專利名稱：：制造脂肪酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過水解油脂來制造脂肪酸的方法。技術(shù)背景脂肪酸的制造通過水解油脂來進(jìn)行。作為水解油脂的方法，使用高壓高溫水解(JP-A-2003-113395)或酶水解(JP-A-2000-160188)。前一方法在高溫高壓條件下在水存在下進(jìn)行并具有高生產(chǎn)率的優(yōu)點(diǎn)。但是，當(dāng)在該方法中使用含大量不飽和脂肪酸的原料時(shí)，在一些情況下根據(jù)條件產(chǎn)生大量反式不飽和脂肪酸。另一方面，后一方法在具有0至7(TC的低溫的反應(yīng)條件下在作為催化劑的例如脂肪酶這樣的酶存在下進(jìn)行，因此，該方法與高壓高溫水解法相比，盡管不產(chǎn)生反式不飽和脂肪酸，但具有低生產(chǎn)率。此外，高壓高溫水解在分解開始前的反應(yīng)初始階段具有誘導(dǎo)期。為了避免或縮短這種誘導(dǎo)時(shí)間，一種技術(shù)是首先使用1，3-位特異性脂肪酶通過酶水解將甘油酯部分水解以制備部分水解的甘油酯，然后進(jìn)行高壓高溫水解(JP-A-8-507917)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及通過水解油脂來制造脂肪酸的方法，其包括通過下列方法(a)或(b)中的任一種來部分水解油脂的第一步驟，和通過另一方法進(jìn)行水解的第二步驟(a)使用固定化酶的酶水解法，該固定化酶是固定在載體上的酶，(b)高壓高溫水解法。具體實(shí)施方式最近，越來越關(guān)注食用油對健康的影響?？茖W(xué)研究已證實(shí)，反式不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸和膽固醇一起提高LDL(低密度脂蛋白)膽固醇水平并提高冠心病的危險(xiǎn)。因此，希望降低食用油中的反式不飽和脂肪酸含量。省略了除臭步驟的未精制的原料油脂在構(gòu)成脂肪酸中含有1.5重量％或更少的反式不飽和脂肪酸。當(dāng)原料油脂通過酶水解法被水解時(shí)，構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量不增加。但是，在這種情況下，由于原料的顏色保持不變，所得脂肪酸具有差的外觀。另一方面，僅通過高壓高溫水解法水解未精制的原料油脂而得的脂肪酸具有良好外觀，因?yàn)橹煞直环纸?，但?gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量高。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，JP-A-8-507917中所述的方法可以縮短油脂通過高壓高溫水解法水解的反應(yīng)時(shí)間并由此可以有效制造脂肪酸，因此，可以制造在構(gòu)成脂肪酸中具有降低的反式不飽和脂肪酸含量的脂肪酸。但是，已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)在通過酶水解法部分水解后通過高壓高溫水解法進(jìn)行水解時(shí)，不一定產(chǎn)生具有良好色調(diào)的脂肪酸。并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，原因在于所用酶的形式。于是，本發(fā)明提供通過油脂的水解制造脂肪酸的方法，其能夠有效制造在構(gòu)成脂肪酸中的反式不飽和脂肪酸含量低并具有色調(diào)降低的良好外觀的脂肪酸。在這種情形下，本發(fā)明人對在油脂的水解反應(yīng)中酶水解和高壓高溫水解的組合進(jìn)行了研究并發(fā)現(xiàn)，當(dāng)(a)首先通過使用固定化酶(該固定化酶是固定在載體上的酶)的酶水解法部分水解油脂(第一步驟)，然后(b)通過高壓高溫水解法水解(第二步驟)時(shí)，可以有效生產(chǎn)在構(gòu)成脂肪酸中具有降低的反式不飽和脂肪酸含量并具有良好外觀的脂肪酸。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)(b)首先通過高壓高溫水解法部分水解油脂(第一步驟)，然后(a)通過使用固定化酶(該固定化酶是固定在載體上的酶)的酶水解法水解(第二步驟)時(shí)，同樣可以有效生產(chǎn)在構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸和單酰甘油含量低并具有良好外觀的脂肪酸。還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以相反順序進(jìn)行該方法時(shí)，構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量降低但單酰甘油含量沒有降低。根據(jù)本發(fā)明，可以通過油脂的水解有效生產(chǎn)在構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸含量低并具有良好外觀的脂肪酸。在本發(fā)明中，"(a)使用固定化酶的酶水解法，該固定化酶是固定在載體上的酶"(下文簡稱為"酶水解")是指，一種制備脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入水并使用例如脂肪酶這樣的固定化酶(該固定化酶是固定在載體上的酶)作為催化劑在低溫條件下使該混合物反應(yīng)。在本發(fā)明中，"(b)高壓高溫水解法"是指，一種制備脂肪酸和甘油的方法，包括在原料油脂中加入水并使該混合物在高溫高壓條件下反應(yīng)。