專利名稱:通過增加底物轉運增強工業(yè)生產的制作方法
技術領域:
本發(fā)明一般地涉及增強期望的終產物的生物轉變,特別地涉及過量表達轉運蛋白以促進底物從一個細胞部位穿膜轉運到另一個細胞部位。本發(fā)明提供了在微生物中增強期望的終產物生產的表達載體、方法和系統(tǒng)。
背景技術:
生物膜的脂雙層通常對離子和極性分子是非通透性的。這些生物膜構成了細胞的區(qū)室,使細胞的不同部分相互隔開。因而被細胞利用以合成各種產物的底物以及被細胞利用以生成能量或生長的代謝物可與利用它們的合成和/或代謝反應分隔開。至于產物的合成,不同的合成途徑或其部分可發(fā)現(xiàn)于在細胞的不同部分。一些氧化反應可發(fā)生在細胞溶膠的外面。例如,膜結合蛋白質可用于將碳源氧化為其他中間物。胞質反應或途徑例如一些還原或脫氫作用也可用來將底物或中間物轉變?yōu)榱硪环N產物。當底物和合成裝置位于膜的相反側時,期望的產物的生產需要底物轉位到合成反應的位置以使其能夠轉變?yōu)榻K產物。換句話說,在細胞膜內部生成的終產物需要從細胞內轉位。由于細胞隔開的部分可能具有不同的環(huán)境參數例如溶質、離子、終產物等,濃度或者需要穿過通常非通透性的膜障礙物轉運,所以需要一些形式的主動轉運。
針對這些問題,出現(xiàn)了關于增加材料跨膜轉運的研究。已用溶劑或裂解試劑來使膜破裂,以使得材料能夠跨過膜。然而,這樣的方法具有不利于宿主細胞生存力的作用。如果合成或代謝途徑依賴于宿主細胞自身的代謝或分解代謝途徑或由其提供能量,例如需要如NADH或NADPH的輔因子,那么破壞細胞的生存力即停止了宿主細胞進一步的或連續(xù)的合成生產。另外,雖然已在增加細胞生長方面探索了葡萄糖或其他糖類轉運的增加(Parker,C.等人,Mol.Microbiol 15(5)795-802(1995)),但尚未認識到通過利用重組微生物的生物合成途徑而改變細胞轉運系統(tǒng)以增加化學終產物或中間物的工業(yè)生產。
Cornish(J.of Gen.Microbiol.,134;3111-3122(1988))討論了放射土壤桿菌(Agrobacteriym radiobacter)葡萄糖轉運和琥珀酰聚糖(Succinoglucan)外聚糖(exopolysaccharide)生產之間的關系。Cornish提出葡萄糖的攝入是琥珀酰聚糖生產的主要動力學控制點,并且應該可能通過利用重組DNA方法獲得更高的琥珀酰聚糖生產速率。然而Cornish的生產速率不在符合工業(yè)生產規(guī)模需要。此外,葡萄糖轉運中的高水平能量消耗和復雜的調節(jié)機制阻礙了而不是促使該轉運的使用。
Volschenk,H.等人(Nat.Biotechnol.15253(March1997))描述了將蘋果酸降解途徑引入到釀酒酵母(Saccharomycescerevisae)中,這是通過克隆和表達編碼所述途徑的異源DNA而耗盡酒中蘋果酸水平來實現(xiàn)的。Volschenk主要關注從周圍培養(yǎng)基中去除蘋果酸,而并非任何期望的終產物的工業(yè)規(guī)模生產。
此外,有關轉運系統(tǒng)涉及其中的起碼知識很難保證能實現(xiàn)期望的終產物或中間物的增強生產。合成裝置可能已經飽和,因而增加的底物的存在不定導致期望的終產物增加的生產。另外,增加對除作為生產底物用途之外還被直接或間接用作代謝物的底物的轉運可能不會導致期望的增加的生產。
僅僅增加將底物轉變?yōu)槠谕慕K產物的酶的表達水平可能并不導致利用重組微生物的化學化合物增加的生產。需要有一種方法,能夠利用重組微生物通過除增加細胞內底物表達水平之外的其它方法增加化學化合物的生產。
發(fā)明概述微生物的底物轉運裝置容量可能成為期望的終產物生產的一個限制因子或瓶頸,尤其當終產物、中間物或前體生產分散在細胞的不同區(qū)域時。本發(fā)明提供了一種減輕所說的瓶頸的方法。
本發(fā)明部分基于增加底物穿越細胞膜的轉運可以增加期望底物的總體生產這一發(fā)現(xiàn)的。
本發(fā)明也提供了增強具有至少部分細胞內途徑的宿主細胞中生物合成期望化合物的改進方法。因此,提供了增強具有至少部分細胞內途徑的宿主細胞中生物合成期望化合物的方法,該方法含有選擇具有至少部分細胞內使用細胞外底物的合成途徑的宿主細胞;增加該細胞外底物向宿主細胞的轉運,且保持宿主細胞的完整性;培養(yǎng)宿主細胞生成該細胞外底物;生成期望的化合物。
在一個優(yōu)選實施方案中,該底物進入該宿主細胞的轉運是該宿主細胞生物合成中的一個限速步驟。
在一個優(yōu)選實施方案中,宿主細胞選自克雷伯菌屬(Kleibsiella)和泛菌屬(Pantoea)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中,增加細胞外底物進入宿主細胞的轉運包括,給宿主細胞轉化編碼一個或多個能增加底物轉運到宿主細胞內的蛋白質的DNA。在一個實施方案中,此蛋白質是轉運促進物。在另一個實施方案中,此蛋白質是一個主要易化物(facilitator)超家族。然而,在另一個實施方案中,此蛋白質是陰離子/陽離子H+轉運蛋白。
本發(fā)明進一步提供了過表達底物/H+同向轉運蛋白的方法,其包含選擇宿主細胞和把編碼一個或多個底物/H+同向轉運蛋白的基因轉化到該宿主細胞這些步驟。
附圖簡述
圖1,表示產酸克雷伯氏桿菌(Klebsiella oxytoca)YiaX2的DNA和氨基酸序列;PE1(環(huán)境通透酶);PE6(環(huán)境通透酶);檸檬泛菌(Pantoea citrea)的PermA;檸檬泛菌的PermB;檸檬泛菌的YiaX2。
圖2是一個表示從葡萄糖生產抗壞血酸前體2-KLG的合成途徑的流程圖。
圖3是一個表示抗壞血酸前體2-酮-L-古洛糖酸(2-KLG)的合成途徑的示意圖。
圖4是一個表示可由葡萄糖得到2-KLG的各種合成途徑的流程圖。Boudrant,J.,Enzym Microb.Tech.,1990,12,322-329。
圖4A是一個表示D-山梨糖醇到2-KLG的合成途徑的示意圖,顯示了該途徑中反應相對于其他反應的細胞內定位和底物跨過細胞膜的轉運。saito,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.58(2/3)305-315(1998)。
圖5表示D-葡萄糖(G)到2,5-DKG再到2-KLG的合成途徑,顯示了該途徑中反應相對于其他反應的細胞內定位和各自的底物跨過細胞膜的轉運。
圖6是一個比較DKG轉運速度與KLG生產速率的線圖,顯示了2,5-DKG的攝入量隨時間的變化(nmoles/OD 600)(-◆-=果糖飼料139-2a,0.0486x+0.67;-▲-=葡萄糖飼料139-2a,y=0.0497+0,5877;-●-=種子燒瓶(seed flask)139-2a,y=0.0075x+0.0569)。
圖7是一個產酸克雷伯氏桿菌中抗壞血酸分解代謝的yia操縱子的示意圖。
圖8是一個表示由硅酮油轉運測定測量的產酸克雷伯氏桿菌的2,5-DKG攝入量(nmo1)圖(-◆-=實驗者+異丙基-β-D-硫代半乳糖苷[IPTG];-▲-=ΔAyiaaX2+IPTG; =實驗者-IPTG)圖9是一個表示對來自檸檬泛菌、產酸克雷伯氏桿菌和環(huán)境來源的通透酶的選擇設計的示意圖。
圖10是一個表示產酸克雷伯氏桿菌菌株中2,5-DKG攝入活性的條線圖(YiaX2、pcp1、pcp10、pcp32、pK1、環(huán)境來源#1和環(huán)境來源#6)。
圖11是一個表示具有各種DKG通透酶(139-2A、139-2A+PCP32、139-2A+PCP10、139-2A+PK1、139-2A+PCP1)和在相同質粒構建體(pBCL 1920)中的139-2A+PE6的搖瓶的2,5-DKG攝入測定的條線圖,在28℃測量了DKG攝入速率(g/l/hr)。
圖12是一個表示由于超表達的DKG通透酶的比生產力增加/比9A-9B。生產速率(g/L/hr)的線圖(-◆-=野生型;-x-=WT、prmA)圖13是一個膜表面PermA轉運蛋白的示意圖。推定的跨膜結構域編號為I-XI。保守殘基的位置以粗體顯示。N是氨基端,C是羧基端。推定的檸檬泛菌通透酶A(SEQ ID_)跨膜結構域是用從http//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframeO.html上可得到的工具推斷的。
圖14是一個相應于殘基G119s到142的保守的氨基酸序列。
詳述定義轉運蛋白定義細菌通道轉運蛋白指那些通常為TC分類#1.A的轉運蛋白(Saier,M.等人,1998,微生物生理學進展(Advances in MicrobialPhysiology(Poole,R.K.,d.)pp.81-136,Academic Press,SanDiego,CA.)。(“TC”代表“Transport Council”,即一種考慮到轉運蛋白的系統(tǒng)發(fā)育方面的分類系統(tǒng)。)這些轉運蛋白通常通過一種非能量依賴性易化擴散機制用一種跨膜孔道來轉運底物、離子或其他材料。
初級轉運蛋白指那些通常為TC分類TC#3.A的轉運蛋白(Saier,M.等人,1998),即那些利用化學能完成底物的主動攝入和轉運排出的,一般以ATP水解形式作為能量偶聯(lián)方式。
