本發(fā)明涉及一種藥物組合物及其制備方法和應用，特別涉及一種藥物組合物及其制備方法和在抗萬古霉素耐藥菌上面的應用，屬于藥物化學領域。

背景技術：

細菌(Bacteria)是生物的主要類群之一，屬于細菌域，是所有生物中數(shù)量最多的一類，細菌對環(huán)境、人類和動物既有用處又有危害。一些細菌成為病原體，可導致破傷風、傷寒、肺炎、梅毒、霍亂和肺結核等各類感染性疾病。在植物中，細菌導致葉斑病、火疫病和萎蔫。

在被稱為抗生素“黃金時代”的五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人數(shù)約為700萬，而這一數(shù)字到了1999年上升到2000萬。在號稱科技最發(fā)達國家的美國，1982至1992年間死于傳染性疾病的人數(shù)上升了40％，死于敗血癥的人數(shù)上升了89％。醫(yī)學家在研究這一現(xiàn)象后驚訝地發(fā)現(xiàn)，在和抗生素接觸多次后，細菌已進化出一整套有效的耐藥機制，耐藥菌這個隱藏的“敵人”正在逐漸強大起來，造成病死率升高的主要原因是耐藥菌帶來的用藥困難。

所謂細菌的耐藥性，是指細菌多次與藥物接觸后，對藥物的敏感性減小甚至消失，致使藥物對耐藥菌的療效降低甚至無效。同自然界其他生物一樣，細菌的基因也在進化中隨機發(fā)生突變。對抗生素敏感的細菌被殺死了，而基因突變后不敏感的細菌則可能存活下來，經過一次次與抗菌藥物的“遭遇戰(zhàn)”，存活下來的細菌都積累了豐富的“戰(zhàn)斗經驗”，成為變異的物種。如銅綠假單胞菌可以改變細胞膜的通透性，阻止抗菌藥物的進入；結核分枝桿菌通過改變體內蛋白質結構阻止抗生素與其結合；更有甚者，有的細菌可以主動出擊，產生水解酶破壞青霉素和頭孢菌素類藥物。細菌不但可以將突變的基因遺傳給下一代，還可以通過質粒傳遞等方式把耐藥性傳遞給異種菌株。時至今日，當今世界乃至我國的耐藥菌問題已變得十分突出，耐藥菌引起的醫(yī)院感染人數(shù)，已超過住院感染患者總人數(shù)的50％。

長久以來，細菌的耐藥性并未引起足夠的重視，醫(yī)生們相信現(xiàn)有抗菌藥物對付耐藥菌已經是綽綽有余。比如對天然青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(金葡菌)，可以應用苯唑西林；即使出現(xiàn)對所有β內酰胺類耐藥的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)，人們還有最后一道防線——萬古霉素。萬古霉素是一種高分子量的糖肽類抗菌藥物，它通過與革蘭氏陽性菌細胞壁肽聚糖前體結合，抑制細菌細胞壁合成發(fā)揮抗菌作用，臨床上大多數(shù)革蘭氏陽性菌對此類抗生素敏感。據(jù)報道，糖肽類抗生素(如萬古霉素)曾經是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)引起全身嚴重感染的唯一有效藥物。

但是從1992年起，美國首次發(fā)現(xiàn)了可對萬古霉素產生耐藥性的MRSA后，世界各國相繼發(fā)現(xiàn)了萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(vancomycin intermediate Staphylococcus aureus，VISA)、異質性萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(heterogeneous vancomycin resistant Staphylococcus aureus，h-VRSA)、萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(vancomycin resistant Staphylococcus aureus，VRSA)等耐萬古霉素菌株。

下面對萬古霉素耐藥菌耐藥機理進行分析：以萬古霉素耐藥腸球菌為例，萬古霉素耐藥腸球菌自20世紀80年代后期被發(fā)現(xiàn)以來，已逐漸發(fā)展成為重要的醫(yī)院感染病原菌，由耐萬古霉素腸球菌(VRE)引發(fā)的感染日益增多，引起全世界廣泛關注。VRE的耐藥機制主要與萬古霉素等糖肽類藥物作用靶位改變有關，萬古霉素耐藥基因簇是介導此類靶位改變的遺傳物質。萬古霉素通過與肽聚糖前體物質五肽鏈上C末端D-Ala-D-Ala結合而抑制革蘭陽性菌細胞壁的合成。VRE攜帶的萬古霉素耐藥基因簇(van gene cluster)可編碼多種蛋白，合成新的細胞壁前體，并清除原有含D-Ala-D-Ala的細胞壁前體，致使糖肽類藥物與細胞壁前體的親和力下降，進而產生耐藥性，是已知細菌耐藥機制中最復雜的機制。根據(jù)這些基因簇的基因序列以及基因結構不同可分為9種類型，并根據(jù)它們攜帶的連接酶分別命名為VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG、VanL、VanM和VanN型萬古霉素耐藥基因簇。萬古霉素耐藥基因簇編碼產物可催化合成與萬古霉素、替考拉寧等糖肽類抗生素親和力極低的細胞壁前體導致耐藥。

