苷元對其是作為一種抑制劑。在別的實驗研究中，在體外的牛蒡子苷元顯示 出一種非常強烈的抑制效果，是在對HIV-I病毒蛋白的表達方面;也對其分子存在的機理做 了詳細的研究，目前人們認為有關活性抑制劑應該是核基質(zhì)，認為被病毒感染的細胞的酶 抑制的活性更強。
[0022] (2)抗流感的作用
[0023]高陽等人對ARC-G做了一些實驗，其研究在抗甲I型流感病毒的方面，結果發(fā)現(xiàn)了 ARC-G對離體的胸主動脈、大鼠氣管及豚鼠的氣管有一定的松弛作用，是因為抑制了細胞外 的鈣向內(nèi)流入，細胞內(nèi)的鈣進行釋放而引起的，牛蒡子在體外有很強的抗甲I流感病毒的作 用。
[0024]牛蒡子的臨床應用，簡介如下：
[0025] ( - )風熱感冒
[0026] 牛蒡子與桔梗、金銀花、薄荷、連翹、甘草等可以一同被人們所食用，對疏散身體的 風熱以及宣清肺利咽喉有很好的治療效果，常用于對風熱引起的感冒以及咽喉腫痛等癥狀 的治療。
[0027] (二)肺熱喘咳、陰虛火旺
[0028] 牛蒡子與麻黃、杏仁、石膏、黃芩等辛涼清肺藥物一同被食用，能夠很好的宣肺利 膈、祛痰止咳，對肺熱而引起的喘咳癥狀的療效很好。牛蒡子與一些合適的藥物相搭配食 用，對經(jīng)?？人圆⑶覛獯粩?、陰虛火旺等這類癥狀具有非常好的療效。
[0029](三)鼻竅不通
[0030] 牛蒡子具有疏散風熱、辛涼解表、解毒利咽、消腫等相關功效，可單一食用或者與 其他藥物搭配，對各種鼻炎以及鼻竇炎都有非常不錯的治療效果。
[0031] (四）痄腮喉痹、癰腫瘡毒
[0032] 牛蒡子能夠?qū)ν鈹U散其熱量、對內(nèi)排除其毒素、清熱身體多余的熱量，對身體的毒 素有解除作用，因此能夠?qū)︼L熱的外部襲擊、毒火在內(nèi)淤結所帶來的癰腫瘡毒的癥狀，它可 以對其有很好的改善作用。牛蒡子和一些適宜的藥物一起被人們食用，對痄腮、喉痹都有一 定的治療效果。
[0033](五）神經(jīng)病變
[0034] 牛蒡子的功效很多，如果頭面部位有了風火，它可以幫助其得以上宣下泄、順暢調(diào) 節(jié)氣血、邪火也有了排除的通道。牛蒡子與其他的一些藥物在一起相互組合食用，對周圍性 的神經(jīng)性麻痹癥狀和三叉神經(jīng)疼痛癥狀都可以起到治療的作用。
[0035] (六)小兒流涎
[0036] 有人曾經(jīng)用牛蒡子與其他療效相近的藥物組合，牛蒡子通過炒至焦，并且和這些 藥物一起熬煎，把其當作茶水給一個大約2歲左右的小孩來飲用，用到兩付此藥，小孩的流 涎之癥狀被治療并且痊愈。
[0037](七)小兒積滯
[0038]曾有人給一個因為厭食而拒絕食用食物的3歲小男孩進行了治療，他只用牛蒡子 一種藥物，將其炒至表皮變的焦黃，然后加水煎熬，小孩將其食用了一天，然后重新去醫(yī)院 復查，發(fā)現(xiàn)腹脹已經(jīng)被消除了。
[0039](八)便秘
[0040]牛蒡子具有降氣下行、潤腸通便等功效，可用于治療習慣性便秘、血虛便秘、氣滯 便秘等癥狀。對于咽喉腫痛、癰腫瘡瘍、風熱癢疹等病癥所引起的大便干結，造成便秘，可以 與連翹、浮萍等藥物一起煎藥食用。
[0041]植物源殺菌劑，是目前的研究熱點之一，開發(fā)一種新型的植物源殺菌劑具有重要 的價值和意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0042]針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明制備了牛蒡子提取物，并對牛蒡子提取物的抑菌性能 進行了研究。本發(fā)明為天然性植物抑菌劑的研究提供了理論和實踐的依據(jù)，對于新型天然 抑菌先導化合物的研究提供了理論依據(jù)，研究結果對其具有一定的理論價值。
[0043] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0044] 牛蒡子提取物，是通過以下方法制備得到的：取牛蒡子，粉碎；按固液比1:6~10 (單位g:ml)的比例加入65~80 %乙醇溶液(體積百分數(shù)），60 °C ± 5°C水浴中浸提1.5~2.5 小時，抽濾，濾渣在同樣條件下再浸提1.5~2.5小時，抽濾;合并兩次的濾液，40°C以下蒸發(fā) 濃縮，加入無水乙醇，密封靜置18~24小時(沉淀糖），再次抽濾，得牛蒡子提取液，冷凍干燥 得粉末，即為牛蒡子提取物。
[0045] 優(yōu)選的，粉碎至顆粒直徑在0.1_。
[0046] 所述牛蒡子提取物，在抑制大腸桿菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、耶爾森氏菌、 腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌或/和副溶血性弧菌中的應用。
