Artalbic acid的O?(苯并咪唑基)乙基與O?(二羥乙胺基)乙基衍生物的組合物在抗病毒 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Artalbic acid的O?(苯并咪唑基)乙基與O?(二羥乙胺基)乙基衍生物的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及Artalbic acid的O?(苯并咪唑基)乙基與O?(二羥乙胺基)乙基衍生物的組合物及其在制備抗病毒藥物上的用途。公開了一種Artalbic acid的O?(苯并咪唑基)乙基與O?(二羥乙胺基)乙基衍生物的組合物及其制備方法。藥理學(xué)實驗表明，本發(fā)明的Artalbic acid的O?(苯并咪唑基)乙基與O?(二羥乙胺基)乙基衍生物的組合物具有抗病毒作用，具有開發(fā)抗病毒藥物的價值。
【專利說明】
Arta I bi c acid的O-(苯并咪唑基)乙基與O-(二輕乙胺基）乙 基衍生物的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 單純皰疹病毒1型（Herpes simplex virus，HSV-l)和單純皰疹病毒2型(Herpes simplex virus，HSV-2)屬于皰疹科病毒，HSV-I和HSV-2不僅引起口唇或生殖粘膜皰疹，同 時也是引起腦炎、肝炎、全身嚴重感染甚至宮內(nèi)感染的重要病原。
[0003] 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)主要引起呼吸系統(tǒng)感染， 在嬰幼兒、老年以及免疫缺陷人群引起嚴重肺炎，是人類上呼吸道感染的重要病原之一。
[0004] 甲型流感病毒（Influenza A virus，F(xiàn)lu_A)屬于正粘科病毒，在人類和其他生物 每年都有小范圍的流行，引起上呼吸系統(tǒng)感染。大流行時，可引起嚴重呼吸系統(tǒng)感染，甚者 引起肺炎、腦炎甚至死亡。
[0005] 上述三種病毒的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題，從天然產(chǎn)物 中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物 最有重要價值。
[0006] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個2011年發(fā)表（Antonella Maggio et al ·， 2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily·Tetrahedron Letters,52(2011 )4543-4545)的化合物，我 們對化合物I進行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合 物III和化合物IV制備了組合物，并對該組合物抗病毒活性進行了評價，其具有抗病毒活 性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分數(shù)分別為20%和80%。
[0008]
[0009] 本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
[0010] 藥效學(xué)實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗病毒作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接 受的鹽具有同樣的藥效。
[0011]組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗HSV-1、HSV-2、RSV和flu A的活性， 因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗病毒藥物。
[0012]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1化合物Artalbic acid的制備
[0014] 化合物Artalbic acid(I)的制備方法參照Antonella Maggio等人發(fā)表的文獻 (Antonella Maggio et al.,2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily. Tetrahedron Letters ,52 (2011 )4543-4545)的方法。
[0015]
[0016] 實施例2 Artalbic acid的O-溴乙基衍生物（II)的合成
[0017] 將化合物I (266mg，I .OOmmol)溶于IOmL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙燒(3.76(^，20.00_〇1)和61]1]^的50%氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?0攝氏 度攪拌Iehieh之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然 后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌5次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除 溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100:1.0，v/V)， 收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(272mg，73% )。
[0018] 1H NMR(500MHz,DMS0-d6)5ll.41(s,lH),6.06(s,lH),5.76(s,lH),4.99(s,lH), 4.71(s,1H),4.56(s,1H),3.86(s,2H),3.54(s,2H),2.65(s,1H),2.43(s,2H),2.33(s,2H), 2.10(s,lH),1.64(s,3H),1.54(s,lH),1.44(s,2H),0.95(s,3H).
[0019] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S201.95(s),175.93(s),149.13(s),148.15(s),117.05 (s),109.43(s),81.86(s),70.27(s),57.68(s),41.26(s),39.07(s),38.86(s),35.69(s), 33.36(s),30.72(s),20.44(s),18.42(s).
[0020] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci7H26BrO4:373.1014；found 373.1017.
[0021]
水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100: ι.ο，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮 即得到化合物π I的棕色固體(80.0 mg，39 % )。
[0024] 1H MMR(500MHz，DMS0-d6)Sl6.65(s，lH)，8.22(s，lH)，7.61(d，J = 25.0Hz，2H)， 7.25(s，1H)，7.16(s，1H)，6.05(s，1H)，5.76(s，1H)，4.90(s，1H)，4.67(s，1H)，4.58(s，1H)， 4.12(s，1H)，4.00(s，1H)，3.85(s，2H)，2.63(s，1H)，2.43(s，2H)，2.35(s，2H)，1.95(s，1H)， 1.61(s，3H)，1.52(s，2H)，1.37(s，lH)，0.94(s，3H).