萬古霉素耐藥基因簇編碼的連接酶(ligase)是介導耐藥的關鍵蛋白，根據(jù)基因簇中編碼的連接酶不同又可分為2類：一類是D-Ala:D-Lac連接酶(D-Ala:D-Lac ligase)基因簇，包括VanA、VanB、VanD和VanM，介導產生的細胞壁前體含D-丙氨酸-D-乳酸(D-Ala-D-Lac)末端，常介導宿主菌對萬古霉素高度耐藥，對臨床治療影響最大，其中VanA、VanB型最為常見，近年上海地區(qū)vanM型上升迅速，并成為主要型別；另一類為D-Ala:D-Ser連接酶(D-Ala：D-Ser ligase)基因簇，包括VanC、VanE、VanG、VanL和VanN，介導產生的細胞壁前體含D-丙氨酸-D-絲氨酸(D-Ala-D-Ser)末端，攜帶此類基因簇的菌株表現(xiàn)為對萬古霉素低水平耐藥，故對臨床治療影響小。故研發(fā)出一種能抑制基因簇編碼蛋白D-Ala:D-Lac連接酶活性，抗萬古霉素高度耐藥菌的化合物，對制備預防或治療萬古霉素耐藥菌感染疾病的藥物有重要意義，具有極大市場價值。

目前，市面上抗萬古霉素耐藥菌的化合物較少，但發(fā)明人研發(fā)了一種抗萬古霉素耐藥菌的組合物，可制備治療萬古霉素耐藥菌感染疾病的藥物。

技術實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術中存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種藥物組合物及其制備方法和應用，該藥物組合物含有活性較高的VanA型D-Ala:D-Lac連接酶的抑制劑，能阻礙連接酶參與耐藥細菌中細胞壁前體D-Ala-D-Lac的合成，從而避免此類前體合成的細胞壁肽聚糖介導的萬古霉素耐藥性的形成，與萬古霉素或替考拉寧等糖肽類藥物聯(lián)合，達到抑制萬古霉素耐藥菌生長的作用。

本發(fā)明提供了一種有活性的化合物，其具體結構如化學式(I)所示：

作為一種優(yōu)選方案，所述藥物組合物包括含有化學式I的化合物或其藥學上可接受的鹽及藥學上可接受的載體。其作為萬古霉素耐藥菌抑制劑，有顯著抗菌作用。

作為一種優(yōu)選方案，所述藥物組合物包括抗生素、含有化學式I的化合物或其藥學上可接受的鹽及藥學上可接受的載體。

更優(yōu)選地，所述抗生素選自糖肽類藥物，如萬古霉素、去甲萬古霉素、替考拉寧等。

本發(fā)明的另一目的是提供上述藥物組合物的應用，以充分發(fā)揮含化學式I的化合物在臨床中的藥用價值。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的藥物組合物的應用，是指以化學式I作為活性成分的化合物或其藥學上可接受的鹽用于制備抗菌藥物的新用途。

更優(yōu)選地，本發(fā)明所述的藥物組合物的應用，是指以化學式I作為活性成分的化合物或其藥學上可接受的鹽用于制備預防或治療萬古霉素耐藥菌感染疾病的藥物的新用途。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的藥物組合物的應用，是以化學式I作為活性成分的的化合物或其藥學上可接受的鹽和抗生素的組合物用于制備抗菌藥物組合物的新用途。

更優(yōu)選地，本發(fā)明所述的藥物組合物的應用，是以化學式I作為活性成分的的化合物或其藥學上可接受的鹽和抗生素的組合物用于制備預防或治療萬古霉素耐藥菌感染疾病的藥物的新用途。