[0047] 所述牛蒡子提取物，在制備抑制大腸桿菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、耶爾森 氏菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌或/和副溶血性弧菌的制劑中的應用。
[0048] 本發(fā)明以牛蒡子為原料，采用濾紙片法、96孔板法和菌落總數(shù)法對牛蒡子提取物 抑菌作用進行了初步研究，同時用牛津杯法研究了紫外照射、PH值、熱處理、金屬離子對提 取物抑菌性能的影響。研究結果顯示，牛蒡子提取物對大腸桿菌〇157:H7、銅綠假單胞菌、單 增李斯特菌、耶爾森氏菌屬、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等各種食源性 致病菌均具有顯著的抑制作用。以單增李斯特菌、大腸桿菌0157 :H7、腸炎沙門氏菌和金黃 色葡萄糖菌為受試菌，PH對牛蒡子提取液的抑菌效果沒有顯著的影響，經(jīng)60°C處理30min、 121°C高壓處理15min，提取物仍均有明顯抑菌效果，紫外照射15min，30min，以及加入不同 金屬離子后，提取物仍有較顯著的抑菌效果。結論:牛蒡子具有良好的抑菌效果和抑菌穩(wěn)定 性。
【附圖說明】
[0049] 圖I :pH對提取物抑菌效果的影響。
[0050] 圖2:熱處理對提取物抑菌效果的影響。
[0051 ]圖3:紫外照射對提取物抑菌效果的影響。
[0052]圖4:金屬離子對提取物抑菌效果的影響。
【具體實施方式】
[0053]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0054]下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術中已有 的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢 測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法等。
[0055]實施例1牛蒡子提取物的抑菌作用研究 [0056] 1 · 1實驗材料
[0057] 1 · 1 · 1實驗原料
[0058] 柳川理想牛蒡子，購買于江蘇省徐州市豐縣。
[0059] 1.1.2供試菌種:如表1所示。
[0060] 表1供試菌種
[0066] 1.1.4實驗儀器:如表3所示。
[0067]表3實驗儀器
[0070] 1.2實驗方法
[0071] 1.2.1牛蒡子提取液的制備
[0072] 取足夠量的干燥柳川理想牛蒡子，用粉碎機粉碎至粉末狀（用粉碎機粉碎到顆粒 直徑在0.1mm;顆粒太大，提取率不高，也不利于有效成分溶出；顆粒太小，各種雜質(zhì)的溶出 度也會增高，而且不利于過濾、濃縮和分離）；稱取30克粉末狀的牛蒡子，用量筒準確量取 240mL70 %乙醇，加入500mL燒杯中，配成料液比為1:8的混合液，于60°C水浴中浸提2h(在浸 提時注意密封防止乙醇揮發(fā)）后抽濾，濾渣在同樣條件下再浸提2h，合并兩次濾液，40°C以 下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮（真空度為O.IMPa，溫度為35°C)，至50mL后加入無水乙醇 400mL，密封靜置18~24h沉淀糖，再次抽濾，所得液體即為牛蒡子提取液，先放在冰箱冷凍 至固體，再放于冷凍干燥機里冷凍干燥24h至干燥粉末，保持干燥，保存?zhèn)溆谩?br>[0073] 1.2.2菌懸液的制備
[0074]所有供試菌種在含有20 %甘油的TSB甘油管中，放于-20 °C冰箱中冷凍保存。實驗 時，取出TSB甘油管放于在無菌操作臺中，用無菌移液槍從其中取其原菌液，將其接種于已 制備好的無菌TSB的試管中，對于每種受試菌分別接于兩支試管，將其置于37°C的生化恒溫 培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18~24h。然后挑選取出菌液生長較好的試管，使用劃線方式接種于TSA中， 置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24h，然后挑取其中生長較好的單菌落，將其接種于裝有TSB的 試管中培養(yǎng)18~24h，然后保存在4°C冰箱中。每次實驗時取0.5mL菌懸液于裝有4.5mL無菌 生理鹽水的試管中，稀釋10倍，使其菌液濃度約保持在IO 8CFUAiL~109CFU/mL。
[0075] 1.2.3最大抑菌圈直徑