基團轉位系統(tǒng)指TC分類為TC#4.A中的轉運蛋白(Saier,M.等人,1998),即伴隨轉運而磷酸化其底物的轉運蛋白。這類的成員通常是細菌特異性磷酸轉移酶系統(tǒng)(PTS)的部分,且其特征在于與磷酸烯醇丙酮酸(PEP)利用的氧化相偶聯(lián)。
次級轉運蛋白指那些通常為TC分類#2.A的轉運蛋白(Saier,M.等人,1998),即那些通常利用化學滲透能例如以質子梯度的形式提供能量以跨膜轉運底物、離子或終產物的轉運蛋白。
主要易化物超家族(major facilitator superfamily,MFS)指通常為TC分類#2的次級轉運蛋白(Saier,M.等人,1998)。
轉運蛋白指任何允許化學化合物跨膜轉位而從一個細胞或細胞區(qū)室進或出的大分子。轉運蛋白已知為或被稱為通透酶。雖然不限于一個特定的理論,但認為轉運蛋白是一種與膜相互作用的蛋白質,該蛋白質的部分從膜的外表面伸出、穿過膜且從膜的內表面伸出。
主動轉運指與能量消耗例如腺苷三磷酸(ATP)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的水解偶聯(lián)的轉運。
陰離子/陽離子同向轉運蛋白(symporter)指利用化學滲透梯度來跨膜轉運底物的轉運蛋白(TC類14)。它們也指底物/H+同向轉運蛋白。
TMS指跨膜結構域。
途徑定義“胞質的”指位于內細胞膜內。
“外源底物”指在合成反應的隔膜相反面發(fā)現(xiàn)的材料,例如當底物將被細胞內合成途徑或合成途徑的細胞內部分轉變?yōu)槠谕慕K產物或中間物時,指內細胞膜外面。外源底物的例子包括己糖、包括葡萄糖、戊糖、包括木糖、阿拉伯糖、核糖、來蘇糖、核苷、神經遞質、藥物、維生素、氨基酸、中間物或多種途徑的前體、包括抗壞血酸。
“細胞外”或“內細胞膜外面”指位于與胞質相反的膜一側的細胞位置,包括但不局限于周質。
“內細胞膜”指將胞質與周質分隔開的障礙物。
“膜”指對底物有內在非通透性的脂雙層。
“細胞內”指位于最靠近或作為細胞溶膠的膜一面的細胞部分。細胞內也包括胞質。
“細胞內反應”指位于胞質內的細胞材料即包含在內細胞膜內的材料的合成反應或生物轉變。
“限速步驟”指生物合成途徑的步驟,其中跨該步驟轉變的增加可導致產物的增加。
“增強生產”指期望的合成反應中間物、終產物或前體的增加的效價(總量),通常以反應過程中獲得的gm/l/hour的增加來測量。它也可指期望產物生產速度的增加,通常以g/l每單位時間的重組產物來測量,其中生產的終產物、中間物或前體作為DNA轉化的結果而增加,該DNA編碼至少一種在超表達的轉運蛋白存在時增加底物跨膜轉運的蛋白質。
“產率增加”是指產生的期望的終產物或中間物的量除以消耗量,計算出的重量百分比的增加。
“底物”指由合成反應進行生物轉變的化合物,反應位置通常與底物是由膜分隔的,需要一種轉運機制來把底物運送到反應位置。底物本身可能是終產物、中間物或隨后的合成反應或隨后的途徑的前體。
“合成反應”指底物到中間物或終產物的生物轉變。該反應可能是生物體內源的或可通過遺傳工程在細胞裝置中進行。
2,5-DKG還原酶指能夠立體選擇性地催化2,5-DKG到2-KLG的轉變的蛋白質。
2,5-DKG轉運蛋白指能夠將2,5-DKG跨過內細胞膜轉運以由2,5-KLG還原酶將其轉變?yōu)?-KLG的蛋白質。
表達定義啟動子指引導RNA聚合酶在適當位點啟動基因轉錄以生成信使RNA的DNA元件,該信使RNA一旦被細胞的翻譯裝置翻譯則能夠形成多肽。
“上游激活序列”是正作用性DNA結合調節(jié)物的結合位點。如其名字所顯示的,上游激活序列在轉錄起始位點的上游且是核酸。
調節(jié)區(qū)指DNA上調節(jié)基因表達的區(qū)域。這種修飾的一種機制是一些調節(jié)區(qū)充當蛋白質(也已知為阻抑物)的結合位點。一旦結合,阻抑物可妨礙RNA聚合酶轉錄基因的能力。
表達系統(tǒng)包括一種或多種蛋白質和/或核酸,當它們一起作用時可以增加宿主細胞中蛋白質的表達。表達系統(tǒng)可在一種或多種質粒中編碼,且可與編碼目的蛋白質的基因在或不在相同的質粒上。
短語“功能性連接的”或“功能性偶聯(lián)的”表示調節(jié)元件(DNA或蛋白質)為了發(fā)揮其功能而物理地相互作用。這可以是蛋白質/蛋白質的、DNA/蛋白質的或DNA/DNA的相互作用。例如,DNA結合調節(jié)物與啟動子相互作用,但是編碼它們的基因可位于染色體上的不同位點。同樣地,編碼元件的基因相互間和與編碼目的蛋白質的基因間可位于不同的質粒上而仍然一起發(fā)揮作用來調節(jié)蛋白質的表達。
一般地,當描述蛋白質和編碼它們的基因時,基因的術語不是大寫的而是斜體的,也就是permA。蛋白質的術語通常為正常文字,且首字母大寫,也就是PermA。
生物體定義“真菌”是指任何大量缺乏葉綠素的植物有機體,包括酵母、霉菌和蘑菇。
“哺乳動物”是指任何多種溫血脊椎動物,標志為皮膚上有毛發(fā)覆蓋。
“植物”是指相關植物,包括單子葉植物、雙子葉植物等。
“細菌”包括裂殖菌綱(Schizomycetes)的微生物。細菌可為革蘭氏陰性的或革蘭氏陽性的。革蘭氏陰性細菌包括屬大腸桿菌屬(Escherichia)、嗜血桿菌屬(Hemophilus)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、醋桿菌屬(Acetobacter)、耶爾森氏菌屬(Yersenia)、志賀菌屬(Shigella)、弧菌屬(Vibrio)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、泛菌屬(Pantoea)和沙雷氏菌屬(Serratia)的成員。革蘭氏陽性細菌包括屬芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)的成員。
革蘭氏陰性細菌可為泛菌(pantoeans),是泛菌屬成員的菌株。優(yōu)選的細菌是檸檬泛菌。檸檬泛菌有時也被稱為草生歐氏桿菌(Erwinia herbicola)。
如此處所用的術語“分離的”或“純化的”指除去至少一種與其天然聯(lián)合的成分的核酸或氨基酸。
優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明提供了增強衍生自所述宿主細胞至少部分細胞內途徑的期望化合物生物合成的新方法,該方法通過增加外源或細胞外底物轉運來改善合成途徑的瓶頸,增強期望的中間物或終產物的合成,尤其是當轉運蛋白已經被重組導入并被宿主細胞過量表達時。
本發(fā)明的一個實施方案是用包括編碼表達系統(tǒng)的核酸的質粒轉化宿主細胞的方法。本發(fā)明的另一個實施方案是用包括編碼一種或多種增加底物跨膜轉運的蛋白質的DNA的質粒轉化宿主細胞的方法。宿主細胞是本發(fā)明的質粒能夠通過如轉化而被插入的細胞。宿主細胞優(yōu)選地為細菌,更優(yōu)選地為檸檬泛菌、大腸桿菌;克雷伯氏桿菌屬或芽孢桿菌屬。
在另一個實施方案中,如果包括了調節(jié)元件,那么這樣的表達系統(tǒng)的元件來自大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。在一個實施方案中,宿主細胞優(yōu)選地為革蘭氏陰性細菌。在另一個實施方案中,宿主細胞是泛菌屬。相同的宿主細胞可用另外一個包括編碼一種或多種轉運蛋白的核酸的質粒轉化。優(yōu)選地,該轉運蛋白為編碼的MFS轉運蛋白,更優(yōu)選地為陰離子/陽離子同向轉運蛋白??勺鳛榉独霓D運蛋白包括那些檸檬泛菌或產酸克雷伯氏桿菌和異源來源的yiaX2、permA、permB、pe6、pel編碼或表達的蛋白。
合成反應本發(fā)明提供了增加底物跨膜轉運以增強底物的生產。增加的轉運提供了底物跨過把細胞內合成反應位置分隔的膜的轉位。合成反應可能是一個單個酶轉變、一個合成途徑的一部分或全部。本發(fā)明尤其用于包含細胞質和細胞外合成反應的合成途徑,其一個反應的終產物轉運后被膜另一邊的另一個反應使用。本發(fā)明涉及一個合成反應,其可能發(fā)生在細胞溶膠中,而且需要第五轉運進入細胞溶膠;或可能發(fā)生在細胞溶膠外的反應,而且需要底物穿透膜轉運到細胞外位置。因而,本發(fā)明特別用于耦合需要本發(fā)明提及的輔助因子的反應,例如NADH或NADPH反應、一般需要底物或中間物進行還原的反應、或還原反應相當的氧化反應。典型的反應包括,但是并不局限于2,5-DKG到2-KLG的還原;L-山梨糖酮(L-sorbosone)到2-KLG的還原;5-酮-D-葡糖酸(5-keto-D-Gluconic acid,5-KDG)到L-艾杜糖酸(L-idonic acid,IA)的還原;和5-KDG到L-古洛糖酸(L-gulonic acid,GA)的還原。另外的反應包括 在上面的反應(1)中,可能設想在甘油-3-磷酸到甘油的生物轉化中,甘油-3-磷酸的轉運可能是一個限速步驟。
在上面的反應(2)中,葡糖酸通過一系列酶促步驟轉化成D-核糖-5-磷酸。D-核糖-5-磷酸是有價值的化合物,可以轉化成核糖、核苷酸、核黃素或氣味增強劑類似肌苷單磷酸(Wulf &Vandame,1997,Appl.Microbiol.Biotechnol.48141-148)。葡糖酸到其他產物的生物轉化可能到達細胞內轉運可能是一限速步驟的點。