[0025] 13C NMR(125MHz，DMS0-d6)S201.70(s),175.59(s),149.OO(s),147.93(s),146.20 (s),139.75(s),133.40(s),123.95(s),123.48(s),118.46(s),116.84(s),110.97(s), 109.08(s),81,62(s),67.86(s),57.36(s),44.96(s),41.15(s),38.72(s) ,38.62(s), 35.56(s),30.41(s),20.19(s),18.28(s).
[0026] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcd for C24H3IN2O4^ll .2284；found:411.2281 〇
[0027]
[0032] HRMS(ESI) :m/z[M+H].calcd for C2iH36Ni〇6:398.2543;found:398.2547〇
[0033]
[0034] 實施例5組合物抗病毒活性
[0035] (一)實驗例:組合物對皰疹病毒的作用研究：
[0036] (1)細胞株與病毒株：
[0037] 人胚腎細胞(HEK293，為HSV-I、HSV-2病毒敏感細胞)購自美國Clontech公司；單純 皰疹病毒1型(HSV-1)Sm44株、單純皰癥病毒2型(HSV-2)333株引自中國⑶C病毒病研究所。 [0038] (2)細胞毒性測定：
[0039] 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的20mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的SOmg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到IOOmg組合物， 使用時用水溶解這IOOmg的組合物即得到組合物的溶液。
[0040]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(1):25~27)的方法，將各樣品以2倍比做系列稀釋（2<) -5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復(fù)3孔 (A、B、C行），平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細胞對照，7~12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡 下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細胞對照組 OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD50)。
[0041 ] (3)抑毒試驗：
[0042]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008; 24( 1): 25~27)的方法，將樣品按稀釋順序α3+14)橫向接 種于96板孔中的單層細胞上，每孔IOOuU每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行加含100 個TCID 5q的病毒IOOuL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設(shè) F行作為病毒對照，E行的1~12作為細胞對照。37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察 4d。病毒對照出現(xiàn)90%以上CPE時，加1 %中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值， 各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（IC 5q)，最終將TD5q和IC5q相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
[0043] ⑷結(jié)果：
[0044]①樣品TD5q的測定:對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物 III 和化合物 IV 的 TD5Q 在 HEK293 分別為 2-2·14、2-2·26、2-2· 35。
[0045] ②抑毒實驗:對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HSV-I、HSV-2病毒對 照組分別在第3d、3d出現(xiàn)90%以上的CPE，HSV 1和HSV 2在HEK293CPE則以腫脹、多細胞融合 (HSV 1致多個細胞融和成大泡，而HSV 2致融合為小泡）、變圓、脫落為主要特征。
[0046] 而組合物抑毒試驗各組細胞，按照組合物樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE: HSV 1-HEK293在第10稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第9稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn) CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[0047]而化合物III和化合物IV處理組在I3+6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。 [0048] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組A 值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC5q，IC5q與TD5q相比獲得組合物的TI:抑制 HSV-l、HSV-2在HEK293細胞發(fā)生CPE，IC5()分別為2-11·15、2- 11·26，TI分別為515·6、556·4?；?物III的TI:對應(yīng)的IC5q分別為21 79、2438，1'1分別為2.9、4.3?；衔?￥的11:對應(yīng)的1(： 50分 別為 2-4·°4、2-4·32，TI 分別為 3.2、3.9。
[0049]結(jié)論：組合物具有顯著的抗皰疹科病毒（包括HSV-I、HEV-2)的作用，而且安全性 高，因此組合物在治療皰疹病毒感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景?；衔颕II和化合物IV不 具有顯著的抗皰疹科病毒(包括HSV-l、HEV-2)的作用，而且安全性極低，因此化合物III和 化合物IV在治療皰疹病毒感染疾病中沒有應(yīng)用背景。
[0050](二)實驗例:組合物對呼吸道合胞病毒(RSV)的作用研究
[0051 ] (1)組合物、化合物III和化合物IV的配置:將藥物溶于細胞維持液(含2 %新生牛 血清的MEM，GIBIC0公司產(chǎn)品）中備用。
[0052] (2)細胞株與病毒株：
[0053] 人胚腎細胞(HEK293，RSV病毒敏感細胞)購自美國Clontech公司；呼吸道合胞病毒 (RSV) Long株引自中國⑶C病毒病研究所。
[0054] (3)細胞毒性測定：
[0055] 參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(1):25~27)的方法，將樣品以2倍比做系列 稀釋(2°^ 6)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向 重復(fù)3孔(A、B、C行），平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細胞對照，7~12孔不接種細胞為空白對照， 顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細胞 對照組OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD 50)。
[0056] (4)抑毒試驗：
[0057]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作 用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(1):25~27)的方法，將樣品按稀釋順序(2 _2一 13)橫向接種于96板孔中的單層細胞上，每孔IOOuU每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、 B、C行加含100個TCID5q的病毒IOOuL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥 物對照，平行設(shè)F行作為病毒對照，E行的1~12作為細胞對照。37°C、5%⑶ 2培養(yǎng)，每日觀察 CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90%以上CPE時，加1 %中性紅染色，用酶標儀在波長540nm 波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存 活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（IC 5q)，最終將TD5q和IC5q相比獲得抑毒指數(shù) (TI)〇
