含fk506類化合物/fkbp蛋白二聚體的藥物組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了含F(xiàn)K506類化合物/FKBP蛋白二聚體的藥物組合物及其制備方法。本發(fā)明的含F(xiàn)K506類化合物/FKBP蛋白二聚體的藥物組合物中FK506與hFKBP12a蛋白以物質(zhì)的量比1:1的比例結(jié)合，溶劑為pH6～8的PBS緩沖液。本發(fā)明中FK506的內(nèi)源性結(jié)合蛋白hFKBP12a蛋白與FK506形成的二聚體，可極大增強(qiáng)FK506在水溶液中的溶解性，從而增強(qiáng)FK506水溶液的藥效和儲存時間。
【專利說明】
含F(xiàn)K506類化合物/FKBP蛋白二聚體的藥物組合物及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及含F(xiàn)K506類化合物/FKBP蛋白二聚體的藥 物組合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 他克莫司（Tacro I imus)又名FK506，分子式為C44H69NO12，分子量為804，由日本藤澤 制藥有限公司從筑波山的土壤的鏈霉菌屬(Streptomyces tsukubaensis)中分離出的發(fā)酵 產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬23元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。為一種強(qiáng)力的新型免疫抑制劑，主要通過抑制 白介素 -2(L-2)的釋放，全面抑制T淋巴細(xì)胞的作用。其免疫抑制效果極強(qiáng)，較同類藥物環(huán)孢 素 A(CsA)相比強(qiáng)100倍。近年來，作為肝、腎移植的一線用藥，已在日本、美國等14個國家上 市。臨床實(shí)驗(yàn)表明，其在心、肺、腸、骨髓等移植中應(yīng)用有很好的療效。同時FK506在治療特應(yīng) 性皮炎(AD)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和免疫性眼病，如過敏性結(jié)膜炎、角膜移植等疾病中也 發(fā)揮著重要的作用。
[0003] FK506結(jié)構(gòu)式如下：
[0004]
[0005] FK506目前臨床上應(yīng)用的劑型主要為口服膠囊、注射液、外用眼膏和滴眼液四種。 其中，滴眼液是治療眼部疾病中最常用、最直接和最有效的方法。由于FK506在水溶液中溶 解性極差，估計最大溶解度低于1〇μΜ，嚴(yán)重影響其達(dá)到有效的藥物濃度。此外，F(xiàn)K506水溶液 中穩(wěn)定性差，容易發(fā)生異構(gòu)化，轉(zhuǎn)化為其他兩種無免疫抑制功能的異構(gòu)體。因此，提高FK506 在水中的溶解度和穩(wěn)定性，進(jìn)而提高其藥效，一直是臨床和基礎(chǔ)研究中亟待解決的問題。
[0006] 人類FKBP12是一類具有脯氨酸異構(gòu)酶活性的FK506內(nèi)源性結(jié)合蛋白。hFKBP12可與 進(jìn)入體內(nèi)的FK506結(jié)合，形成FK506/FKBP12二聚體，該二聚體進(jìn)而與鈣調(diào)蛋白磷酸酶 (Calcineurin)結(jié)合，從而阻斷免疫反應(yīng)的發(fā)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明根據(jù)FK506/hFKBP12a蛋白二聚體在水溶液中具有極好的溶解性的特性，設(shè) 計和制備新型FK506的水溶液制劑，提供了一種含有FK506類化合物/FKBP蛋白二聚體的藥 物組合物，其是利用藥物-蛋白二聚體制備新型的FK506醫(yī)用藥劑，其中的FK506類化合物/ FKBP蛋白二聚體具有極好的溶解性，可解決目前單純FK506水溶液制劑存在的如下缺點(diǎn)： 一、水溶液中溶解度低，F(xiàn)K506在水中最大溶解性低于ΙΟμΜ;二、穩(wěn)定性差，易發(fā)生異構(gòu)化，生 成兩種無免疫抑制功能的分子。本發(fā)明的含有FK506類化合物/FKBP蛋白二聚體的藥物組合 物可用于眼科及其他領(lǐng)域。
[0008] 一種藥物組合物，含有FK506類化合物/FKBP蛋白二聚體和含水的液體賦形劑，所 述的FK506類化合物/FKBP蛋白二聚體是以FK506類化合物作為活性成分，以FKBP蛋白作為 載體，所述的 FK506類化合物為 FK506、EP184162、EP315978、EP323042、EP423714、EP427680、 W091/13889、TO91/19495、EP484936 或 EP532088;所述的 FKBP 蛋白為hFKBP12a 蛋白或其變 體、同系物或衍生物，所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的 hFKBP12a蛋白的氨基酸序列C末端有His-tag、N末端有V5-tag。
