藥物組合物及其應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域,特別涉及藥物組合物及其應用。該藥物組合物由常壓高濃度氧(NBO)與N?乙酰半胱氨酸(NAC)組成。急性腦缺血期給予NBO和再灌注給予NAC聯(lián)合作用可顯著降低急性腦缺血再灌后的梗死和水腫,效果顯著強于單一治療。NBO和NAC聯(lián)合作用可顯著降低缺血2小時,再灌注7天后動物的腦萎縮,腦組織損傷及神經(jīng)功能損傷。聯(lián)合治療效果顯著好于單一治療效果。NBO和NAC聯(lián)合作用可顯著降低氧自由基的產(chǎn)生、PARP?1裂解和PAR的積累。聯(lián)合治療效果顯著好于單一治療效果。NBO和NAC聯(lián)合作用可顯著降低缺血再灌注對血腦屏障(BBB)的破壞和緊密連接蛋白的降解。
【專利說明】
藥物組合物及其應用
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明設及生物技術(shù)領域,特別設及藥物組合物及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性缺血性腦卒中的首要目標是挽救半暗帶,如果不能得到再灌注,半暗帶將發(fā) 展成為不可逆的損傷。運種損傷首先是由于缺血過程中的缺氧W及生物能量衰竭導致的, 隨后是由于再灌注誘導的損傷W。半暗帶的運一概念啟發(fā)我們藥物的發(fā)展方向為阻斷細胞 死亡通路。
[0003] 如果組織得不到再灌或者血管的完整性受損,單純的神經(jīng)保護可能不足W治療急 性中風。然而,再灌注的同時,也會由于一些機制造成額外的損傷,如炎癥、氧化應激和興奮 性損傷。N-乙酷半脫氨酸(NAC ),谷脫甘膚的前體,在臨床中作為抗氧化劑,也是一種氧自由 基清除劑。在暫時性和永久性MCA0動物模型中已有證明NAC預處理(缺血前)能夠通過其抗 炎作用減輕再灌注損傷和梗死面積。然而,缺血后給予NAC在治療局灶性腦缺血中的作用還 鮮為人知。
[0004] 讓人一直失望的是神經(jīng)保護藥物在臨床試驗中并沒有表現(xiàn)出抗氧化劑的積極作 用。缺血性腦損傷的多階段進程促使我們尋求聯(lián)合的治療方法用于治療缺血性腦卒中。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 現(xiàn)有的治療都是針對急性腦缺血后缺血或者再灌注階段的單一祀向治療。有鑒于 此,本發(fā)明提供一種藥物組合物及其應用。本發(fā)明的目的是采用針對缺血階段和再灌注階 段給予不同的藥物,觀察該治療策略對急性腦缺血后的神經(jīng)和血管保護作用。
[0006] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供W下技術(shù)方案:
[0007] 本發(fā)明提供了一種藥物組合物,由NB0與NAC組成。
[000引在本發(fā)明的一些具體實施方案中,NB0的有效劑量范圍是95%化~100%化。
[0009] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中,NAC的有效劑量是60mg/kg~150mg/kg。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述藥物組合物在制備降低急性腦缺血再灌后的梗死幾率的藥 物中的應用。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述藥物組合物在制備降低急性腦缺血再灌后的水腫幾率的藥 物中的應用。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述藥物組合物在制備降低缺血2小時和/或再灌注7天后動物的 腦萎縮和/或腦組織損傷的藥物中的應用。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述藥物組合物在制備降低氧自由基的產(chǎn)生和/或PARP-1裂解 和/或PAR的積累的影響的藥物中的應用。
[0014] 本發(fā)明還提供了所述藥物組合物在制備降低缺血再灌注對BBB的破壞和緊密連接 蛋白的降解的藥物中的應用。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述藥物組合物在制備治療急性腦缺血后的神經(jīng)保護藥物中的 應用。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述藥物組合物在制備治療急性腦缺血后的血管保護藥物中的 應用。
[0017] 本發(fā)明的實驗結(jié)果表明:
[0018] (l)NBO和NAC聯(lián)合治療可顯著降低急性腦缺血再灌后的梗死和水腫,效果顯著強 于單一治療。
[0019] (2)NB0和NAC聯(lián)合治療可顯著降低缺血2小時,再灌注7天后動物的腦萎縮,腦組織 損傷及神經(jīng)功能損傷。聯(lián)合治療效果顯著好于單一治療效果。
[0020] (3)NB0和NAC聯(lián)合治療可顯著降低氧自由基的產(chǎn)生、PARP-1裂解和PAR的積累。聯(lián) 合治療效果顯著好于單一治療效果。
[0021] (4)NB0和NAC聯(lián)合治療可顯著降低缺血再灌注對BBB的破壞和緊密連接蛋白的降 解。
【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案,下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0023] 圖1示NB0和NAC聯(lián)合治療可顯著降低急性腦缺血再灌后的梗死;(A)示腦梗死代表 圖,(B)示統(tǒng)計圖,(C)示水腫,效果顯著強于單一治療;