另一個反應尤其可用于本發(fā)明的戊糖到乙醇的生物轉化實驗中。近來有報道木糖用于操縱大腸桿菌中的同型乙醇途徑。(Tao,H,等,J.bact.2001,183,2979-2988)增加木糖到細胞溶膠的轉運可以增強乙醇的生產??梢灶A想將植物來源的生物質(它是增強這些戊糖到化學化合物合成的便宜來源)與這些糖的生產相偶聯(lián)。以細菌質子相關轉運系統(tǒng)(Henderson,P.J.Bioeng.Biomem 1990,4,525-569)或這些戊糖相關的類似產物、途徑,來增加這些糖的轉運。
發(fā)明者在此認為上面提供的反應僅僅是本發(fā)明的說明,對于理解本發(fā)明是有用的例子。本領域的技術人員能很容易地鑒定其他合成反應,由此本發(fā)明的應用將有效增加底物到期望的中間物或終產物的生產。同樣的,根據本文的教導,普通技術人員能很容易選擇合適化學生產或生物合成途徑。例如,若終產物涉及作為生物體內源代謝一部分的途徑或反應,其決定性轉運步驟可用簡單的方式確定。同樣的,若將生成期望的終產物的途徑引入細胞,可能使用此處提供的技術來確定關鍵途徑元素和將益于終產物生產的最適底物轉運點。
在一個實施方案中,合成途徑可能包含至少一個合成反應,其包括需轉運入或轉運出細胞的底物或產物。例如在這個實施方案中,待增強的反應包含至少部分細胞內或細胞溶膠內途徑;和至少部分細胞外途徑。外源底物在位于細胞溶膠內的合成反應或部分合成途徑中使用。作為例子,酮糖衍生物(其中一些可以用做抗壞血酸前體或中間物)的生產可以用本發(fā)明進行優(yōu)化。其他象5-酮-D-葡糖酸可以用于酒石酸的制備(美國專利第5,763,656號)。本發(fā)明尤其可用于抗壞血酸中間體合成,例如2,5-DKG向2-KLG的轉變;山梨糖或山梨醇通過山梨糖酮到2-KLG的轉變;5-酮-D-葡糖酸到L-艾杜糖酸的還原;5-酮-D-葡糖酸到L-古洛糖酸的還原。這些途徑每個都有位于細胞質的合成途徑和合成反應的部分,例如2,5-DKG被2,5-DKG還原酶的還原;L-山梨糖酮被山梨糖酮脫氫酶還原成2-KLG;5-酮-D-葡糖酸被5-KDG脫氫酶還原成L-艾杜糖酸;5-酮-D-葡糖酸被5-KDG還原酶還原成L-古洛糖酸。這些途徑特征均在于跨膜轉運底物例如2,5-DKG;L-山梨糖酮等的必要性,以通過胞質內的合成反應進行生物轉化。
底物是通常在沒有一些主動轉運機制時不能有效地通過膜的物質。優(yōu)選地,這些底物包括但不局限于抗壞血酸中間物(2,5-DKG、山梨糖酮)。發(fā)明者預想的其他底物如表2和表3所述。另外,底物是一種被轉運以在工業(yè)規(guī)模上用作合成用途而通常不被宿主細胞用作代謝用途的物質。工業(yè)規(guī)模指效價和容量的生產力大于1gm/升/小時,優(yōu)選地大于2g/l/h,更優(yōu)選地大于3g/l/h,并且更加優(yōu)選地大于5g/l/h。在另一個實施方案中,生產力效價在2到14gm/l/小時之間,優(yōu)選地為3到12g/l/h之間,更加優(yōu)選地為5到10g/l/h之間,為一個經濟上可行的工業(yè)生產方法。另外,本發(fā)明可以增加合成途徑的產量。在一個實施方案中,產量大于50%(重量),在另一個實施方案中,產量大于60%,在另一個實施方案中產量大于70%。尤其優(yōu)選的底物包括2,5-DKG和山梨糖酮。本發(fā)明的發(fā)明方面在這些實施方案中尤其有用。
在本發(fā)明的實踐中尤其有用的一個反應是2,5-DKG的跨內細胞膜轉運以被胞質內脫氫酶2,5-DKG還原酶將其進行胞質還原而生成2-KLG。2,5-DKG是由2-酮-D-葡糖酸(2-KDG)被膜結合的2-酮葡糖酸脫氫酶轉變而來的。2-KDG是從葡萄糖經過D-葡糖酸(GA)的氧化作用轉變而來的。2,5-DKG跨內細胞膜轉運到胞質還原為2-KLG的位點可通過DNA編碼的2,5-DKG轉運蛋白的增加來實現(xiàn)。(Boudrant,J.(1990)Enzyme Microb.Technol.1990322-329)在本發(fā)明的實踐中尤其有用的另一個反應是通過山梨糖、山梨糖醇生產2-KLG的中間物,即山梨糖酮的轉運。(Saito,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.58(2/3)309-315(19987))從山梨糖醇和/或山梨糖向山梨糖酮的轉變是由山梨糖醇或山梨糖轉變?yōu)?-KLG的途徑中的一個步驟(Boudrant,J.,1990;Saito(1997))。下面是對根據本發(fā)明的山梨糖酮轉運蛋白工程化的討論。
如圖4a所示,D-山梨糖到2-KLG的途徑包括L-山梨糖脫氫酶(SDH)將L-山梨糖氧化為L-山梨糖酮,隨后是L-山梨糖酮脫氫酶將L-山梨糖酮氧化2KLG。已描述了一個由膜結合的脫氫酶將D-山梨糖醇轉變?yōu)長-山梨糖酮的重組宿主細胞(Saito,Y.等人(1997))。然后L-山梨糖酮被從細胞周質轉運以被胞質內的L-山梨糖酮脫氫酶還原。已認識到將山梨糖酮轉運蛋白超表達而促進將山梨糖酮中間物轉運到2-KLG轉化途徑中具有有利作用。
如圖4所示,D-葡萄糖到2-KLG的一個可選擇的途徑包括將D-葡糖酸氧化為5-酮-D-葡糖酸(5KDG),后者再被還原為L-艾杜糖酸(IA)或L-古洛糖酸以氧化為2KLG。(Boudrant,J.,(1990))??赏ㄟ^5KDG轉運蛋白的超表達促進5-酮-D-葡糖酸到細胞溶膠的轉運,以便由酮還原酶還原。
在另一個實施方案中,合成反應可為胞質外的或相對于底物位于膜的外面。第一個反應的終產物可為中間底物,用于位于膜的相反面的第二個反應中。例如,在來自Japanese persimmon的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)T-100(FERM BP-4188)中自D-山梨糖醇合成2-KLG時,D-山梨糖醇被胞質內L-山梨糖醇脫氫酶轉變?yōu)長-山梨糖,產生一種中間物,該中間物跨過細胞膜被轉運出胞質,以被膜結合的L-山梨糖脫氫酶轉變?yōu)長-山梨糖酮。因而,發(fā)明者預期可增加將胞質中間物即一種底物從內膜的胞質側跨膜到膜外的轉運以進行隨后的轉變。Saito,Y.,(1997)雖然一個優(yōu)選實施方案包括位于單一的生物體里的合成反應或途徑,但位于不同的生物體內的不同反應也是本發(fā)明者所預期的。例如,在從葡萄糖生產2-KLG的混合的培養(yǎng)系統(tǒng)中,葡萄糖到中間物2,5-DKG的轉變可發(fā)生在一種生物體中(醋單孢桿菌屬(Acetomonas)、醋桿菌屬、葡糖桿菌屬或歐氏桿菌屬),而該中間物向目的抗壞血酸中間物2-KLG的轉變發(fā)生在第二個生物體中(短桿菌屬(Brevibacterium)或棒狀桿菌屬(Corynebacterium))。參見授予Sonoyama(1976)的美國專利第3,963,574號。也參見Hoshino,美國專利第5,312,741號。
在另一個實施例中,氨基酸L-色氨酸已經以吲哚或鄰氨基苯甲酸轉化進行生產。在這個實踐中,該產物被細胞用于進行蛋白質生物合成。(美國專利第3,801,457號)因此,合成反應可生成一種自身可在由細胞膜分隔的另一個細胞位置被轉變的中間物。在這個實施方案中,終產物可為隨后的反應的中間底物。
確定限速步驟的方法為了增加底物從第一個細胞位置到第二個細胞位置的轉運的效果最大化,在一個優(yōu)選實施方案中,底物穿膜轉運組成了合成途徑的限速步驟。確定這樣一個步驟是否限速步驟是通過分析該途徑、估定每一步驟的產量以及改變可被該途徑用于轉變的底物量以確定是否這種增加底物可導致該途徑總產量的增加來完成的。在確定了底物的增加可增強期望終產物的生產時,如果底物是需要從一個細胞位置穿過細胞膜轉運到另一個細胞位置,就可以確定增加底物轉運將增強通過該途徑的生產。
有多種方法可用于確定限制目的分子生產的瓶頸。大體上,他們大多依賴于生物合成途徑中一個或多個組分的變化,而且可確定這些變化在過程中的效果。這些變化可在于底物轉變成產物的合成速率、總累計量或產量。(Walsh & Koshland.,1985,PNAS 823577-3581)(Jensen等人,1993,Eur.J.Biochem.211181-191)確定途徑部分的限速狀態(tài)的一個方法是在途徑的各個點比較增加了一種特殊的生物轉化物的存在之前或之后中間物的生產力。如果盡管增加了中間物或超表達了轉變途徑,而終產物的生產并沒有增加,那么該步驟不是限速性的,因而影響該合成反應的具體酶的超表達可能不導致生產增加。各中間物的量可由各種直接或間接方法確定。間接方法包括用線內(in-line)測量法如氣體分壓來測量呼吸參量的消耗或產生,如二氧化碳生產、氧氣消耗。中間物的直接測量可通過各種本領域公知的分析技術來實現(xiàn),它們描述于Lazarus,Analyt.Biochem 157,360-366(1986)及其中引用的參考文獻描述(在此處引用作為參考),包括但不局限于紙、氣體相、液相和薄層層析以及化學和酶促測定。高效液相層析方法學,尤其如Lazarus,1986提出的,是尤其有用的。本發(fā)明者所使用的一種方法包括Waters 2690HPLC和Waters 410差示折光計(differentialrefractermeter),設置用流速為1ml/分的50mM乙酸鹽緩沖液作為洗脫介質和Dyonex lonpac AS-10離子交換柱(4×250mm)來分離并確定存在的化學化合物的量。