[0009] FK506可被其他自然存在或人工合成的FK506類似物所代替，該FK506類似物可以 同hFKBP12a蛋白（或其他的可與FKB506相結(jié)合的FKBP同源蛋白）結(jié)合且具備相應(yīng)的藥理學(xué) 作用。FK506有許多衍生物、拮抗劑、激動劑與同型物都是已知的，它們具有FK506的基本結(jié) 構(gòu)和至少一種生物學(xué)的性質(zhì)。在許多專利中都敘述過這類化合物，例如EP184162、 EP315978、EP323042、EP423714、EP427680、TO91/13889、W091/19495、EP484936、EP532088 等;FK506和這些化合物一起稱作FK506類化合物。
[0010] hFKBPl 2a蛋白可以被其他的可與FKB506 (或其他FK506類化合物）相結(jié)合的FKBP同 源蛋白所代替。本發(fā)明所采用的hFKBP12a蛋白可以通過多種人工和酶促的方法進(jìn)行修飾和 改良，以提高其可溶性和在血漿中的生存期，并可改變其免疫原性。所述的改良包括但不僅 限于聚乙二醇化、乙酰化和甲基化?？梢詫FKBP 12a蛋白結(jié)構(gòu)中的FK506結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行改良 和修飾，以提高或減弱FK506和hFKBP12a蛋白的結(jié)合力、加速或減慢FK506/hFKBP12a蛋白二 聚體中FK506的釋放速度。本發(fā)明中，hFKBP12a蛋白、對其進(jìn)行改良或修飾后得到的 hFKBPl 2a蛋白以及其變體、同系物或衍生物統(tǒng)稱為FKBP蛋白。
[0011] 優(yōu)選，所述的FK506類化合物為FK506，所述的FKBP蛋白為hFKBP12a蛋白，所述的含 水的液體賦形劑為PBS緩沖液，其pH為6~8,滲透壓為260~320m0sm/L(不含鈣鎂離子）。
[0012 ] 優(yōu)選，所述的FK506與hFKBP 12a蛋白的物質(zhì)的量比為1:1~2。所述的藥物組合物中 FK506與hFKBP12a蛋白以物質(zhì)的量比1:1的比例結(jié)合，稍過量的hFKBP12a蛋白以確保絕大部 分的FK605同hFKBP12a蛋白相結(jié)合形成二聚體。
[0013 ]優(yōu)選，所述的PBS緩沖液的pH為7 · 5。
[0014] 優(yōu)選，所述的藥物組合物還含有羧甲纖維素、甲基纖維素、羥丙甲纖維素、聚乙烯 醇、聚維酮、聚乙二醇、黃原膠、泊洛沙姆、卡波姆、玻璃酸鈉和/或丙三醇作為增粘劑。
[0015] 優(yōu)選，所述的藥物組合物還含有硫柳汞和/或苯扎溴銨作為防腐劑和抑菌劑。
[0016] 所述的藥物組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0017] (1)將FK506溶于有機(jī)溶劑中，制備成FK506溶液；
[0018] (2)將hFKBP12a蛋白溶于pH6~8、滲透壓為260~320πι〇8Π?/1的I3BS緩沖液中，制備 成hFKBP12a蛋白溶液，所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ν0.1所示；
[0019 ](3)使用步驟⑵制備的hFKBPl 2a蛋白溶液稀釋步驟（1)制備的FK506溶液，控制混 合溶液中FK506與hFKBP12a蛋白的物質(zhì)的量比為1:1~2，攪拌均勻，以形成?1(506/1^仙？12& 蛋白二聚體，由此得到FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚體水溶液；
[0020] (4)去除FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中的有機(jī)溶劑，得到的去除有機(jī)溶劑 的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液即為所要制備的藥物組合物。
[0021] 所述的步驟(1)的有機(jī)溶劑為DMS0、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、乙酸乙酯或乙醚。
[0022] 所述的去除FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中的有機(jī)溶劑，是采用離心機(jī)溶液 置換、透析或凝膠過濾層析的方法進(jìn)行去除。
[0023] 本發(fā)明還提供所述的藥物組合物用于制備免疫抑制劑中的用途。
[0024] 優(yōu)選，所述的免疫抑制劑為滴眼液。
