易操作周期型馬來(lái)絲蟲m29表位基因dna疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種易操作周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因DNA疫苗的制備方法，以我國(guó)流行的周期型馬來(lái)絲蟲為研究對(duì)象，擴(kuò)增馬來(lái)絲蟲myosin基因片段，構(gòu)建了周期型馬來(lái)絲蟲myosin真核表達(dá)重組質(zhì)粒。根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析，推測(cè)其氨基酸序列，然后利用相關(guān)的軟件預(yù)測(cè)它們的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，制備出周期型馬來(lái)絲蟲肌球蛋白表位基因疫苗。將該疫苗免疫接種BALB/c小鼠，并檢測(cè)其疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫的應(yīng)答效果。試驗(yàn)結(jié)果證明了該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，取得滿意效果，制備周期型馬來(lái)絲蟲肌球蛋白表位基因疫苗獲得成功。
【專利說(shuō)明】易操作周期型馬來(lái)竺蟲M29表位基因DNA疫苗的制備方法
[0001 ] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枺?01410564361.9、申請(qǐng)日2014.10.21、名稱"周期型馬來(lái)絲蟲M29 表位基因 DNA疫苗的制備方法"的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及一種周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 淋己絲蟲病是全球最古老的疾病之一。據(jù)埃及開羅博物館展示的4000年前的古埃 及法老塑像，顯示患有右下肢象皮腫，即為該病典型臨床表現(xiàn)之一。據(jù)WK)報(bào)告，全球有83個(gè) 國(guó)家和地區(qū)共有淋己絲蟲感染者約1.2億，其中班氏絲蟲病約1.07億，馬來(lái)絲蟲病和帝議絲 蟲病共約1300萬(wàn)。運(yùn)些感染者中約4400萬(wàn)有淋己絲蟲病的臨床表現(xiàn)，約7600萬(wàn)為微絲蝴血 癥者。估計(jì)全球有受威脅人口超過(guò)11億，約占世界總?cè)丝诘?0%。我國(guó)曾是全球淋己絲蟲病 流行最嚴(yán)重的國(guó)家之一，受威脅人口達(dá)3.3億。雖然絲蟲病的防治在全球范圍內(nèi)取得了巨大 的成績(jī)，但由于氣候變暖等自然、生物和社會(huì)W及淋己絲蟲的夜現(xiàn)周期性和微絲蝴血癥者 多無(wú)臨床癥狀等諸多因素的廣泛存在，近年來(lái)在一些國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn)疫情復(fù)燃和蔓延的趨 勢(shì)，絲蟲病的流行不僅給人民的健康帶來(lái)嚴(yán)重危害，也成為因病致貧的重要原因之一。最新 研究報(bào)道表明，感染者殘存?zhèn)魅驹吹奈⒔z蝴血癥可持續(xù)20年W上，中等密度和較高密度微 絲蝴血癥者具有傳播絲蟲病的作用。所W后期的監(jiān)控與防治任務(wù)仍很艱巨。
[0004] 在我國(guó)流行的主要是班氏絲蟲和馬來(lái)絲蟲。后者生活史較復(fù)雜，主要包括幼蟲在 蚊體內(nèi)和成蟲在人體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程，此外還可在人體W外的多種脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育成熟。 淋己絲蟲病可導(dǎo)致患者永久或長(zhǎng)期致殘，被WK)列為世界第二大致殘病兇。尋找控制絲蟲病 疫苗的研究越來(lái)越受到人們重視。篩選有效的保護(hù)性抗原并有機(jī)結(jié)合W獲得最佳保護(hù)效應(yīng) 是疫苗研究的一個(gè)重要內(nèi)容。肌球蛋白（myosin)是一種廣泛存在于真核生物中的功能蛋 白，不僅存在于肌細(xì)胞中，而且在非肌細(xì)胞中也存在。它作為生物體的一種重要的收縮蛋白 質(zhì)，在調(diào)節(jié)肌肉收縮和細(xì)胞重組等方面發(fā)揮著重要作用。有關(guān)寄生蟲myosin的分子生物學(xué) 和免疫學(xué)方面的研究表明它是一種早期免疫顯性分子，具有較顯著的免疫原性，免疫動(dòng)物 可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。運(yùn)也是研究者致力于myosin分子疫苗和藥物研究的原因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種方法簡(jiǎn)便、易操作，效果好的周期型馬來(lái)絲蟲M29表位 基因 DNA疫苗的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：
[0007] 一種周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法，其特征是:包括 [000引下列步驟：
[0009] (一）引物設(shè)計(jì)
[0010] 根據(jù)GenBa址中周期型馬來(lái)絲蟲肌球蛋白基因（的高度保守
[00川序列區(qū)，應(yīng)用Primer Premie巧.ο軟件設(shè)計(jì)引物，并分別引入趾ο I/BamH I酶切位 點(diǎn)，起始終止密碼W及保護(hù)性堿基；
[0012] ?1:上游5'-〇： GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T-3'
[OOU] 下劃線序列為Ba恤I酶切位點(diǎn)Tm = 56.84
[0014] P2:下游5'-CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG-3'
[001引下劃線序列為趾0I酶切位點(diǎn)Tm = 66.90
[0016] (二)周期型馬來(lái)絲蟲蟲體及微絲蝴的收集和總RNA的提取和測(cè)定
[0017] (1)將取自長(zhǎng)爪沙鼠腹腔液的成蟲及微絲蝴移入1.5ml勻漿器中，加入1mlTrizol 試劑研磨，室溫靜置5min;
[001引 （2)加入0.2ml氯仿，震蕩15s后靜置2min，4°C，12000巧m離屯、15min取上清；
[0019] (3)加入0.5ml異丙醇混勻，室溫靜置10min，4°C，12000巧m離屯、lOmin棄上清；
[0020] (4)加入1ml 75%乙醇混勻，4°C ,9000巧m離屯、5min棄上清；
[0021] (5)干燥5min后溶于DEPC處理水30ul，60 °C 1 Omin;
[0022] (6)取化1總RNA稀釋200倍，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)0D260和0D280值，確定其濃度 和純度，并進(jìn)行甲醒電泳檢測(cè)；
[0023] (S)cDNA 的合成
[0024] (1)取總RNA 5ul,后加入lOmM dNTPmix lul，0.5ug/ul oligo(dT)12-18ul，DEPC 處理水3ul，65°C加熱5min，后冰浴5min;
[0025] (2)另取lOXBuffer 化l，25mM MgC12 4ul，0.1M DTT 化1，RNA酶抑制劑lul混勻， 42°C 解育 2min;
[00%] (3)將步驟(2)混合液加入步驟（1)物質(zhì)中混勻，再加入lul逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript Π 混勻;42°C解育50min，70°C 15min終止反應(yīng)，-70°C保存?zhèn)溆茫?br>[0027](四）PCR 擴(kuò)增 Bm-myosin 基因
[002引 P1 = 56.84，P2 = 66.90,反應(yīng)體系cDNA 1.5ul，10XPCR Buffer 2.5ul，2.5mM dNTTmix 4.0ul，Pl P2各0.7ul,抓/ill TaqDNA聚合蛋白酶0.化l，d地20 15.4ul;混勻在DNA 擴(kuò)增儀?了0100上進(jìn)行？〔1?;循環(huán)參數(shù)為：941：3111111，941：503,511：453,721：903，共33個(gè)循 環(huán)，最后一次循環(huán)72°C延伸反應(yīng)時(shí)間為7min，4°C冷卻終止反應(yīng)；同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。PCR產(chǎn) 物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
[0029] (五)Bm-myosin基因片段純化和T載體的連接W及轉(zhuǎn)化
[0030] (1)純化Bm-myosin基因片段:取50U1PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈 下切割含目的基因的凝膠，按膠回收試劑盒說(shuō)明，純化回收產(chǎn)物；