在本發(fā)明中，"脂肪酸"不僅包括脂肪酸還包括存在甘油、單酰甘油、二酰甘油和/或三酰甘油的脂肪酸。在本發(fā)明中，要水解的原料油脂可以是植物油脂和動(dòng)物油脂。原料的具體實(shí)例包括菜籽油、葵花油、玉米油、大豆油、亞麻籽油、米糠油、紅花油、棉籽油、牛脂和魚油。除此之外，通過將上述油脂分餾或混合而獲得的油脂和通過氫化或酯交換調(diào)節(jié)了脂肪酸的組成的油脂可用作原料。但是，優(yōu)選未經(jīng)氫化的油脂，因?yàn)榭山档驮嫌椭械臉?gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，優(yōu)選在從植物或動(dòng)物中獲得各自作為原料的油脂后，通過過濾、離心或類似方法去除油以外的固體物質(zhì)。然后，在原料油脂中進(jìn)一步加入水，或根據(jù)情況加入酸，并混合，優(yōu)選通過離心或類似方法分離膠狀組分以進(jìn)行脫膠。此外，在加入堿并混合后，優(yōu)選通過水洗和脫水將原料油脂脫酸。此外，優(yōu)選通過使原料油脂與例如活性粘土這樣的吸附劑接觸并通過過濾或類似方法分離吸附劑來脫色。優(yōu)選這些處理以上述順序進(jìn)行，但該順序可以改變。除了這些外，為了去除蠟，可以對原料油脂施以冷凍(wintering),這是在低溫下分離固體物質(zhì)的步驟。原料油脂也可以根據(jù)需要通過在減壓下與蒸汽接觸來除臭。此時(shí)，優(yōu)選保持盡可能低的熱歷程以降低油脂的構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量。對于除臭步驟的條件，優(yōu)選將溫度控制至300'C或更低，更優(yōu)選27(TC或更低，時(shí)間優(yōu)選為10hr或更短，更優(yōu)選5hr或更短。在本發(fā)明中，使用構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸含量優(yōu)選為1.5重量％或更低、更優(yōu)選為1重量％或更低、進(jìn)一步優(yōu)選為0.5重量％或更低的原料油脂以降低水解后脂肪酸的構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量。例如，優(yōu)選使用未除臭油脂作為原料油脂的一部分或全部，因?yàn)榭梢詼p少構(gòu)成脂肪酸中的反式不飽和脂肪酸。在此，當(dāng)使用兩種或更多油脂時(shí)，構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量是指這兩種或更多油脂中反式不飽和脂肪酸的總量。在高壓高溫水解中，原料油脂的構(gòu)成脂肪酸的不飽和度越高，越容易通過加熱形成反式不飽和脂肪酸。具體而言，盡管在不飽和度為1的油酸的情況下，加熱幾乎不會(huì)形成反式不飽和脂肪酸，但在例如亞油酸和亞麻酸這樣的不飽和度為2或更高的脂肪酸的情況下，反式不飽和脂肪酸的形成明顯?？紤]到生理效應(yīng)，本發(fā)明的方法中所用的原料油脂的構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量優(yōu)選為1.5重量％或更低，更優(yōu)選0.01至1重量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0.1至1重量％。原料油脂具有優(yōu)選20或更大、更優(yōu)選35或更大的色調(diào)C，因?yàn)轱@著表現(xiàn)出本發(fā)明的改善外觀的效果。在本發(fā)明中，"構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量"和"脂肪酸的組成"是指通過美國油化學(xué)家學(xué)會(huì)官方方法(AmericanOilChemists'SocietyOfficialMethod)Celf-96(GLC法)測量樣品而得的值，樣品是根據(jù)日本油化學(xué)家學(xué)會(huì)(JapanOilChemists'Society)編輯的"標(biāo)準(zhǔn)油脂分析試驗(yàn)法(StandardMethodsfortheAnalysisofFats,OilsandRelatedMaterials)"中的"脂肪酸甲酯的制備(PreparationofFattyAcidMethylEsters)(2.4丄2-1996)"制備的脂肪酸甲酯。原料油脂或脂肪酸的"色調(diào)C"按照美國油化學(xué)家學(xué)會(huì)官方方法Ca13e-92(洛維邦德法(Lovibondmethod)用5.25英寸試驗(yàn)池測量，并通過下式(1)色調(diào)C二10R+Y(1)(在該式中，R二紅色值，Y二黃色值)在本發(fā)明中，在油脂的酶水解中，需要使用固定化酶，其是固定在載體上的酶。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，脂肪酶優(yōu)選作為酶水解中所用的分解油脂的酶。不僅可以使用源自動(dòng)物或植物的脂肪酶，還可以使用源自微生物的市售脂肪酶。分解油脂的酶的實(shí)例包括源自例如根霉菌屬、曲霉菌屬、色桿菌屬、毛霉菌屬、假單胞菌屬、地絲菌屬、青霉菌屬和假絲酵母菌屬這樣的微生物的脂肪酶和諸如胰脂肪酶的動(dòng)物脂肪酶。為了實(shí)現(xiàn)高水解速率，沒有位置特異性(無規(guī)型)的脂肪酶是優(yōu)選的，且源自假單胞菌屬和假絲酵母菌屬之類微生物的脂肪酶是優(yōu)選的。固定化載體的實(shí)例包括無機(jī)載體，例如C鹽、硅藻土、高嶺石、硅膠、分子篩、多孔玻璃、活性炭、碳酸鈣和陶瓷、陶瓷粉末；和有機(jī)聚合物，例如聚乙烯醇、聚丙烯、殼聚糖、離子交換樹脂、疏水吸附劑樹脂、螯合樹脂和合成吸附劑樹脂。