在一些優(yōu)選方案中，本發(fā)明化合物或組合物可用于治療革蘭陽性菌感染，包括萬古霉素耐藥菌及敏感菌引起的感染。

本發(fā)明還提供所述藥物組合物在制備抗感染藥物中的應用。

該抗感染藥物的抗菌譜為革蘭氏陽性菌及它們的耐藥菌。

優(yōu)選地，所述革蘭氏陽性菌為：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌等中的一種或多種。

此外，本發(fā)明的術語“化合物”，如在本文中所使用，是指包括所有的立體異構體、幾何異構體、互變異構體、同位素。

術語“藥用鹽”是指其中母體化合物通過所存在的堿部分轉化成它的鹽形式而進行改性的化合物的衍生物，或者其中母體化合物通過所存在的酸部分轉化成它的鹽形式而進行改性的化合物的衍生物。藥用鹽的實例包括但不限于：堿性基團(如氨)的無機或有機酸的鹽，或者酸性基團(如羧酸)的無機或有機堿的鹽。合適的鹽被在Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418和Journal of Pharmaceutical Science,66,2(1977)中列出。

術語“藥學上可接受的載體”是指一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性?！跋嗳菪浴痹诖酥傅氖墙M合物中各組份能和本發(fā)明的活性成分以及它們之間相互摻和，而不明顯降低活性成分的藥效。所述藥學上可接受的載體可以是纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如)、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。

本發(fā)明的化合物可以是非對稱的，例如具有一個或多個立體中心。除非有另外的限定，所有的立體異構體，可以是對映異構體和非對映異構體。含有非對稱取代的碳原子的本發(fā)明的化合物可以被分離成光學純或外消旋形式。光學純形式可以通過外消旋體的拆分來制備，或者通過使用手性合成子(synthon)或手性試劑來制備。

本發(fā)明的化合物也可以包括互變異構體形式?；プ儺悩嬻w新形式由單鍵和相鄰的雙鍵一起伴隨質子的遷移而互換所產生的。

本發(fā)明的化合物也可以包括存在于中間體或最終化合物中的原子的所有同位素形式。同位素包括具有相同的原子序數(shù)但不同的質量數(shù)的那些原子。例如，氫的同位素包括氘和氚。

本發(fā)明的化合物、以及其藥用鹽還包括溶劑化物形式或水合物形式。一般而言，溶劑化物形式或水合物形式與非溶劑化物形式或非水合物形式是等同的，均包括在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明的一些化合物可以以多種晶型形式或非晶型形式存在。總體而言，化合物的所有的物理形式都包括在本發(fā)明的范圍內。

本發(fā)明還包括化學式(I)化合物的前藥。前藥是一種由母體藥物衍生的藥理學物質(即藥物)。一旦給藥之后，前藥在體內被代謝成為母體藥物。前藥可以通過取代在化合物中存在的一個或多個官能團來制備。關于前藥的制備和使用可以在T.Higuchi and V.Stella,“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,”Vol.14of the A.C.S.Symposium Series和Bioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中找到。

上述的藥物組合物可以是任何可藥用的劑型，包括：片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑等；優(yōu)選口服劑型，如：膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。所述的口服劑型可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進行包衣。適宜的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑；適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉；適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂；適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉。

上述各種劑型均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備?？梢酝ㄟ^胃腸外給藥(注射)、口服給藥、噴霧吸入、局部給藥、經直腸給藥、經鼻腔給藥、陰道給藥、腹膜內給藥或經由植入的儲庫給藥；物理或化學介導的方法導入如肌肉、內皮、皮下、靜脈、黏膜組織；或是其他物質混合或包裹后導入機體。

用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。

在所述固體劑型中，活性成分與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和(i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。

所述的固體劑型還可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性成分的釋放可以延遲的方式在消化道內的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實例是聚合物質和蠟類物質。

用于口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性成分外，液體劑型可包含本領域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質的混合物等。除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料。

除了活性成分外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質的混合物等。

用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。

本發(fā)明提供的藥物組合物可以單獨給藥，也可以與其它藥學上可接受的化合物聯(lián)合給藥。

實驗結果表明化合物(式I)可抑制革蘭陽性菌生長，與糖肽類藥物萬古霉素、去甲萬古霉素或替考拉寧聯(lián)合，可增強糖肽類藥物的抗菌活性；可望開發(fā)成治療抗萬古霉素耐藥菌的藥物以替代現(xiàn)有的無法抑制萬古霉素耐藥菌生長的化學藥物，本發(fā)明可促使本發(fā)明提供的化合物(式I)充分發(fā)揮其藥用價值。