[0031] (2)感受態(tài)大腸桿菌的制備:大腸桿菌D冊(cè)α在新鮮LB瓊脂平板上37 °C培養(yǎng)過(guò)夜;挑 取單菌落于3ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過(guò)夜；取300ul菌液加入30ml LB培養(yǎng)基中，37°C 220巧m振蕩4h,冰浴化，后分裝到1.5ml Eppendorf管4°C離，8000巧m 5min;棄上清，加入冰 浴 O.lmol/L MgC12 lOOul 懸浮，4°C 離屯、，8000rpm 5min,棄上清，加入冰浴 O.lmol/L 化Cl2-10%甘油溶液300ul懸浮，-70°C保存?zhèn)溆茫?br>[0032] (3)Bm-myosin基因和pGEM-T載體的連接:取純化的PCR產(chǎn)物3ul，2X快速連接緩沖 液加 1，pGEM - T 載體 1U1，T4DNA 連接酶 3we i S S /u 1 1U1，共 1 Ou 1 混勻，4 °C 連接20h;
[0033] (4).轉(zhuǎn)化:取連接反應(yīng)物lOul加入新鮮制備的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞300ul混 勻，冰浴30min，42°C熱休克90s，快速移至冰浴3min，加入200ul LB培養(yǎng)基，37°C解育45min。 將培養(yǎng)物lOOul涂在含有X-gal，IPTG，Amp的1.5%瓊脂平板上，倒置平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)；
[0034] (六）陽(yáng)性重組克隆的篩選和鑒定
[0035] (1)陽(yáng)性重組克隆的篩選:挑取生長(zhǎng)狀態(tài)好的白色菌斑，并提取質(zhì)粒；
[0036] (2)PCR鑒定：W重組質(zhì)粒Bm-myosin/pGEM-T為模板，用Bm-myosin的引物P1、P2進(jìn) 行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系25ul ,Bm-myosin/pGEM-T重組質(zhì)粒 1.加1,10 XPCR Buffer 2.5ul, 2.51111(1饑'化1義4.〇111，？1、？2各0.7111，抓/111化9〇臟聚合蛋白酶0.化1，(1地20 15.4111;循環(huán) 參數(shù)為:94°C3min，94°C50s，51°C45s，72°C90s，共33個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)72°C延伸反應(yīng)時(shí) 間為7min，4°C冷卻終止反應(yīng);PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
[0037] (3)酶切鑒定:取經(jīng)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，用BamHI與化〇1雙酶切，用1.0%瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)酶切片段；
[003引（屯)Bm-MYOSIN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
[0039] 分別應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的50?]^、601?、11證'6山(3、!1順方法^及6]\?055程序分析 預(yù)測(cè)Bm-myosin的二級(jí)結(jié)構(gòu)；
[0040] (八)Bm-MYOSIN親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔初性參數(shù)預(yù)測(cè)
[0041 ] 采用化pp&Woods親水性參數(shù)、血ini表面可及性參數(shù)、Jameson-Wolf抗原性參數(shù)、 Zimmerman極性參數(shù)和柔初性參數(shù)預(yù)測(cè)；
[0042] (九)Bm-MYOSIN T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)
[0043] (1)人源化AI類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的AA序列WFASTA格式輸入 Rankpep服務(wù)器，選擇AA長(zhǎng)度為9-mers，基因型為化4-40201、化4-41101，預(yù)測(cè)化41類分子結(jié) 合膚，保留輸出的結(jié)果；
[0044] (2)鼠源MHCI類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的AA序列WFASTA格式輸入 Rankpep服務(wù)器，選擇AA長(zhǎng)度為9 -mer S，基因型為肥-d，包括H2 - Kd、H2 - Ld和肥-Dd，為肥-d型 小鼠表達(dá)的MHCI類分子;預(yù)測(cè)MHCI類分子結(jié)合膚，保留輸出的結(jié)果；
[0045] (3)人源HLA Π 類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的AA序列WFASTA格式輸入 Rankp邱服務(wù)器，選擇基因型為HLA - DRB1 *0101、HLA - DRB1 *0 301、HLA - DRB1 *0 401、HLA - DRB1 * 0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1301、HLA-DRB1*1501，預(yù) 測(cè)HLA Π 類分子結(jié)合膚，保留輸出的結(jié)果；
[0046] (4)鼠源MHCn類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的ΑΑ序列WFASTA格式輸入 Rankpep服務(wù)器，選擇選擇基因型為I-Ad、I-Ed，預(yù)測(cè)鼠源MHCn類分子結(jié)合膚，保留輸出的 結(jié)果；
[0047] (十)表位基因片段的選擇
[0048] 根據(jù)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)和T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇富含抗原表位的基因片段56化P- 1269bp設(shè)計(jì)引物，W質(zhì)粒pcDNA3.1( + )-BmM55為模板，并將該片段克隆至原核表達(dá)載體祀T- 28a(+)中，構(gòu)建祀T-BmM29。應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物；
[0049] 上游P1:5' -GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC-3'
[(K)加]其中GGATCC為BamHI酶切位點(diǎn)；
[0化 1 ]下游P2:5 ' -CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT [0化2] 其中GAATTC為EcoRI酶切位點(diǎn)；
[0053] 引物使用前用dd肥0溶解，濃度為1 ΟμL?ο 1 /1;
[0054] (十一)表位基因片段PCR擴(kuò)增
[0055] (1似PCDNA3.1 ( + ) - BmM55為模板，Ρ1、Ρ2分別為上、下游引物，反應(yīng)體系： [0化6] PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
[0059] 擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：
[0化7]
[0化引
[0060]
[0061] 取化1樣品用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增目的基因；
[0062] (十二）目的基因與載體連接與鑒定
[0063] A、PCR產(chǎn)物及祀T-28a( + )載體質(zhì)粒雙酶切體系：
[0064] 雙酶切反應(yīng)體系
[00 化]
[0066] 目的基因與載體連接，具體反應(yīng)體系：
[0067] 目的基因與載體連接反應(yīng)體系
[006引
[0069] 混勻，室溫反應(yīng)30minW上，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化；
[0070] B、E.coli D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0071] (1)用接種環(huán)取保存于-80°CDH5a菌液，劃菌于不含抗生素的LB平板上，37°C倒置 培養(yǎng)約14-1化至單菌落出現(xiàn)；
[0072] (2)挑單菌落至5ml無(wú)抗性的LB液，37 °C振蕩培養(yǎng)約10 -1化；
[0073] (3)取1ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液至含100ml無(wú)抗LB液中，37°C振蕩培養(yǎng)約2-2.化，至化D值 達(dá) 0.5,冰浴5-lOmin;
[0074] (4)分裝到2個(gè)50ml預(yù)冷無(wú)菌的離屯、管，4°C ,1600巧m離屯、7min;
[00巧](5)用10ml冰冷的0.1M CaC12溶液重懸細(xì)胞，4°C，1100巧m離屯、5min;
[0076] (6)用10ml冰冷的0.1M CaC12溶液重懸細(xì)胞，冰上放置30min后，4°C，1100巧m離屯、 5min；
