專利名稱：一種穩(wěn)定的新型即用型底物－dab顯色液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫組織化學領域，主要產品為穩(wěn)定的即用型底物-DAB顯色液。此底物-DAB溶液包含緩沖液(首推咪唑緩沖液)，過氧化氫底物，顯色的有機電子供體以及作為穩(wěn)定劑的碳水化合物電子供體。底物-DAB溶液具有完全的過氧化物活性。
背景技術：
過氧化物活性的檢測已被廣泛應用于分析化學、生物化學和臨床化學中。在多數檢測中，過氧化物和顯色的電子供體與樣品中分析物反應，此分析物可能是催化劑(如法醫(yī)樣品或糞便、尿液、血漿、血清中的亞鐵血紅素、血色素等)或與催化劑相關的物質(酶標過氧化物酶)。如果樣品中含有此分析物，則會發(fā)生過氧化反應，并在幾秒到幾小時內發(fā)生可見的顯色反應。過氧化活性檢測也適用于固定在濾膜、細胞或組織切片、電泳凝膠、雜交斑點上分析物的定位分析。
免疫學或核酸檢測系統(tǒng)中常用的酶標記為辣根過氧化物酶(HRP)，在過氧化氫(H2O2)存在情況下，HRP催化苯酚、萘酚、胺、二胺或其它可以產生在光學和電子顯微鏡及比色法或肉眼下可見顯色底物的化合物。HRP可以將2個過氧化氫分子分解成氧氣和水，在這一反應中，首先HRP將一對電子供給過氧化氫分子，接著HRP從合適的有機供體中得到電子，反應完成時HRP-有機供體復合體可以在反應部位形成可溶性的或不可溶沉淀。

發(fā)明內容
(一)發(fā)明目的目前常規(guī)分析方法的不足之處是自動化的氧化反應，即檢測到的過氧化物活性可能是過氧化物與有機電子供體在加入催化酶之前就直接反應造成的“背景”，使指示劑的有效時間限制在幾小時內；這種氧化反應還可能是染色液和痕量氧化劑如過渡態(tài)金屬造成的污染。因此本發(fā)明的目的就是提供穩(wěn)定的底物—顯色液復合物，以適于可見、熱計量、分光光度、反射計分析；并且還提供了這些穩(wěn)定底物—顯色液復合物的使用方法。
(二)發(fā)明優(yōu)勢常規(guī)方法的顯色液與底物分開存放，測試時要將底物—顯色液預先混合。與之相比，本發(fā)明為穩(wěn)定的底物—顯色液復合物，既節(jié)省儲存空間，又縮短檢測時間，同時提高檢測的靈敏度及可靠性；而且DAB為誘癌物質，本發(fā)明的產品避免了操作人員與DAB的直接接觸，降低了危害性。

發(fā)明內容詳述本發(fā)明包括緩沖體系(pH3-8)、顯色電子供體以及作為穩(wěn)定劑的碳水化合物形式電子供體以及一個聚合物。
碳水化合物電子供體可以從下列物質中挑選單糖、二糖、多糖，它們可以抑制顯色電子供體的自動氧化活性。
底物緩沖液的pH在3-8之間，采用咪唑或者含咪唑的其它緩沖液混合物；盡管不同的過氧化物分析可在較寬的pH范圍內進行，但大部分HRP分析的最佳pH值在4-6之間。在聚合物存在時，咪唑-HCl由于對顯色電子供體的溶解能力強以及在pH5.0-7.8之間的強緩沖能力而成為理想的緩沖液；而且咪唑能提高DAB的氧化能力，它的終濃度在1-500mM尤其是50mM時效果最佳。
聚合物是一類由重復的簡單分子形成的高分子量分子，大多聚合物分子在加成聚合化反應中形成碳碳間烯鍵。在底物溶液中加入聚合物可以提高顯色電子供體的溶解性并降低其自發(fā)氧化反應。首推聚合物是聚乙烯乙二醇PEG或丙烯乙二醇PG，終濃度在1-1000mM.之間。
由于強溶解力及無毒性，本發(fā)明建議采用過氧化氫和脲過氧化氫作為過氧化物，終濃度在0.1-10mM之間，它們的靈敏度高于烷基過氧化氫。
具體實施例方式
(一)底物-DAB復合物配方工作濃度50mM咪唑，pH6.0，含有7.5mM PEG(分子量3350)，2.94mM H2O2和2.77mMDAB-4HCl以及10mM木糖。
一般配制儲備液(20×，100mL的pH7.5、0.5M Tris-HCl溶液)6.8g咪唑，終濃度1M2.51g PEG(分子量3350)，終濃度7.5mM2g DAB-4HCl，終濃度55.4mM150mg木糖，終濃度10mMH2O2(20×)儲備液0.45％H2O2溶液(二)免疫組化檢測免疫組化檢測時，完成樣品的HRP試劑孵育并沖洗樣品后，即可用本發(fā)明產品進行顯色1.H2O2與底物—DAB復合物等比例混勻。該溶液避光保存，30分鐘內有效。
2.第一步制備的溶液覆蓋樣品，孵育4-10分鐘，顯微鏡下觀察染色結果，為棕黃色。
(三)結果免疫組化分析結果顯示，基于底物—DAB復合物的顯色法比傳統(tǒng)的DAB顯色法簡捷、快速、具有更高的檢測靈敏度及可靠性。
權利要求
1.本發(fā)明涉及到免疫組化分析的顯色反應，可以用于免疫組織化學分析以及Western雜交分析。此底物-DAB溶液包含緩沖液(首推咪唑緩沖液，pH3-8)，過氧化氫底物，顯色的有機電子供體，作為穩(wěn)定劑的碳水化合物電子供體以及一個聚合物。其特色為碳水化合物電子供體及聚合物的加入，降低了顯色電子供體的自動氧化活性，提高顯色電子供體的溶解性。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫組織化學領域，鑒于目前顯色溶液不穩(wěn)定且易污染、對人體有傷害，本發(fā)明采用新型底物－DAB顯色液。此顯色液包含緩沖液(首推咪唑緩沖液)，過氧化氫底物，顯色的有機電子供體，作為穩(wěn)定劑的碳水化合物電子供體以及一個聚合物。其中聚合物用于提高顯色電子供體的溶解性并降低其自發(fā)氧化反應。本發(fā)明可以用于免疫組化分析或核酸雜交分析。基于底物－DAB復合物的顯色法與傳統(tǒng)的DAB顯色法相比，具有穩(wěn)定簡捷、高靈敏度及可靠性。
文檔編號G01N33/535GK1595150SQ0315089
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月10日 優(yōu)先權日2003年9月10日
發(fā)明者肖國偉 申請人:上海長島生物技術有限公司