[0025]本發(fā)明還提供所述的藥物組合物用于提高FK506在水溶液中的溶解度、提高FK506 藥效、降低游離FK506的副作用中的用途。
[0026] 制備得到的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體也可通過結(jié)晶等方法進(jìn)一步純化。FK506/ hFKBP12a蛋白二聚體的分子構(gòu)成和結(jié)構(gòu)可以通過X射線晶體解析的技術(shù)進(jìn)行檢測和驗(yàn)證。 對于大規(guī)模批量生產(chǎn)而言，可抽取FK506/hFKBP12a蛋白二聚體的樣本進(jìn)行結(jié)晶，并通過X射 線晶體解析的技術(shù)檢測FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚體的分子構(gòu)成和結(jié)構(gòu)，以確保產(chǎn)品質(zhì)量。 [0027] 上述步驟(3)和(4)制備的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體可以使用如PBS緩沖液在內(nèi) 的其他醫(yī)用緩沖液濃縮，以利于儲備和進(jìn)一步應(yīng)用。
[0028]
【發(fā)明人】們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的含有FK506類化合物/FKBP蛋白二聚體的藥物組合物具有 以下優(yōu)點(diǎn)：
[0029] (1)可以提高FK506在水溶液或其他醫(yī)用FK506溶液中的溶解性。在角膜移植動物 模型中，我們成功配置的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中FK506在水溶液中的溶解度 可以至少達(dá)到1〇〇μΜ，這將FK506在水溶液中的溶解度至少提高了 10倍；而根據(jù)我們使用 Nano dr ο ρ測定的hFKBP 12 a蛋白質(zhì)儲存液濃度的結(jié)果，理論上我們可以配制出濃度高達(dá) 1.58mM的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體溶液，這將FK506在水溶液中的溶解度提高了約158 倍。
[0030] (2)FK506同hFKBP12a蛋白結(jié)合后可以避免發(fā)生異構(gòu)化，從而保持FK506結(jié)構(gòu)的活 化狀態(tài)；
[0031] (3)可以通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)工程學(xué)的方法來進(jìn)一步改善藥物配方，從而改變FK506/ hFKBP12a蛋白二聚體穩(wěn)定性和其在血漿中的生存期；
[0032] (4)可以通過修飾和改變FKBP與FK506的結(jié)合位點(diǎn)，從而改變FK506/hFKBP12a蛋白 二聚體中FK506的釋放動力學(xué)特性；
[0033] (5)可以通過蛋白融合工程學(xué)的方法改進(jìn)劑型，以提高藥物的在人體組織中的靶 向作用能力，如腫瘤組織等；
[0034] (6)基于熱動平衡的原理，F(xiàn)K506/hFKBP12a蛋白二聚體可以同人體內(nèi)源性FKBP進(jìn) 行交換，以產(chǎn)生理想的藥學(xué)作用。本發(fā)明揭示了FK506同hFKBP12a蛋白結(jié)合后，在細(xì)胞水平 和動物模型中都具有相應(yīng)的藥理學(xué)作用；而且較低濃度的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶 液（100μΜ)即可起到與市面上通用的較高濃度的FK506混懸液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%，ΒΡ621.89μ Μ)相同或更好的抑制角膜植片免疫排斥反應(yīng)的效果，還顯著延長角膜植片生存期;此外，由 于FK506非常昂貴，F(xiàn)K506在藥物中的使用濃度大大降低將極大的減少藥物成本；
[0035] (7)由于FK506/hFKBP12a蛋白二聚體具有極強(qiáng)的親和力，這使得最終溶液中游離 的FK506極少。同單純的FK506的劑型相比，本發(fā)明可以極大程度地降低游離FK506的副作用 和不良反應(yīng)。
【附圖說明】
[0036] 圖1為FK506/hFKBP12a蛋白二聚體在NFAT-GFP HeLa細(xì)胞系中免疫抑制圖；其中 DMSO(上排左圖）為DMSO(二甲基亞砜)處理組(DMS0終濃度為0.1%)，1(下排左圖）為離子霉 素處理組（離子霉素終濃度為3μΜ)，F(xiàn)KBP (上排中圖）為hFKBPl 2a蛋白水溶液處理組 (hFKBPl2a蛋白終濃度為1.2μΜ)，F(xiàn)KBP+I (下排中圖）為hFKBPl 2a蛋白水溶液和離子霉素處 理組(hFKBP12a蛋白終濃度為1.2μΜ、離子霉素終濃度為3yM)，F(xiàn)K506+I(上排右圖）為FK506 水溶液和離子霉素處理組(FK506終濃度為1.2μΜ、離子霉素終濃度為3μΜ)，F(xiàn)KBP+FK506+I (下排右圖）為FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚體水溶液和離子霉素處理組(FK506/hFKBPl 2a蛋白 二聚體終濃度為1.2μΜ、離子霉素終濃度為3μΜ)。