[0077] (7)用2ml冰冷的0.1M化CI2溶液重懸細(xì)胞，分裝后15%甘油凍存于-80°C;
[0078] C、轉(zhuǎn)化及鑒定
[0079] (1)取10化1膽存于-80°C巧化菌，冰浴化開;加入10μ1連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴 30min；
[0080] (2)熱休克，42 Γ水浴30 - 90s，勿動(dòng)；
[0081 ] (3)快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻l-2min;
[0082] (4)加2.25ml LB液至試管，再加0.25ml混合物，傾斜放置，37°C，100巧m振蕩培養(yǎng) 45min；
[0083] (5)5000巧111離屯、1111；[]1;
[0084] (6)棄部分上清，混勻后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均勻，室溫靜置，直至 液體被吸收，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12-1化；
[0085] (7)用白槍頭挑單克隆至5ml含Amp的LB液，37°C，220巧m振蕩培養(yǎng)12-1化，至0D值 在0.6-0.8之間；
[0086] (8)同時(shí)按上述步驟做陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)化反應(yīng)；
[0087] (9)提取質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒電泳鑒定和PCR鑒定；
[008引（10)選取PCR鑒定陽(yáng)性菌液，于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序；
[0089] (十S)BmM29表位基因真核表達(dá)載體構(gòu)建
[0090] 純化目的表位基因并亞克隆至真核表達(dá)載體PCDNA3.U + )的BamH巧蛇coRI的克隆 位點(diǎn)。目的基因和載體的摩爾比為5:1，反應(yīng)體系25ul，16°C水浴連接過(guò)夜;取連接液轉(zhuǎn)化感 受態(tài)大腸桿菌D冊(cè)α，涂布于LB-Amp平板上，其中每mlLB中含AmplOOmg，37°C過(guò)夜培養(yǎng);從LB- Amp平板上隨機(jī)挑取單個(gè)菌落，分別接種于LB-Amp培養(yǎng)基中，37 Γ振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，提取重組 質(zhì)粒，經(jīng)BamHI和EcoRI酶切，后1. ο %瓊脂糖凝膠電泳鑒定；
[0091] (十四)BmM29表位基因疫苗免疫應(yīng)答試驗(yàn)
[0092] A. PCDNA3.1 ( + )和PCDNA3.1 ( + ) - BmM29 質(zhì)粒大量抽提
[0093] (1)取100ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入50ml離屯、管，12000巧m離屯、3min收集細(xì)菌，盡量 棄盡上清；
[0094] (2)1200化pm離屯、3min，用移液器把剩下的少量液體吸出；
[0095] (3)加入10ml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液1，使用滿旋振蕩器和移液器讓細(xì)胞懸 浮，無(wú)小菌塊；
[0096] (4)加入10ml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液2,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫靜置 5min；
[0097] (5)加入10ml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液4,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫靜置 lOmin，1200化pm離屯、20min，將溶液全部倒入過(guò)濾柱中，慢慢推動(dòng)推柄，濾液收集在50ml離 屯、管中；
[009引（6)向?yàn)V液中加8ml異丙醇，混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱，12000rpm離屯、2min，棄收集管中 的廢液；
[0099] (7)向吸附柱中加3ml去內(nèi)毒素緩沖液，室溫靜置2min，12000rpm離屯、2min，棄收集 管中的廢液；
[0100] (8)向吸附柱中加入漂洗液W2，12000巧m離屯、2min，棄收集管中的廢液。重復(fù)一次；
[0101] (9)將吸附柱重新放回收集管，12000巧m離屯、5min，去除吸附柱中殘余的液體。
[0102] (10)吸附柱置于干凈的50ml收集管，加1ml洗脫液TE，室溫靜置5min，12000巧m離 屯、2min;
[0103] (11)用生理鹽水將純化的質(zhì)粒稀釋至終濃度為lmg/ml，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br>[0104] 步驟(十二)C(7)中，0D 值為 0.7.
[0105] 一種免疫佐劑，其特征是：序列如下：CpG 0DN 1826 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT- 3/，并全鏈硫代憐酸骨架修飾來(lái)增強(qiáng)其核酸酶抗性。
[0106] 本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、易操作，效果好。本發(fā)明W我國(guó)流行的周期型馬來(lái)絲蟲為研究對(duì) 象，擴(kuò)增馬來(lái)絲蟲町osin基因片段，構(gòu)建了周期型馬來(lái)絲蟲町osin真核表達(dá)重組質(zhì)粒 (pcDNA3.1( + )-Bm-myosin)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析，推測(cè)其氨基酸序列，然后利用相關(guān)的軟件 預(yù)測(cè)它們的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，制備出周期型馬來(lái)絲蟲肌球蛋白表位基因疫苗。將該 疫苗免疫接種BALB/c小鼠，并檢測(cè)其疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫的應(yīng)答效果。試驗(yàn)結(jié)果證 明了該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，取得滿意效果，制備周期型馬來(lái)絲蟲 肌球蛋白表位基因疫苗獲得成功。
[0107] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】 [010引一、引物設(shè)計(jì)
[0109] 根據(jù)GenBank中周期型馬來(lái)絲蟲肌球蛋白基因（Bm-myosin)的高度保守序列區(qū)，應(yīng) 用Primer Premie巧.0軟件設(shè)計(jì)引物，并分別引入趾oI/BamHI酶切位點(diǎn)，起始終止密碼W及 保護(hù)性堿基，引物由上海生物工程公司合成。
[0110] ?1:上游5'-〇： GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA Τ_3'
[0111] 下劃線序列為BamHI酶切位點(diǎn)化= 56.84
[0112] P2:下游5'-CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG-3'
[0113] 下劃線序列為趾ol酶切位點(diǎn)化= 66.90
[0114] 二、周期型馬來(lái)絲蟲蟲體及微絲蝴的收集和總RNA的提取和測(cè)定
[0115] 1.將取自長(zhǎng)爪沙鼠腹腔液的成蟲及微絲蝴移入1.5ml勻漿器中，加入1mlTrizol試 劑充分研磨，室溫靜置5min。
[0116] 2.加入0.2ml氯仿，震蕩15s后靜置2min，4°C，12000巧m離屯、15min取上清。
[0117] 3.加入0.5ml異丙醇混勻，室溫靜置10min,4°C , 12000巧m離屯、lOmin棄上清。
[0118] 4.加入1ml 75%乙醇混勻，4°C ,9000巧m離屯、5min棄上清。
[0119] 5.干燥5min后溶于DEPC處理水30ul，60°C lOmin。
[0120] 6.取2ul總RNA稀釋200倍，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)0D260和0D280值，確定其濃度和 純度，并進(jìn)行甲醒電泳檢測(cè)。
[0121] S、cDNA 的合成
[0122] 1.取總RNA 加1，后加入lOmM dNTTmix lul，0.5ug/ul oligo(dT)12-18ul，DEPC處 理水3ul，65°C加熱5min,后冰浴5min。
[0123] 2.另取lOXBuffer 化l，25mM MgC12 4ul，0.1M DTT 化1，RNA 酶抑制劑 lul混勻， 42°C 解育 2min。
[0124] 3.將步驟2混合液加入步驟1混勻，再加入lul逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript Π 混勻，42°C 解育50min，70°C 15min終止反應(yīng)，-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0125] 四、PCR 擴(kuò)增 Bm-myosin 基因