[0076] 該實驗采用濾紙片法測定最大抑菌圈直徑。首先，菌懸液的涂布，將TSB培養(yǎng)基倒 于培養(yǎng)皿中，待其完全冷卻凝固后，將培養(yǎng)好的新鮮菌液，稀釋三個梯度，用移液槍分別移 取IOOyL菌懸液，用涂布器將其在平皿培養(yǎng)基上均勻涂布。其次，濾紙片的貼放，將無菌并在 lOmg/mL牛蒡子提取液中浸泡6h后的濾紙樣片用無菌鑷子貼放于培養(yǎng)基表面，每個平板均 勻的貼放5片濾紙片，然后用無菌鑷子輕輕傾乳樣片，使其緊貼于平皿培養(yǎng)基表面。每個樣 品做三個平行，實驗重復三次，蓋好平皿，放于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時觀察結果。最 后，最大抑菌圈直徑的測量，采用十字交叉法，測量抑菌圈的直徑，使用直尺(包括貼片直徑 6mm)，并記錄實驗數(shù)值，取平均值。
[0077] 1.2.4最低抑菌濃度
[0078]用二甲基亞諷配制成 10mg/mL、5mg/mL、2 · 5mg/mL、1 · 25mg/mL、0 · 625mg/mL、 0 · 3125mg/mL、0 · 15625mg/mL、0 · 07815mg/mL的牛蒡子提取液。用TSB將新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌 0157:H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌濃度分別稀釋至61og CFU/mL。于 96孔板各孔中分別加入受試TSB菌液20uL，20uL牛蒡子二甲基亞砜提取液和120mLTSB，每個 濃度做三個平行實驗，96孔板置于37 °C培養(yǎng)24h后，在每個孔中加入4(^濃度為0.4mg/mL碘 硝基四唑紫（INT)，之后于37°C培養(yǎng)40min后記錄各提取物最低抑菌濃度(如樣液顯示紅色 則表示其無抑菌作用）。
[0079] 1.2.5菌落總數(shù)的測定
[0080]以新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌0157: H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌 為受試菌，分別接種各病原菌〇.5mL(5-61og CFU/mL)于生理鹽水中，使抑菌體系中微生物 初始濃度約為4_51og CFU/mL。加入50mg提取物粉末，使提取物濃度為5mg/mL，同時做一組 空白實驗。各培養(yǎng)液分別于0、1、3、5、7、12和24h測定菌落總數(shù)。在每個測定時間點，各取 0.5mL培養(yǎng)液采用生理鹽水行系列梯度稀釋，然后取IOOyL各適宜濃度稀釋液涂布于與其相 應培養(yǎng)基平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~24h，菌落總數(shù)計數(shù)法測定各培養(yǎng)液中的微生物 濃度。每個提取液實驗濃度做3個平行，每個實驗重復3次。
[00811 1.2.6 pH值對提取物抑菌效果的影響
[0082] 分別用檸檬酸和氫氧化鈉配制pH = 3 · 5、4 · 8、8 · 3、9 · 9的二甲基亞砜溶液和5mg/mL 二甲基亞砜提取液。用TSB將新鮮培養(yǎng)大腸桿菌0157: H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金 黃色葡萄球菌濃度分別稀釋至61og CFU/mL。在無菌操作環(huán)境下，將TSA固體培養(yǎng)基倒入培 養(yǎng)皿，用移液槍分別移取各菌懸液100μΙ，涂布器涂布均勻。采用牛津杯法，將牛津杯消毒殺 菌后每個培養(yǎng)皿加4個牛津杯，將上述溶液用移液器移入IOOuL于牛津杯中，蓋好培養(yǎng)皿，每 個平板做三個平行實驗，放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時觀察結果。
[0083] 1.2.7熱處理對提取物抑菌效果的影響
[0084] 將5mg/mL牛蒡子二甲基亞砜提取液分別在60 °C下熱處理30min和121°C高壓熱處 理15min，用TSB將新鮮培養(yǎng)大腸桿菌0157: H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球 菌濃度分別稀釋至61og CFU/mL。在無菌操作環(huán)境下，將TSA固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，用移液 槍分別移取各菌懸液100μΙ，涂布器涂布均勻。采用牛津杯法，將牛津杯消毒殺菌后每個培 養(yǎng)皿加4個牛津杯(注意做一個二甲基亞砜的和沒有處理過的牛蒡子提取液的對照實驗）， 將上述溶液用移液器移入IOOuL于牛津杯中，蓋好培養(yǎng)皿，每個平板做三個平行實驗，放入 37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時觀察結果。
[0085] 1.2.8紫外照射對提取物抑菌效果的影響
