一種超臨界流體技術(shù)制備共載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種超臨界流體技術(shù)制備共載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球的方法，先通過(guò)離子凝膠法制備載基因藥物的殼聚糖納米顆粒，將其分散于碳酸氫銨溶液中作為水相，將聚乳酸溶解于二氯甲烷中作為油相，同時(shí)在油相中加入多肽類藥物攪拌均勻，加入致孔劑和乳化劑后，通過(guò)超聲乳化形成油包水的乳懸液，將該乳懸液以一定的速率經(jīng)過(guò)噴嘴壓入到特定參數(shù)的超臨界流體CO2中，經(jīng)過(guò)超臨界流體抗溶劑過(guò)程即可得到共載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球具有較好空氣動(dòng)力學(xué)性能，有望實(shí)現(xiàn)藥物之間的協(xié)同作用，在癌癥與糖尿病等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
一種超臨界流體技術(shù)制備共載基因與多肽類藥物的微鑲納多 孔微球的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療器械及生物醫(yī)藥載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種超臨界流體技術(shù)制 備共載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 憑借肺部獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)(表面積大、血流量快、代謝反應(yīng)少）、對(duì)藥物吸收轉(zhuǎn) 運(yùn)的高效性、以及對(duì)蛋白質(zhì)和多肽類藥物生物利用度高的優(yōu)勢(shì)，肺部吸入給藥體系兼具肺 部靶向治療(如哮喘、肺癌及慢性阻塞性肺病)和全身性疾病的有效調(diào)控功能（如治療糖尿 病、骨質(zhì)疏松及免疫調(diào)節(jié)等），已成為一種功能卓越、前景誘人的給藥途徑。
[0003] 多孔微球作為一種載體，可以將藥物有效的運(yùn)送到特定部位，目前的研究表明，具 有優(yōu)越的粉體動(dòng)力學(xué)特征及肺部沉積性能的多孔高分子微球已經(jīng)成為適于肺部給藥劑型 的首選。傳統(tǒng)的多孔微球的制備方法有有聚合法、交聯(lián)法、乳化-溶劑揮發(fā)、噴霧干燥法等。 在這些多孔微球制備方法中，有機(jī)溶劑簡(jiǎn)單、有效地去除一直是尚未解決的關(guān)鍵問(wèn)題，對(duì)于 肺部吸入給藥的載體而言，可能會(huì)導(dǎo)致較高的生物安全隱患。因此，找到一種環(huán)境友好型、 條件可控、成孔效果好的多孔微球制備新途徑，已成為研究人員亟待解決的問(wèn)題。
[0004] 超臨界流體(SCF,Supercritical Fluid)是溫度和壓力處于臨界點(diǎn)之上的流體， 此狀態(tài)下的流體，密度接近于液體而粘度接近于氣體，因而具有較好的溶解和擴(kuò)散性能。而 超臨界流體技術(shù)正是因?yàn)槌R界流體這些良好的性能，近年來(lái)已被廣泛用于萃取、石油化 工、化學(xué)合成及制備超細(xì)微粒等領(lǐng)域。與其它制粒技術(shù)相比，超臨界二氧化碳SC-CO 2制備過(guò) 程條件溫和，尤其適于高溫敏感的生物大分子，利用SC-CO2制得的多孔微球有機(jī)溶劑殘留 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定，且通過(guò)細(xì)胞、動(dòng)物及分子水平的評(píng)價(jià)，顯示出良好的生物安全性，是肺 部給藥劑型的良好備選之一。
[0005] 此外，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，特別是腫瘤醫(yī)學(xué)中，由于腫瘤的耐藥性，單一用藥往往很難保 證療效，一些藥物本身也具有較大毒性（比如說(shuō)阿霉素），所以不可能通過(guò)無(wú)限增加用藥量 而達(dá)到治療的目的。選用作用不相重疊的藥物聯(lián)合用藥則可以通過(guò)藥物的協(xié)同作用而增加 療效?；蛑委熥鳛槎兰o(jì)末發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，其能從分子水平上抑制特定基因的 表達(dá)。