[0024] 圖2示NB0和NAC聯(lián)合治療可顯著降低缺血2小時,再灌注7天后動物的腦萎縮(A和 B),腦組織損傷及神經(jīng)功能恢復情況(C);
[0025] 圖3示NB0和NAC聯(lián)合治療可顯著降低氧自由基的產(chǎn)生(AKPARP-1裂解(B)和PAR的 積累(C)的影響:A)具有代表性的肥t巧光圖像顯示每組在皮質(zhì)和皮質(zhì)下超氧陰離子的產(chǎn)生 情況;聯(lián)合治療效果顯著好于單一治療效果;
[0026] 圖4示NB0和NAC聯(lián)合治療可顯著降低缺血再灌注對BBB的破壞和緊密連接蛋白的 降解的作用;A)對EB泄露進行定量,聯(lián)合治療顯著降低缺血再灌注誘導的EB泄露(巧< 0.05,11 = 6);8)缺血再灌注后緊密連接蛋白(31日11山11-5降解而聯(lián)合治療可抑制其降解;比例 尺= 50ym;C)缺血再灌注可顯著降低緊密連接蛋白claudin-5(C)及occludin(D)的降解,聯(lián) 合治療可顯著降低緊密連接蛋白的降解。
【具體實施方式】
[0027] 本發(fā)明公開了一種藥物組合物及其應用,本領域技術(shù)人員可W借鑒本文內(nèi)容,適 當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動對本領域技術(shù)人員來說 是顯而易見的,它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進 行了描述,相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用 進行改動或適當變更與組合,來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。
[0028] 本發(fā)明提供的藥物組合物及其應用中所用原料及試劑均可由市場購得。
[0029] 下面結(jié)合實施例,進一步闡述本發(fā)明:
[0030] 實施例1
[0031] 1.常壓高濃度氧(NB0)與N-乙酷半脫氨酸(NAC)聯(lián)合治療對缺血再灌注后急性期 的神經(jīng)及血管保護作用:雄性Sprague-Dawley大鼠(270-290g)大腦中動脈栓線阻塞化的過 程中將其暴露于NB0(95%02)或常氧(21%02),之后進行48小時的再灌注。大鼠再灌注前 5min腹腔注射NAC(60mg/kg)或相應溶劑。實驗分為四組:(l)Air+Veh組;(2)Air+NAC組;(3) NBO+NAC組;(4)NBO+Veh組。再灌4她后檢測腦梗死體積、BBB損傷、行為學評分、檢測自由基 產(chǎn)生量、HIF-la、PARP、VEGF。
[0032] NB0與NAC聯(lián)合治療對缺血再灌注后慢性期的神經(jīng)保護作用:雄性Sprague-Dawley 大鼠(270-290g)大腦中動脈栓線阻塞2小時的過程中將其暴露于NB0(95%化)或常氧(21% 化),之后進行7天的再灌注。大鼠再灌注前5分鐘腹腔注射NAC(60mg/kg)或相應溶劑。實驗 分為四組:(l)Air+Veh組;(2)Air+NAC組;(3)NB0+NAC組;(4)NB0+Veh組。再灌7天后進行神 經(jīng)功能評分、foot-化1111:、〇96]1-門16(1檢測神經(jīng)功能恢復、取組織檢測腦萎縮^及細胞調(diào)亡 情況。
[0033] 2.方法
[0034] 2.1實驗設計
[00巧]雄性Sprague-Dawl巧大鼠(270-290g)大腦中動脈栓線阻塞2小時的過程中
[0036] 將其暴露于NB0(95%化)或常氧(21%化),之后進行48小時的再灌注。大鼠再灌注 前5分鐘腹腔注射NAC(60mg/kg)或生理鹽水。再灌4她后檢測腦梗死、腦水腫、BBB損傷、氧自 由基、hif-la、VEGF、PARP、PAR。
[0037] 2.2實驗動物分組
[003引實驗分為四組:(l)Air+Veh組;(2)Air+NAC組;(3)NB0+NAC組;(4)NB0+Veh組。
[0039] 2.3建立大鼠短暫性急性腦缺血模型
[0040] 2.3.1 步驟
[0041] (1)大鼠用異氣燒氣體麻醉后,用剌毛器將頸部剌毛,仰邸后用膠帶固定四肢。
[0042] (2)用酒精對頸部皮膚進行消毒,并準備好手術(shù)器械及結(jié)扎線。
[0043] (3)沿著頸部中線剪口,口長約4厘米,剪開結(jié)締組織,分離肌肉和筋膜。
[0044] (4)用顯微綴分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈化CA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。
[0045] (5)放一根短線結(jié)扎CCA,打個活結(jié),盡量靠近分叉。
[0046] (6)放一根長線,剪為兩段,分別在頸外動脈的遠端打死結(jié),下面的結(jié)盡量向上打, 然后綴子拉住下面的結(jié),另一手將上面的結(jié)再往上打。確認結(jié)拉緊W后,用眼科剪在兩個結(jié) 中間剪斷。
[0047] (7)分離頸內(nèi)動脈,并放置動脈夾。注意:不能碰到迷走神經(jīng),并確保夾子完全閉塞 了血液的流動。
[004引(8)放一根長線,剪為兩端,分別在頸總動脈相連的頸外動脈上打一個活結(jié)和一個 單結(jié)?;罱Y(jié)靠近交叉口的遠端,單結(jié)靠近交叉口的近端,兩個結(jié)都不要拉緊。