由本發(fā)明者使用的另一種確定在肉湯中生產的2-klg的純度的方法是通過總碳分析的。
因而在一個實施方案中,轉運的活性可通過測量在細胞外底物存在時產物的生產而在底物可被轉變?yōu)楫a物的任何細胞中進行測量。例如,在天然地或重組地表達2,5-DKG還原酶的細胞中,細胞內2,5-DKG被轉變?yōu)?-KLG。當提供細胞外2,5-DKG時,在有2,5-DKG通透酶的表達時細菌細胞生產2-KLG的能力是表達的通透酶將2,5-DKG轉運入細胞的能力的量度標準,因而也是其2,5-DKG通透酶活性的量度標準。例如,細胞內2-KLG可用HPLC或本領域公知的其他靈敏檢測方法檢測。2,5-DKG的其他代謝產物也可經類似的方法檢測。
期望底物的轉運蛋白本發(fā)明所用的轉運蛋白包含使材料跨膜轉運更容易的化合物。在一個實施方案中,轉運蛋白類型選擇自通道蛋白、初級主動轉運蛋白、次級主動轉運蛋白和基團轉位蛋白的組。在另一個實施方案中,轉運蛋白類型是次級轉運蛋白,優(yōu)選是主要易化物超家族成員,更優(yōu)選陰離子陽離子同向轉運蛋白成員,更加優(yōu)選來自yiaX2,permA,permB,pe1和pe6編碼的轉運蛋白。
基于轉運模式和能量偶聯(lián)機制,有四種不同類型的功能性特征化的轉運系統(tǒng)。第一種是細菌通道蛋白質(TC#1.A,Saier,1998),其通過一種能量非依賴性易化擴散機制利用跨膜孔道進行轉運。第二種轉運系統(tǒng)即易化物(faciliators)和/或次級轉運蛋白(secondary transporter)(第二類,TC#2.A)代表了轉運蛋白的最大種類。第三類ATP驅動的初級主動轉運蛋白利用ATP水解作為溶質主動攝入和/或排出的能量偶聯(lián)模式。最后一類由在轉運中使其底物磷酸化的轉運蛋白組成(TC#4.A)。
在次級家族中,類型II家族中最大的是主要易化物超家族(MFS)和氨基酸多胺膽堿(amino acid polyamine choline,APC)家族(Reizer等人,Protein Sci,2(1)20-30(1993))。這些次級轉運蛋白超家族可進一步分為三類(1)質子動力(proton motiveform,pmf)驅動的,(2)鈉動力(sodium motive force,smf)驅動的,和(3)其他離子或溶質驅動的交換劑。這些轉運系統(tǒng)催化溶質的單向轉運、反向轉運和/或同向轉運。次級主動轉運蛋白已在大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H.influenzae)、幽門螺桿菌(H.pylori)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、生殖道支原體(M.genitalium)、集胞藍細菌屬(Synechocystis)、詹氏甲烷球菌(M.Jannaschii)中鑒定(Paulsen等 1998 J.Mol.Biol.277573-592)。次級轉運蛋白一般是多中心(polytopic)膜蛋白質,常常有12個TMS。對于通常大多數初級載體,即一種能量驅動的基團轉位的化學形式,是ATP-依賴性系統(tǒng),如同大多數ATP-結合盒(ATP-binding cassette,ABC)超家族成員一樣,或是用PEP作為糖類攝入和磷酸化的磷?;w的PTS。次級轉運蛋白與初級轉運蛋白(ABC轉運蛋白)區(qū)別在初級轉運蛋白利用ATP,消耗細胞的能量。另外,ABC轉運蛋白的使用需要一種更加復雜的轉運蛋白系統(tǒng),即包含兩個疏水的膜內在結構域和兩個ATP-結合結構域(Hosie等人Molecul.Microbiol(2001)40(6),1449-1459)。那些負責溶質攝入的ABC轉運蛋白也需要溶質結合蛋白質(solute-bindingprotein,SBP)的存在。因而改進的ABC轉運系統(tǒng)的基因工程需要比次級轉運蛋白性質更復雜的表達和轉化。
本發(fā)明范圍內的轉運蛋白包括如表I和II所示的轉運蛋白表1,根據細菌基因組分析對轉運蛋白家族進行分類家族名稱 縮寫 TC編號a例子I. 通道蛋白主要內在蛋白質MIP 1.1 GlpF Eco高電導敏感離子通道MscL 1.3 MscL Eco電壓敏感離子通道 VIC 1.5 Kch Eco氯通道CIC 1.10 Gefl SceII. 次級主動轉運蛋白主要易化物超家族 MFS 2.1 LacY Eco糖苷-戊糖-已糖苷酸陽離子同向轉 GPH 2.2 MeIB Eco運蛋白氨基酸-聚胺-膽堿 APC 2.3 PheP Eco陽離子擴散易化物 CDF 2.4 CzcD Aeu抗腫瘤細胞分化RND 2.6 AcrB Eco小型多藥抗性 SMR 2.7 Smr Sau葡糖酸H+同向轉運蛋白 GntP 2.8 GntP EcoL-鼠李糖轉運蛋白 RhaT 2.9 RhaT Eco2-酮-e-脫氧葡糖酸轉運蛋白 KdgT 2.10 KdgT Eco檸檬酸-Mg2+H+同向轉運蛋白CitMHS2.11 CitM BsuC4-二羧酸攝入 Dcu 2.13 DcuA Eco乳酸通透酶LctP 2.14 LctP Eco甜菜堿/肉毒堿/膽堿轉運蛋白BCCT 2.15 BetT Eco亞碲酸鹽抗性/二羧酸轉運蛋白 TDT 2.16 TehA Eco質子依賴型寡肽轉運蛋白POT 2.17 Ptr2 EcoCa2+/陽離子反向轉運蛋白 CaCA 2.19 YrbG Eco無機磷酸鹽轉運蛋白PiT 2.20 PitA Eco鈉溶質同向轉運蛋白 SSS 2.21 PutP Eco神經遞質鈉同向轉運蛋白 NSS 2.22 Gatl Hsa二羧酸陽離子(Na+或H+)同向轉運DCS 2.23 GltP Ecp蛋白檸檬酸鹽Na+同向轉運蛋白 CSS 2.24 CitS Kpn丙氨酸Na+同向轉運蛋白 ASS 2.25 DagA Aha支鏈氨基酸Na+同向轉運蛋白 LIVSS 2.26 BrnQ Sty谷氨酸Na+同向轉運蛋白 ESS 2.27 GltS Eco膽汁酸Na+同向轉運蛋白 BASS 2.28 NabA RnoNhaA Na+H+反向轉運蛋白 NhaA 2.33 NhA EcoNhaB Na+H+反向轉運蛋白 NhaB 2.34 NhB EcoNhaC Na+H+反向轉運蛋白 NhaC 2.35 NhC Eco單價陽離子質子反向轉運蛋白-1CPA-1 2.36 Nhe1 Rno單價陽離子質子反向轉運蛋白-2CPA-2 2.37 KefC EcoK+H+轉運蛋白 Trk 2.38 TrkHAE Eco核苷堿基陽離子同向轉運蛋白-1NCS1 2.39 CodB Eco核苷堿基陽離子同向轉運蛋白-2NCS2 2.40 UraA Eco核苷攝入通透酶NUP 2.41 NupC Eco芳香族氨基酸通透酶ArAAP 2.42 Mtr Eco絲氨酸/蘇氨酸通透酶 STP 2.43 SdaC Eco甲酸-亞硝酸鹽轉運蛋白 FNP 2.44 FocA Eco金屬離子轉運蛋白 MIT 2.45 CorA Eco苯甲酸鹽H+同向轉運蛋白 BenE 2.46 BenE Aco二價陰離子Na+同向轉運蛋白 DASS 2.47 NadC1 Has銨轉運蛋白Amt 2.49 HoxN ReuNi2+-Co2+轉運蛋白 NiCoT 2.52 HoxN Reu硫酸鹽轉運蛋白SulP 2.53 *Sul1 Sce三聯(lián)ATP-非依賴型周質轉運蛋白 TRAP-T2.56 DctPQM Rca磷酸鹽Na+同向轉運蛋白 PNaS 2.58 NapT Rno
家族名稱縮寫 TC編號a例子III.初級主動轉運蛋白ATP-結合盒 ABC 3.1 MalEFGK EcoH+或Na+轉位-F-型、V-型和A-型 F-3.2 UncA-H EcoATP酶 ATPase陽離子轉位-P-型ATP酶P-3.3 CadA SauAtPase砷化物外向通量 Ars 3.4 ArsAb EcoIV. 基團轉位蛋白葡萄糖-葡萄糖苷磷酸轉移酶系統(tǒng) Glc 4.1 PtsG/CrrEco果糖-甘露醇磷酸轉移酶系統(tǒng) Fru 4.2 FruAB Eco乳糖-纖維二糖磷酸轉移酶系統(tǒng) Lac 4.3 Cel ABC Eco葡萄糖醇磷酸轉移酶系統(tǒng) Gut 4.4 GutAB Eco半乳糖醇磷酸轉移酶系統(tǒng) Gat 4.5 GatABC Eco甘露糖-果糖-山梨糖磷酸轉移酶系統(tǒng)Man 4.6 ManXYZ EcoV. 未分類的多糖轉運蛋白PST 99.1 RfbX EcoMerTP汞離子(Hg2+)通透酶MerTP 99.2 MerTP Sau煙酰胺單核苷攝入通透酶 NMN 99.4 PnuC EcoK+攝入通透酶 Kup 99.5 Kup EcoL-賴氨酸輸出蛋白LysE 99.6 LysE Cgl鉻酸鹽離子轉運蛋白 CIT 99.7 ChrA Aeu亞鐵離子攝 FeoB 99.8 FeoB EcoMg2+轉運蛋白 Mgt 99.19MgtE Pst
