一種胃蛋白酶原Ⅰ酶促化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬免疫檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種胃蛋白酶原I酶促化學(xué)發(fā)光檢測 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 該測試用于診斷嚴(yán)重萎縮性胃體胃炎，W及提示早期胃癌風(fēng)險。血清或血漿PGI(P-PGI，S-PGI)檢測法是檢測嚴(yán)重萎縮性胃體胃炎的一種可靠方法，其敏感性和特異性 分別為92 %和90%。
[0003]胃蛋白酶原（Pesinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的無活性前體，由胃體的主細(xì)胞 和黏液細(xì)胞分泌。大部分分泌到胃腔，少量可在血液中被檢測到。PGI水平與胃體黏膜主細(xì) 胞的數(shù)量具有可靠相關(guān)性。血清PG水平反映了不同部位胃黏膜的形態(tài)和功能；PGI是檢 測胃泌酸腺細(xì)胞功能的指標(biāo)，胃酸分泌增多PGI升高，分泌減少或胃黏膜腺體萎縮PGI 降低；PGII與胃底黏膜病變的相關(guān)性較大（相對于胃竇黏膜），其升高與與胃底腺管萎縮， 胃上皮化生或假幽口腺化生、異型增值有關(guān)；PGI/II比值進(jìn)行性降低與胃黏膜萎縮進(jìn)展 相關(guān)。因此，聯(lián)合測定PGI和PGII比值可起到胃底腺黏膜"血清活檢巧r的作用。
[0004] 化學(xué)發(fā)光技術(shù)興起于上個世紀(jì)80年代是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)后發(fā)展起來 的新興技術(shù)，由于其高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快速，標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，無放射同 位素?fù)p傷和污染等特點(diǎn)，在近些年得到了飛速發(fā)展?；瘜W(xué)發(fā)光的原理是在化學(xué)反應(yīng)中生成 的不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到基態(tài)時，釋放光子。在免疫檢測分析中，使用化學(xué)發(fā)光 技術(shù)，可W使檢測范圍達(dá)到6個數(shù)量級，而且靈敏度很高，加上標(biāo)記物穩(wěn)定，有效期長，使其 受到越來越多的關(guān)注與應(yīng)用。磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)是一種W磁性微粒為固相分離 載體，將免疫磁微粒分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型免疫檢測方法。傳 統(tǒng)化ISA方法，抗原，抗體的結(jié)合反應(yīng)是在固相巧LISA板反應(yīng)孔）表面進(jìn)行的，而磁分離酶 聯(lián)免疫檢測方法，抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)也在近似液相的條件下進(jìn)行，因而反應(yīng)快速，徹底。 與傳統(tǒng)化ISA相比具有自動化程度高、靈敏度高、檢測用時少的優(yōu)點(diǎn)。但目前市場上檢測PG I試劑盒主要W傳統(tǒng)化ISA法為主。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于提供一種胃蛋白酶原I酶促化學(xué)發(fā)光檢測試劑 盒，使對人胃蛋白酶原I檢測實現(xiàn)了自動化、高特異性和靈敏度。
[0006] -種胃蛋白酶原I酶促化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括酶標(biāo)液、 胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)品、包被胃蛋白酶原I單克隆抗體的免疫磁珠、樣本稀釋液、化學(xué)發(fā)光底 物液、洗漆液。
[0007] 所述的一種胃蛋白酶原I酶促化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，將胃蛋白酶原 I單克隆抗體包被在磁珠微球表面，經(jīng)捕捉樣本中的胃蛋白酶原IW及加入酶標(biāo)胃蛋白酶 原I單克隆抗體試劑后，形成固相-抗體-抗原-酶標(biāo)抗體夾屯、免疫復(fù)合物。
[0008] 所述的一種胃蛋白酶原I酶促化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于，所述的包被胃 蛋白酶原I單克隆抗體的免疫磁珠為含有標(biāo)記有抗胃蛋白酶原I單克隆抗體的磁性微 球；
[0009] 所述的酶標(biāo)液中酶標(biāo)抗體的酶是辣根過氧化物酶；
[0010] 所述的洗漆液是含有吐溫-20的緩沖液；
[0011] 所述的化學(xué)發(fā)光底物溶液是酶促化學(xué)發(fā)光底物溶液。
[0012] 任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述包被胃蛋白酶原I單克隆抗體的免疫磁 珠按如下方法制得：
[0013] (1)初洗緩沖液的配制：
[0014] 稱取0. 1952g的MEShygrate于100ml的純水中，調(diào)整抑至5. 0;
[00巧]加入50y1吐溫-20,配成0.Olmol/LMES緩沖液，調(diào)整抑至5. 0;
[0016] (2)偶聯(lián)緩沖液的配制：
[0017] 稱取0. 38138g化284〇7? 10&0溶于40ml純水中，得到0. 05mol/L的棚砂溶液； [001引稱取0. 1237g郵03溶于10ml純水中，得到0. 2mol/L的棚酸溶液；
[001 引 取 18ml0. 05mol/L的NasBA溶液與 2ml0. 2mol/L的H3BO3溶液混合，定容至 80ml得0. 05mol/L棚酸緩沖液；
