專利名稱：牛蒡苷元的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥牛蒡子提取物牛蒡苷元的醫(yī)藥用途，特別是牛蒡苷元在制備治療癌癥方面的用途，屬于化合物的治療活性領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌癥是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。癌癥與心腦血管疾病和意外事故一起，構(gòu)成當(dāng)今世界所有國(guó)家三大死亡原因。因此，世界衛(wèi)生組織和各國(guó)政府衛(wèi)生部門都把攻克癌癥列為一項(xiàng)首要任務(wù)。世界上治療癌癥的方法主要有三種，一是采用手術(shù)切除法，切除病變組織，防止癌細(xì)胞擴(kuò)散；二是采用化療或放療，以殺死癌細(xì)胞 ’三是用藥物治療。采用手術(shù)切除的方法增加了病人的痛苦，傷其元?dú)?，費(fèi)用巨大。用化療或放療的方法，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也傷及紅細(xì)胞和白細(xì)胞，病人苦不堪言。白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是一類起源于造血(或淋巴)干細(xì)胞的惡性疾病。由于干細(xì)胞受損，白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力，或者增值與分化能力不平衡，而停止在細(xì)胞發(fā)育的不同階段，具體表現(xiàn)為細(xì)胞在體內(nèi)無(wú)限增值，而其分化成熟和凋亡受阻。因此，白血病的治療可從三個(gè)方面入手誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞分化及干細(xì)胞移植重建造血功能。迄今白血病的治療仍主要采用傳統(tǒng)的聯(lián)合化療，但此療法副作用甚大，復(fù)發(fā)率高，尤其對(duì)機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有較大的損害。牛蒡苷與牛蒡苷元均來(lái)源于牛蒡的干燥成熟果實(shí)牛蒡子，牛蒡苷活性很小，必須經(jīng)過(guò)代謝轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元才能被人體吸收，而牛蒡苷元是可以被人體直接吸收的有效成分。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道牛蒡苷元具有如下藥理活性1)抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用；2)抗病毒作用，包括HIV-I與流感病毒；3)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用；4)腎病及糖尿病、糖尿病并發(fā)癥治療作用；5)熱休克反應(yīng)抑制作用；6)神經(jīng)保護(hù)作用；7)擴(kuò)張血管作用；8)血小板活化因子拮抗作用；9)抗老年性癡呆的作用；10)抑制K+攣縮的作用等。比如，Cho J Y，et al. Immunomodulatory effect of arctigenin, a lignan compound on tumor necrosis factor-α and nitric oxide production, and lymphocyte proliferation[J]. J Pharm Pharmcol. 1999 ；51 (11) :1267-1273.公開(kāi)了牛蒡苷元具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用；Gao Y， et al. Activity of in vitro anti-influenza virus of arctigenin[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs (中草藥).2002 ;33 (8) :724-726.公開(kāi)了牛蒡苷元具有抗病毒的作用；Kim S H, et al. Hepatoprotective dibenzylbutyrolactone lignans of Torreya nucifera against CC14-induced toxicity in primary cultured rat hepatocytes[J], Biol Pharm Bull. 2003 ；26 (8) :1202-1205.公開(kāi)了牛蒡苷元具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

發(fā)明內(nèi)容
惡性腫瘤細(xì)胞在誘導(dǎo)分化劑作用下，可以向正?；蚪咏５募?xì)胞方向分化逆轉(zhuǎn)。癌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和分化治療作為腫瘤治療的一條新的途徑，近年來(lái)研究非?；钴S。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，在一些制劑誘導(dǎo)下，腫瘤細(xì)胞可發(fā)生分化，有的出現(xiàn)類似正常細(xì)胞的表型， 有的恢復(fù)了正常細(xì)胞的某些功能，這是對(duì)“一旦成為癌細(xì)胞，永遠(yuǎn)是癌細(xì)胞”的傳統(tǒng)觀念提出的有力挑戰(zhàn)，為抗腫瘤研究開(kāi)辟了一條嶄新的途徑。本發(fā)明的目的就是公開(kāi)牛蒡苷元在制備癌細(xì)胞或白血病細(xì)胞分化的藥物中的用途。形態(tài)學(xué)上的分化成熟是表明腫瘤細(xì)胞分化的標(biāo)志。發(fā)明人通過(guò)大量的體外試驗(yàn)意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)癌細(xì)胞與牛蒡苷元共同培養(yǎng)后，可明顯出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)向成熟方向轉(zhuǎn)化，細(xì)胞表現(xiàn)出核固縮，核漿比降低，核仁減少等特征。這個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)促使發(fā)明人將牛蒡苷元制備成癌細(xì)胞或白血病細(xì)胞分化的藥物。通過(guò)如下體外試驗(yàn)可以看出，牛蒡苷元可以誘導(dǎo)人源慢性髓性白血病細(xì)胞K562、 人源急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60、人源胃癌細(xì)胞SGC7901和人源肺癌細(xì)胞A549分化。具體地，在牛蒡苷元誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的試驗(yàn)中，無(wú)論是K562細(xì)胞，還是HL-60細(xì)胞，其與牛蒡苷元共同培養(yǎng)后，可出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)明顯向成熟方向轉(zhuǎn)化，細(xì)胞表現(xiàn)出體積減小，核染色質(zhì)濃縮，核漿比降低，核仁減少等特征，分化抗原試驗(yàn)表明，K562細(xì)胞向粒系方向分化，HL-60 向紅系、粒系方向分化。