具體實施方式

下面結合實施例及對比例對本發(fā)明作進一步詳細、完整地說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。下列實施例中未注明的試劑均采用市售分析純，按照使用說明書操作。

實驗材料：

(一)菌株

Enterococcus faecium BM4147(VanA型萬古霉素耐藥腸球菌標準株，對糖肽類藥物萬古霉素及替考拉寧均耐藥)，由法國巴斯德研究所提供；

Enterococcus faecalis ATCC 29212(糞腸球菌ATCC標準株，對糖肽類藥物萬古霉素、去甲萬古霉素及替考拉寧均敏感，故亦可稱為萬古霉素敏感腸球菌)，購自美國標準生物品收藏中心；

(二)實驗試劑及耗材

陽離子調節(jié)的MH肉湯培養(yǎng)基(Cation-adjusted Mueller-Hinton broth)、MH瓊脂培養(yǎng)基(Mueller-Hinton agar)、腦心浸出液培養(yǎng)基(Brain-heart infusion broth)及空白藥敏紙片，均購自英國OXOID公司；

萬古霉素及替考拉寧標準品，購自中國藥品生物制品檢定所；

萬古霉素及替考拉寧Etest藥敏試條，購自法國生物梅里埃公司；

一次性試管、培養(yǎng)皿及96培養(yǎng)板，購自青島金典生化器材有限公司。

抗菌活性實驗

通過紙片擴散法藥敏試驗來評價化合物(式I)的抗菌活性，實驗步驟見美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI,Clinical and Laboratory Standards Institute)提供的操作手冊，每張實驗紙片含式I化合物50μg，抑菌實驗結果見表1。

表1式I化合物紙片擴散法藥敏試驗結果

其中，紙片(50μg)表示紙片含式I化合物50μg，紙片(100μg)表示紙片含式I化合物100μg，紙片(空白)表示紙片不含式I化合物。

由表1可知，式I化合物在低濃度時無明顯抑菌作用，但隨濃度升高，對萬古霉素耐藥及敏感菌株均有一定抑菌作用。

式I化合物與其他抗生素聯(lián)用的抗菌活性實驗

本實施例與實施例1的差別僅在于采用不同濃度的式I化合物(0mM、0.1mM、0.5mM或1.0mM)與糖肽類藥物(100μg萬古霉素或替考拉寧)聯(lián)用分別進行紙片擴散法藥敏試驗，以明確式I化合物與糖肽類藥物聯(lián)合后，對糖肽類藥物抗菌活性的影響。其實驗結果見表2。

表2化合物(式I)與糖肽類抗菌藥物聯(lián)用藥敏試驗結果

其中，萬古霉素的用藥量為16mg/L。

由表2可知，式I化合物為低濃度(0.1mM)時，與糖肽類藥物(萬古霉素、替考拉寧)聯(lián)合，對糖肽類藥物的抗菌活性無明顯增強作用，但隨濃度升高(0.5mM、1.0mM)，聯(lián)合糖肽類藥物無論對萬古霉素耐藥菌株還是敏感菌株，式I化合物對糖肽類藥物的抗菌活性均有明顯的增強作用。

萬古霉素最小抑菌濃度(MIC)測定：

采用Etest方法分別對不同濃度的化合物(式I)(0mM或1.0mM)與萬古霉素或替考拉寧聯(lián)用進行MIC實驗，實驗步驟見美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI,Clinical and Laboratory Standards Institute)及法國生物梅里埃公司提供的操作手冊，其實驗結果見表3。

表3化合物(式I)與糖肽類抗菌藥物聯(lián)用的MIC實驗結果

MIC實驗所用樣品與藥敏性實驗相同。

上述實驗證明，本發(fā)明提供的化合物(式I)具有顯著的抑菌活性，尤其是抑制萬古霉素耐藥菌的活性，此外與萬古霉素聯(lián)用后針對相同菌株的MIC降低，證明其與萬古霉素類抗生素聯(lián)用具有拮抗作用，可將本發(fā)明提供的化合物(式I)作為一種理想的抗菌藥物進行進一步研發(fā)利用。

最后有必要在此說明的是：以上實施例只用于對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細地說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據(jù)本發(fā)明的上述內容作出的一些非本質的改進和調整均屬于本發(fā)明的保護范圍。