[0086]在無菌操作環(huán)境下，將5mg/mL牛蒡子二甲基亞砜提取液在紫外燈下分別照射 15min，30min，用TSB將新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌0157: H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色 葡萄球菌濃度分別稀釋至61og CFU/mL。在無菌操作環(huán)境下，將TSA固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿， 用移液槍分別移取各菌懸液1〇〇μ1，涂布器涂布均勻。采用牛津杯法，將牛津杯消毒殺菌后 每個培養(yǎng)皿加3個牛津杯，將上述溶液用移液器移入IOOuL于牛津杯中，蓋好培養(yǎng)皿，每個平 板做三個平行實驗，放入37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時觀察結果。
[0087] 1.2.9金屬離子對提取物抑菌效果的影響
[0088] 實驗前配制二甲基亞砜、5mg/mL的二甲基亞砜提取液、提取液Na'提取液Ca2+提取 液Fe3+、提取液Zn2+等六份溶液，在無菌操作環(huán)境下，將TSA固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，用移液 槍分別移取各菌懸液100μΙ，涂布器涂布均勻。采用牛津杯法，將牛津杯消毒殺菌后每個培 養(yǎng)皿加6個牛津杯，將上述六份溶液用移液器移入IOOuL于牛津杯中，蓋好培養(yǎng)皿，每個平板 做三個平行實驗，放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時觀察結果。
[0089] 2結果與分析
[0090] 2.1牛蒡子提取物對食源性致病菌的抑制作用
[0091 ] 2.1.1牛蒡子提取物對食源性致病菌的最大抑菌圈直徑:如表4所示。
[0092]表4牛蒡子提取物對食源性致病菌最大抑菌圈直徑
[0095]從表4中可以看出，不同濃度牛蒡子提取液對各種食源性致病菌的生長均表現(xiàn)出 良好抑制作用，也可以看出對不同菌有著不同的抑制效果。抑制效果最好的是G+單增李斯 特菌的最大抑菌圈直徑為22.3mm，其次G-大腸桿菌0157:H7的最大抑菌圈直徑為22.9mm，對 G-惡臭假單胞菌、G-銅綠假單胞菌、G-耶爾森氏菌屬抑菌效果很微弱，然而對G+的食源性致 病菌在一定程度上均有較好的抑制效果，通過實驗數(shù)據(jù)看出G+和G-的各種食源性致病菌的 抑菌效果參差不齊。整體來說牛蒡子提取液對G+菌屬的抑制效果優(yōu)于對G-。
[0096] 2.1.2牛蒡子提取物對食源性致病菌的最低抑菌濃度
[0097]選擇食品中最常見的大腸桿菌0157 : H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡 萄球菌4種菌為受試菌，進行MIC實驗:結果如表5所示。
[0098]表5牛蒡子提取物對食源性致病菌的最低抑菌濃度
[0100]通過實驗數(shù)據(jù)得出：牛蒡子提取液對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，MIC為 0.3125mg/mL。其次為單增李斯特菌，MIC為2.5mg/mL。大腸桿菌0157 :H7和腸炎沙門氏菌抑 制效果最差，MIC為5mg/mL。
[0101] 2.1.3菌落總數(shù)法測定其抑菌效果
[0102] 選擇食品中最常見的大腸桿菌0157 :H7、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌3種菌為 受試菌，進行實驗:結果如表6所示。
[0103] 表6菌落總數(shù)的測定
[0105] 從上表實驗數(shù)據(jù)分析得出：在空白實驗的對照下，除去菌的自然死亡，牛蒡子提取 物對大腸桿菌抑制效果最好，其次是金黃色葡萄球菌。可得出牛蒡子提取液內(nèi)含有抑菌活 性物質(zhì)。
[0106] 2.2牛蒡子提取物的抑菌穩(wěn)定性
[0107] 2.2.1 pH對提取物抑菌效果的影響
[0108] 選取大腸桿菌0157 :H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌這四種菌 為受試菌，將相同PH值下二甲基亞砜溶液與牛蒡子提取物的抑菌效果做比較，結果如圖1所 示。通過空白對照實驗，pH=3.5對于四種提取液抑菌有一定的促進作用，pH=4.8對大腸桿 菌0157 :H7和腸炎沙門氏菌抑制效果不明顯，pH=8.3對抑菌略微有促進作用，pH=9.9對抑 菌效果略微有抑制作用。通過最大抑菌圈直徑法，從數(shù)據(jù)中可以得到牛蒡子提取物對各致 病菌的抑制作用并不僅僅是PH值的影響，原因是提取液中的活性物質(zhì)發(fā)揮了抑菌作用。