考慮到保水能力，離子交換樹脂是優(yōu)選的。在離子交換樹脂中，多孔離子交換樹脂是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈冇捎诰哂写蟊砻娣e而可以吸附大量脂肪酶。用作固定化載體的樹脂具有優(yōu)選100至1000微米、更優(yōu)選250至750微米的粒徑。優(yōu)選地，樹脂具有IO至150納米的孔徑。這類樹脂材料的實(shí)例包括酚醛樹脂、聚苯乙烯樹脂、丙烯酰胺樹脂和二乙烯基苯樹脂，其中酚醛樹脂(例如可獲自羅門哈斯(RohmandHass)的DuoliteA-568)是優(yōu)選的。當(dāng)將酶固定化時(shí)，酶可以直接吸附到載體上，但為了創(chuàng)造產(chǎn)生高活性的吸附條件，載體可以在吸附酶之前用脂溶性脂肪酸或其衍生物處理后再使用。所用的脂溶性脂肪酸的實(shí)例包括具有8至18個(gè)碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪酸，其羥基可以被取代。其具體實(shí)例包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、油酸、亞油酸、a-亞麻酸、蓖麻油酸和異硬脂酸。其衍生物的實(shí)例包括這些脂肪酸與一元醇或多元醇的酯、磷脂和通過在這些酯上加成氧乙烯而獲得的衍生物。其具體實(shí)例包括上述脂肪酸的甲酯和乙酯、單酸甘油酯、甘油二酯、其氧乙烯加成物、聚甘油酯、山梨糖醇酯及蔗糖酯。這些脂溶性脂肪酸或其衍生物可以兩種或多種結(jié)合使用。為了使這些脂溶性脂肪酸或其衍生物與載體接觸，這些脂溶性脂肪酸或其衍生物可以在水或有機(jī)溶劑中直接添加到載體上。但是，為了改進(jìn)分散性，脂溶性脂肪酸或其衍生物可以暫時(shí)分散或溶解在有機(jī)溶劑中然后添加到分散在水中的載體上。有機(jī)溶劑的實(shí)例包括氯仿、己垸和乙醇?；贗OO重量份載體，脂溶性脂肪酸或其衍生物以優(yōu)選1至500重量份、更優(yōu)選10至200重量份的量使用。接觸溫度優(yōu)選為0至10(TC，更優(yōu)選20至6(TC。接觸時(shí)間為大約5min至5hr。處理完成后的載體通過過濾收集，并可以將其干燥。干燥溫度為室溫至IO(TC。干燥可以在減壓下進(jìn)行。將酶固定在載體上的溫度可以根據(jù)酶的特性確定。優(yōu)選酶不會(huì)失活的溫度，具體而言優(yōu)選0至6(TC，更優(yōu)選5至4(TC。用于固定化的酶溶液的pH范圍可以是使得酶不會(huì)變性的pH范圍，并可以像溫度一樣根據(jù)酶的特性確定。優(yōu)選地，pH值為3至9。使用緩沖液保持pH值，這類緩沖液的實(shí)例包括乙酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液和三鹽酸(tris-HCL)緩沖液。優(yōu)選地，考慮到固定化效率，酶溶液具有不大于酶的飽和溶解度的充分的酶濃度。根據(jù)需要通過離心去除不溶部分而獲得的上清液或通過超濾或類似方法精制的溶液也可以用作酶溶液。盡管所用酶的重量隨酶的活性而變，基于100重量份載體，該重量優(yōu)選為5至1000重量份，更優(yōu)選10至500重量份。為了使條件適合酶固定化后的水解反應(yīng)，優(yōu)選通過過濾從酶溶液中收集固定化酶并去除不必要的水，然后在不干燥的情況下，使固定化酶與作為反應(yīng)基質(zhì)的例如大豆油這樣的油脂相接觸。接觸后，固定化酶中的水分含量隨所用載體的類型而變，并優(yōu)選基于100重量份固定化載體，為0.1至100重量份，更優(yōu)選1至50重量份，進(jìn)一步優(yōu)選5至50重量份。在此，將固定化酶裝入容器，例如柱中，可以用泵使油脂循環(huán)通過該柱，或可以將固定化酶分散在油脂中。接觸溫度優(yōu)選為2(TC至60。C，并可以根據(jù)酶的特性進(jìn)行選擇。接觸時(shí)間為大約l至48hr。考慮到工業(yè)生產(chǎn)率，優(yōu)選在接觸完成后過濾收集固定化酶。固定化酶的水解活性范圍優(yōu)選為20U/g或更大，更優(yōu)選100至10000U/g，進(jìn)一步優(yōu)選500至5000U/g。在此，1U酶是指，在40。C下邊攪拌30min邊混合油脂:水二100:25(重量比)的混合物進(jìn)行水解時(shí)，每min產(chǎn)生1微摩爾游離脂肪酸的酶的水解能力。在本發(fā)明中，在第一步驟中通過酶水解或高壓高溫水解進(jìn)行的油脂的部分水解和在第二步驟中通過高壓高溫水解或酶水解進(jìn)行的油脂的水解，可以分批、連續(xù)或半連續(xù)進(jìn)行?？梢允褂锰畛湓谒械墓潭ɑ富蚩梢允褂迷跀嚢璨壑械墓潭ɑ福珵榱朔乐构潭ɑ傅钠茐?，優(yōu)選使用填充在塔中的固定化酶。部分水解的脂肪酸和水可以并流或逆流加入反應(yīng)器。優(yōu)選地，供入水解反應(yīng)器的原料油脂酸和水預(yù)先脫氣或脫氧以防止脂肪酸的氧化。用于酶水解反應(yīng)的固定化酶的量可以相應(yīng)地根據(jù)酶的活性確定?；?00重量份要分解的原料油脂，固定化酶以優(yōu)選0.01至30重量份、更優(yōu)選O.l至20重量份、特別優(yōu)選1至IO重量份的量使用。此外，基于100重量份要分解的脂肪酸，以優(yōu)選10至200重量份、更優(yōu)選20至100重量份、進(jìn)一步優(yōu)選30至80重量份的量使用水。這種水可以是蒸餾水、離子交換水、脫氣水、自來水或井水。這類水可以含有其它水溶性組分，例如甘油。必要時(shí)，可以使用pH3至9的緩沖液以保持酶的穩(wěn)定性。