[0049] (9)在靠近頸外動脈的死結(jié)處用眼科剪剪一個小口,插線栓。當線栓到達動脈夾處 時,拉緊活結(jié)并取掉動脈夾,繼續(xù)前進至線栓的白色標記處時停止前進并拉緊活結(jié)。
[0050] (10)拉鉤去掉,縫皮(4號手術(shù)縫線),待大鼠蘇醒后放于干凈的鼠籠中飼養(yǎng)。
[0051] (11)再灌注的時候,麻醉大鼠,剪開縫線,放拉鉤,把拴線抽出,將單結(jié)打為死結(jié), 確認不出血的話,將CCA的活結(jié)去掉,縫皮。
[0化2] 2.3.2手術(shù)后神經(jīng)功能學評分
[0053] 按照Rogers八分神經(jīng)功能評分標準:0無神經(jīng)功能障礙;1左前爪不能完全伸展;2 拉尾時左前爪抓握能力減弱;3向各個方向自發(fā)運動,拉尾時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;4向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或行 走;5僅當受激時行走;6無意識,受激時無反應;7死亡。
[0054] 2.4腦梗死、腦水腫的測定
[0化5] 2.4.1 TTC染色的原理
[0056]氯化-2,3,5-Ξ苯基四氮挫(2,3,S-Tri地enyltehazolium 化loride,TTC)包括 兩種形態(tài),即還原型(紅色)和氧化型(無色)。正常腦組織內(nèi)含有脫氨酶,在尼克酷胺腺巧二 核巧酸(NADP)存在的條件下,能將無色的氧化型基團(氧化Ξ苯基四氮挫)還原成還原型 TTC(即TTC-red)。腦缺血后,缺血區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)細胞缺血壞死,組織內(nèi)還原型尼克酷胺腺巧 二核巧酸(NADPH)喪失,而正常腦組織內(nèi)則存在。當TTC與腦組織結(jié)合后,正常區(qū)域內(nèi)的 NADP聞尋氧化型還原為還原型,該區(qū)域呈現(xiàn)紅色,而梗死區(qū)域內(nèi)因缺乏NADPH,故不能將其還 原,仍為氧化型,該區(qū)域組織顏色則為灰白色。本法是腦缺血早期直觀簡便、快速易行、準確 而實用的顯示方法。
[0化7] 2.4.2腦梗死體積的測定
[0058]大鼠缺血2小時,再灌48小時后,深度麻醉,固定于自制的手術(shù)木板上,置于解剖盤 中,開胸暴露并游離出屯、臟,經(jīng)左屯、室插入灌流針并固定,切開右屯、耳,灌注冰凍1XPBS(4 °C),直到肝臟和肺顏色轉(zhuǎn)白及右屯、房流出液澄清,斷頭取腦,放入腦模具中并調(diào)整腦組織 的擺放位置,前3毫米棄掉,剩余的每2毫米切一片,共六片,注意保持腦片的完整性。將腦片 浸沒于TTC染色液中,37°C水浴避光染色5分鐘,翻轉(zhuǎn)腦片再次染色五分鐘。染色完畢后拍 照,并用Image J軟件進行腦梗死體積統(tǒng)計分析。腦梗死體積百分比=腦梗死體積/總體積 X100%。
[0化9] 2.4.2腦水腫體積的測定
[0060]將上述TTC染色后拍得的圖片用Image J分別統(tǒng)計缺血側(cè)與非缺血側(cè)的體積 [0061 ]再進行統(tǒng)計分析。腦水腫體積百分比=缺血側(cè)體積/非缺血側(cè)體積X100%。
[0062] 2.5伊文思藍滲透率的測定
[0063] 2.5.1伊文思藍檢測血腦屏障的原理
[0064] 伊文思藍,又稱偶氮藍,是一種常用的偶氮染料制劑,其分子量大小與血漿白蛋白 相近。在神經(jīng)所研究中伊文思藍常被用于失蹤觀察血腦屏障(BBB)的完整性。在血液中伊文 思藍與血漿白蛋白有很高的親和力,正常生理條件下血漿白蛋白無法透過血腦屏障,所W 與血漿白蛋白結(jié)合的伊文思藍也不能透過血腦屏障,無法使其著色。如果血腦屏障遭到破 壞,血漿白蛋白透過血腦屏障進入神經(jīng)系統(tǒng),與其結(jié)合的伊文思藍進入神經(jīng)系統(tǒng)并使其著 色。
[00化]2.5.2操作步驟
[0066] (1)大鼠缺血再灌注后47小時,股靜脈注射2%伊文思藍(3ml/kg);
[0067] (2)1小時后,用水合氯醒麻醉。使大鼠仰邸固定,用剪刀剪開大鼠胸膛,使屯、臟充 分暴露;
[0068] (3)將灌流針尖插入左屯、室后固定,剪開右屯、耳,血液流出。通過灌流累將預冷的 憐酸鹽緩沖液勻速灌入到屯、臟經(jīng)過體內(nèi)循環(huán)移除體內(nèi)血液直至右屯、耳流出的液體至無色;
[0069] (4)將大鼠斷頭,取出大腦。去掉嗅球,腦干及小腦,將大腦分為左右半球,稱重。將 大腦半球放入1.5毫升EP管中后,加入1毫升預冷的Ξ氯乙酸,用勻漿器充分勻漿。然后4°C 離屯、14000gX15分鐘;
[0070] (5)吸取上清,用酶標儀檢測620nm波長下的吸光值,根據(jù)標準曲線計算得出腦中 伊文思藍的含量(單位為yg/g)。
[0071] 2.6氧自由基檢測
[0072] 2.6.1二氨乙錠檢測氧自由基的原理
[0073] 二氨乙錠是一種最常用的超氧化物陰離子巧光檢測探針??蒞直接用于活細胞的 標記。二氨乙錠被活細胞攝入后,可W在細胞內(nèi)的超氧化物陰離子作用下脫氨,產(chǎn)生 ethidium。化Mdium(例如漠化乙錠)可W和RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色巧光。當細胞內(nèi)的超氧 化物陰離子水平較高時,產(chǎn)生的ethidium較多,紅色巧光就較強,反之則較弱。運樣就可W 用二氨乙錠進行超氧化物陰離子水平的檢測。
[0074] 2.6.2操作步驟
[0075] (1)缺血前5分鐘靜脈注射0.5mg肥t(濃度為Img/ml);
[0076] (2)缺血2小時,48小時;