[0020] (3)終洗液的配制：
[0021] 稱取2. 78g化2冊〇4溶于100ml純水得0. 2mol/L化2冊〇4溶液；
[0022] 稱取 1. 2g化&?〇4溶于 50ml純水得 0. 2mol/LNaH2PO4溶液；
[0023]取 81ml0.2mol/LNa2HP〇4溶液與igml0.2mol/LN址2PO4溶液混合，得 0. 2mol/L PB緩沖溶液得0. 2mol/Lro緩沖溶液；
[0024]取 50ml0. 2mol/LPB緩沖液，2 倍稀釋到 100ml，加入 0. 9gNaCl, 0. 5g0. 5% -1% 的BSA，0. 02-0. 03%生物防腐劑、0. 05%吐溫20,充分溶解混勻；
[00幼 （4)封閉液的配制：
[002引取100mlTris緩沖液，將溶液的抑調(diào)節(jié)成8. 5-9. 0之間；
[0027]向其中加入2%BSA;
[002引 巧化DC溶液和N服溶液的配制；
[0029] 稱取25mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞胺，溶解于1ml的初洗緩沖 液中，配制成25mg/ml的邸C溶液；
[0030] 稱取25mg/ml的N-哲基班巧酷亞胺溶解于初洗緩沖液中，配置成25mg/mlN服溶 液；
[0031] (6)磁珠包被過程：
[0032]A、初洗；取100y1磁珠，將其稀釋成lOmg/ml的磁珠濃度，從中吸取100y1;磁分 離架上分離，去上清；用初洗液250y1洗漆=次，磁分離，去上清；
[003引 B、活化；取初洗完成的磁珠加入150y1MES，再加入50y1EDC及50y1的N服溶 液，充分混勻。室溫下25°C活化30min，活化完成磁分離去上清，W250y1偶聯(lián)緩沖液重懸 洗漆=次，分離去上清；
[0034]C、稀釋抗G-17單克隆抗體：
[00巧]將抗G-17單克隆抗體從-20°c冰箱中取出，待其融化后取出20y1，用偶聯(lián)緩沖液 1:20稀釋到400y1，稀釋后的抗體濃度為0. 0397mg/ml。
[003引 D、偶聯(lián)；
[0037] 加入400y1用偶聯(lián)緩沖液稀釋的抗G-17單克隆抗體重懸活化后的磁珠，充分混 勻，其磁珠包被比率為Img磁珠；0. 0159mg抗體；
[0038] 37°C偶聯(lián)化，37°C搖床搖晃恒溫混勻；
[0039] E、封閉；
[0040] 將偶聯(lián)結(jié)束的磁珠于磁分離架上分離，去上清；
[0041] 加入400y1封閉液，37°C搖床封閉比；
[0042] 封閉結(jié)束后去除上清；
[0043] F、終洗保存；
[0044] W400y1終洗液洗漆封閉完成的磁珠，重復(fù)立次，最終定容到500y1。
[0045] 本發(fā)明的工作原理為雙抗體夾屯、法化學(xué)發(fā)光與免疫磁珠技術(shù)相結(jié)合的一種檢測 方法。在標(biāo)本中加入定量的包被胃蛋白酶原I單克隆抗體的免疫磁珠和HRP標(biāo)記抗PGI 單克隆抗體。37°C解育后，包被胃蛋白酶原I單克隆抗體的免疫磁珠與HRP標(biāo)記抗PGI單 克隆抗體分別與標(biāo)本中PGI分子的不同表位結(jié)合，形成磁珠-抗體-抗原-抗體復(fù)合物。 在外加磁場中直接沉淀，即可分離。棄去上清液，清洗沉淀的復(fù)合物，然后加入酶促化學(xué)發(fā) 光底物。底物在酶的作用下催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基 態(tài)時便發(fā)出了光子，形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用發(fā)光儀檢測反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即 可算出樣品中的PGI含量。在檢測范圍中，發(fā)光強(qiáng)度與樣本中的PGI濃度成正比。
[0046] 本發(fā)明的特征在于；檢測血清中胃蛋白酶原I的方法使用了W下的試劑：
[0047] 本發(fā)明使用酶標(biāo)液為HRP標(biāo)記抗PGI單克隆抗體
[0048] 本發(fā)明的胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)品是含有一定量的PGI抗原的BSA蛋白溶液。
[0049] 本發(fā)明所含的樣本稀釋液是含有1 %BSA的PBS溶液。
[0050] 本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光底物液為酶促化學(xué)發(fā)光底物溶液。
[0051] 本發(fā)明的洗漆液是含有吐溫-20和ProCline-300的緩沖液。
[0052] 本發(fā)明所述的胃蛋白酶原I酶促化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒操作方法如下：
[0053] -、磁珠包被緩沖液配制：
[0054] 1.初洗緩沖液的配制：
[0(巧5] 1. 1稱取0. 1952g的MEShygrate于100ml的純水中，調(diào)整抑至5. 0。
[0056] 1. 2加入50y1吐溫-20,配成0.Olmol/LMES緩沖液，調(diào)整抑至5. 0。
[0057] 2.偶聯(lián)緩沖液的配制：
[0058] 2. 1稱取0. 38138g化284〇7? 10&0溶于40ml純水中，得到0. 05mol/L的棚砂溶液。
[0059] 2. 2稱取0. 1237g郵〇3溶于10ml純水中，得到0. 2mol/L的棚酸溶液。
[0060] 2. 3取ISml0.OSmol/L的NasBA溶液與加！ 0.2mol/L的H3BO3溶液混合，定容至 80ml得0. 05mol/L棚酸緩沖液。
[006。 3.終洗液的配制；
[0062] 3. 1稱取2. 78g化2冊〇4溶于100ml純水得0. 2mol/L化2冊〇4溶液。
[0063] 3. 2 稱取 1. 2g化&?〇4溶于 50ml純水得 0. 2mol/LNaH2PO4溶液。
[0064] 3. 3 取 81ml0.2mol/LNa2H