調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度至優(yōu)選0至7(TC，更優(yōu)選20至50。C，此時(shí)有效呈現(xiàn)酶的活性且分解產(chǎn)生的游離脂肪酸不結(jié)晶。優(yōu)選地，反應(yīng)在惰性氣體存在下進(jìn)行以盡可能避免與空氣接觸。通過酶水解或高壓高溫水解進(jìn)行的油脂的水解反應(yīng)可以根據(jù)脂肪酸濃度來控制并在達(dá)到預(yù)定脂肪酸濃度時(shí)終止。在本發(fā)明中，"脂肪酸濃度"是指，根據(jù)"油脂產(chǎn)品的知識(shí)(OilandFatProducts)"(幸書房株式會(huì)社(SaiwaishoboLtd.))"通過測量脂肪酸的酸值和組成并通過下式(2)計(jì)算而獲得的值。通過美國油化學(xué)家學(xué)會(huì)官方方法Ca5a-40測量酸值。脂肪酸濃度(重量％)=xXy/56.1/10(2)(x二酸值[m沐OH/g]，y=由脂肪酸組成測定的平均分子量)用于高壓高溫水解的反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)例包括配有容積7至40立方米的水解反應(yīng)槽的逆流式Colgate-Emery法油脂分解塔(例如IHI制造)。對于小規(guī)模分解，可以使用市售實(shí)驗(yàn)室規(guī)模高壓釜系統(tǒng)(例如曰東高壓株式會(huì)社(NittoKouatsuCo.,Ltd.)制造)作為水解反應(yīng)槽。在本發(fā)明的方法中，描述了包括通過(a)酶水解法部分水解的第一步驟的方法?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)率、良好的外觀和防止生成反式不飽和脂肪酸，油脂通過酶水解法部分水解直至脂肪酸具有優(yōu)選20至90重量％、更優(yōu)選25至85重量％、進(jìn)一步優(yōu)選30至80重量％的濃度。在部分水解后，構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量優(yōu)選為0至1.5重量％，更優(yōu)選0至1重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0至0.7重量％。優(yōu)選地，用于高壓高溫水解的部分水解脂肪酸中總氮量小以使通過高壓高溫水解法水解的脂肪酸的色調(diào)更好。總氮量優(yōu)選為2ppm或更少，更優(yōu)選1.5ppm或更少，進(jìn)一步優(yōu)選0.1至1.5ppm。出于相同考慮，與要被酶水解的原料中的總氮量相比，已經(jīng)被酶水解的油的總氮量的升高優(yōu)選為50重量％或更少，更優(yōu)選20重量％或更少，進(jìn)一步優(yōu)選0至15重量％。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)油脂在第一步驟中通過酶水解法部分水解時(shí)，隨后必須通過高壓高溫水解法進(jìn)行水解(第二步驟)。在本發(fā)明中，高壓高溫水解在下列反應(yīng)條件下進(jìn)行。在第二步驟的高壓高溫水解中，優(yōu)選在100重量份部分水解脂肪酸中加入10至250重量份水，由此在200至270。C的溫度和2至8MPa的壓力條件下進(jìn)行水解0.1至6hr?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)率和脂肪酸的脫色以及防止生成反式不飽和脂肪酸，溫度優(yōu)選為210至265°C，更優(yōu)選215至26(TC。出于相同考慮，在IOO重量份部分水解脂肪酸中加入的水量更優(yōu)選為15至150重量份，進(jìn)一步優(yōu)選20至120重量份。出于相同考慮，壓力更優(yōu)選為2至7MPa，進(jìn)一步優(yōu)選2.5至6MPa。出于相同考慮，反應(yīng)時(shí)間更優(yōu)選為0.2至5hr，進(jìn)一步優(yōu)選0.3至4hr。用于第二步驟的油脂的高壓高溫水解的部分水解脂肪酸可以直接使用，但脂肪酸和水相也可以根據(jù)需要通過諸如靜置分離或離心的方法進(jìn)行分離。此外，可以根據(jù)需要通過離心或水洗去除分布在油相中的甘油以進(jìn)行精制。通過第二步驟的高壓高溫水解進(jìn)行的油脂的水解反應(yīng)可以根據(jù)上式(2)所示的脂肪酸濃度來控制并在達(dá)到預(yù)定脂肪酸濃度時(shí)終止。在水解反應(yīng)完成后，優(yōu)選通過諸如靜置分離或離心的方法分離脂肪酸和水相。可以根據(jù)需要通過離心、水洗或類似方法去除分布在油相中的甘油以進(jìn)行精制。在本發(fā)明的方法中，在油脂的水解反應(yīng)中，在100重量份原料油脂中各加入0.01至30重量份固定化酶和10至200重量份水以通過在0至7(TC的酶水解來進(jìn)行部分水解(第一步驟)，然后在如上所述的第二步驟中在100重量份部分水解脂肪酸中加入10至250重量份水以在200至27(TC的溫度和2至8MPa的壓力條件下進(jìn)行水解0.1至6hr。相應(yīng)地，可以以提高的工業(yè)生產(chǎn)率獲得具有良好外觀以及在構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸含量低的脂肪酸。在本發(fā)明的方法中，現(xiàn)在描述包括通過(b)高壓高溫水解法部分水解的第一步驟的方法。在第一步驟的高壓高溫水解中，優(yōu)選在100重量份油脂中加入10至250重量份水，由此在200至270。C的溫度和2至8MPa的壓力條件下進(jìn)行水解0.1至6hr?