[0037]圖2為術(shù)后第14日FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液在大鼠同種異體角膜移植模 型中抗免疫排斥反應(yīng)的眼前段照相;Α:100μΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液組;B:質(zhì) 量分?jǐn)?shù)0.05 % FK506混懸液組;C: PBS陰性對照組。
[0038] 圖3為100μΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液在大鼠同種異體角膜移植模型中 抗免疫排斥反應(yīng)的生存分析圖；1〇〇μΜ ?1(506/^0?、0.05%?1(506和？83分別表示10(^]\1 FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚體水溶液組、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05 % FK506混懸液組和PBS陰性對照組。 [0039]圖4為使用Nanodrop測定hFKBP12a蛋白質(zhì)儲存液的濃度，A為中山眼科中心國家重 點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的美國Nanodrop超微量分光光度計(ND2000)，用于測定蛋白質(zhì)、核酸和脫氧核酸 的濃度，具有高度靈敏性;B為測定hFKBP12a蛋白濃度的結(jié)果，濃度(mg/ml)C計算為所測得 的 A280/Abs，其中 hFKBPl 2a蛋白的 Abs 值為0.642。
【具體實(shí)施方式】
[0040]以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0041 ]以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)儀器:德國Beckman超速離心機(jī)、美國奧豪斯分析天平 (DV114C)、美國Nanodrop超微量分光光度計(ND2000)、美國密理博3000MWC0蛋白質(zhì)離心分 子篩（15ml，3kD)。
[0042]以下實(shí)施例中所用的藥品來源:所用hFKBP12a蛋白來自北京康樂衛(wèi)士生物公司， FK506來自美國Sigma公司、福建科瑞生物制藥公司，DTT來自美國Sigma公司，DMSO來自美國 Sigma 公司，PBS(pH=7.5,滲透壓 260-320m0sm/L)來自美國 Sigma 公司。
[0043]上述的來自北京康樂衛(wèi)士生物公司的hFKBP12a蛋白是使用大腸埃希菌或者其他 真核細(xì)菌誘導(dǎo)和表達(dá)重組hFKBP12a蛋白（其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示），并利用已建 立的蛋白質(zhì)純化方法得到實(shí)驗(yàn)所需的高純度的hFKBP12a蛋白。hFKBP12a蛋白的摩爾質(zhì)量約 為12000g/mol，即12kD，C末端加入His-tag、N末端加入V5-tag后其分子量約為15.5kD。 [0044] 實(shí)施例1
[0045] FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液的制備方法如下：
[0046] (1)使用分析天平精密稱取FK506粉末4mg溶解于0.2ml純DMSO中，制備成20mg/ml (即約25mM)的FK5〇6的DMSO溶液；
[0047] (2)使用ρΗ7·5的I3BS緩沖液(滲透壓320m0sm/L)將高純度的hFKBP12a蛋白稀釋制 備成0.1 mM的hFKBPl2a蛋白溶液；