表2,根據細菌基因組分析對轉運蛋白家族進行分類家族名稱 典型底物 Dist.c參考文獻I. 通道蛋白主要內在蛋白質 甘油,水 BE Park和Saier(1996)高電導敏感離子通道 離子 B Sukarev等人(1996)電壓敏感離子通道 鉀BAEAlexander和Peters(1997)氯通道 氯化物BAESaier等人(來發(fā)表);Jentsch等人(1995)II. 次級主動轉運蛋白主要易化物超家族 糖類、藥物、代謝物、 BAEPao等人(1998)(未發(fā)表結神經遞質、有機離子、 果);Paulsen和Skurray核苷、羧酸酯、有機和 (1993);Paulsen等人無機陰離子 (1996a,b)糖苷戊糖-己糖苷酸陽離子同向 糖苷、戊糖、己糖苷酸 B Poolman等人(1996)轉運蛋白氨基酸-聚胺-膽堿 氨基酸、膽堿、多胺BAEReizer等人(1993)陽離子擴散易化物 金屬離子 BAEPaulsen和Saier(1997)抗腫瘤細胞分化 藥物、金屬離子、脂多 B Paulsen等人(1996b)糖小型多種藥物抗性 藥物 B Paulsen等人(1996b)葡糖酸H+同向轉運蛋白 葡糖酸B Peekhaus等人(1997)L-鼠李糖轉運蛋白 鼠李糖B Tate等人(1992)2-酮-e-脫氧葡糖酸轉運蛋白 2-酮-3-脫氧葡糖酸 B Allen等人(1989)檸檬酸-Mg2+H+同向轉運蛋白 檸檬酸G+ Boorsma等人(1996)C4-二羧酸攝入 二羧酸G- Saier等人(未發(fā)表結果)乳酸通透酶 乳酸 BA Saier等人(未發(fā)表結果)甜菜堿/肉毒堿/膽堿轉運蛋白 甜菜堿、肉毒堿、膽堿 B Saier等人(未發(fā)表結果)亞碲酸鹽抗性/二羧酸轉運蛋白亞碲酸鹽、二羧酸 BA Saier等人(未發(fā)表結果)質子依賴型寡肽轉運蛋白 肽BE Saier等人(未發(fā)表結果)Ca2+/陽離子反向轉運蛋白Ca2+/Na+或H+BAESaier等人(未發(fā)表結果)無機磷酸鹽轉運蛋白 磷酸鹽BAESaier等人(未發(fā)表結果)鈉溶質同向轉運蛋白 氨基酸、糖類、維生BE Reizer等人(1993)素、核苷、無機陰離子神經遞質鈉同向轉運蛋白 神經遞質 BAEReizer等人(1993)二羧酸鹽陽離子(Na+或H+)同 二羧酸鹽、氨基酸 BE Saier等人(未發(fā)表結果)向轉運蛋白檸檬酸鹽Na+同向轉運蛋白 三和二羧酸盤 B Kawai等人(1997)
丙氨酸Na+同向轉運蛋白 丙氨酸 B Reizer等人(1993)支鏈氨基酸Na+同向轉運蛋白 支鏈氨基酸 B Reizer等人(1993)谷氨酸鹽Na+同向轉運蛋白谷氨酸鹽 G- Reizer等人(1993)膽汁酸Na+同向轉運蛋白 膽汁酸 BE Reizer等人(1993)NhaA Na+H+反向轉運蛋白Na+/H+G- Gerchman等人(1993)NhaB Na+H+反向轉運蛋白Na+/H+B Pinner等人(1992)NhaC Na+H+反向轉運蛋白Na+/H+B Ivey等人(1991)單價陽離子質子反向轉運蛋白-1 Na/H+BAESaier等人(未發(fā)表結果);Orlowski等人(1992)單價陽離子質子反向轉運蛋白-2 K+,Na+/H+BAESaier等人(未發(fā)表結果);Stumpe等人(1996)K+H+轉運蛋白 K+/H+BAESaier等人(未發(fā)表結果)Stumpe等人(1996)核苷堿基陽離子同向轉運蛋白-1胞嘧啶、尿嘧啶、尿囊 BE Saier等人(未發(fā)表結果)素核苷堿基陽離子同向轉運蛋白-2核苷 BE Saier等人(未發(fā)表結果)核苷攝入通透酶核苷 BE Saier等人(未發(fā)表結果)芳香族氨基酸通透酶氨基酸 G- Sarsero和Pittard(1997)絲氨酸/蘇氨酸通透酶 氨基酸 G- Shao等人(1994)甲酸-亞硝酸鹽轉運蛋白 氨基酸、甲酸、亞硝酸 BAESaier等人(未發(fā)表結果)鹽金屬離子轉運蛋白 Mg2+、Co2+、Mn2+、Al3+BA Smith等人(1993)苯甲酸H+同向轉運蛋白 苯甲酸 G- Neidle等人(1991)二價陰離子Na+同向轉運蛋白 NadC1 HsaBAEMarkovich等人(1993)銨轉運蛋白銨 BAESaier等人(未發(fā)表結果)Ni2+-Co2+轉運蛋白 Ni2+,Co2+B Wolfram等人(1995)硫酸鹽轉運蛋白硫酸鹽 BE Saier等人(未發(fā)表結果);Smith等人(1995)三聯(lián)ATP-非依賴型周質轉運蛋白 二羧酸鹽 B Forward等人(1997)磷酸鹽Na+同向轉運蛋白 磷酸鹽 BE Magagnin等人(1993)III.初級主動轉運蛋白ATP-結合盒糖、氨基酸、藥物、金 BAEKuan等人(1995)屬離子、代謝物、肽、維生素、蛋白質、復雜碳水化合物H+或Na+轉位-F-型、V-型和A H+/Na+BAEBlair等人(1996)-型ATP酶陽離子轉位-P-型ATP酶 M+、M2+BAEFagan和Saier(1994)砷化物外向通量亞砷酸鹽、亞銻酸鹽 BAETsai等人(1997)IV. 基團轉位蛋白葡萄糖-葡萄糖苷磷酸轉移酶系統(tǒng) 葡萄糖、蔗糖、β-葡B Reizer等人(1996c)糖苷、N-乙酰葡糖胺果糖-甘露醇磷酸轉移酶系統(tǒng) 果糖、甘露醇 B Reizer等人(1996c)乳糖-纖維二糖磷酸轉移酶系統(tǒng) 乳糖、纖維二糖 B Reizer等人(1996a)葡萄糖醇磷酸轉移酶系統(tǒng)葡萄糖醇 B Reizer等人(1996b)半乳糖醇磷酸轉移酶系統(tǒng)半乳糖醇 G- Nobelmann和Lengeler(1996)甘露糖-果糖-山梨糖磷酸轉移酶 甘露糖、果糖、山梨糖 B Reizer等人(1996d)系統(tǒng)V. 未分類的多糖轉運蛋白 多糖 B Paulsen等人(1997)MerTP汞離子(Hg2+)通透酶 汞和重金屬離子 B Silver和Phung煙酰胺單核苷酸攝入通透酶 煙酰胺單核苷酸 G- Foster等人(1990)K+攝入通透酶 鉀 BE Banuelos等人(1995)L-賴氨酸輸出蛋白 賴氨酸 B Vrljic等人(1996)鉻酸鹽離子轉運蛋白鉻酸離子 BA Nies和Silver(1995)亞鐵離子攝入 亞鐵離子 BA Kammler等人(1993)Mg2+轉運蛋白 Mg2+、Co2+BA Townsend等人(1995)aTC編號,轉運蛋白委員會的分類號(Saier,1998)b引用的例子顯示蛋白質的縮寫,基于編碼基因名稱(前四個字母),再加上來源生物體的三字母縮寫。(例如Eco,大腸桿菌;Sce,釀酒酵母)c下述生物體系統(tǒng)發(fā)生組內的家族成員表示如下革蘭氏陰性細菌,G-;革蘭氏陽性細菌,G+;細菌,B;古生物,A;真核生物,E。
(Paulsen,I.T.等人,J.Mol.Biol.277,573-592(1998)),而且這兒引用地參考文獻都合并做參考。
本發(fā)明范圍內的次級轉運蛋白如表3和4所述。
表3縮寫 描述門*ExuT Eco 糖醛酸轉運蛋白 BYcbE Bsu 推定的葡糖二酸轉運蛋白 BYcbE Ppu 推定的葡糖二酸轉運蛋白 BHpaX Eco 4-羥基苯乙酸轉運蛋白BOrf f450 Eco 推定的葡糖二酸轉運蛋白 BPht1 Ppu 鄰苯二甲酸轉運蛋白 BTtuB Avi 酒石酸轉運蛋白 BTtuB1 Avi 酒石酸轉運蛋白 BYhaU Eco 推定的葡糖二酸轉運蛋白 BYidT Eco 半乳糖酸轉運蛋白BYybO Bsu 葡糖二酸轉運蛋白BC11D3.18c Spo C11D3.18c(推定的Na+/磷酸鹽共轉運蛋白) YDal5 Sce 尿囊酸(allantoate)通透酶YL0578 Sce 未知功能YYal0670 Sce未知功能YYcr28c Sce 未知功能YYgr260w Sce未知功能YYil166c Sce未知功能YYlr004c SceOrf Ylr004c(未知功能) Y表4縮寫 生物體 大小(殘基數目) 接受號 數據庫*ExuT Eco 大腸桿菌472 P42609 SPYcbE Bsu 枯草芽孢桿菌455 P42237 SPYcbE Ppu 惡臭假單胞菌456 P42205 SPHpaX Eco 大腸桿菌458 Z37980 GBOrf f450 Eco 大腸桿菌450 U29581 GBPht1 Ppu 惡臭假單胞菌451 Q05181 SPTtuB Avi 葡萄土壤桿菌433 U25634 GBTtuB1 Avi 葡萄土壤桿菌449 U32375 GBYhaU Eco 大腸桿菌444 P42613 SPYidT Eco 大腸桿菌445 P31457 SPYybO Bsu 枯草芽孢桿菌435 P37489 SPC11D3.18c Spo 粟酒裂殖酵母498 Z68166 GBDal5 Sce 釀酒酵母543 P15365 SPL0578 Sce 釀酒酵母531 S50965 PIRYal0670 Sce釀酒酵母593 P39709 SPYcr28c Sce 釀酒酵母512 P25621 SPYgr260w Sce釀酒酵母534 Z73044 GBYil166c Sce釀酒酵母542 P40445 SPYlr004c Sce釀酒酵母523 Z73176 GBPao,S.S.等人,1998,Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1)1-34。