[0058] (5)結(jié)果：
[0059] ①樣品TD5q的測定:對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物III和化合物IV對HEK293的TD 5Q分別為2?31、2<·46、2?75。
[0060] ②抑毒實驗:對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RSV病毒對照組在第 2d出現(xiàn)90%以上的CPE，RSV在HEK293CPE以折光性增強、變圓、脫落、破碎為主要特征。
[0061 ]而組合物抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE:
[0062] RSV-HEK293試驗組細胞在第9稀釋度之前，細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨 樣品濃度減少逐漸加重。
[0063]而化合物III和化合物IV處理組在I3+6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。 [0064] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組A 值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC5q，IC5q與TD5q相比獲得TI:組合物抑制RSV 在 HEK293細胞發(fā)生 CPE，IC5Q 為2-11 ·12，TI 為448.8;化合物III 的 IC5Q 為2-4·68，TI 為4.7;化合物 工乂的比印為]-4·93，!！*'』。
[0065]結(jié)論:組合物具有顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，可以用來制備 抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物?；衔颕II和化合物IV無顯著的抗副粘科病毒呼吸 道合胞病毒RSV的作用，不可以用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物。
[0066](三)實驗例:組合物對甲型流感病毒的作用研究：
[0067] (1)細胞株與病毒株:狗腎細胞(MDCK，流感病毒敏感細胞）引自中國CDC病毒病研 究所;流感病毒甲型(Flu A) 1995. AII: 32094地方株引自中國CDC病毒病研究所。
[0068] (2)細胞毒性測定：
[0069]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(1): 25~27)的方法，將各樣品以2倍比做系列稀釋（2 4-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復(fù)3孔 (A、B、C行），平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細胞對照，7~12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡 下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細胞對照組 OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD50)。
[0070] (3)抑毒試驗：
[0071]參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008; 24( 1): 25~27)的方法，將樣品按稀釋順序橫向接種于96板 孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID 50 的病毒IOOuL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設(shè)F行作為 病毒對照，E行的1~12作為細胞對照。37 °C、5 % CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對 照出現(xiàn)90 %以上CPE時，加1 %中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去 除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方 法計算半數(shù)抑毒濃度（IC 5q)，最終將TD5q和IC5q相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
[0072] ⑷結(jié)果：
[0073]①樣品TD5q的測定:對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化 合物III和化合物IV對的TD5Q在MDCK分別為2-3 ·16、2-2 ·72、2-2 ·13。
[0074] ②抑毒實驗:對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lu A在MDCK CPE以 折光性增強、壞死、破碎為主要特征。
[0075]而組合物抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE = FluA-MDCiai 細胞在第8稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
[0076]而化合物III和化合物IV處理組在I3+6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。 [0077]將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標儀測450nm的A值，各組A值減掉病毒對照 組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC5q，IC 5q與TD5q相比獲得TI:組合物抑制 Flu A在MDCK細胞發(fā)生CPE，IC5Q為2-η·78，ΤΙ為393.4 ;化合物111的1(：5()為2-4'69，1'1為3.9 ;化 合物 IV 的 IC5q 為 2-4·91，TI 為 6.9。
[0078] 結(jié)論:組合物對甲型流感病毒具有很強的抑制作用，而且安全，因此組合物在治療 甲型流感病毒感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景?；衔颕II和化合物IV對甲型流感病毒沒 有顯著的抑制作用，而且安全性極低，因此化合物III和化合物IV在治療甲型流感病毒感染 疾病中沒有應(yīng)用背景。
[0079] 實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0080] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
[0081] 實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0082] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權(quán)項】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物HI和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分數(shù)分別為20%和80%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質(zhì)量百分數(shù)分別為20%和80%充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述病毒為甲型流 感病毒。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述病毒為單純瘤 疹病毒。6. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述病毒為呼吸道 合胞病毒。7. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述單純瘤疹病毒 為單純瘤疹病毒1型或者單純瘤癥病毒2型。8. 如權(quán)利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述單純瘤疹病毒 1型為單純瘤疹病毒1型的Sm44株。9.如權(quán)利要求7所述的組合物在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于:所述單純瘤疹病毒 2型為單純瘤癥病毒2型333株。
【文檔編號】A61K31/4184GK106074523SQ201610405846
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】丁秋菊
【申請人】南京海澳斯生物醫(yī)藥科技有限公司