[0109] 2.2.2熱處理對提取物抑菌效果的影響
[0110] 結果如圖2所示。牛蒡子提取物經(jīng)60°C下熱處理30min與空白實驗做對照后看出其 仍具有較好的抑菌活性，且與未經(jīng)處理的提取物抑菌效果相當，與對照組相比較，其可以明 顯抑制大腸桿菌0157 :H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的生長。牛蒡葉提取 物經(jīng)121°C高壓熱處理15min后，與對照組相比較，其抑菌活性略有下降，但仍能明顯的抑制 大腸桿菌〇157:H7、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的生長。以上實驗結果 表明牛蒡葉提取物具有較好的熱穩(wěn)定性。
[0111] 2.2.3紫外照射對提取物抑菌效果的影響
[0112] 如圖3所示。結合圖形，可以看出牛蒡子提取物在紫外燈下分別照射15min，30min 之后其抑菌效果還是很好，尤其是對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制作用幾乎是沒 有任何影響的，與未經(jīng)處理的提取物抑菌效果差不多一致。整體來說，牛蒡子提取物在紫外 照射后，仍可明顯的抑制大腸桿菌0157 :H7、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特 菌。以上結果表明，紫外照射對提取物抑菌效果沒有顯著性影響。
[0113] 2.2.4金屬離子對提取物抑菌效果的影響
[0114]在牛蒡子提取物中分別加入金屬離子Na+、Ca2+、Fe3+、Zn2+，實驗發(fā)現(xiàn)其抑菌活性在 不同程度上都有所變化（如圖4所示），與對照組相比較，可以非常明顯表現(xiàn)出對大腸桿菌 0157:H7、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的影響，雖然影響程度大小不一。 Na+對四種菌的抑菌效果都有一定的促進作用;Ca2+對四種菌有略微的限制;Fe3+和Zn 2+對大 腸桿菌0157 :H7和腸炎沙門氏菌也有所促進效果，對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌有所 抑制但不是很明顯，抑菌效果還是不錯的。
[0115] 結論:確定牛蒡子提取液對大腸桿菌0157: H7、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、耶爾 森氏菌屬、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等各種食源性致病菌的抑制作 用。
[0116] 以單增李斯特菌、大腸桿菌0157 :H7、腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄糖菌為受試菌， pH對牛蒡子提取液的抑菌效果沒有顯著的影響，經(jīng)60°C處理30min、121°C高壓處理15min， 提取物仍均有明顯抑菌效果，紫外照射15min，30min，以及加入不同金屬離子后，提取物仍 有較顯著的抑菌效果。牛蒡子具有良好的抑菌效果和抑菌穩(wěn)定性。
【主權項】
1. 一種牛蒡子提取物的制備方法，其特征在于:取牛蒡子，粉碎;按固液比1:6~10的比 例加入65~80%乙醇溶液，60°C ±5°C水浴中浸提1.5~2.5小時，抽濾，濾渣在同樣條件下 再浸提1.5~2.5小時，抽濾;合并兩次的濾液，蒸發(fā)濃縮，加入無水乙醇，密封靜置18~24小 時，再次抽濾，得牛蒡子提取液，冷凍干燥得粉末，即為牛蒡子提取物。2. -種利用權利要求1所述的制備方法制備得到的牛蒡子提取物。3. 權利要求2所述的牛蒡子提取物在抑制大腸桿菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特菌、耶 爾森氏菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌或/和副溶血性弧菌中的應用。4. 權利要求2所述的牛蒡子提取物在制備抑制大腸桿菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特 菌、耶爾森氏菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌或/和副溶血性弧菌的制劑中的應用。
【文檔編號】A61K36/28GK105963334SQ201610422933
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】賀菊萍, 張晨, 鄭欣宇
【申請人】徐州工程學院