[0126] P1 = 56.84，P2 = 66.90,反應(yīng)體系cDNA 1.5ul，10XPCR Buffer 2.5ul，2.5mM dNTTmix 4.0ul，Pl P2各0.7ul,抓/ill TaqDNA聚合蛋白酶0.化l，d地20 15.4ul?；靹蛟贒NA 擴(kuò)增儀PTC-100上進(jìn)行PCR。循環(huán)參數(shù)為：94°C3min，94°C50s，51°C45s，72°C90s，共33個(gè)循 環(huán)，最后一次循環(huán)72°C延伸反應(yīng)時(shí)間為7min，4°C冷卻終止反應(yīng)。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。PCR產(chǎn) 物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0127] 五、Bm-myosin基因片段純化和T載體的連接W及轉(zhuǎn)化
[01巧]1.純化Bm-myosin基因片段:取50U1PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下 切割含目的基因的凝膠，按膠回收試劑盒說(shuō)明，純化回收產(chǎn)物。
[0129] 2.感受態(tài)大腸桿菌的制備：大腸桿菌D冊(cè)α在新鮮LB瓊脂平板上37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑 取單菌落于3ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過(guò)夜。取300ul菌液加入30ml LB培養(yǎng)基中，37°C 220巧m振蕩4h,冰浴化，后分裝到1.5ml E卵endorf管4°C離，8000巧m 5min。棄上清，加入冰 浴 O.lmol/L MgC12 lOOul 懸浮，4°C 離屯、，8000rpm 5min,棄上清，加入冰浴 O.lmol/L CaCl2-10%甘油溶液300ul懸浮，-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0130] 3. Bm-myosin基因和pGEM-T載體的連接:取純化的PCR產(chǎn)物3ul，2 X快速連接緩沖 液加 1，pGEM - T 載體(50ng)lul, T4DNA 連接酶 3we i S S /u 1 1U1，共 1 Ou 1 混勻，4 °C 連接20h。
[0131] 4.轉(zhuǎn)化:取連接反應(yīng)物lOul加入新鮮制備的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞300ul混勻， 冰浴30min，42°C熱休克90s，快速移至冰浴3min，加入200ul LB培養(yǎng)基，37°C解育45min。將 培養(yǎng)物lOOul涂在含有X-gal，IPTG，Amp的1.5%瓊脂平板上，倒置平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。
[0132] 六、陽(yáng)性重組克隆的篩選和鑒定
[0133] 1.陽(yáng)性重組克隆的篩選:挑取生長(zhǎng)狀態(tài)好的白色菌斑，并提取質(zhì)粒。
[0134] 2.PCR鑒定：W重組質(zhì)粒Bm-myosin/pGEM-T為模板，用Bm-myosin的引物P1 P2進(jìn)行 PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系25ul，Bm-myosin/pGEM-T重組質(zhì)粒 1.加1，10 X PCR Buff er2.5ul，2.5mM dNTTmix4. Oul，PI P2各0.7ul，抓All TaqDNA聚合蛋白酶0.化1，d地2015.4ul。循環(huán)參數(shù)為： 94°C3min，94°C50s，5rC45s，72°C90s，共33個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)72°C延伸反應(yīng)時(shí)間為 7min，4 °C冷卻終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[01巧]3.酶切鑒定：取經(jīng)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，用BamHI與趾〇1雙酶切，用1.0%瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)酶切片段。
[0136] 屯、Bm-MYOSIN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
[0137] 分別應(yīng)用EXPASY服務(wù)器化ttp : //www . expasy . ch/tool S)上的S0PMA、G0R、 nnPredict(University of California at SanFrancisco(UCSF))、HNN(Hierarchical NeuralNetwork methodiGuermeur，1997)方法W及EMBOSS程序分析預(yù)測(cè)Bm-myosin的二級(jí) 結(jié)構(gòu)。
[0138] 八、Bm-MYOSIN親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔初性參數(shù)預(yù)測(cè)
[0139] 采用化pp&Woods親水性參數(shù)、血ini表面可及性參數(shù)、Jameson-Wo If抗原性參數(shù)、 Zimmerman 極性參數(shù)和柔初性參數(shù)預(yù)測(cè)化 ttp: //www. expasy. org/cgi -bin/protscale. pi)
[0140] 九、Bm-MYOSIN T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)
[0141] 1.人源化AI類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的AA序列WFASTA格式輸入 Rankpep服務(wù)器，選擇AA長(zhǎng)度為9-mers，基因型為化4-40201、化4-41101，預(yù)測(cè)化41類分子結(jié) 合膚，保留輸出的結(jié)果。
[0142] 2.鼠源MHCI類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的AA序列WFASTA格式輸入 Rankpep服務(wù)器，選擇AA長(zhǎng)度為9 -mer S，基因型為肥-d (包括H2 - Kd、H2 - Ld和肥-Dd，為肥-d型 小鼠表達(dá)的MHCI類分子），預(yù)測(cè)MHCI類分子結(jié)合膚，保留輸出的結(jié)果。
[0143] 3 .人源HLA Π 類分子結(jié)合表位的預(yù):將肌球蛋白的AA序列WFASTA格式輸入 Rankp邱服務(wù)器，選擇基因型為HLA - DRB1 *0101、HLA - DRB1 *0 301、HLA - DRB1 *0 401、HLA - DRB1 * 0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1301、HLA-DRB1*1501，預(yù) 測(cè)HLA Π 類分子結(jié)合膚，保留輸出的結(jié)果。
[0144] 4.鼠源MHCn類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的ΑΑ序列WFASTA格式輸入 Rankpep服務(wù)器，選擇選擇基因型為I-Ad、I-Ed，預(yù)測(cè)鼠源MHCn類分子結(jié)合膚，保留輸出的 結(jié)果。
[0145] 十、表位基因片段的選擇
[0146] 根據(jù)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)和T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇富含抗原表位的基因片段 (562bp-1269bp)設(shè)計(jì)引物，W質(zhì)粒pcDNA3.1( + )-BmM55為模板，并將該片段克隆至原核表達(dá) 載體祀T- 28a(+)中，構(gòu)建祀T-BmM29。應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物。
[0147] 上游(P1) :5' -GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC-3'
[014引（其中GGATCC為BamHI酶切位點(diǎn)）；
[0149] 下游(P2) :5' - CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT
[0150] (其中GAATTC為EcoRI酶切位點(diǎn)）。
[0151] 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，使用前用dd出0溶解，濃度為10ymol/L。
[0152] 十一、表位基因片段PCR擴(kuò)增
[0153] 1. WpcDNA3.1( + )-BmM55為模板，P1、P2分別為上、下游引物，反應(yīng)體系見表1。