將基因藥物搭配多肽類等大分子藥物聯(lián)合給藥，可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，即可發(fā)揮基因的 高效識(shí)別性，解除組織對(duì)藥物的耐藥性，提高藥物的敏感度，又可以減少藥物的用量，降低 藥物的毒副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種超臨界流體技術(shù)制備共 載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球的方法。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種超臨界流體技術(shù)制備共載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球的方法，其特 征在于:包括：
[0009] 1)離子凝膠法制備CS NPs(殼聚糖納米顆粒）：將基因藥物加入到1.0~2. Omg/mL 的TPP (三聚磷酸鹽）溶液中，振蕩溶解，隨后加入到O . 5~2 . Omg/mL的CS (殼聚糖）溶液中， TPP溶液與CS溶液的體積比為O . 9~I . 1: 1.8~2.2，立即渦旋1~5miη，室溫孵育30~ 120min，得到載基因藥物的CS NPs懸浮液;再將該CS NPs懸浮液與220~280mg/mL的致孔劑 碳酸氫銨水溶液混合，得到水相；
[0010] 2)將聚乳酸基質(zhì)材料和乳化劑PF-127溶解于10~20mL DCM(二氯甲烷）中使其終 濃度分別為15~16mg/mL和7~8mg/mL，加入致孔劑薄荷醇;所述加入的聚乳酸基質(zhì)材料、乳 化劑PF-127、薄荷醇的質(zhì)量比為1.8~2.2:0.9~1. 1:1.8~2.2;然后再將多肽類藥物溶于 其中，得到油相；
[0011] 3)按水油比1.5~2.5/18~22(v/v)將步驟1)得到的水相與步驟2)得到的油相混 合，冰浴下超聲乳化形成穩(wěn)定的搭載基因藥物和多肽類藥物的CS NPs油包水乳液，并迅速 裝入活塞裝置中；
[0012] 4)在壓力8~15MPa，溫度30~40°C，⑶2流速40~60g/min，油包水乳液流速2~ 4mL/min的條件下進(jìn)行二氧化碳抗溶劑制備過(guò)程;制備結(jié)束后淋洗10~20min，收集樣品，在 45~55°C條件下干燥，即得所述之共載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球。
[0013] 一實(shí)施例中：所述聚乳酸基質(zhì)材料為聚乳酸（PLLA)，聚乳酸-羥基乙酸共聚物 (poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)或聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇共聚物（Poly (Lactic-Co-Glycolic Acid)-Poly(Ethylene Gycol),PLGA-PEG)〇
[0014] 一實(shí)施例中:所述基因藥物為siRNA。
[0015] -實(shí)施例中:所述多肽類藥物為GLP-I。
[0016] 本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比，它具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 1.本發(fā)明以二氯甲烷為溶劑，碳酸氫銨與薄荷醇為致孔劑，PF-127作為乳化劑，利 用超臨界CO 2的抗溶劑過(guò)程制備了高分子微鑲納多孔微球，所制備的微鑲納微球可以同時(shí) 負(fù)載基因與多肽類藥物發(fā)揮協(xié)同作用，具有良好的空氣動(dòng)力學(xué)性能，能夠促進(jìn)藥物的釋放 與吸收。且微鑲納體系成球與載藥同步進(jìn)行，條件溫合，特別適用于熱敏性藥物，無(wú)有機(jī)殘 留;載藥量可以根據(jù)需求調(diào)節(jié)，最大載藥量8.0~10.0%左右，具有極大應(yīng)用空間。
[0018] 2.本發(fā)明通過(guò)綜合調(diào)控致孔劑的用量、水油比、噴嘴尺寸、抗溶劑過(guò)程中溫度、壓 力和CO 2流速等參數(shù)，得到同時(shí)負(fù)載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球體系，擔(dān)載基因藥 物的殼聚糖納米顆粒和多肽類藥物均分散于聚乳酸的基質(zhì)中，其中擔(dān)載基因藥物的殼聚糖 納米顆粒粒徑在50~300nm范圍內(nèi)，微鑲納多孔微球的粒徑在5~30μπι范圍內(nèi)，具有優(yōu)越的 粉體動(dòng)力學(xué)特征及肺部沉積性能，而且可以調(diào)控反應(yīng)過(guò)程調(diào)整得到不同粒徑、孔隙率與形 貌的多孔微球，適用性更廣。