[0048] (3)使用上述步驟(2)中的hFKBP12a蛋白溶液（50ml)緩慢稀釋步驟（1)中的FK506 的DMSO溶液(0.2ml)，緩慢均勻攪拌，以形成FK506/hFKBP12a蛋白二聚體，由此得到50.2ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液。該FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中FK506同 hFKBPl2a蛋白的摩爾比為I: I，F(xiàn)K506/hFKBP12a蛋白二聚體的終濃度為100μΜ。即將步驟（1) 中20mg/ml (即25mM)的FK506的DMSO溶液用步驟（2)中的0 · ImM的hFKBPl2a蛋白溶液稀釋了 250倍，有機(jī)溶劑DMSO在該FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中的體積比為0.4% (v/v)。有 機(jī)相中釋放出來的FK506在稀釋過程中會立即與hFKBP12a蛋白結(jié)合(Kd = 0.4nM)。即使在稀 釋的ΙΟμΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中，高達(dá)99.99%的？1(506處在同1^仙？123蛋 白的結(jié)合狀態(tài)；
[0049] (4)用ρΗ7·5的PBS緩沖液將50.2ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液稀釋至 502ml，再使用15ml的分子篩離心管將該溶液濃縮至50.2ml (美國密理博3000MWC0蛋白質(zhì)離 心分子篩，離心機(jī)參數(shù):4000g，40min)。經(jīng)過此步驟的處理，F(xiàn)K506/hFKBP12a蛋白二聚體溶 液中的有機(jī)溶劑DMSO得到去除。由此得到去除了有機(jī)溶劑的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水 溶液，可以用于儲備或進(jìn)一步應(yīng)用。
[0050] 按上述過程制備出的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液使FK506的溶解性得到明 顯提高。單純FK506在水溶液中最大溶解度不足ΙΟμΜ，而參照本實(shí)施例中FK506/hFKBP12a蛋 白二聚體水溶液的制備方法制備得到的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中FK506在水溶 液中的溶解度可以至少達(dá)到100μΜ，這將FK506在水溶液中的溶解度至少提高了 10倍;配制 較高濃度的hFKBP12a蛋白質(zhì)儲存液并使用Nanodrop測定（圖4)，如圖4Β中第18行結(jié)果所示， 儲存液中hFKBP12a蛋白濃度可達(dá)2.44mg/ml (計算公式為C = A280/Abs = 1.567/0.642，Abs =0.642)，換算單位后（除以hFKBP12a蛋白的分子量15.5kD)約為1.58mM。因此，理論上我們 至少可配制濃度為1.58mM的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液，這將FK506在水溶液中的 溶解度提高了約158倍。
[0051 ] 此外，該FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液也在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中取得了良好的 免疫抑制效果。
[0052]在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人通過使用NFAT-GFP的HeLa細(xì)胞系，驗(yàn)證了終濃度為1.2μΜ的 FK506/hFKBP12a蛋白二聚體可明顯抑制Ca2+-Cn-NFAT免疫反應(yīng)通路的激活。如圖1所示，在 NFAT-GFP HeLa細(xì)胞系中，綠色熒光部位為NFAT存在的位置，如果綠色熒光存在于細(xì)胞漿 中，則未啟動免疫反應(yīng)。相反，如果細(xì)胞核為綠色，則表示NFAT進(jìn)入細(xì)胞核引起免疫反應(yīng)。如 圖1所示，在加入離子霉素（Ionomycin，I)后（圖1中I組），引起HeLa細(xì)胞的免疫反應(yīng)，大量 NFAT進(jìn)入細(xì)胞核使其呈現(xiàn)出綠色熒光;而在FK506+I組，由于FK506對Ca2+-Cn-NFAT信號通路 的抑制作用，綠色熒光標(biāo)記的NFAT停留在細(xì)胞漿中；在FKBP+FK506+I組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與FK506+ I組相同，均在細(xì)胞漿中看到綠色熒光標(biāo)記的NFAT。這表明在細(xì)胞水平，F(xiàn)K506/hFKBP12a蛋 白二聚體同F(xiàn)K506，可有效阻斷Ca 2+-Cn-NFAT信號通路，從而抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生。