[0154] 表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
[0159] 取化1樣品用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增目的基因。
[0160] 十二、目的基因與載體連接與鑒定
[0161] 1.PCR產(chǎn)物及祀T-28a( + )載體質(zhì)粒雙酶切體系見表2。
[0162] 表2雙酶切反應(yīng)體系
[0163]
[0164] 目的基因與載體連接，具體反應(yīng)體系見表3。
[0165] 表3目的基因與載體連接反應(yīng)體系
[0166]
[0167]
[0168] 混勻，室溫反應(yīng)30minW上，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化。
[0169] 2.E.coli D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0170] (1)用接種環(huán)取保存于-80°CDH5a菌液，劃菌于不含抗生素的LB平板上，37°C倒置 培養(yǎng)約14-1化至單菌落出現(xiàn)。
[0171] (2)挑單菌落至5ml無(wú)抗性的LB液，37 °C振蕩培養(yǎng)約10 -1化。
[0172] (3)取1ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液至含100ml無(wú)抗LB液中，37°C振蕩培養(yǎng)約2-2.化，至化D值 達(dá) 0.5,冰浴5-lOmin。
[0173] (4)分裝到2個(gè)50ml預(yù)冷無(wú)菌的離屯、管，4°C，1600巧m離屯、7min。
[0174] (5)用10ml冰冷的0.1M CaC12溶液重懸細(xì)胞，4°C，1100巧m離屯、5min。
[01對(duì) （6)用10ml冰冷的0.1M CaC12溶液重懸細(xì)胞，冰上放置30min后，4°C，1100巧m離屯、 5min。
[0176] (7)用2ml冰冷的0.1M化C12溶液重懸細(xì)胞，分裝后15%甘油凍存于-80°C。
[0177] 3.轉(zhuǎn)化及鑒定
[0178] (1)取10化1膽存于-80°C巧化菌，冰浴化開;加入10μ1連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴 30min。
[01巧](2)熱休克，42 Γ水浴30 - 90s，勿動(dòng)。
[0180] (3)快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻l-2min。
[0181] (4)加2.25ml LB液至試管，再加0.25ml混合物，傾斜放置，37°C，100巧m振蕩培養(yǎng) 45min。
[0182] (5)5000巧111離屯、1111；[]1。
[0183] (6)棄部分上清，混勻后倒在LB平板(含Amp)上，用涂布器涂均勻，室溫靜置，直至 液體被吸收，37°C溫箱倒置培養(yǎng)12-1化。
[0184] (7)用白槍頭挑單克隆至5ml LB液(含Amp)，37°C，220巧m振蕩培養(yǎng)12-1化，至0D值 在0.6-0.8之間。
[0185] (8)同時(shí)按上述步驟做陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
[0186] (9)提取質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒電泳鑒定和PCR鑒定。
[0187] (10)選取PCR鑒定陽(yáng)性菌液，于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增后送上海英驗(yàn)生物技術(shù)有限 公司進(jìn)行測(cè)序。
[0188] 十Ξ、ΒπιΜ29表位基因真核表達(dá)載體構(gòu)建
[0189] 純化目的表位基因并亞克隆至真核表達(dá)載體PCDNA3.U + )的BamH巧蛇coRI的克隆 位點(diǎn)。目的基因和載體的摩爾比為5:1，反應(yīng)體系25ul，16°C水浴連接過(guò)夜。取連接液轉(zhuǎn)化感 受態(tài)大腸桿菌D冊(cè)α，涂布于LB-Amp( lOOmg/ml)平板上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。從LB-Amp( lOOmg/ml) 平板上隨機(jī)挑取單個(gè)菌落，分別接種于LB-Amp培養(yǎng)基中，37 °C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì) 粒，經(jīng)BamHI和EcoRI酶切，后1.0 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0190] 十四、BmM29表位基因疫苗免疫應(yīng)答試驗(yàn)
[0191] 1. PCDNA3.1 ( + )和PCDNA3.1 ( + ) -BmM29 質(zhì)粒大量抽提
[0192] (1)取100ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入50ml離屯、管，12000巧m離屯、3min收集細(xì)菌，盡量 棄盡上清。
[0193] (2) 1200化pm離屯、3min，用移液器把剩下的少量液體吸出。
[0194] (3)加入10ml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液1，使用滿旋振蕩器和移液器讓細(xì)胞懸 浮，無(wú)小菌塊。
[0195] (4)加入10ml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液2,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫靜置 5min〇
[0196] (5)加入10ml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液4,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫靜置 lOmin，1200化pm離屯、20min，將溶液全部倒入過(guò)濾柱中，慢慢推動(dòng)推柄，濾液收集在50ml離 屯、管中。
[0197] (6)向?yàn)V液中加8ml異丙醇，混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱，12000rpm離屯、2min，棄收集管中 的廢液。
[0198] (7)向吸附柱中加3ml去內(nèi)毒素緩沖液，室溫靜置2min，12000rpm離屯、2min，棄收集 管中的廢液。
[0199] (8)向吸附柱中加入漂洗液W2，12000巧m離屯、2min，棄收集管中的廢液。重復(fù)一次。
[0200] (9)將吸附柱重新放回收集管，12000巧m離屯、5min，去除吸附柱中殘余的液體。
[0201] (10)吸附柱置于干凈的50ml收集管，加1ml洗脫液TE，室溫靜置5min，12000巧m離 屯、2min。
[0202] (11)用生理鹽水將純化的質(zhì)粒稀釋至終濃度為lmg/ml，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br>[0203] 2.免疫佐劑CpG 0DN的制備
[0204] 新型佐劑中W非甲基化的胞喀晚和鳥嚷嶺核巧酸為核屯、的寡聚脫氧核巧酸(CpG 0DN)最具代表性。CpG 0DN合成的序列如下:CpG 0DN 1826 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'， 并全鏈硫代憐酸骨架修飾來(lái)增強(qiáng)其核酸酶抗性，由上海英驗(yàn)生物公司合成。用生理鹽水溶 解配制成Img/ml。
[02化]3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
[0206] 將48只BALB/c實(shí)驗(yàn)小鼠稱量體重排序，按照隨機(jī)數(shù)字表法分4組，每組12只，A: PBS 對(duì)照組;B:佐劑CpG對(duì)照組;C:空載體PCDNA3.1 ( + )/CpG組;D:重組質(zhì)粒PCDNA3.1 ( + ) -BmM29/ CpG組，免疫方案為0、2、4周各免疫一次。
[0207] 4.接種部位預(yù)處理
[0208] DNA疫苗注射部位為小鼠后腿腔前肌，重組蛋白疫苗為皮下多點(diǎn)注射。將1ml左旋 鹽酸布比卡因注射液稀釋到14ml生理鹽水中，得到0.5mg/ml稀釋液。每次接種前2地，于接 種部位注射左旋鹽酸布比卡因50μ1進(jìn)行預(yù)處理。
[0209] 5.免疫接種
[0^0] A:PBS 100μ1;Β:佐劑CpG 30yg;C:pcDNA3.1( + )/CpG 100yg/30yg;D:pcDNA3.1 (+) - BmM29/CpG 100yg/30yg。共免疫 3次，每次間隔 2 周。
[0211] 十四、免疫應(yīng)答反應(yīng)檢測(cè)
[0212] 1.血清采集:分別于初次免疫后4、6、8周用眼球摘除法收集小鼠血清，每組取4只 小鼠。室溫靜置化，置4 °C過(guò)夜，待析出血清，4 °C，400化pm離屯、1 Omin。分裝血清，膽存于-80 Γ。
[0213] 2.免疫小鼠血清中IgG檢測(cè)
[0214] (1)抗原包被:用抗原包被緩沖液將抗原稀釋成扣g/mL，Wl(K)yl/孔包被酶標(biāo)板，4 °C過(guò)夜；