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)率和脂肪酸的脫色以及防止生成反式不飽和脂肪酸，溫度優(yōu)選為210至265"C，更優(yōu)選215至26(TC。出于相同考慮，在100重量份油脂中加入的水量更優(yōu)選為15至150重量份，進(jìn)一步優(yōu)選20至120重量份。出于相同考慮，壓力更優(yōu)選為2至7MPa，進(jìn)一步優(yōu)選2.5至6MPa。出于相同考慮，反應(yīng)時(shí)間更優(yōu)選為0.2至5hr，進(jìn)一步優(yōu)選0.3至4hr。油脂在高溫高壓條件下的水解反應(yīng)可以根據(jù)脂肪酸濃度來控制并在達(dá)到預(yù)定脂肪酸濃度時(shí)終止。在此，"脂肪酸濃度"通過上式(2)確定?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)率、良好外觀和防止生成反式不飽和脂肪酸和單甘油酯，油脂在第一步驟中通過高壓高溫水解法部分水解直至脂肪酸具有優(yōu)選0.5至卯重量％、更優(yōu)選1.5至85重量％、進(jìn)一步優(yōu)選20至70重量％的濃度。在部分水解后，部分水解脂肪酸具有優(yōu)選35或更小、更優(yōu)選1至30、進(jìn)一步優(yōu)選5至25的色調(diào)C，構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸的含量優(yōu)選為0至1.5重量％，更優(yōu)選0.1至1.2重量％，進(jìn)一步優(yōu)選0.2至0.7重量％。此外，單甘油酯的含量優(yōu)選為1至20重量%，更優(yōu)選1至15重量％，進(jìn)一步優(yōu)選3至10重量％。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)油脂在第一步驟中通過高壓高溫水解法部分水解時(shí)，隨后必須在第二步驟中通過酶水解法進(jìn)行水解。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，當(dāng)在第二步驟中通過酶水解法進(jìn)行油脂的水解時(shí)，為了有效利用酶活性，優(yōu)選使用固定化酶，其是固定在載體上的酶，盡管也可以使用酶粉末。優(yōu)選使用擔(dān)載在固定化載體上的脂肪酶作為固定化酶。在本發(fā)明中，在第二步驟中油脂通過酶水解法的水解在下列反應(yīng)條件下進(jìn)行。用于酶水解反應(yīng)的固定化酶的量可以相應(yīng)地根據(jù)酶活性確定?；?00重量份要分解的脂肪酸，以優(yōu)選0.01至30重量份、更優(yōu)選0.1至15重量份、進(jìn)一步優(yōu)選0.2至IO重量份的量使用固定化酶。此外，基于100重量份要分解的脂肪酸，以優(yōu)選10至200重量份、更優(yōu)選20至100重量份、進(jìn)一步優(yōu)選30至80重量份的量使用水。該水可以是蒸餾水、離子交換水、自來水或井水。這類水可以含有其它水溶性組分，例如甘油。必要時(shí)，可以使用pH3至9的緩沖液以保持酶的穩(wěn)定性。用于第二步驟的油脂的酶水解反應(yīng)的部分水解脂肪酸可以直接使用，但可以根據(jù)需要通過諸如靜置分離或離心的方法分離脂肪酸和水相。此外，可以通過離心、水洗或類似方法去除分布在油相中的甘油以進(jìn)行精制。第二步驟的通過酶水解進(jìn)行的油脂的水解反應(yīng)可以根據(jù)上式(2)所示的脂肪酸濃度來控制并在達(dá)到預(yù)定脂肪酸濃度時(shí)終止。在水解反應(yīng)完成后，優(yōu)選通過諸如靜置分離或離心的方法分離脂肪酸和水相。此外，可以通過離心、水洗或類似方法去除分布在油相中的甘油以進(jìn)行精制。在本發(fā)明的方法中，在油脂的水解反應(yīng)中，在100重量份油脂中加入10至250質(zhì)量份水以在200至270。C的溫度和2至8MPa的壓力條件下進(jìn)行部分水解0.1至6hr(第一步驟)，然后在100重量份部分水解脂肪酸中各加入0.01至30重量份固定化酶和10至200重量份水以如上所述在0至7(TC下進(jìn)行水解。由此，可以以提高的工業(yè)生產(chǎn)率獲得具有良好外觀以及具有降低的反式不飽和脂肪酸和單酰甘油含量的脂肪酸。實(shí)施例A.在第一步驟中使用方法(a)并在第二步驟中使用方法(b)的方法的研究[制造固定化酶的方法]將50gDuoliteA-568(可獲自Rohm&Hass)在500mL0.1N氫氧化鈉水溶液中攪拌lhr。隨后，用500mL蒸餾水洗滌lhr并用500mL500mM磷酸鹽緩沖液使pH值保持恒定(pH7)2hr。此后，每2hr用500mL50mM磷酸鹽緩沖液使pH值保持恒定(pH7)兩次。隨后，過濾收集載體并用250mL乙醇置換30min。過濾后，向其中加入250mL含50g蓖麻油酸的乙醇，并將蓖麻油酸吸附到載體上30min。此后，過濾收集載體并用250mL50mM磷酸鹽緩沖液(pH7)洗滌4次以去除乙醇，并過濾收集載體。然后，使載體與1000mL10。/。市售脂肪酶的10%溶液(可獲自AmanoEnzymeInc.的脂肪酶AY"Amano"30G)接觸，其作用于油脂4hr以將酶固定在載體上。然后進(jìn)行過濾以收集固定化酶并用250mL50mM乙酸鹽緩沖液(pH7)洗滌以去除未固定的酶或蛋白質(zhì)。這些步驟均在2(TC下進(jìn)行。由酶溶液在固定化后的殘留活性和酶溶液在固定化前的活性之間的差異確定固定化比率為95%。隨后，向其中加入200g除臭大豆油，將混合物在4(TC下攪拌2hr，并過濾分離除臭大豆油以提供固定化酶。由此獲得的固定化酶用作為實(shí)際用于反應(yīng)的基質(zhì)的未除臭大豆油洗滌3次并在使用之前過濾。