[0077] (3)1XPBS灌流取腦,浸泡4%PFA中后固定至少24小時;
[0078] (4)振動切片,厚度為40微米;
[0079] (5)腦切片用含0.2%棚氨化鋼的PBS處理20min然后用PBS漂洗;
[0080] (6)封片;
[0081] (7)置于巧光顯微鏡下觀察(激發(fā)波長510~550,發(fā)射波長>580)。
[0082] 2.7 Western blot檢測
[0083] 2.7.1組織取材
[0084] 再灌注48小時后,將大鼠用PBS灌流后取腦,分為非缺血側(cè)(NI)與缺血側(cè)(I),置于 1.5ml離屯、管中,-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[00化]2.7.2總蛋白提取
[0086] (1)組織塊與裂解液按l:7(v/v)加入EP管,裂解液中含1%的蛋白酶抑制劑(PI);
[0087] (2)用勻漿器進行勻漿;
[0088] (3)冰上靜置裂解30分鐘;
[0089] (4) 14000巧m離屯、15分鐘,取上清,-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0090] 2.7.3樣品準備
[0091 ] (1)用BCA蛋白定量試劑盒測定所提取樣品的蛋白濃度;
[0092] (2)調(diào)整上樣量,使各組蛋白總量一致,在樣品中加入5X上樣緩沖液,吹打均勻,短 暫離屯、,100°C煮沸5分鐘。
[009引 2.7.4 SDS-PAGE電泳
[0094] (1)仔細清洗玻璃板,無水乙醇去脂(可用洗潔精洗并沖洗干凈,驚干),干燥后安 裝。
[00M] (2)灌膠與上樣
[0096] ①對齊玻璃板后用夾子夾緊并固定在架子上,準備灌膠;
[0097] ②按W下配方配制凝膠(按目的蛋白的分子量確定膠的濃度,見后面附表)
[0098] 試劑10%分離膠5%濃縮膠
[0099] Ξ蒸水 4ml 2.7ml
[0100] 30%Acr-Bis 3.3ml 0.67ml
[0101] 1.5M Tris-HCl(pH 8.8) 2.5ml -
[0102] l.OM Tris-HCl(pH 6.8) - 0.5ml
[0103] 10%SDS 0.1ml 0.04ml
[0104] 10%APS 0.1ml 0.04ml
[0105] ΤΕΜΗΜμΙ 化1
[0106] 加入TEM邸后立即搖勻即可灌膠。小屯、將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中,為積 層膠留有足夠空間(梳齒長加1厘米)。頂層注入Ξ蒸水做覆蓋液,W阻止空氣中氧氣對凝膠 的抑制作用,室溫放置30分鐘;
[0107] ③凝膠聚合完成后,倒掉覆蓋物,濾紙吸干殘留液體;
[0108] ④按上述配方制備好濃縮膠,迅速注入分離膠上端,立刻插入干凈的梳子。待濃縮 膠聚合完畢后,將玻璃板安裝至電泳槽中,加入1 X電泳緩沖液,并浸沒膠及梳孔,檢查是否 泄露;小屯、移去梳子,按次序上樣,每孔不超過20μ1,加扣1 marker。然后開始電泳。起始電 壓為80V,待漠酪藍進入分離膠后,將電壓增加到120V,繼續(xù)電泳直至漠酪藍達分離膠底部, 即可終止電泳。
[0109] 7.2.5 轉(zhuǎn)膜
[0110] (1)電泳結(jié)束后,用蛋白轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,按轉(zhuǎn)移蛋白的常規(guī)方法進 行:裁出與凝膠同樣大小的膜,用甲醇浸泡15s,然后,Ξ蒸水浸泡2分鐘,將膜浸入IX轉(zhuǎn)膜 緩沖液中,平衡5分鐘X3次;
[0111] (2)將電泳完畢的凝膠取出,切去積層膠,剝離至盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的器皿中,平衡5 分鐘,洗去膠上的SDS等離子。膜和膠都切去右上角做標記;
[0112] (3)棉墊和濾紙也要先在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸潤,從負極開始依次將棉墊、濾紙、凝膠、 PVDF膜、濾紙、棉墊放好,各層之間應避免氣泡,整個操作在轉(zhuǎn)移緩沖液中進行,夾好此Ξ明 治結(jié)構(gòu),移入已置有冰盒的轉(zhuǎn)移槽緩沖液中,膠側(cè)置負極,膜側(cè)置正極。通電轉(zhuǎn)移,350mA 2 小時或100V 1.5小時。
[0113] (4)斷開電源,取出膜,用麗春紅染液染1分鐘,用Ξ蒸水洗2分鐘(看有無清晰條 帶,若無條帶,不必浪費抗體和時間)。
[0114] 7.2.6免疫印跡
[011引(1)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用TBST洗膜,室溫下?lián)u床上5分鐘X 3次;
[0116] (2)將PVDF膜放入封閉液(5%脫脂牛奶,用1XTBST配制)中,室溫下置于搖床上封 閉2小時;
[0117] (3)TBST洗膜,搖床上5分鐘X3次
[0118] (4)配好一抗(用1 TBST按說明書比例稀釋一抗),混勻,滴加于塑封膜(Ξ邊封好) 里,將PVD刊莫平放于塑封膜,趕盡氣泡,將口封好,4 °C解育過夜;
[0119] (5) TBST洗膜,搖床上5分鐘X 3次;
[0120] (6)配制二抗(用1XTBST按說明書比例稀釋二抗),滴加到封口膜(將封口膜貼于 一平的板上)上,將PVD刊莫倒扣于封口膜上,倒解二抗,室溫2小時;
[0121] (7)TBST洗膜,搖床上5分鐘X3次;
[0122] 7.2.7 顯影
[0123 ] (1)將E化底物顯色A、B液W1:1的比例混合;
[0124] (2)用濾紙將膜表面吸干,膜正面朝上,滴上ECL底物顯色液,室溫反應1分鐘;