[0053] 在體內(nèi)試驗(yàn)中，100μΜ濃度的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液可在同種異體大 鼠角膜移植模型中，30日內(nèi)明顯抑制角膜植片免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，并且通過生存分析、病 理學(xué)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)多方面證實(shí)了其效果。在圖2，我們可以看到100μΜ FK506/hFKBPl2a蛋白 二聚體水溶液組（圖2A)同質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%FK506混懸液組（圖2B)相同在術(shù)后第14日，角膜 透明、可清晰看到虹膜紋理、無明顯水腫；角膜切片HE染色均表現(xiàn)為少量炎性細(xì)胞聚集、基 質(zhì)層無明顯腫脹、各層結(jié)果完整;在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，與免疫反應(yīng)密切相關(guān)的IL-2在角膜組 織中表達(dá)量較少。而PBS陰性對照組（圖2C)則發(fā)生角膜排斥反應(yīng)、出現(xiàn)角膜混濁、水腫，難以 辨認(rèn)瞳孔輪廓；角膜切片HE染色可以清楚看到大量炎癥細(xì)胞聚集，角膜基質(zhì)層腫脹、斷裂； 免疫組化實(shí)驗(yàn)可見角膜組織中表達(dá)大量的IL-2。這從形態(tài)學(xué)、病理學(xué)和免疫學(xué)三個層面證 實(shí)了 FK506/hFKBP12a蛋白二聚體在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抗角膜排斥反應(yīng)的有效性。
[0054] 圖3為三組大鼠角膜植片的生存曲線，100μΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液 組和質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 05 %FK506混懸液組角膜植片生存期均明顯優(yōu)于I3BS陰性對照組，并且100μ M FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液組的角膜植片生存期明顯優(yōu)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05 %FK506 混懸液組的角膜植片生存期，P<〇.05,具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0055] 實(shí)施例2
[0056] (1)使用分析天平精密稱取FK506粉末3.22mg溶解于0.02ml無水乙醇中，制備成 161mg/ml (即約200mM)的FK506的乙醇溶液；
[0057] (2)使用ρΗ7·5的I3BS緩沖液(滲透壓280m0sm/L)將高純度的hFKBP12a蛋白稀釋制 備成0.1 mM的hFKBPl2a蛋白溶液；
[0058] (3)使用上述步驟(2)中的hFKBP12a蛋白溶液(40ml)緩慢稀釋步驟（1)中的FK506 的乙醇溶液（0.02ml)，緩慢均勻攪拌，以形成FK506/hFKBPl2a蛋白二聚體，由此得到40ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液。該FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中FK506同 hFKBPl2a蛋白的摩爾比為I: I，F(xiàn)K506/hFKBP12a蛋白二聚體的終濃度為100μΜ。即將步驟（1) 中161mg/ml(即200mM)的FK506的乙醇溶液用步驟（2)中的O.lmM的hFKBP12a蛋白溶液稀釋 了2000倍，有機(jī)溶劑乙醇在該FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中的體積比為0.05% (v/ v)。有機(jī)相中釋放出來的FK506在稀釋過程中會立即與hFKBP12a蛋白結(jié)合(Kd = 0.4nM)。即 使在稀釋的1〇μΜ FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液中，高達(dá)99.99%的？1(506處在同 hFKBPl2a蛋白的結(jié)合狀態(tài)；
[0059] (4)用ρΗ7·5的PBS緩沖液將40ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液稀釋至 400ml，再使用15ml的分子篩離心管將該溶液濃縮至40ml (美國密理博3000MWC0蛋白質(zhì)離心 分子篩，離心機(jī)參數(shù):4000g，40min)。經(jīng)過此步驟的處理，F(xiàn)K506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶 液中的有機(jī)溶劑乙醇得到去除。由此得到去除了有機(jī)溶劑的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水 溶液，可以用于儲備或進(jìn)一步應(yīng)用。