在一個實施方案中,編碼所述至少一種可增加底物跨內細胞膜轉運的蛋白質的DNA選自哺乳動物、植物、真菌或細菌細胞。作為植物細胞的例子,下面有草本、樹本、海草。作為真菌細胞的例子,下面有用的有酵母、絲狀真菌、白腐真菌和粘菌。作為細菌細胞的例子,下面有用的有醋桿菌屬、假單胞桿菌屬、桿菌屬(Bacterium)、藍球菌屬(Cyanococcus)、微球菌屬、短桿菌屬、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、醋單孢菌屬、葡糖桿菌屬和歐氏桿菌屬。優(yōu)選的生物體選自大腸桿菌、泛菌屬和克雷伯氏桿菌屬。
II.表達系統(tǒng)本發(fā)明提供了增強微生物包括細菌和酵母中期望的異源或同源蛋白質的生產和轉運的表達系統(tǒng)。
a.編碼序列在本發(fā)明中,載體包含至少一個拷貝的編碼轉運蛋白的核酸,優(yōu)選地包含多拷貝。轉運蛋白的編碼序列可以依照本領域熟練技術人員所知的常規(guī)和標準技術來獲取。適當的啟動和終止密碼子,內含子、外顯子相關問題和其他基因結構優(yōu)化將容易用標準分子生物學方法來應用。
b.載體序列用于在微生物中表達本發(fā)明的轉運蛋白的表達載體包含至少一種與啟動子、終止序列和其他調控序列,這些是轉運蛋白因子表達或過表達必需的或理想的,該啟動子在宿主細胞中是有功能的。在本發(fā)明的一個實施方案中,啟動子是所選擇的轉運蛋白的野生型啟動子,而在本發(fā)明的另一個實施方案中,啟動子對轉運蛋白而言是異源的,但在宿主中仍然是有功能的。
與編碼目的蛋白質或多肽的異源核酸相關聯(lián)的額外的啟動子可通過重組DNA技術而被引入。在本發(fā)明的一個實施方案中,宿主細胞能夠過表達異源的蛋白質或多肽,并重組地引入編碼一種或多種轉運蛋白的核酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中,編碼所述至少一種或多種增加底物轉運的蛋白質的核酸可穩(wěn)定地整合入微生物基因組。在另一個實施方案中,宿主細胞被加工成表達編碼一種或多種增加所說的底物轉運入該宿主細胞的本發(fā)明蛋白質的DNA,且編碼異源蛋白質或多肽的核酸是通過重組技術引入的。本發(fā)明包含能夠使本領域技術人員所公知的其它轉運蛋白超表達的宿主細胞,包括但不局限于那些在表1、2或3或本領域技術人員所公知的或將來鑒定的轉運蛋白。
在一個優(yōu)選實施方案中,表達載體包含多克隆位點盒,該盒優(yōu)選地包含至少一個對載體是唯一的限制性內切酶位點,以使得對核酸的操作容易。在一個優(yōu)選實施方案中,表達載體也包含一個或多個選擇性標記。如在此處所用的,術語選擇性標記指能夠在革蘭氏陽性宿主中表達、從而便于對那些含有載體的宿主進行選擇的基因。這樣的選擇性標記的實施例包括但不局限于抗生素如紅霉素、壯觀霉素(aspectinomycin)、氯霉素和四環(huán)素。也提供了其中的轉運蛋白由與SEQ ID NOS[____]所示的DNA序列有至少90%的同源性的核酸編碼的實施方案。優(yōu)選地,同源性為至少95%,更優(yōu)選地為至少98%。同源性可以通過將要求保護的氨基酸或DNA序列與另一序列比對起來并以總序列的百分比確定有多少氨基酸或核苷酸相匹配而確定。同源性也可用商業(yè)上可獲得的序列分析軟件程序之一來確定,例如序列分析軟件包6.0版(Sequence Analysis Software PackageVersion 6.0)中的TFastA Data Searching Program(GeneticComputer Group,University of Wisconsin BiotechnologyCenter,Madison,Wis.53705)。
可以利用如在此處所描述的雜交或利用簡并引物的PCR來篩選同源序列。Chen和Suttle(1995)Biotechniques 18(4)609-610,612。在本發(fā)明的幾個實施方案中,也提供了可在嚴格的條件下分別與FIGS.和SEQ ID NOS所示的DNA或其片段雜交的核酸。嚴格的雜交條件包括本領域的技術人員所公知的嚴格的雜交和洗滌條件。雜交和適當的嚴格條件描述于Sambrook等人1989《分子克隆》(Molecular Cloning)2d ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York。
在具有編碼轉運蛋白質的轉化DNA的宿主細胞中增加重組肽生產的方法增加底物從一個細胞位置到另一個細胞位置的轉運的特別有力的方法涉及從轉化的宿主細胞基因組中缺失代謝轉移(metabolicdiversions)及伴隨提供可增加想要的底物的轉運的DNA。這可通過向細胞提供缺失-轉運蛋白嵌合體或融合蛋白質而方便地實現(xiàn),其中缺失部分的代謝轉移被最小化,而轉運蛋白能力部分是超表達的?;瘜W地融合的多肽或基因組的改組部分是可能發(fā)生的,但是重組蛋白質自然地是如此方式使用時最優(yōu)選的。用于這樣的嵌合體的適當通透酶片段的鑒定已在上面此處描述。
至于這些融合蛋白質的轉運部分,任何含有足夠的一級序列信息以賦予嵌合體以轉運活性的通透酶衍生序列在這種情況中都是有用的。然而,經常優(yōu)選地使用整個轉運蛋白酶,因為這在方法學方面是更直接的。此外,可參看在各種發(fā)表的參考書目中提供的大量的信息以助于鑒定適當的轉運蛋白或其片段。
轉化本發(fā)明也涵蓋增大或增加細胞生產生物活性多肽的能力,這樣的多肽可增加底物從第一細胞位置跨膜轉運到第二細胞位置。在一些情況,這可通過使與底物向另一細胞位置轉運以進行進一步生物轉變有關的蛋白質超表達而實現(xiàn),例如次級轉運蛋白陰離子/陽離子同向轉運蛋白(Saier,1988),在一個實施方案中為陰離子/陽離子H+同向轉運蛋白。
與維持宿主細胞的生存力和生產能力尤其是轉運能力有關的轉運蛋白的表達是重要的。在所述途徑是需要NADPH或NADH的反應的情況下,宿主細胞持續(xù)的生存力是由想要的途徑進行成功的連續(xù)生產所必要的。在確定維持生物體的生存力同時可被超表達的多拷貝數或啟動子時應牢記某些需要考慮的事項和因子。通常,轉運蛋白的過度表達對細胞是有害的,這是因為在膜中摻入轉運蛋白的可用空間是有限的。因此,一種轉運蛋白的非常過度的超生產可減少與其他養(yǎng)分從培養(yǎng)基的轉運有關的其它轉運蛋白在膜中的摻入。加工細胞類型特異性轉錄因子的超表達可增加或穩(wěn)定工程改造的宿主細胞的轉運蛋白性能。
細菌宿主細胞中H+同向轉運蛋白的穩(wěn)定超表達適用于幾個目的。它可在維持微生物的生存力時增加轉基因的表達。同向轉運蛋白的超表達比ABC轉運蛋白的超表達更簡單,這是因為同向轉運蛋白不需要ABC轉運蛋白的多重成分的大量編碼。第三,通過使次級轉運蛋白而不是ATP或PTS偶聯(lián)轉運蛋白質超表達,可使宿主細胞的能量需求的轉移最小化。
在本發(fā)明的一個實施方案中,編碼本發(fā)明一種或多種轉運蛋白的核酸是通過能夠在宿主細胞中復制的表達載體而引入宿主細胞的。適于泛菌屬的復制型質粒描述于Sambrook等人1989《分子克隆》(Molecular Cloning)2d ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,在此特別地引入作為參考,這是基于泛菌屬能維持與大腸桿菌相同質粒的復制的事實的。
在另一個實施方案中,編碼一種或多種轉運蛋白的核酸被穩(wěn)定地整合到微生物基因組中。優(yōu)選的宿主細胞來自泛菌屬。另一個優(yōu)選的宿主細胞是產酸克雷伯氏桿菌。在文獻中已經描述了幾個將DNA整合到基因組中的策略(參見如Balbas等人,1996,Gene 17265-69;LeBorge等人,1998,Gene 223213-219)。
檸檬泛菌的轉化可采用對于大腸桿菌發(fā)展的規(guī)程由電穿孔方法來實現(xiàn)(Potter,H.,1988,Anal.Biochem.174361-373)。
III.轉化體的鑒定將DNA引入到宿主中后,轉化體是通過在載體中編碼的抗生素抗性或通常通過選擇在質粒中編碼的功能來選擇的。一旦轉化體已經與未轉化的細胞區(qū)分開來,則可用標準規(guī)程來證實具有完整結構的質粒的存在(Sambrook等人,1989)。
轉運蛋白多核苷酸序列的存在可通過合適的基于序列或同源性設計的探針、部分或片段進行DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴增來檢測。
IV.轉運測定測定宿主細胞中底物轉運水平、檢測轉運的底物的方法,易于用本領域普通技術人員容易地確定,而且包括使用蛋白質特異性的多克隆或單克隆抗體。實施例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)和熒光激活細胞分揀術(fluorescent activatedcell sorting,F(xiàn)ACS)。這些和其他測定方法在Hampton R等人(1990,Serological Methods,實驗室手冊,APS Press,St PaulMinn.)和Maddox DE等人(1983,J Exp Med 1581211)等的文獻中有描述。
為了詳細描述本發(fā)明,下面提供了測定2-KLG途徑中抗壞血酸中間物水平的方法。然而,已經公開的一般概念和技術,以及本領域熟練技術人員的知識,將有助于設計策略以測定生物合成途徑中的底物、中間物和終產物的水平。