[0215] (2)棄液體，用PBST洗涂3次。使用100μΙ/孔封閉液封閉，室溫靜置化；
[0216] (3)棄液體，血清用抗體稀釋液按照比例稀釋后，100μΙ/孔，室溫化；
[0217] (4)用 PBST 洗涂 3次；
[0218] (5)用樣品稀釋液1:2000稀釋HRP偶聯(lián)的IgG抗體后，100μΙ/孔，室溫化；
[0219] (6)使用PBST洗涂3次；
[0220] (7)加入10化1/孔底物液，作用15min后，加5化1 2mol/L出S化終止反應(yīng)；
[0221] (8)在450nm處測(cè)定吸光值，保存數(shù)據(jù)。
[0222] 3.小鼠脾細(xì)胞采集
[0223] (1)初次免疫后8周處死小鼠；
[0224] (2)取無(wú)菌10ml螺口管，加入3ml淋己細(xì)胞分離液，37 °C預(yù)熱化；
[0225] (3)將處死的小鼠置75%乙醇溶液中2-3min進(jìn)行消毒；
[0226] (4)將小鼠左腹側(cè)朝上，用綴子將小鼠左腹部皮膚輕輕提起，用手術(shù)剪剪出約1cm 長(zhǎng)刀口，用手將腹部皮膚撕開，暴露腹膜，可見紅色長(zhǎng)條狀脾臟，將其小屯、分離。
[0227] (5)將100目銅篩放入盛3ml化nk^s液的平皿中，將脾臟放在銅篩上，先將脾臟撕 碎，再用玻璃棒輕輕研磨，直至銅篩上只剩下結(jié)締組織，再用3ml化nk^ S液沖洗銅篩；
[0。引（6)將含3ml淋己細(xì)胞分離液的螺口管傾斜45°，用滴管將平皿中的細(xì)胞懸液沿管 壁緩慢轉(zhuǎn)移(淋己細(xì)胞分離液:細(xì)胞懸液=1:2)，不要沖破淋己細(xì)胞分離液的界面；
[02巧](7)室溫2000巧m離屯、20min，管中液體分為4層；
[0230] (8)取白色的第2層，轉(zhuǎn)移至含10ml化nk^s液的50ml離屯、管中，室溫1000巧m離屯、 lOmin;
[0231] (9)棄上層液體，加入10ml化址/ S液，輕輕吹打混勻，室溫1000巧m離屯、lOmin;
[0232] (10)棄上層液體，加入10ml化址/ S液，輕輕吹打混勻，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；
[0233] (11)室溫1000巧m離屯、lOmin，棄上層液體，加入適量完全培養(yǎng)基使得細(xì)胞的終濃 度為 2X 106cells/ml。
[0234] 4.細(xì)胞因子的誘生
[0235] 24孔板加入2X106cells/ml細(xì)胞懸液47扣1/孔，每孔各加 100μΙ/ml ConA 25μ1至 終濃度為扣g/ml，5 %C02培養(yǎng)箱中37°C解育4她。5000巧m離屯、1 Omin收集培養(yǎng)液，取上清準(zhǔn) 備檢測(cè)。
[0236] 5.INF-丫和IL-4含量測(cè)定
[0237] (1)提前20min取出保存在4°C的化ISA試劑盒，平衡至室溫；
[0238] (2)將濃縮洗涂液用dd肥0稀釋20倍；
[0239] (3)從已平衡至室溫的密封袋中取出酶標(biāo)板，加入標(biāo)準(zhǔn)樣品（160pg/ml、80pg/ml、 40pg/ml、20pg/ml、lOpg/ml、Opg/ml)各50ul;
[0240] (4)從已平衡至室溫的密封袋中取出酶標(biāo)板，除空白孔外，分別加入樣品稀釋液 40ul和待測(cè)樣品lOul;
[0241] (5)除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體 10化1，用封板膜封住反應(yīng)孔，37°C解育30min;
[0242] (6)棄去液體，在吸水紙上拍干，每孔加滿洗涂液，靜置Imin，甩去洗涂液，在吸水 紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；
[0243] (7)每孔先加入顯色劑A、B各50μ1，37Γ避光解育15min;
[0244] (8)每孔加入終止液50μ1，15π?η內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的0D值；
[0245 ] (9)計(jì)算0D值:每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的0D值減去至白孔的0D值；
[0246] (10)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的0D值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品 線性回歸曲線；
[0247] (11)通過(guò)樣品的0D值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該樣品的濃度。
[0248] 6.數(shù)據(jù)分析
[0249] 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析樣本數(shù)據(jù)，計(jì)量資料W均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，小鼠血 清抗體的OD450值、小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN- 丫和比-4水平的組間比較比較采用 單因素方差分析，組間多重比較采用SNK(S化dent-Newman-Keuls)法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。
[0250] 表4免疫小鼠血清抗體0D450值測(cè)定
[0251]
[0252] 注:*表示與Ξ個(gè)對(duì)照組分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。
[0253] 表5不同免疫分組小鼠細(xì)胞因子INF- 丫和比-4水平(pg/ml)
[0 巧 4]
[02巧]注:*表示與Ξ個(gè)對(duì)照組分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。
[0256]通過(guò)試驗(yàn)成功地?cái)U(kuò)增出周期型馬來(lái)絲蟲myosin基因片段。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)，Bm-myosin擴(kuò)增片段大小與預(yù)期的1292bp基本相符?；驕y(cè)序與GeneBank上提供的 序列blast比較的結(jié)果，同源性為98%，證明克隆片段正確。其表達(dá)蛋白為431個(gè)氨基酸。綜 合Bm-MYOSIN蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和親水性、表面可及性、極性及柔初性參數(shù)等B細(xì)胞表位 預(yù)測(cè)結(jié)果，W及T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)研究結(jié)果，選擇富含抗原表位的基因片段(562bp-1269bp)， 將真核表達(dá)載體PCDNA3.1 ( + )質(zhì)粒與BmM29目的基因片段連接，構(gòu)建PCDNA3.1 ( + ) - BmM29真 核表達(dá)載體，制備出周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因 DNA疫苗。
[0257]將該表位基因 DNA疫苗免疫接種BALB/c小鼠后腿腔前肌，對(duì)免疫小鼠進(jìn)行疫苗免 疫效果檢測(cè)，測(cè)定免疫小鼠血清中IgG和脾細(xì)胞細(xì)胞因子INF- 丫和比-4含量。結(jié)果顯示:免 疫小鼠產(chǎn)生高水平特異性IgG抗體，明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。隨著免疫次數(shù)的增加，免 疫小鼠 IgG抗體的0D450值呈上升趨勢(shì)。免疫細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示:免疫組小鼠脾細(xì)胞培 養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN- 丫和IL-4的水平均明顯高于對(duì)照組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（口均< 0.05)上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因 DNA疫苗免疫接種可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生 特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，取得滿意效果。周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因 DNA疫苗 的制備獲得成功。