[0125] (3)用濾紙將膜表面殘余的顯色液吸干,膜正面朝上包于保鮮膜中,放進暗盒中, 膠片壓片15秒(運個時間要看發(fā)光的強度而定);
[0126] (4)將膠片放于顯影機中顯影,然后用掃描儀掃描,圖像分析系統(tǒng)(ImageJ等)進行 光密度分析。
[0127] 2.8免疫組織化學標記檢測 [012引 2.8.1組織固定及取材
[0129] 再灌注48小時后的SD大鼠,用水合氯醒麻醉后,使大鼠仰邸固定,用剪刀剪開大鼠 胸膛,使屯、臟充分暴露。將灌流針尖插入左屯、室后固定,剪開右屯、耳,血液流出。通過灌流累 將預冷的憐酸鹽緩沖液勻速灌入到屯、臟,經(jīng)過全身循環(huán)移除體內(nèi)血液直至右屯、耳流出的液 體至無色。然后把憐酸鹽緩沖液換成4%的多聚甲醒,灌注約15分鐘后,將大鼠的全腦取出, 放入有4%多聚甲醒的大離屯、管中后固定2小時,然后按10%、20%、30%的薦糖梯度脫水, 每次脫水都要等到組織塊沉入試管底部后再更換高濃度薦糖溶液。
[0130] 2.5.2免疫組織化學標記檢測步驟
[0131] (1)將腦組織標本用0CT進行包埋,然后用冰凍切片機進行冠狀連續(xù)切片,厚度為 20微米,然后將切片貼到明膠包被過的載玻片上。室溫驚干后放置于-20°C冰箱備用。
[0132] (2)玻片從-20攝氏度冰箱取出后,復溫30分鐘,清理干凈腦片周圍的包埋劑后,用 阻水筆在腦片周圍畫一圈阻水圈。
[0133] (3)阻水圈凝好之后,將玻片在1XPBS中洗3次
[0134] (4) 0.3 % Tr i t i on (1 X PBST抗體稀釋劑配制)稀釋的10 %羊血清封閉1.5小時。
[0135] (5)傾去血清,不必洗,加適當比例稀釋的一抗(用1XPBST抗體稀釋劑釋,按1%比 例加入羊血清W降低背景),放入濕盒,4°C冰箱過夜(若雙標,則兩種一抗都要按比例加入 稀釋液中)。
[0136] (6)第二天取出濕盒,室溫復溫30分鐘,傾去一抗后,用1XPBST洗脫液清洗,10分 鐘X3次。
[0137] (7)此后的步驟需要避光!加入按比例稀釋的巧光二抗(1XPBST的抗體稀釋劑配 制,1 %的血清)室溫避光解育1小時。
[013引(8)傾去二抗,用1 X PBST洗脫液清洗,10分鐘X 3次。
[0139] (9)若雙標,加入第二種按比例稀釋的二抗,室溫避光解育1小時,再清洗3次。
[0140] (10)DAPI染核(1:100),室溫避光15分鐘,1 X PBST洗脫液清洗,5分鐘X 3次次。
[0141] (11)巧光防澤滅的封片劑封片,共聚焦巧光顯微鏡觀察。
[0142] 2.9統(tǒng)計學處理
[0143] 采用Image J軟件對梗死照片和Western blot圖像進行采集,Graph化d Prism統(tǒng) 計軟件作圖分析,實驗數(shù)據(jù)W均值±標準差表示,用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析,當P<0.05 時表示有統(tǒng)計學意義。
[0144] 結(jié)果:
[0145] 表1急性期各組大鼠腦梗死情況
[0146]
[0147] Post Hoc Tests
[0148] Multiple Comparisons
[0149] VAR00002
[0150] LSD
[0151]
[0152] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0153] 備注;
[0154] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[01巧](本發(fā)明的化st化c Tests表格中均相同);
[0156] 缺血2小時再灌注48小時后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.957)或NB0(p = 0.155)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.014)有顯著差異。
[0157] 表2急性期各組缺血大鼠腦水腫情況 [015 引
[0159] Post Hoc Tests
[0160] Multiple Comparisons
[0161] VAR00002
[0162] LSD
[0163]
[0164] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[01化]備注;
[0166] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0167] 缺血2小時再灌注48小時后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.789)或NB0(p = 0.588)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.031)有顯著差異。
[0168] 表3慢性期各組大鼠腦萎縮情況
[0169]
[0170] Post Hoc Tests
[0171] Multiple Comparisons
[0172] VAR00002
[0173] LSD
[0174]
[0175] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0176] 備注;
[0177] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[017引缺血2小時再灌注7天后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.056)或NB0(p = 0.050) 治療無顯著差異,聯(lián)合治療(P = 0.012)有顯著差異。