舉例來說,對于測定KLG生產途徑中抗壞血酸中間物水平的方法,本領域中的技術人員將認識到HPLC方法學是一種測定化學化合物水平和評估相對產量和消耗的方法。
另外,許多種標記和綴合技術是本領域技術人員所公知的并可被用于各種核酸和氨基酸測定。生產經標記的雜交或PCR探針用于檢測特定的多核苷酸序列的方法包括寡標記(oligolabeling)、切口平移、末端標記或用標記的核苷酸進行的PCR擴增?;蛘?,可將核苷酸序列或其任何部分克隆入載體以生產mRNA探針。這樣的載體是本領域所公知的,在商業(yè)上可得到,且可以通過添加適當的RNA聚合酶如T7、T3或SP6和標記的核苷酸而在體外用于合成RNA探針。
許多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway N.J.)、Promega(Madison Wis.)和US Biochemical Corp(Cleveland Ohio)供應用于這些程序的商業(yè)試劑盒和規(guī)程。適當的報告分子或標記包括那些放射性核素、酶、熒光的、化學發(fā)光的或產色的試劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。講授這樣的標記的使用的專利包括美國專利號3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。同樣,重組免疫球蛋白可如美國專利號4,816,567所示而生產,在此處引入作為參考。同樣,重組免疫球蛋白可如美國專利號4,816,567所示而生產,在此引入作為參考。
實施例實施例1材料和方法a.質粒、細菌菌株和培養(yǎng)基質粒pBCL 1920、產酸克雷伯氏桿菌、檸檬泛菌1392A,Murphy III培養(yǎng)基含有果糖0.5%、磷酸鹽1.6%、MgSO4.7H2O 0.2%、Soytone 0.2%、檸檬酸鹽0.01%、(NH4)2SO41%、ppm范圍的痕量鹽如Fe、Co、Mn、Zn和維生素如煙酸、葉酸和B12;M9培養(yǎng)基含有0.9%的磷酸鹽、0.1%的NaCl、0.1%的NH4Cl、MgSO4 0.0005%、CaCl2 0.025%;發(fā)酵培養(yǎng)基含有磷酸鉀(Potassium Phosphate)1%、MgSO4 0.15%、谷氨酸鹽1.5%、果糖2.5%、硫酸銨0.1%和含有生物素、硫胺素、吡哆醇、核黃素、煙酸、葉酸和B12的維生素混和物,以及含有10-100ppm水平的鐵、Zn和Mn離子的痕量金屬混合物溶液;轉運測定培養(yǎng)基含有100mM磷酸鉀pH6.9;抗生素壯觀霉素50μg/ml和四環(huán)素20μg/ml,IPTG 100μM。
b.DNA技術c.細胞生長使以重組方法構建的菌株以及野生型檸檬泛菌和產酸克雷伯氏桿菌生長在含有DKG作為唯一碳源的M9培養(yǎng)基或以果糖作為唯一碳源或的MIII培養(yǎng)基中,或者具有混和碳源如0.1%到1%范圍內的果糖、葡糖酸和DKG的MIII培養(yǎng)基中。使細胞在20-37℃之間生長,但優(yōu)選地低于30℃。細胞優(yōu)選地生長在中性pH,但是可以在pH5-8范圍內。生長在來自種子瓶的發(fā)酵罐中的檸檬泛菌細胞使用以果糖或葡萄糖飼養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基。
d.DKG攝入生化測定將含有細胞的發(fā)酵肉湯樣品從各自的生長設備中取出并在冰水浴中驟冷。離心發(fā)酵肉湯并丟棄上清液。用0.95冰冷的鹽溶液洗滌細胞沉淀,隨后由DKG攝入測定緩沖液100mM冰冷的磷酸鉀pH6.9洗滌兩次。將細胞重懸于相同的測定緩沖液中至550nm的OD值為12,然后在室溫或優(yōu)選地在28℃溫育。DKG攝入測定是通過將細胞與富C-14放射性同位素標記2,-5 DKG混和而開始。DKG攝入的時間進程是用基于用冰冷的測定緩沖液真空/濾器驟冷來進行的。DKG攝入測量是由細胞中放射性同位素的摻入來完成的,將所獲得的數據對時間繪圖得到DKG攝入速率。
也進行了另一個用硅油對細胞DKG攝入和代謝研究的測定(Johnson,J.D.等人,J.Lab.Clin.Med.,1980,95429-439)。將100μl硅油加入到準備好進行測定的epitube中。將細胞和富14C(U)的2,5-DKG混和,然后在定期的時間間隔取出100μl的細胞/底物混和物并將其加入到含有硅油的epitube中,離心15秒,然后迅速在干冰/乙醇浴中冷凍。5分鐘后,將含有細胞沉淀的epitube的頂端直接切入閃爍小瓶中。正好在試管剩余部分的冷凍部分上面再次切割并置入另一個含有閃爍液的小瓶中。在過夜以促進細胞沉淀從epitube頂部松散開之后記數。頂部記數的損失和沉淀中記數的出現(xiàn)的差異歸因于細胞的代謝和釋放的CO2。在攝入測定結束時,當細胞被透化時,低分子的細胞內容物泄露出來并提供了關于積累的輸入底物和底物進一步代謝變?yōu)榧毎煞值拿\的信息。
e.DKG還原酶測定收集來自每個發(fā)酵罐的細胞沉淀并在-70℃冷凍約24小時。將在15和25小時時間點的沉淀在冰上解凍并用弗氏壓碎器在pH6.5的50mM PIPES緩沖液中壓碎。將抽提液在臺式離心機中以14K rpm旋轉2分鐘,隨后測量總蛋白質的濃度和還原酶的活性。所有樣品是通過蛋白質的Bradford和BCA測定法來測量的,并根據需要稀釋以進行精確的分級測定。該測定是相對于背景等級(backgroud rate)而測量的,其中的背景等級含有除2,5-DKG之外的所有成分(低于總等級的10%)。緩沖液含有50mM PIPES pH6.5、150μM NADPH和5mM 2,5-DKG。
也進行了利用硅油對細胞的DKG攝入和代謝分析的另一個測定(Johnson,J.D.等人,J.Lab.Clin.Med.,1980,95429-439)。將100μl硅油加入到準備好進行測定的epitube中。將細胞和富14C(U)的2,5-DKG混和,然后在定期的時間間隔(例如約每10秒鐘)取出100μl的細胞/底物混和物并將其加入到含有硅油的epitube中,離心15分鐘,然后迅速在干冰/乙醇浴中冷凍。5分鐘后,將含有細胞沉淀的epitube的頂端直接切入閃爍小瓶中。正好在試管剩余部分的冷凍部分上面再次切割并置入另一個含有閃爍液的小瓶中。在過夜以促進細胞沉淀從epi頂部松散開之后記數。頂部記數的損失和沉淀中記數的出現(xiàn)的差異歸因于細胞的代謝和釋放的CO2。在攝入測定結束時,當細胞被透化時,低分子的細胞內容物泄露出來并提供了關于積累的輸入底物和底物進一步代謝變?yōu)榧毎煞值拿\的信息。
實施例II實施例II提供了底物的轉運蛋白可能是全細胞生物轉變的限速因子的基礎本實施例解說了可被區(qū)室化為4個部分的從葡萄糖形成2KLG的關鍵步驟(圖5)。利用三種周質酶在檸檬泛菌中以14-15g/l/hr的速率對關鍵中間物2,5-DKG進行生產(Sonoyama等人,Appl.Environ.Microbiol.,1982,431064-1069)。第二部分是需要DKG在細胞的胞質空間內轉運的速率。第三個是用DKG還原酶將DKG轉化為2KLG的速率(美國專利號5,032,514)。當DKG還原酶超表達時,DKG向2KLG的轉變不是速率限制性的。在我們目前的2KLG生產發(fā)酵中,將誘導型質粒用于增加和減少相對于我們一般的發(fā)酵(目前使用pD92)而言的還原酶比活性,其中的DKG還原酶是在組成型啟動子trp控制下的。誘導型質粒pD23是在taq啟動子控制下的,可用IPTG誘導。運行了三個發(fā)酵罐,一個用pD92,兩個用pD23且其中的一個用IPTG誘導。對照的pD92和誘導的pD23生產了幾乎同樣水平的2-KLG,而未誘導的pD23的產量則低得多。還原酶比活性的測定顯示,相對于對照pD92而言,未誘導的質粒生成的還原酶水平不到一半,而誘導的pD23則生成了多于兩倍。這些結果顯示,在我們生產2KLG的檸檬泛菌發(fā)酵中,還原酶活性的水平不是2-KLG生產的瓶頸。
菌株 蛋白質濃度還原酶活性 比活性pD92(對照) 3.2mg/ml 25.0u/ml 7.8u/mgpD23(未誘導的) 3.7mg/ml 12.0u/ml3.2u/mgpD23(誘導的) 3.9mg/ml 73u/ml 19u/mg第四部分是在細胞內生成的并需要輸出的2KLG的轉運。2KLG在發(fā)酵中的生產速率(2.2g/l/hr-2.7g/l/hr)可認為與2KLG從細胞的輸出速率相等。這是這樣論證的,如果2KLG輸出的速率是限制性的,那么細胞將在細胞內積累2KLG,這樣細胞將不能以其代謝潛力發(fā)揮功能并最終死亡。然而,檸檬泛菌生產2KLG的細胞沒有展示這些情形的任何一個,并且細胞內2KLG的測量值保持在低于生產的2KLG最大濃度的十到二十分之一。因而可想象2KLG的輸出也不是2KLG生產中的限速步驟。
實施例III實施例III提供了證實底物轉運進入細胞以進行生物轉變確實是限速步驟的證據將來自發(fā)酵過程的三個不同時間即種子燒瓶(seed-flask)階段、果糖飼養(yǎng)階段和葡萄糖飼養(yǎng)階段的細胞沉淀收集并如在實驗中描述進行加工。利用這些細胞類型的DKG攝入測定,確定出DKG攝入速率(引入DKG以轉變?yōu)镵LG)為0.5g/l/hr、2.7g/l/hr和2.75g/l/hr(圖2)。DKG輸入的速率與KLG輸出的速率相等。因而這個結果證明,DKG到KLG的生物轉變的速率依賴于2,5-DKG進入細胞的輸入速率。因而本發(fā)明將證明,通過以超表達來增加DKG攝入轉運蛋白,將增強2,5-DKG的輸入速率,并因而將增強2KLG的生產速率。本領域的專家可想象利用全細胞轉變方法的各種生物轉化中的關鍵限制因子實際上是底物進入細胞以進行生物轉化的輸入和輸入速率。