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種易操作周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法，其特征是：包括下列 步驟： (一） 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中周期型馬來(lái)絲蟲肌球蛋白基因（的高度保守序列區(qū)，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并分別引入Xho I/BamH I酶切位點(diǎn)，起始終止密碼以及保護(hù)性 喊基； Pl:上游5'-CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T-3' 下劃線序列為BamH I酶切位點(diǎn)Tm=56.84 P2:下游5'-CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG-3' 下劃線序列為Xho I酶切位點(diǎn)Tm=66.90 (二) 周期型馬來(lái)絲蟲蟲體及微絲蝴的收集和總RNA的提取和測(cè)定 (1) 將取自長(zhǎng)爪沙鼠腹腔液的成蟲及微絲蝴移入1.5ml勻漿器中，加入1mlTrizol試劑 研磨，室溫靜置5min; (2) 加入0.2ml氯仿，震蕩15s后靜置2min，4°C，12000rpm離心15min取上清； (3) 加入0.51111異丙醇混勾，室溫靜置1〇111；[11，4<€，12000印1]1離心1〇111；[11棄上清 ； (4) 加入1ml 75%乙醇混勾，4°C，9000rpm離心5min棄上清； (5) 干燥5min后溶于DEPC處理水30ul，60 °C IOmin; (6) 取2ul總RNA稀釋200倍，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)0D260和0D280值，確定其濃度和純 度，并進(jìn)行甲醛電泳檢測(cè)； (三) cDNA的合成 (1) 取總RNA 5ul,后加入IOmM dNTPmix lul，0.5ug/ul oligo(dT)12-18ul，DEPC處理 水3ul，65°C加熱5min，后冰浴5min; (2) 另取IOXBuffer 2ul，25mM MgC12 4ul，0.1M DTT 2ul,RNA酶抑制劑Iul混勻，42°C 孵育2min; (3) 將步驟(2)混合液加入步驟（I)物質(zhì)中混勻，再加入Iul逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript Π 混 勻；42°C孵育50min，70°C15min終止反應(yīng)，-70°C保存?zhèn)溆茫? (四） PCR擴(kuò)增Bm-myosin基因 ?1 = 56.84，？2 = 66.90，反應(yīng)體系。0嫩1.5111，10\卩〇?811打612.5111，2.5111]\1(1犯1311^叉 4.0ul，Pl P2各0.7ul，5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul，ddH20 15.4ul;混勻在DNA擴(kuò)增儀 ?1'0100上進(jìn)行？0?;循環(huán)參數(shù)為：941€31^11，94 1€5〇8,511€458,721€9〇8，共33個(gè)循環(huán)，最后 一次循環(huán)7 2 °C延伸反應(yīng)時(shí)間為7 m i η，4 °C冷卻終止反應(yīng)；同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。P C R產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定； (五) Bm-myos in基因片段純化和T載體的連接以及轉(zhuǎn)化 (1) 純化Bm-myosin基因片段:取50ulPCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切 割含目的基因的凝膠，按膠回收試劑盒說(shuō)明，純化回收產(chǎn)物； (2) 感受態(tài)大腸桿菌的制備:大腸桿菌DH5a在新鮮LB瓊脂平板上37°C培養(yǎng)過(guò)夜;挑取單 菌落于3ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過(guò)夜;取300ul菌液加入30ml LB培養(yǎng)基中，37°C220rpm振 蕩4h，冰浴Ih，后分裝到1 · 5ml Eppendorf管4°C離，8000rpm 5min ;棄上清，加入冰浴 O.lmol/L MgC12 IOOul懸浮，4°C離心，8000rpm 5min,棄上清，加入冰浴O.lmol/L CaCh- IO %甘油溶液300u 1懸浮，-70 °C保存?zhèn)溆茫? (3) Bm-myosin基因和pGEM-T載體的連接：取純化的PCR產(chǎn)物3ul，2 X快速連接緩沖液 5u I，pGEM - T載體 I u I，T4DNA連接酶 3we i s s /u I I u 1，共 I Ou 1 混勻，4 °C 連接20h; (4) .轉(zhuǎn)化:取連接反應(yīng)物IOul加入新鮮制備的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞300ul混勻，冰 浴30min，42°C熱休克90s，快速移至冰浴3min，加入200ul LB培養(yǎng)基，37°C孵育45min。將培 養(yǎng)物IOOul涂在含有X-gal，IPTG，Amp的1.5%瓊脂平板上，倒置平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)； (六） 陽(yáng)性重組克隆的篩選和鑒定 (1) 陽(yáng)性重組克隆的篩選:挑取生長(zhǎng)狀態(tài)好的白色菌斑，并提取質(zhì)粒； (2) PCR鑒定：以重組質(zhì)粒Bm-myosin/pGEM-T為模板，用Bm-myosin的引物Pl、P2進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系25ul，Bm-myosin/pGEM-T重組質(zhì)粒 1 · 5ul，10 X PCRBuf f er 2 · 5ul，2 · 5mM dNTPmix4 · Oul，Pl、P2各0 · 7ul，5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0 · 2ul，ddH20 15 · 4ul;循環(huán)參數(shù) 為:94°C3min，94°C50s，51°C45s，72°C90s，共33個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)72°C延伸反應(yīng)時(shí)間為 7min，4°C冷卻終止反應(yīng);PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定； (3) 酶切鑒定:取經(jīng)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒，用BamHI與XhoI雙酶切，用1.0 %瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)酶切片段； (七) Bm-MYOSIN二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 分別應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的SOPMA、GOR、nnPred i c、HNN方法以及EMBOSS程序分析預(yù)測(cè) Bm-myosin的二級(jí)結(jié)構(gòu)； (八) Bm-MYOSIN親水性、表面可及性、抗原性、極性及柔韌性參數(shù)預(yù)測(cè) 采用Hopp&Woods親水性參數(shù)、Emini表面可及性參數(shù)、Jame son-Wo If抗原性參數(shù)、 Zimmerman極性參數(shù)和柔韌性參數(shù)預(yù)測(cè)； (九) Bm-MYOSIN T細(xì)胞表位預(yù)測(cè) (1) 人源HLA I類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入Rankpep 服務(wù)器，選擇AA長(zhǎng)度為9-mers，基因型為HLA-A020UHLA-A1101，預(yù)測(cè)HLA I類分子結(jié)合肽， 保留輸出的結(jié)果； (2) 鼠源MHC I類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入Rankpep 服務(wù)器，選擇AA長(zhǎng)度為9-mers，基因型為H2-d，包括H2-Kd、H2-Ld和H2-Dd，為H2-d型小鼠表 達(dá)的MHC I類分子;預(yù)測(cè)MHC I類分子結(jié)合肽，保留輸出的結(jié)果； (3) 人源HLA Π 類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入 Rankpep服務(wù)器，選擇基因型為HLA - DRB1 *0101、HLA - DRB1 *0 301、HLA - DRB1 *0 401、HLA - DRB1 * 0701、HLA-DRB1*0801、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1301、HLA-DRB1*1501，預(yù) 測(cè)HLA Π 類分子結(jié)合肽，保留輸出的結(jié)果； (4) 鼠源MHC Π 類分子結(jié)合表位的預(yù)測(cè)：將肌球蛋白的AA序列以FASTA格式輸入 Rankpep服務(wù)器，選擇選擇基因型為Ι-AcUI-Ed，預(yù)測(cè)鼠源MHC Π 類分子結(jié)合肽，保留輸出的 結(jié)果； (十)表位基因片段的選擇 根據(jù)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)和T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇富含抗原表位的基因片段562bp-1269bp設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒pcDNA3.1( + )-BmM55為模板，并將該片段克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建pET-BmM29。