[0060] 實(shí)施例3
[0061 ] (1)使用分析天平精密稱取FK506粉末3.3mg，并溶于0.05ml純DMSO中，得到80mM的 FK506 的 DMSO 溶液。
[0062] (2)按照MFK5〇6:MhFKBPi2affi= 1:1 ·6的比例，用pH7 · 5的PBS緩沖液溶解hFKBP12a蛋白 制備0.2mM的hFKBP12a蛋白溶液32ml。
[0063] (3)將步驟（1)和步驟(2)中得到的溶液混合均勻以形成FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚 體，由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液(其中FK506的濃度為0.125mM)。
[0064] (4)再使用 PBS 緩沖液(ρΗ=7·5,滲透壓 260m0sm/L)將 32ml 的 FK506/hFKBP12a 蛋白 二聚體水溶液稀釋至320ml，再使用15ml的分子篩離心管(離心機(jī)參數(shù):4000g，40min)將該 溶液濃縮至32ml。由此得到去除了有機(jī)溶劑DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液。 [0065] (5)將得到的去除了有機(jī)溶劑DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液分裝于洗 凈滅菌的滴眼液瓶中，密封包裝。
[0066] 實(shí)施例4
[0067] (1)使用分析天平精密稱取FK506粉末3.3mg，并溶于0.05ml純DMSO中，得到80mM的 FK506 的 DMSO 溶液。
[0068] (2)按照MFK5〇6:MhFKBPi2affi= 1:2的比例，用pH7 · 5的PBS緩沖液溶解hFKBP12a蛋白制 備0 · 25mM的 hFKBP12a蛋白溶液32ml。
[0069] (3)將步驟（1)和步驟(2)中得到的溶液混合均勻以形成FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚 體，由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液(其中FK506的濃度為0.125mM)。
[0070] (4)再使用 PBS 緩沖液(ρΗ=7·5,滲透壓 280m0sm/L)將 32ml 的 FK506/hFKBP12a 蛋白 二聚體水溶液稀釋至320ml，再使用15ml的分子篩離心管(離心機(jī)參數(shù):4000g，40min)將該 溶液濃縮至32ml。由此得到去除了有機(jī)溶劑DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液。 [0071] (5)在得到的去除了有機(jī)溶劑DMSO的FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚體水溶液中加入 1.67g甲基纖維素，均勻攪拌直至溶解。
[0072] (6)然后將其分裝于洗凈滅菌的滴眼液瓶中，密封包裝。
[0073] 實(shí)施例5
[0074] (1)使用分析天平精密稱取FK506粉末3.3mg，并溶于0.05ml純DMSO中，得到80mM的 FK506 的 DMSO 溶液。
[0075] (2)按照MFK5〇6:MhFKBPi2affi= 1:1 ·6的比例，用pH7 · 5的PBS緩沖液溶解hFKBP12a蛋白 制備0.2mM的hFKBP12a蛋白溶液32ml。
[0076] (3)將步驟（1)和步驟(2)中得到的溶液混合均勻以形成FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚 體，由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液(其中FK506的濃度為0.125mM)。
[0077] (4)再使用 PBS 緩沖液(ρΗ=7·5,滲透壓 280m0sm/L)將 32ml 的 FK506/hFKBP12a 蛋白 二聚體水溶液稀釋至320ml，再使用15ml的分子篩離心管(離心機(jī)參數(shù):4000g，40min)將該 溶液濃縮至32ml。由此得到去除了有機(jī)溶劑DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液。 [0078] (5)在得到的去除了有機(jī)溶劑DMSO的FK506/hFKBPl 2a蛋白二聚體水溶液中加入 1.0 g羥丙甲纖維素，均勻攪拌直至溶解。