[原料油脂]使用表1中所示的未除臭大豆油作為原料油脂。通過下述方法測量甘油酯組成。[測量甘油酯組成的方法]將10mg樣品和0.5mL三甲基甲硅烷化劑(可獲自KantoChemicalCo.,Inc.的"甲硅垸化劑TH")裝入樣品瓶中。將該瓶密封并在7(TC下加熱15min。向其中加入l.OmL蒸餾水和2.0mL己烷，在混合后，通過氣相色譜法(GLC)分析己烷層。裝置HewlettPackard制造的型號6890柱DB-1HT(可獲自J&WScientific)7米柱溫初始二8(TC，最終=340°。升溫速率10°C/min，在340。C下保持20min檢測器FID，溫度二350。C注射部分分流比=50:1，溫度二320。C樣品注射量lpL載氣氦氣，流速二1.0mL/min在lomL量瓶中稱入5g未除臭大豆油和部分水解脂肪酸并通過總痕量氮分析器測量用甲苯調(diào)節(jié)了的樣品的總氮量。使用各種濃度的吡啶/甲苯溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。裝置MitsubishiChemicalCorporation制造的型號TN-05總痕量氮分析器溫度入口80(TC/催化劑90(TC所用氣體和流速氧氣600mL/min氦氣/氧氣Sub100/100mL/min時(shí)間氦氣30秒/氧氣120秒樣品注射量和注射速率50|iL，1.0i:iL/秒[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>MAG:單酰甘油DAG:二酰甘油TAG:三酰甘油[使用固定化酶的酶水解]通過使用固定化酶的酶水解將表1中所示的未除臭大豆油水解。通過使反應(yīng)溶液循環(huán)通過裝有固定化酶的酶柱和基質(zhì)循環(huán)容器來進(jìn)行水解反應(yīng)。將20.0g干基的用未除臭大豆油洗過的固定化酶(水解活性2960U/g)裝入配有夾套的不銹鋼酶柱(內(nèi)徑22mm，高145mm)。通過使用丙酮和己烷去除附著到配有夾套的不銹鋼酶柱中填充的批料的固定化酶上的油并在減壓下脫水來測定干基的固定化酶的初始重量。將900g未除臭大豆油和540g蒸餾水裝在配有夾套的150mm內(nèi)徑的3L容積的基質(zhì)循環(huán)容器中，并將混合物在攪拌(半圓葉片O90mmXH25mm，600r/min)的同時(shí)混合并加熱至40°C。在此期間，用氮?dú)庵脫Q配有夾套的基質(zhì)循環(huán)容器中的氣相以形成氮?dú)夥铡Ｔ趯⒒|(zhì)加熱至4(TC后，將配有夾套的基質(zhì)循環(huán)容器中的基質(zhì)使用液體供給泵以55mL/min的流速從上部供給到配有夾套的不銹鋼酶柱中。反應(yīng)溶液從配有夾套的不銹鋼酶柱的底部回到配有夾套的基質(zhì)循環(huán)容器中以開始分批循環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)開始lhr后，將整個(gè)反應(yīng)溶液從配有夾套的基質(zhì)循環(huán)容器中提取到3L燒杯中。在4(TC下在氮?dú)夥障蚂o置120min以去除水相，從而提供樣品A。將部分樣品A取樣并離心(5000Xg，10min)以去除水相。然后在70。C下在400Pa真空下將所得部分水解脂肪酸完全脫水10min，然后分析。進(jìn)而，將用于制備樣品A的裝有固定化酶的配有夾套的不銹鋼酶柱用未除臭大豆油洗滌。然后，在與樣品A的情況相同的條件下啟動(dòng)分批循環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)開始3hr后，將整個(gè)反應(yīng)溶液從配有夾套的基質(zhì)循環(huán)容器中抽取到3L燒杯中，并在4(TC下在氮?dú)夥障蚂o置120min以去除水相，從而提供樣品B。在與樣品A的情況相同的處理后分析樣品B。作為所得部分水解脂肪酸的分析結(jié)果，總氮量與未除臭大豆油中相同并且在固定化酶中沒有發(fā)生酶的脫離。[使用脂肪酶粉末的酶水解]通過使用脂肪酶粉末(可獲自AmanoEnzymeInc.的脂肪酶AY"Amano"30G)的酶水解將表1中所示的未除臭大豆油水解。將1300g未除臭大豆油和750g蒸餾水裝在3000mL容積四頸燒瓶中。將混合物在攪拌(半圓葉片0卯mmXH25mm，300r/min)的同時(shí)混合并加熱至40°C。在此期間，用氮?dú)庵脫Q3000mL容積四頸燒瓶中的氣相以形成氮?dú)夥?。在密封狀態(tài)下在氮?dú)夥障略?(TC攪拌(半圓葉片O90mmXH25mm，300r/min)的同時(shí)，向其中加入整個(gè)混合物，其中將3.9g脂肪酶粉末(可獲自AmanoEnzymeInc.的脂肪酶AY"Amano"30G)溶解在30g蒸餾水中以在攪拌的同時(shí)啟動(dòng)分批反應(yīng)。反應(yīng)開始0.6hr后，將整個(gè)反應(yīng)溶液從3000mL容積四頸燒瓶中抽取到3L燒杯中。在40。C下在氮?dú)夥障蚂o置120min以去除水相，從而提供樣品C。在與樣品A的情況同樣進(jìn)行處理后分析樣品C。[使用粒狀脂肪酶的酶水解]通過使用粒狀脂肪酶(可獲自NovozymesA/S的Lipolase100T)的酶水解將表1中所示的未除臭大豆油水解。將1300g未除臭大豆油和750g蒸餾水裝在3000mL容積的四頸燒瓶中。將混合物在攪拌(半圓葉片090mmXH25mm，300r/min)的同時(shí)混合并加熱至45°C。在此期間，用氮?dú)庵脫Q3000mL容積的四頸燒瓶中的氣相以形成氮?dú)夥?。在密封狀態(tài)下在氮?dú)夥障略?5。