[0179]表4慢性期各組大鼠 7組連續(xù)切片中腦損傷情況
[0181]
[0182] 表5慢性期各組大鼠第1切片處腦損傷情況統(tǒng)計分析
[0183] Multiple Comparisons
[0184] VAR00002
[0185] LSD
[0186]
[01871
[0188] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0189] 備注;
[0190] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0191] 缺血2小時再灌注7天后,在距前因 +4.7讓處,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.055)治療無顯著差異,單獨NB0(p = 0.009)及聯(lián)合治療(P = 0.012)有顯著差異。
[0192] 表6慢性期各組大鼠第2切片處腦損傷情況統(tǒng)計分析
[0193] Multiple Comparisons
[0194] VAR00002
[0195] LSD
[0196]
[0197] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[019引備注;
[0199] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0200] 缺血2小時再灌注7天后,在距前因 +2.7讓處,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.013)治療有顯著差異,單獨NB0(p = 0.001)及聯(lián)合治療(p = 0.003)有極顯著差異。
[0201 ]表7慢性期各組大鼠第3切片處腦損傷情況統(tǒng)計分析
[0202]
[0203] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0204] 備注;
[0205] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0206] 缺血2小時再灌注7天后,在距前因+0.7mm處,與非治療組相比,單獨NAC (p = 0.383)或單獨NB0(p = 0.103)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.014)有顯著差異。
[0207] 表8慢性期各組大鼠第4切片處腦損傷情況統(tǒng)計分析
[0208] Multiple Comparisons
[0209] VAR00002 腳0] LSD Γ02111
[0212]
[0213] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0214] 備注;
[0^5] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0216] 缺血2小時再灌注7天后,在距前因 -1.3讓處,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.477)或單獨NB0(p = 0.255)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.013)有顯著差異。
[0217]表9慢性期各組大鼠第5切片處腦損傷情況統(tǒng)計分析 [0別引 Multiple Comparisons
[0219] VAR00002
[0220] LSD
[0221]
[0222] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0223] 備注;
[0224] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[02巧]缺血2小時再灌注7天后,在距前因 -3.3讓處,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.593)或單獨NB0(p = 0.253)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.044)有顯著差異。
[0226] 表10慢性期各組大鼠第6切片處腦損傷情況統(tǒng)計分析
[0227] Multiple Comparisons
[0228] VAR00002
[0229] LSD
[0230]
[0231] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0232] 備注;
[0233] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0234] 缺血2小時再灌注7天后,在距前因-5.3讓處,與非治療組相比,單獨NAC (p = 0.048)或單獨NB0(p = 0.030)治療有顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.002)有極顯著差異。
[0235] 表11慢性期各組大鼠第7切片處腦損傷情況統(tǒng)計分析
[0236] Multiple Comparisons
[0237] VAR00002
[023引 LSD
[0239]
[0240]
[0241] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0242] 備注;