[0019] 3.本發(fā)明制備的微鑲納多孔微球的特征在于:材料選擇上，殼聚糖是唯一的天然 堿性多糖，富含氨基，形成納米粒后可以保護(hù)基因藥物在釋放過(guò)程中的藥物活性。而左旋聚 乳酸PLLA作為FDA認(rèn)證的生物材料，對(duì)人體無(wú)毒害。并且，由于其在二氯甲烷中溶解度較大， 而在超臨界CO 2中的溶解度較低，特別適合以二氯甲烷作為溶解的超臨界體系，具有較高的 成球率。制備方法上，采用了二種致孔劑，碳酸氫銨作為內(nèi)致孔劑存在于水相中，薄荷醇作 為外致孔劑存在于油相中，二種致孔劑的聯(lián)用使得所制備的多孔微球具有合適的孔隙率與 粗糙的表面結(jié)構(gòu)，有利于后續(xù)的吸附與藥物釋放。制備過(guò)程中雖然采用了二氯甲烷作為溶 劑，但由于超臨界CO2的技術(shù)可以將有機(jī)溶劑很好的去除，符合當(dāng)前對(duì)環(huán)境友好型材料的要 求。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0021] 圖1為本發(fā)明的方法中二氧化碳抗溶劑制備過(guò)程的裝置及流程示意圖。
[0022]圖2為實(shí)施例l(a與d)、實(shí)施例2(b與e)與實(shí)施例3(c與f)的載SiRNA和GLP-I的微鑲 納多孔微球的掃描電鏡照片(a，b，c X 3K，d X 22K，e X 20K，f X 60K)。
[0023]圖3為實(shí)施例4制備的siRNA和GLP-1的微鑲納多孔微球的N元素能譜掃描圖，展示 了負(fù)載基因藥物的殼聚糖納米顆粒在聚乳酸基質(zhì)表面的分布。
[0024]圖4為實(shí)施例4制備的siRNA和GLP-I的微鑲納多孔微球的DCM殘留量的頂空氣相檢 測(cè)結(jié)果，其中（a)為DCM對(duì)照品，tR = 4.629min; (b)為微鑲納多孔微球。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容：
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 1)將IOD基因藥物siRNA加入到lmg/mL的25yL TPP溶液中，振蕩溶解，隨后加入到 lmg/mL的250yL CS溶液中，立即渦旋1~5min，室溫孵育30~120min，得到載siRNA的CS NPs 懸浮液;再將該CS NPs懸浮液冷凍于-80°C過(guò)夜后置于凍干機(jī)中凍干48h即可得到載siRNA 的CS NPs粉末；將該CS NPs粉末與5mL的250mg/mL的致孔劑碳酸氫銨水溶液混合，得到水 相；
[0028] 2)將306.6mg聚乳酸PLLA和153.3mg乳化劑PF-127溶解于20mL DCM中，加入致孔劑 薄荷醇306.6mg;然后再將多肽類藥物GLP-KGLP-I預(yù)先溶解于200yL蒸餾水中）溶于其中， 超聲乳化30s，得到油相；
[0029] 3)按水油比2.0/20(v/v)將步驟1)得到的水相與步驟2)得到的油相混合，冰浴下 超聲乳化30s，形成穩(wěn)定的搭載siRNA和GLP-I的CS NPs油包水乳液，并迅速裝入活塞注射器 中；
[0030] 4)在噴嘴尺寸為為0.004英寸，壓力8MPa，溫度35°C，C02流速40g/min，油包水乳液 流速4mL/min的條件下進(jìn)行二氧化碳抗溶劑制備過(guò)程，具體如下：
[0031]密封活塞注射器后將其前端和末端分別與高壓釜和高壓輸液栗連接;鋼瓶中的二 氧化碳經(jīng)質(zhì)量流量計(jì)通過(guò)CO2栗到達(dá)高壓釜內(nèi)，維持二氧化碳栗入速率為40g/min，開(kāi)啟背 壓閥以一定速率放氣，以將高壓釜內(nèi)壓力維持在8MPa;同時(shí)維持高壓釜外部干燥箱及管路 水浴溫度，使高壓釜內(nèi)溫度保持在35°C。待溫度和壓力穩(wěn)定后，打開(kāi)高壓輸液栗，以乙醇為 介質(zhì)以一定流速推動(dòng)油包水乳液。當(dāng)高壓輸液栗壓力稍稍超過(guò)高壓釜內(nèi)二氧化碳的壓力 后，打開(kāi)進(jìn)液?jiǎn)蜗蜷y，使油包水乳液以一定速率從噴嘴處?kù)F化噴入到高壓釜內(nèi)的二氧化碳 中，開(kāi)始二氧化碳抗溶劑制備過(guò)程。
[0032]制備結(jié)束后，維持壓力及溫度不變，繼續(xù)淋洗15min，收集樣品，在50°C條件下干燥 是碳酸氫銨分解，即得siRNA和GLP-I的微鑲納多孔微球。
[0033] 實(shí)施例2