C攪拌(半圓葉片090mmXH25mm，300r/min)的同時(shí)，向其中加入整個(gè)混合物，在該混合物中將2.0g粒狀脂肪酶(可獲自NovozymesA/S的Lipolase100T)溶解在30g蒸餾水中，以在攪拌的同時(shí)啟動(dòng)分批反應(yīng)。反應(yīng)開始43hr后，將整個(gè)反應(yīng)溶液從3000mL容積的四頸燒瓶中抽取到3L燒杯中。在4(TC下在氮?dú)夥障蚂o置120min以去除水相，從而提供樣品D。在與樣品A的情況同樣進(jìn)行處理后分析樣品D。[部分水解的脂肪酸和未除臭大豆油的高壓高溫水解]在NittoKouatsuCo.,Ltd.制造的分批型高壓釜系統(tǒng)(容積2.2L,設(shè)計(jì)壓力lOMPa，設(shè)計(jì)溫度30(TC，材料TB480H)中，使用表1中所示的樣品A至D(它們是部分水解的脂肪酸和未除臭大豆油)作為原料進(jìn)行高壓高溫水解。將700g各原料和350g蒸餾水裝在高壓釜系統(tǒng)中并將高壓釜系統(tǒng)密封。然后，使用氫氣在5.0MPa壓力下進(jìn)行氣密試驗(yàn)以驗(yàn)證高壓釜系統(tǒng)中沒有泄漏，并用氮?dú)庵脫Q空氣。隨后，在600r/min下攪拌的同時(shí)，將溫度升至24(TC，這是反應(yīng)溫度。升溫至24(TC所花的時(shí)間為40min，最終壓力為3.2MPa。達(dá)到240'C后，相應(yīng)地從取樣口收集反應(yīng)溶液，用氮?dú)饷芊獠⒃谡诠鉅顟B(tài)下迅速冷卻至25°C。然后將反應(yīng)溶液離心(5000g，5min)以去除水相，將脂肪酸相在7(TC下在400Pa真空下脫水5min。測量酸值并計(jì)算脂肪酸濃度。在脂肪酸具有85重量％濃度時(shí)終止水解并將反應(yīng)溶液冷卻至50°C。冷卻至50。C所花的時(shí)間為50min。將整個(gè)水解脂肪酸從高壓釜系統(tǒng)中抽取到2L燒杯中，并在4(TC下在氮?dú)夥障蚂o置120min以去除水相。進(jìn)而，在離心(5000g，30min)去除水相后，將所得物裝在2000mL容積四頸燒瓶中，并在70。C下在400Pa真空下在攪拌(半圓葉片(D90mmXH25mm，300r/min)的同時(shí)將脂肪酸完全脫水30min并分析。獲得表2中所示的脂肪酸樣品E至I。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>從表2中清楚看出，當(dāng)通過使用固定化酶的酶水解將原料油脂部分水解以使脂肪酸濃度為20至90重量％然后在高溫高壓條件下將所得物水解時(shí)，可以制備不僅在構(gòu)成脂肪酸中具有低反式不飽和脂肪酸含量還具有良好外觀的脂肪酸(樣品F、G)。相反，已經(jīng)表明，盡管在通過使用脂肪酶粉末或粒狀脂肪酶的酶水解將原料油脂部分水解然后在高溫高壓條件下水解而獲得的脂肪酸(樣品H、I)中，構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸含量低，但該脂肪酸具有差的外觀。還表明，盡管僅通過在高溫高壓條件下水解原料油脂而得的脂肪酸(樣品E)具有良好外觀，但構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸含量高。進(jìn)而，從表1和表2中清楚看出，當(dāng)通過酶水解法部分水解的脂肪酸具有小的總氮量時(shí)，在高溫高壓條件下水解的脂肪酸具有低色調(diào)C。B.在第一步驟中包含方法(b)并在第二步驟中包含方法(a)的方法的研究[制造固定化酶的方法]將50gDuoliteA-568(可獲自Rohm&Hass)在500mL0.1N氫氧化鈉水溶液中攪拌lhr。隨后，用500mL蒸餾水洗滌lhr并用500mL500mM磷酸鹽緩沖液使pH值保持恒定(pH7)2hr。此后，每2hr用500mL50mM磷酸鹽緩沖液(pH7)使pH值保持恒定兩次。隨后，過濾收集載體并用250mL乙醇置換30min。過濾后，向其中加入250mL含50g蓖麻油酸的乙醇，并將蓖麻油酸吸附到載體上30min。此后，過濾收集載體并用250mL50mM磷酸鹽緩沖液(pH7)洗滌4次以去除乙醇，并過濾收集載體。然后，使載體與lOOOmL市售脂肪酶的10%溶液(可獲自AmanoEnzymeInc.的脂肪酶AY"Amano"30G)接觸4hr以將酶固定在載體上，上述脂肪酶作用于油脂。然后進(jìn)行過濾以收集固定化酶并用250mL50mM乙酸鹽緩沖液(pH7)洗滌以去除未固定的酶或蛋白質(zhì)。這些步驟均在2(TC下進(jìn)行。由酶溶液在固定化后的殘留活性和酶溶液在固定化前的活性之間的差異確定固定化比率為95%。隨后，向其中加入200g大豆油，將混合物在4(TC下攪拌2hr，并過濾分離大豆油以提供固定化酶。用作為實(shí)際用于反應(yīng)的基質(zhì)的部分水解脂肪酸洗滌由此獲得的固定化酶并在使用之前過濾。[原料油脂]使用表3中所示的未除臭大豆油作為原料油脂。通過與上述相同的方法測量甘油酯組成。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>[局/EE局MtK角牟]將原料油脂從底部連續(xù)供給到油-水對流高壓熱水分解裝置中并從頂部向其中連續(xù)供給水。供給量為基于100重量份原料油脂供給50重量份水。在此階段，分解塔中的平均停留時(shí)間(hr)(塔體積(m3)/(原料油脂的流速(mVhr)十水的流速(m3/hr)))為大約4hr。在該裝置中通過高壓熱水(5.0MPa，240°C)加熱原料油脂。相應(yīng)地從沿著油-水對流高壓熱水分解裝置分布的取樣口收集反應(yīng)溶液，用氮密封并在遮光狀態(tài)下冷卻至25°C。然后將反應(yīng)溶液離心(5000g，30min)以去除水相，將脂肪酸相在7CTC在400Pa真空下脫水30min以提供樣品J至N。