[0243] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0244] 缺血2小時再灌注7天后,在距前因-7.3讓處,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.301)或單獨NB0(p = 0.112)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.022)有顯著差異。
[0245] 表12急性期及慢性期各組大鼠神經(jīng)行為學評分結(jié)果
[0246]
[0247] 表13急性期各組大鼠行為學評分結(jié)果統(tǒng)計分析
[0248] Multiple Comparisons
[0249] VAR00002 [0巧0] LSD [0251]
[ο 巧 2]
[0253] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0巧4] 備注;
[0 巧5] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0巧6] 缺血2小時再灌注48小時后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.668)或單獨NB0(p = 0.370)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.034)有顯著差異。
[0257] 表14慢性期各組大鼠行為學評分結(jié)果統(tǒng)計分析
[0258] Multiple Comparisons
[0259] VAR00002
[0260] LSD
[0261]
[0262] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0%3] 備注;
[0264] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[02化]缺血2小時再灌注7天后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.804)或單獨NB0(p = 0.351)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.028)有顯著差異。
[0266]表15急性期及慢性期各組大鼠左前肢腳步錯誤放置結(jié)果 「0%71
[0268] 表16急性期各組大鼠左前肢腳步錯誤放置結(jié)果統(tǒng)計分析
[0269] Multiple Comparisons
[0270] VAR00002
[0271] LSD
[0272]
[0273] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0274] 備注;
[0275] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0276] 缺血2小時再灌注48小時后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.338)或單獨NB0(p = 0.129)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.009)有顯著差異。
[0277] 表17慢性期各組大鼠左前肢腳步錯誤放置結(jié)果統(tǒng)計分析
[027引 Multiple Comparisons
[02 巧]VAR00002
[0280] LSD
[0281]
[0283] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0284] 備注;
[0285] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[02化]缺血2小時再灌注7天后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.216)或單獨NB0(p = 0.168)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.018)有顯著差異。
[0287]表18急性期各組大鼠邸泄露情況 [028引
[0289]表19急性期各組大鼠邸泄露統(tǒng)計分析 [0巧0] Multiple Comparisons
[0291] VAR00002
[0292] LSD
[0293]
[0294] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0巧5] 備注;
[0 巧 6] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0297] 缺血2小時再灌注48小時天后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.165)或單獨NB0(p = 0.123)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(p = 0.040)有顯著差異 [029引表20急性期各組大鼠 PARP-1蛋白表達情況
[0299]
[0300] 表21急性期各組大鼠 PARP-1蛋白表達統(tǒng)計分析
[0301] Multiple Comparisons
[0302] VAR00002
[0303] LSD
[0304]
[0305]
[0306] 水,The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0307] 備注;