實施例IV實施例IV說明利用DKG攝入測定發(fā)現(xiàn)產酸克雷伯氏桿菌中2,5-DKG轉運蛋白的存在。WO 002170描述了來自產酸克雷伯氏桿菌的稱為yia操縱子的鑒定和序列測定,該操縱子含有8個推定的開放閱讀框。yia操縱子中各開放閱讀框編碼的這些多肽的功能沒有在WO 002170中描述。該操縱子的破壞去除了產酸克雷伯氏桿菌利用抗壞血酸作為唯一碳源的能力。已知抗壞血酸是一種對氧化不穩(wěn)定的物質,它可通過空氣氧化而分解為2,3-DKG(Kimaya,S.,Vitaminol.1961,719-26)。因而提出2,3-DKG才是生長的真正底物是合理的。Yia操縱子中稱為yiaX2的一個開放閱讀框編碼轉運蛋白型跨膜蛋白質,并因而被認為是2,3-DKG通透酶的候選物。根據尋求2,5-DKG通透酶的并行檢索,從而認識到2,3-DKG和2,5-DKG是類似分子,可能yiaX2可轉運2,5-DKG和其他糖類酮酸如2KLG。
為了確定yiaX2是否可轉運2,5-DKG和2-KLG,將該基因從產酸克雷伯氏桿菌菌株M5a1的染色體中缺失(參見如Streicher等人,Proc.Natl.Acad.Sci.681174-1177(1971))。稱為MGK002的yiaX2缺失突變體是用本領域公知的標準分子生物學規(guī)程來構建的(參見如Hamilton等人,J.Bacterial.1714617-4622(1989))。另一種稱為Tester菌株的產酸克雷伯氏桿菌菌株是通過將質粒編碼的、受lac操縱子調節(jié)的yiaX2基因添加回產酸克雷伯氏桿菌菌株MGK002而創(chuàng)建的。利用MGK002和Tester菌株在+/-IPTG誘導下的DKG攝入測定證實yiaX2編碼具有2,5-DKG轉運活性的多肽(圖9)。
實施例V實施例V提供了從微生物中篩選2,5-DKG通透酶的選擇方法學有了yiaX2基因編碼具有2,5-DKG轉運活性的轉運蛋白的信息,就可能設計出選擇宿主以找到檸檬泛菌和其他生物學來源的2,5-DKG轉運蛋白。構建有yiaX2基因缺失并添加了表達參與2,5-DKG到葡糖酸的分解代謝中的酶的基因的產酸克雷伯氏桿菌,其對于生物體的中央代謝而言是可評估的。能夠分解代謝2,5-DKG到葡糖酸的酶是由在一些革蘭氏陰性生物體中存在的tkr idnD idnO操縱子的tkr和idno基因編碼的(Bausch,C.等人,J.Bacteriol.,1998,1803704-3710)。
結果所得的產酸克雷伯氏桿菌tester菌株是yiaX2[tkr idno],其除了不能將DKG輸入到胞質外,含有所有以2,5-DKG作為唯一的碳源在其上生長所必需的成分。因此,編碼2,5-DKG通透酶的核酸分子在tester菌株中表達后,應可以賦予tester菌株在2,5-DKG上生長的能力。這種選擇方法學如圖9所示。
用于構建檸檬泛菌基因組文庫的克隆載體是質粒pCI1920(Lerner等人,Nucleic Acid Res.,1994,184621),即攜帶有壯觀霉素/鏈霉素抗性決定因子的低拷貝數表達載體。表達是由lacPO啟動子/操縱基因區(qū)域驅動的,當由宿主提供了laclq基因產物時該區(qū)域可被該產物抑制。利用標準規(guī)程從檸檬泛菌(ATCC39140)中分離了基因組DNA并構建了基因組文庫(Sambrook等人,《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningALaboratory manual),Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork(1992))。將擴增的文庫以質粒DNA的形式貯藏以備將來用于尋找檸檬泛菌的2,5-DKG通透酶。
實施例VI實施例VI提供了通過使DKG轉運蛋白在宿主細胞中超表達可以增強DKG向細胞的輸入速率的證據。
將基因組文庫引入tester菌株產酸克雷伯氏桿菌yiaX2[tkridno]菌株。用放射性標記的14C(U)DKG對在具有2.5%的2,5-DKg和0.1mM IPTG的M9-瓊脂平板顯示能夠在2,5-DKG上生長的克隆檢驗DKG的攝入。發(fā)現(xiàn)各種克隆都比對照的tester菌株有改善的DKG攝入(圖10)。將來自這些陽性克隆的基因組文庫DNA轉化入檸檬泛菌(139-2A),并且進行DKG攝入測定以測量超過檸檬泛菌139-2A菌株的DKG攝入改善。在轉化體中觀察到了3到5倍的DKG攝入速率改善,該轉化體通過基因組文庫篩選和選擇方法學而發(fā)現(xiàn)其含有編碼DKG通透酶的質粒的額外拷貝(圖11)。
實施例VII實施例VII提供了通過使DKG轉運蛋白在宿主細胞中超表達可以改善2KLG的生產的證據。
當用低拷貝的載體pBCL 1920將編碼檸檬泛菌DKG通透酶PermA的核酸分子(seq ID no2)亞克隆入適合從葡萄糖生物合成2KLG的檸檬泛菌菌株139-2A中時(美國專利號5,032514),2KLG生產的生產速率從2.5g/l/hr提高到3.2g/l/hr,基于糖類的產量從45%提高到53%(圖12)。
實施例VIII實施例VIII描述了來自檸檬泛菌的2,5-DKG通透酶PermA的特征。
本實施例描述了檸檬泛菌的PermA的膜拓撲結構。PFAM分析(Hirokawa,T.等人,Bioinformatics,1998,4(4)378)預測PermA含有11個跨膜結構域、8個初級結構域和3個次級跨越結構域(圖13)。氨基末端位于周質而羧基末端位于胞質內。有兩個大環(huán)和兩個小環(huán)存在,且周質和胞質中都含有一個大環(huán)和一個小環(huán)。PermA是疏水性為0.62的膜蛋白質,其分子量為48道爾頓?;诶鄯e比例分析,它是一種H+伴隨性2,5-DKG同向轉運蛋白(Lolkema,J.S.等人,1996,生物物理學手冊(Handbook of BiologicalPhysics),Chapter 11,229-260)?;诠灿行蛄蟹治?,它屬于MFS的ACS家族(Pao,S.S.等人,Microniol.Molecular Biol.Rev.,1998,62;1-34)(圖14)。
在本領域的技術人員閱讀過公開內容且不背離本發(fā)明的精神和范圍后,前面的描述和實施例的各種其他的實施例和修飾對他們而言都是顯然的,并且意圖將所有這樣的實施例或修飾都包括在附錄權利要求書的范圍內。此處參考的所有出版物和專利都特此整體引入。
權利要求
1.一種增強宿主細胞中衍生自其中至少部分細胞內途徑的期望化合物的生物合成生產的方法,該方法包含a)選擇含有利用胞外底物的至少部分細胞內途徑的宿主細胞;b)在維持宿主細胞的完整性時增加所說的細胞外底物向該宿主細胞的轉運;c)培養(yǎng)該宿主細胞以生產所說的細胞外底物;和d)生產期望的化合物。
2.權利要求1的方法,其中所說的增加該細胞外底物向該宿主細胞內的轉運包括將DNA轉化入該宿主細胞的步驟,其中所述DNA編碼一種或多種能增加將該底物轉運入所說的宿主細胞中的多肽。
3.權利要求2的方法,其中所說的一種或多種多肽是轉運促進蛋白。
4.權利要求2的方法,其中所說的一種或多種多肽是一個主要易化物超家族轉運蛋白。
5.權利要求4的方法,其中所說的一種或多種多肽是陰離子/陽離子H+同向轉運蛋白。
6.一種增強宿主細胞中衍生自其中至少部分細胞內途徑的期望化合物的生物合成生產的方法,該方法包含a)選擇含有利用胞外底物的至少部分細胞內合成途徑的宿主細胞;b)在維持宿主細胞的完整性時增加所說的細胞外底物向該宿主細胞的轉運,此處該底物進入該宿主細胞的轉運是該宿主細胞生物合成生產中的一個速率限制步驟;c)培養(yǎng)該宿主細胞以生產所說的細胞外底物;和d)生產期望的化合物。
10.增強底物跨內細胞膜進入細胞溶膠的轉運的方法,該方法包含選擇宿主細胞;和把編碼一或多種轉運該底物進入該宿主細胞的酶的DNA轉化進入該宿主細胞。
11.權利要求10的方法,其中所說的宿主細胞選自細菌和酵母。
12.權利要求11的方法,其中所說的宿主細胞是泛菌。
13.一種過量表達陰離子/陽離子同向轉運蛋白的方法,包含以下步驟選擇宿主細胞;和把編碼一或多種陰離子/陽離子同向轉運蛋白的DNA轉化進入該宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增強宿主細胞生產期望的化合物的方法,該宿主細胞中此化合物的合成至少有部分的細胞內途徑。這種方法包含選擇宿主細胞,其具有至少一個使用細胞外底物的細胞內合成途徑;增加該細胞外底物進入該宿主細胞的轉運,且保持宿主細胞的完整性,培養(yǎng)宿主細胞使用該細胞外底物生產;合成期望的化合物。底物的轉運增加通過給宿主細胞轉化編碼一或多種將底物轉運到細胞內的酶的基因來完成。
文檔編號C12N9/14GK1469927SQ01815728
公開日2004年1月21日 申請日期2001年8月3日 優(yōu)先權日2000年8月4日
發(fā)明者M·庫瑪, F·瓦勒, M 庫瑪 申請人:金克克國際有限公司