[0079] (6)然后在該溶液中加入硫柳汞0.004g，混勻。
[0080] (7)再將其分裝于洗凈滅菌的滴眼液瓶中，密封包裝。
[0081]雖然上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本 發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此， 在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種藥物組合物，其特征在于，含有FK506類化合物/FKBP蛋白二聚體和含水的液體 賦形劑，所述的FK506類化合物/FKBP蛋白二聚體是以FK506類化合物作為活性成分，以FKBP 蛋白作為載體，所述的 FK506 類化合物為 FK506、EP184162、EP315978、EP323042、EP423714、 EP427680、W091/13889、W091/19495、EP484936或EP532088;所述的FKBP蛋白為hFKBP12a蛋 白或其變體、同系物或衍生物，所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的FK506類化合物為FK506,所 述的FKBP蛋白為hFKBPl 2a蛋白，所述的含水的液體賦形劑為roS緩沖液，其pH為6~8，滲透 壓為 260 ~320m0sm/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述的FK506與hFKBP12a蛋白的物 質(zhì)的量比為1:1~2。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的PBS緩沖液的pH為7.5。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物還含有羧甲纖維 素、甲基纖維素、羥丙甲纖維素、聚乙烯醇、聚維酮、聚乙二醇、黃原膠、泊洛沙姆、卡波姆、玻 璃酸鈉和/或丙三醇作為增粘劑，還含有硫柳汞和/或苯扎溴銨作為防腐劑和抑菌劑。6. 權(quán)利要求3所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將FK506溶于有機(jī)溶劑中，制備成FK506溶液； (2) 將hFKBP12a蛋白溶于pH6~8、滲透壓為260~320m0sm/L的PBS緩沖液中，制備成 hFKBP12a蛋白溶液，所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示； (3) 使用步驟(2)制備的hFKBP 12a蛋白溶液稀釋步驟（1)制備的FK506溶液，控制混合溶 液中FK506與hFKBP12a蛋白的物質(zhì)的量比為1:1~2,攪拌均勻，以形成FK506/hFKBP12a蛋白 二聚體，由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液； (4) 去除FK506/hFKBP 12a蛋白二聚體水溶液中的有機(jī)溶劑，得到的去除有機(jī)溶劑的 FK506/hFKBP12a蛋白二聚體水溶液即為所要制備的藥物組合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(1)的有機(jī)溶劑為DMSO、甲 醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、乙酸乙酯或乙醚;所述的步驟(4)的去除FK506/hFKBP 12a蛋白二 聚體水溶液中的有機(jī)溶劑，是采用離心機(jī)溶液置換、透析或凝膠過濾層析的方法進(jìn)行去除。8. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物用于制備免疫抑制劑中的用途。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的免疫抑制劑為滴眼液。10. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物用于提高FK506在水溶液中的溶解度、提高FK506藥 效、降低游離FK506的副作用中的用途。
【文檔編號】A61K47/42GK106074367SQ201610576947
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月20日 公開號201610576947.6, CN 106074367 A, CN 106074367A, CN 201610576947, CN-A-106074367, CN106074367 A, CN106074367A, CN201610576947, CN201610576947.6
【發(fā)明人】陳偉蓉, 陳林, 林浩添, 劉奕志
【申請人】中山大學(xué)中山眼科中心