應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物； 上游Pl: 5 ' - GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC - 3 ' 其中GGATCC為BamH I酶切位點(diǎn)； 下游P2:5 ' - CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT 其中GAATTC為EcoR I酶切位點(diǎn)； 引物使用前用ddH20溶解，濃度為lOymol/L; (十一)表位基因片段PCR擴(kuò)增 (1)以pcDNA3.1 ( + ) - BmM55為模板，Pl、P2分別為上、下游引物，反應(yīng)體系： PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為： 預(yù)變性 94°C Smin 變性 94°C Imin " 退火 56°C 30s > 30個(gè)循環(huán) 延伸 72 Γ 50s . 延伸 72°C Smin 取5μ1樣品用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增目的基因； (十二）目的基因與載體連接與鑒定 A、PCR產(chǎn)物及pET-28a( + )載體質(zhì)粒雙酶切體系： 雙酶切反應(yīng)體系目的基因與載體連接，具體反應(yīng)體系： 目的基因與載體連接反應(yīng)體系混勻，室溫反應(yīng)30min以上，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化； B、 E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備 (1) 用接種環(huán)取保存于-80°CDH5a菌液，劃菌于不含抗生素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng) 約14- 16h至單菌落出現(xiàn)； (2) 挑單菌落至5ml無(wú)抗性的LB液，37 °C振蕩培養(yǎng)約10- 12h; (3) 取Iml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液至含100mL無(wú)抗LB液中，37 °C振蕩培養(yǎng)約2- 2.5h，到OD值達(dá) 0.5,冰浴5-IOmin; (4) 分裝到2個(gè)50ml預(yù)冷無(wú)菌的離心管，4°C，1600rpm離心7min; (5) 用IOml冰冷的0 · IM CaC12溶液重懸細(xì)胞，4°C，IIOOrpm離心5min; (6) 用IOml冰冷的0.1M CaC12溶液重懸細(xì)胞，冰上放置30min后，4°C，1100rpm離心 5min； (7) 用2ml冰冷的0.1 M CaCl2溶液重懸細(xì)胞，分裝后15%甘油凍存于-80°C ; C、 轉(zhuǎn)化及鑒定 (1) 取100μΙ貯存于-80°C鈣化菌，冰浴化開;加入IOyl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min; (2) 熱休克，42 °C水浴30 - 90 s，勿動(dòng)； (3) 快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻I - 2min; (4) 加2.25ml LB液至試管，再加0.25ml混合物，傾斜放置，37 °C，IOOrpm振蕩培養(yǎng) 45min； (5) 5000rpm 離心 Imin; (6) 棄部分上清，混勻后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均勻，室溫靜置，直至液體 被吸收，37 °C溫箱倒置培養(yǎng)12 -16h; (7) 用白槍頭挑單克隆至5ml含Amp的LB液，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)12-16h，至OD值在 0.6-0.8 之間； (8) 同時(shí)按上述步驟做陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)化反應(yīng)； (9) 提取質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒電泳鑒定和PCR鑒定； (10) 選取PCR鑒定陽(yáng)性菌液，于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序； (十三)BmM29表位基因真核表達(dá)載體構(gòu)建 純化目的表位基因并亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1( + )的BamH I和EcoR I的克隆位 點(diǎn)。目的基因和載體的摩爾比為5:1，反應(yīng)體系25ul，16°C水浴連接過(guò)夜;取連接液轉(zhuǎn)化感受 態(tài)大腸桿菌DH5a，涂布于LB-Amp平板上，其中每mlLB中含AmpIOOmg，37°C過(guò)夜培養(yǎng);從LB- Amp平板上隨機(jī)挑取單個(gè)菌落，分別接種于LB-Amp培養(yǎng)基中，37 °C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，提取重組 質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和EcoR I酶切，后1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定； (十四）BmM29表位基因疫苗免疫應(yīng)答試驗(yàn) A · pcDNA3 · 1 ( + )和pcDNA3 · I ( + ) -BmM29質(zhì)粒大量抽提 (1) 取100mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入50ml離心管，12000rpm離心3min收集細(xì)菌，盡量棄盡 上清； (2) 12000rpm離心3min，用移液器把剩下的少量液體吸出； (3) 加入IOml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液1，使用渦旋振蕩器和移液器讓細(xì)胞懸浮，無(wú) 小菌塊； (4) 加入IOml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液2,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫靜置 5min； (5) 加入IOml質(zhì)粒大量抽提試劑盒的溶液4,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫靜置 IOmin，12000rpm離心20min，將溶液全部倒入過(guò)濾柱中，慢慢推動(dòng)推柄，濾液收集在50ml離 心管中； (6) 向?yàn)V液中加8ml異丙醇，混勾后轉(zhuǎn)移到吸附柱，12000rpm離心2min，棄收集管中的廢 液； (7) 向吸附柱中加3ml去內(nèi)毒素緩沖液，室溫靜置2min，12000rpm離心2min，棄收集管中 的廢液； (8) 向吸附柱中加入漂洗液W2，12000rpm離心2min，棄收集管中的廢液。重復(fù)一次； (9) 將吸附柱重新放回收集管，12000rpm離心5min，去除吸附柱中殘余的液體。 (10) 吸附柱置于干凈的50ml收集管，加 Iml洗脫液TE，室溫靜置5min，12000rpm離心 2min； (11) 用生理鹽水將純化的質(zhì)粒稀釋至終濃度為lmg/ml，-20°c保存?zhèn)溆茫? 步驟(十二)C(7)中，OD值為0.7。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的易操作周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法，其 特征是:步驟(十二)B (2)中37 °C振蕩培養(yǎng)約I Oh。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的易操作周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法，其 特征是:步驟(十二)B (2)中37 °C振蕩培養(yǎng)約I Ih。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的易操作周期型馬來(lái)絲蟲M29表位基因 DNA疫苗的制備方法，其 特征是:步驟(十二)B (2)中37 °C振蕩培養(yǎng)約12h。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK105999251SQ201610398239
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2014年10月21日
【發(fā)明人】方政, 吳佳倩, 徐倩, 方浩, 張波, 陸施娟, 陶然, 劉芹, 謝東方
【申請(qǐng)人】南通大學(xué)