[0034] 1)將IOD基因藥物siRNA加入至Ijlmg/mL的125yL TPP溶液中，振蕩溶解，隨后加入到 lmg/mL的250yL CS溶液中，立即渦旋1~5min，室溫孵育30~120min，得到載siRNA的CS NPs 懸浮液;再將該CS NPs懸浮液冷凍于-80°C過(guò)夜后置于凍干機(jī)中凍干48h即可得到載SiRNA 的CS NPs粉末；將該CS NPs粉末與5mL的250mg/mL的致孔劑碳酸氫銨水溶液混合，得到水 相；
[0035] 2)將306.6mg聚乳酸PLLA和153.3mg乳化劑PF-127溶解于20mL DCM中，加入致孔劑 薄荷醇306.6mg;然后再將多肽類藥物GLP-KGLP-I預(yù)先溶解于200yL蒸餾水中）溶于其中， 超聲乳化30s，得到油相；
[0036] 3)按水油比2.0/20(v/v)將步驟1)得到的水相與步驟2)得到的油相混合，冰浴下 超聲乳化30s，形成穩(wěn)定的搭載siRNA和GLP-I的CS NPs油包水乳液，并迅速裝入活塞注射器 中；
[0037] 4)進(jìn)行二氧化碳抗溶劑制備過(guò)程，操作方法同實(shí)施例1，制備條件為噴嘴尺寸 0.006英寸壓力8MPa，溫度35 °C，CO2流速40g/min，油包水乳液流速4mL/min;制備結(jié)束后，維 持壓力及溫度不變，繼續(xù)淋洗15min，收集樣品，在50°C條件下干燥是碳酸氫銨分解，即得 siRNA和GLP-I的微鑲納多孔微球。
[0038] 實(shí)施例3
[0039] 1)將IOD基因藥物siRNA加入至Ijlmg/mL的125yL TPP溶液中，振蕩溶解，隨后加入到 lmg/mL的250yL CS溶液中，立即渦旋1~5min，室溫孵育30~120min，得到載siRNA的CS NPs 懸浮液;再將該CS NPs懸浮液冷凍于-80°C過(guò)夜后置于凍干機(jī)中凍干48h即可得到載siRNA 的CS NPs粉末；將該CS NPs粉末與5mL的250mg/mL的致孔劑碳酸氫銨水溶液混合，得到水 相；
[0040] 2)將306.6mg聚乳酸PLLA和153.3mg乳化劑PF-127溶解于20mL DCM中，加入致孔劑 薄荷醇306.6mg;然后再將多肽類藥物GLP-KGLP-I預(yù)先溶解于200yL蒸餾水中）溶于其中， 超聲乳化30s，得到油相；
[0041] 3)按水油比2.0/20(v/v)將步驟1)得到的水相與步驟2)得到的油相混合，冰浴下 超聲乳化30s，形成穩(wěn)定的搭載siRNA和GLP-I的CS NPs油包水乳液，并迅速裝入活塞注射器 中；
[0042] 4)進(jìn)行二氧化碳抗溶劑制備過(guò)程，操作方法同實(shí)施例1，制備條件為噴嘴尺寸 0.008英寸，壓力8MPa，溫度35°C，CO 2流速40g/min，油包水乳液流速4mL/min;制備結(jié)束后， 維持壓力及溫度不變，繼續(xù)淋洗15min，收集樣品，在50°C條件下干燥是碳酸氫銨分解，即得 siRNA和GLP-I的微鑲納多孔微球。
[0043] 實(shí)施例4
[0044] 1)將IOD基因藥物siRNA加入到lmg/mL的125yL TPP溶液中，振蕩溶解，隨后加入到 lmg/mL的250yL CS溶液中，立即渦旋1~5min，室溫孵育30~120min，得到載siRNA的CS NPs 懸浮液;再將該CS NPs懸浮液冷凍于-80°C過(guò)夜后置于凍干機(jī)中凍干48h即可得到載siRNA 的CS NPs粉末；將該CS NPs粉末與5mL的250mg/mL的致孔劑碳酸氫銨水溶液混合，得到水 相；
[0045] 2)將306.6mg聚乳酸PLLA和153.3mg乳化劑PF-127溶解于20mL DCM中，加入致孔劑 薄荷醇306.6mg;然后再將多肽類藥物GLP-KGLP-I預(yù)先溶解于200yL蒸餾水中）溶于其中， 超聲乳化30s，得到油相；
[0046] 3)按水油比2.0/20(v/v)將步驟1)得到的水相與步驟2)得到的油相混合，冰浴下 超聲乳化30s，形成穩(wěn)定的搭載siRNA和GLP-I的CS NPs油包水乳液，并迅速裝入活塞注射器 中；
[0047] 4)進(jìn)行二氧化碳抗溶劑制備過(guò)程，操作方法同實(shí)施例1，制備條件為壓力SMPaj^ 度35°C，CO2流速40g/min，油包水乳液流速2mL/min;制備結(jié)束后，維持壓力及溫度不變，繼 續(xù)淋洗15min，收集樣品，在50 °C條件下干燥是碳酸氫銨分解，即得siRNA和GLP-I的微鑲納 多孔微球。
[0048] 實(shí)施例5