每一脂肪酸的分析值顯示在表4中。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>[通過酶水解法進(jìn)行的水解(1)]將樣品J至M(其是部分水解脂肪酸)和表3中所示的未除臭大豆油通過使用固定化酶的酶水解法水解。將5g(干重量)用樣品J至M或未除臭大豆油洗過的各固定化酶(水解活性2700U/g)稱入300mL容積四頸燒瓶中。向其中加入100g相應(yīng)樣品J至M或未除臭大豆油和60g蒸餾水。在密封狀態(tài)下在4(TC下在氮?dú)夥障聰嚢?半圓葉片O60mmXH15mm，250r/min)的同時(shí)，連續(xù)反應(yīng)直至脂肪酸具有93重量％或更高的濃度。將反應(yīng)溶液離心(5000g，30min)以去除水相和固定化酶，然后將脂肪酸相在7(TC下在400Pa真空下脫水30min以提供脂肪酸(樣品O至S)。每一脂肪酸的分析值(在使用固定化酶的情況下)顯示在表5中。對于每一樣品，通過水解J獲得O，通過水解K獲得P，通過水解L獲得Q，通過水解M獲得R，并通過水解未除臭大豆油獲得S。[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>[通過酶水解法進(jìn)行的水解(2)]將部分水解脂肪酸樣品J至M和表1中所示的未除臭大豆油通過使用酶粉末的酶水解法水解。將100g樣品J至M或未除臭大豆油和55g蒸餾水稱入300mL容積四頸燒瓶中。向其中加入整個(gè)混合物，在該混合物中將O.lg脂肪酶OF(來自柱狀假絲酵母(Candidacylindracea)，可獲自MeitoSangyoCo.,Ltd.)溶角軍在5g蒸餾水中。在密封狀態(tài)下在4(TC下在氮?dú)夥障聰嚢?半圓葉片O60mmXH15mm，250r/min)的同時(shí)，連續(xù)反應(yīng)直至脂肪酸具有93重量％或更高的脂肪酸濃度。將反應(yīng)溶液離心(5000g，30min)以去除水相和存在脂肪酶粉末的中間層，然后將脂肪酸相在7(TC下在400Pa真空下脫水30min以提供脂肪酸(樣品T至X)。每一脂肪酸的分析值(在使用酶粉末的情況下)顯示在表6中。對于每一樣品，通過水解J獲得T，通過水解K獲得U，通過水解L獲得V，通過水解M獲得W，并通過水解未除臭大豆油獲得X。[表6]<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>除臭大旦油)從表3至表6中清楚看出，當(dāng)原料油脂在高溫高壓條件下部分水解以使脂肪酸濃度為0.5至90重量％然后用脂肪酶將所得物水解時(shí)，可以制備不僅在構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸和單酰甘油含量低而且還具有良好外觀的脂肪酸(樣品P、Q、R、U、V、W)。相反，己經(jīng)表明，盡管僅通過在高溫高壓條件下水解原料油脂獲得的脂肪酸(樣品N)具有良好外觀，但構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸和單酰甘油含量高。還已經(jīng)表明，盡管通過在高溫高壓條件下部分水解原料油脂以使脂肪酸濃度為90重量％或更高然后用脂肪酶水解而得的脂肪酸(樣品O、T)具有良好外觀且單酰甘油含量低，但構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸含量高。此外，已經(jīng)表明，盡管在僅通過原料油脂的酶水解反應(yīng)獲得的脂肪酸(樣品S、X)中，構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸和單酰甘油的含量低，但這些脂肪酸具有差的外觀。權(quán)利要求1.一種制造脂肪酸的方法，其特征在于，通過水解油或脂制造脂肪酸，該方法包括通過下列方法(a)或(b)中的任一種方法部分水解油或脂的第一步驟，和通過另一方法進(jìn)行水解的第二步驟(a)使用固定化酶的酶水解法，該固定化酶是固定在載體上的酶，(b)高壓高溫水解法。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造脂肪酸的方法，其特征在于，當(dāng)在第一步驟中進(jìn)行(a)的酶水解法時(shí)，將酶水解進(jìn)行至脂肪酸具有2090重量％的濃度。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造脂肪酸的方法，其特征在于，當(dāng)在第一步驟中進(jìn)行(b)的高壓高溫水解法時(shí)，將高壓高溫水解進(jìn)行至脂肪酸具有0.5至90重量％的濃度。4.根據(jù)權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的制造脂肪酸的方法，其特征在于，在第一步驟中被進(jìn)行部分水解反應(yīng)的油或脂在構(gòu)成脂肪酸中含有1.5重量％或更少的反式不飽和脂肪酸。全文摘要本發(fā)明提供一種通過水解油脂制造脂肪酸的方法，其包括通過下列方法(a)或(b)中的一種方法部分水解油脂的第一步驟，和通過另一方法進(jìn)行水解的第二步驟(a)使用固定化酶的酶水解法，該固定化酶是固定在載體上的酶，(b)高壓高溫水解法。提供了通過油脂的水解有效制造在構(gòu)成脂肪酸中反式不飽和脂肪酸含量降低并具有色度降低了的良好外觀的脂肪酸的方法。文檔編號C11C1/04GK101278054SQ20068003670公開日2008年10月1日申請日期2006年10月6日優(yōu)先權(quán)日2005年10月6日發(fā)明者加瀬實(shí),小松利照申請人:花王株式會(huì)社