在牛蒡苷元誘導(dǎo)人源胃癌細(xì)胞SGC7901分化的試驗(yàn)中，經(jīng)牛蒡苷元處理后的SGC7901細(xì)胞由橢圓形轉(zhuǎn)變成長(zhǎng)圓形或近似菱形，細(xì)胞核漿比例下降等變化，細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，提示牛蒡苷元可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的分化。在牛蒡苷元誘導(dǎo)人源肺癌細(xì)胞A549分化的試驗(yàn)中，牛蒡苷元抑制A549細(xì)胞在軟瓊脂中形成集落的能力。并抑制A549細(xì)胞的DNA合成和有絲分裂，使細(xì)胞發(fā)生Gl/Go期阻滯，證明了牛蒡苷元對(duì)A549細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化的作用。一、牛蒡苷元誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化試驗(yàn)試驗(yàn)分組和給藥終濃度如下陰性對(duì)照組賦形劑牛蒡苷元A 組0. lymol/L牛蒡苷元B 組0. 5ymol/L牛蒡苷元C 組1.0ymol/L取常規(guī)培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人源慢性髓性白血病細(xì)胞K562、人源急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60，以2 X 105/ml接種于M孔板中，和分化誘導(dǎo)劑牛蒡苷元共同培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為RPMI 1640(含體積分?jǐn)?shù)為川^的胎牛血清)，〗？！^1^ C02，飽和濕度培養(yǎng)6天。 此后收集細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)的變化及其它分化指標(biāo)的檢測(cè)。取500 μ L新鮮配置含IOOg/ mlTPA的0. NBT溶液，分別與牛蒡苷元處理后的細(xì)胞懸液混合，37°C孵育30min后，離心去上清，沉淀涂片。胞質(zhì)含藍(lán)灰色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算NBT陽(yáng)性率。NBT陽(yáng)性率=(NBT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))X 100%。取牛蒡苷元作用后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1 X 106/ml，加入PE標(biāo)記的鼠抗人CDm單克隆抗體，混勻后室溫孵育20min，加入500 μ L PBS溶液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)2 X IO5個(gè)細(xì)胞中的抗原表達(dá)。(1)細(xì)胞形態(tài)變化陰性對(duì)照組Κ562細(xì)胞體積大，核大而明顯，核仁清楚，核質(zhì)比例大，經(jīng)牛蒡苷元處理6天后，Κ562細(xì)胞直徑和體積有進(jìn)一步變小的趨勢(shì)，核質(zhì)比減小，細(xì)胞向成熟方向分化較為明顯。具體參見(jiàn)

圖1-4。陰性對(duì)照組HL-60細(xì)胞體積大，外形不規(guī)則，且核大，染色質(zhì)疏松細(xì)致，可見(jiàn)多個(gè)核仁。經(jīng)牛蒡苷元處理后的HL-60細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞體積變小，核染色質(zhì)濃縮， 核質(zhì)比例變小，核質(zhì)呈灰藍(lán)色，原始細(xì)胞減少。具體參見(jiàn)圖5-8。(2) NBT還原能力的測(cè)定。0. 5 μ mol/L牛蒡苷元可顯著增高兩種白血病細(xì)胞的NBT 還原能力，其中HL-60細(xì)胞的變化較為顯著，NBT陽(yáng)性細(xì)胞從對(duì)照組的42%升高至57%，而 K562細(xì)胞NBT的陽(yáng)性率為36% (對(duì)照21% )，P值均< 0. 01，見(jiàn)圖9。(3)牛蒡苷元作用后細(xì)胞表面特異性分化抗原的變化。HL-60細(xì)胞與0. 5μπι01/ L牛蒡苷元作用后，我們檢測(cè)了細(xì)胞表面CDllb、CD13與CD14的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)牛蒡苷元可誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞向成熟粒、單細(xì)胞分化，細(xì)胞表面分化抗原⑶lib、⑶13與⑶14明顯高于對(duì)照組。K562細(xì)胞與牛蒡苷元作用后，粒系分化抗原CD15表達(dá)增強(qiáng)，而單核細(xì)胞系表面分化抗原⑶14表達(dá)無(wú)明顯變化，提示牛蒡苷元可能誘導(dǎo)K562細(xì)胞向粒系方向分化。參見(jiàn)表1、2。表1牛蒡苷元對(duì)HL-60白血病細(xì)胞分化抗原⑶lib、⑶13與⑶14表達(dá)的影響
權(quán)利要求
1.牛蒡苷元在制備促進(jìn)癌細(xì)胞分化的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，所述癌細(xì)胞是白血病細(xì)胞、胃癌細(xì)胞或肺癌細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，所述藥物是牛蒡苷元的微乳制劑，它含有牛蒡苷元、 微乳載體，微乳載體包含油相、乳化劑和助乳化劑，所述的微乳制劑的平均粒徑為15-90nm。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，所述藥物是含牛蒡苷元的口服液、膠囊、注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥牛蒡子提取物牛蒡苷元的醫(yī)藥用途，特別是牛蒡苷元在制備治療癌癥方面的用途，屬于化合物的治療活性領(lǐng)域。通過(guò)體外試驗(yàn)可以看出，牛蒡苷元可以誘導(dǎo)人源慢性髓性白血病細(xì)胞K562、人源急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60、人源胃癌細(xì)胞SGC7901和人源肺癌細(xì)胞A549的分化。
文檔編號(hào)A61K9/00GK102342928SQ201010241038
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者姚景春, 趙志全 申請(qǐng)人:山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司