[0049] 1)將IOD基因藥物siRNA加入到lmg/mL的125yL TPP溶液中，振蕩溶解，隨后加入到 lmg/mL的250yL CS溶液中，立即渦旋1~5min，室溫孵育30~120min，得到載siRNA的CS NPs 懸浮液;再將該CS NPs懸浮液冷凍于-80°C過(guò)夜后置于凍干機(jī)中凍干48h即可得到載siRNA 的CS NPs粉末；將該CS NPs粉末與5mL的250mg/mL的致孔劑碳酸氫銨水溶液混合，得到水 相；
[0050] 2)將306.6mg聚乳酸PLLA和153.3mg乳化劑PF-127溶解于20mL DCM中，加入致孔劑 薄荷醇306.6mg ;然后再將不同質(zhì)量的（23 . Omg，34.5mg和46 . Omg分別對(duì)應(yīng)理論載藥量 5.0%，7.5%和10.0% )多肽類藥物GLP-I(GLP-1預(yù)先溶解于200yL蒸餾水中）溶于其中，超 聲乳化30s，得到油相；
[0051] 3)按水油比2.0/20(v/v)將步驟1)得到的水相與步驟2)得到的油相混合，冰浴下 超聲乳化30s，形成穩(wěn)定的搭載siRNA和GLP-I的CS NPs油包水乳液，并迅速裝入活塞注射器 中；
[0052] 4)進(jìn)行二氧化碳抗溶劑制備過(guò)程，操作方法同實(shí)施例1，制備條件為壓力SMPaj^ 度35°C，CO2流速40g/min，油包水乳液流速4mL/min;制備結(jié)束后，維持壓力及溫度不變，繼 續(xù)淋洗15min，收集樣品，在50 °C條件下干燥是碳酸氫銨分解，即得siRNA和GLP-I的微鑲納 多孔微球。
[0053]如表1所示，為本發(fā)明實(shí)施例5制備的微鑲納多孔微球的空氣動(dòng)力學(xué)性能對(duì)比，可 以看出，不同理論載藥量的多孔微球的Da(空氣動(dòng)力學(xué)直徑)<4.7ym，Dg>15ym，F(xiàn)PF>60%Jf 合肺部給藥制劑的要求，可實(shí)現(xiàn)較好的肺內(nèi)沉積及減少巨噬細(xì)胞吞噬。
[0054]表1不同載藥量微鑲納微球的空氣動(dòng)力學(xué)性能
[0056]以上所述，僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種超臨界流體技術(shù)制備共載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球的方法，其特征 在于:包括： 1) 將基因藥物加入到1.0~2. Omg/mL的TPP溶液中，振蕩溶解，隨后加入到0.5~2. Omg/ mL的CS溶液中，TPP溶液與CS溶液的體積比為0.9~1.1:1.8~2.2，立即渦旋1~511^11，室溫 孵育30~120min，得到載基因藥物的CS NPs懸浮液;再將該CS NPs懸浮液與220~280mg/mL 的致孔劑碳酸氫銨水溶液混合，得到水相； 2) 將聚乳酸基質(zhì)材料和乳化劑PF-127溶解于10~20mL DCM中使其終濃度分別為15~ 16mg/mL和7~8mg/mL，加入致孔劑薄荷醇;所述加入的聚乳酸基質(zhì)材料、乳化劑PF-127、薄 荷醇的質(zhì)量比為1.8~2.2:0.9~1.1:1.8~2.2;然后再將多肽類藥物溶于其中，得到油相； 3) 按水油比1.5~2.5/18~22 (v/v)將步驟1)得到的水相與步驟2)得到的油相混合，冰 浴下超聲乳化形成穩(wěn)定的搭載基因藥物和多肽類藥物的CS NPs油包水乳液，并迅速裝入活 塞裝置中； 4) 在壓力8~15MPa，溫度30~40°C，C02流速40~60g/min，油包水乳液流速2~4mL/min 的條件下進(jìn)行二氧化碳抗溶劑制備過(guò)程；制備結(jié)束后淋洗10~20min，收集樣品，在45~55 °C條件下干燥，即得所述之共載基因與多肽類藥物的微鑲納多孔微球。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚乳酸基質(zhì)材料為聚乳酸，聚乳酸-羥 基乙酸共聚物或聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇共聚物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述基因藥物為siRNA。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述多肽類藥物為GLP-1。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105963714SQ201610430990
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】陳愛(ài)政, 王士斌, 宋湖凡, 劉源崗, 吳文果
【申請(qǐng)人】華僑大學(xué)