[030 引 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0309] 缺血2小時再灌注48小時天后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.071)或單獨NB0(p =0.208)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(P = 0.006)有顯著差異。
[0310] 表22急性期各組大鼠 Claudin-5蛋白表達情況
[0311]
[0312] 表23急性期各組大鼠 Claudin-5蛋白表達統(tǒng)計分析
[0313] Multiple Comparisons
[0314] VAR00002 [031 引 LSD
[0316]
[0317]
[0318] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0319] 備注;
[0320] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0321] 缺血2小時再灌注48小時天后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.259)或單獨NB0(p =0.105)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(P = 0.001)有極顯著差異。
[0322] 表24急性期各組大鼠 Occludin蛋白表達情況
[0323] Occiudii AiH-Veh 0.561 巧34 0.32殺 036 0.4358492 0.760474 0.71的沿 化說70328 Air+NAC 0.7031023 0.6635486 0.3230015 0.8948319 0.9822573 0.9507163 NBO+NAC 1.089149 0.751709 1.097186 1.055609 1.162774 1.朋 7Π3 NBO+Veh 0.7149。 0.6976265 0.7957004 0.8137658 0.8780744 0.6969199
[0324] 表25急性期各組大鼠 Occludin蛋白表達統(tǒng)計分析
[0325] Multiple Comparisons
[03%] VAR00002
[0327] LSD [032引
[0329]
[0330] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0331] 備注;
[0332] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0333] 缺血2小時再灌注48小時天后,與非治療組相比,單獨NAC(p = 0.096)或單獨NB0(p =0.075)治療無顯著差異,聯(lián)合治療(P = 0.000)有極顯著差異。
[0334] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式,應當指出,對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人 員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可W做出若干改進和潤飾,運些改進和潤飾也應 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種藥物組合物,其特征在于,由NBO與NAC組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物,其特征在于,N B 0的有效劑量范圍是9 5 % 0 2~ 100%02〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物,其特征在于,NAC的有效劑量是60mg/kg~ 150mg/kg〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的藥物組合物在制備降低急性腦缺血再灌后的梗死 幾率的藥物中的應用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的藥物組合物在制備降低急性腦缺血再灌后的水腫 幾率的藥物中的應用。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的藥物組合物在制備降低缺血2小時和/或再灌注7天 后動物的腦萎縮和/或腦組織損傷的藥物中的應用。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的藥物組合物在制備降低氧自由基的產(chǎn)生和/或 PARP-1裂解和/或PAR的積累的影響的藥物中的應用。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的藥物組合物在制備降低缺血再灌注對BBB的破壞和 緊密連接蛋白的降解的藥物中的應用。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的藥物組合物在制備治療急性腦缺血后的神經(jīng)保護 藥物中的應用。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的藥物組合物在制備治療急性腦缺血后的血管保護 藥物中的應用。
【文檔編號】A61P39/06GK105998053SQ201610301881
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】金新春, 劉春風, 劉文蘭, 劉玉珊, 孫艷蕓
【申請人】蘇州大學