專利名稱：反應(yīng)治具和反應(yīng)方法、以及cDNA的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反應(yīng)治具(反応治具reaction jig(反應(yīng)保持器))和反應(yīng)方法。更 具體而言，本發(fā)明涉及可平行且簡便地實(shí)施任意包含清洗工序的多個(gè)連續(xù)反應(yīng)的反應(yīng)治具 和反應(yīng)方法。此外，本發(fā)明還涉及使用上述反應(yīng)治具的cDNA的合成方法。
背景技術(shù)：
通常由mRNA起始的cDNA的合成和DNA的擴(kuò)增等基因相關(guān)反應(yīng)多以小容量平行 進(jìn)行多個(gè)種類。此時(shí)，通常例如使用96孔或384孔等微孔列陣(74々α々-Α7Χ microwell array)，準(zhǔn)備已將反應(yīng)液和清洗液加入到各孔中的陣列，一旦反應(yīng)或清洗結(jié)束， 則通過移液管將溶液移動(dòng)到下一個(gè)孔中，供下一步處理使用。當(dāng)上述處理操作通過程序進(jìn) 行時(shí)也可利用機(jī)器人。但是，即使利用機(jī)器人，移動(dòng)溶液所使用的移液管也需要每次清洗或更換后在下 一步處理中使用，操作非常繁雜。為代替使用移液管，也可使用磁珠，用磁石吊起固定于磁珠上的供試品并使之移 動(dòng)(例如日本特表2007-504835號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)1))。但是，當(dāng)使用上述微孔列陣時(shí)，移 動(dòng)所使用的磁石需要從孔的上方靠近，并根據(jù)情況浸漬于孔中的溶液中。浸漬于溶液中的 磁石在下一步驟前需要清洗。另外，在移動(dòng)至下一步驟后，為了將磁珠從磁石上釋放，也需 要磁石可消磁。非專利文獻(xiàn)1中刊登了利用磁珠的RT-PCR反應(yīng)法。在該文獻(xiàn)所記載的方法中，室 溫下的反應(yīng)通過相對(duì)于100份溶液添加1份油，通過油膜覆蓋液滴來進(jìn)行蒸發(fā)等的預(yù)防。專利文獻(xiàn)1 日本特表2007-504835號(hào)公報(bào)Juergen Pipperl,Masafumi Inoue2,Lisa F-P Ng3,PaveL NeuziL 1,4, Yi Zhang l，4&Lukas Novak 1,4, NATURE MEDICINE VOLUME 13 NUMBER 10 OCTOBER 2007 第 1259-1263 頁

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題如上所述，當(dāng)使用96孔或384孔等微孔列陣平行進(jìn)行多種反應(yīng)和清洗操作時(shí)，無 論使用移液管，還是使用磁珠，都需要清洗或更換操作所使用的移液管或磁珠，操作繁雜。此外，如非專利文獻(xiàn)1所記載的方法所示，通過油膜覆蓋液滴來防止蒸發(fā)等，就操 作而言也是繁雜的。特別是當(dāng)使用大量液滴時(shí)，這種繁雜無法忽視。因此，本發(fā)明的目的在于提供每次操作不需要清洗或更換移動(dòng)溶液等所使用的器 具，可平行進(jìn)行多種反應(yīng)和清洗操作的裝置和方法。此外，本發(fā)明的目的還在于提供不通過 油膜覆蓋液滴而可以平行進(jìn)行多種反應(yīng)和清洗操作的裝置和方法。解決課題的手段本發(fā)明如下所示。
(1)反應(yīng)治具，其特征在于基板一側(cè)的表面排列設(shè)置有多個(gè)突起狀圍壁，所述突 起狀圍壁至少具有1個(gè)凹口部，且在內(nèi)部具有可保持液滴的空間，并且所述基板表面的至少保持所述液滴的面對(duì)于純水的接觸角為90 150°的范圍。(2) (1)中記載的反應(yīng)治具，其中，所述多個(gè)突起狀圍壁至少部分或全部縱橫地排 列設(shè)置。(3) (1)或(2)中記載的反應(yīng)治具，其中，所述突起狀圍壁的液滴保持用空間可保 持0. 5 μ 1 200 μ 1范圍的量的液滴。(4) (1) (3)中任1項(xiàng)記載的反應(yīng)治具，其中，突起狀圍壁具有2個(gè)或3個(gè)凹口 部，所述凹口部開口的間隔為0.5 IOmm的范圍。(5)⑴ (4)中任1項(xiàng)記載的反應(yīng)治具，其中，所述基板表面由石蠟樹脂(〃，7 ^ >樹脂)、特氟隆樹脂或有機(jī)硅樹脂構(gòu)成。(6)⑴ (4)中任1項(xiàng)記載的反應(yīng)治具，其中，所述基板具有由石蠟樹脂、特氟隆 樹脂或有機(jī)硅樹脂構(gòu)成的涂層。(7)⑴ (6)中任1項(xiàng)記載的反應(yīng)治具，其中，使用所述反應(yīng)治具以在各突起狀圍 壁的液滴保持用空間中，將相同或不同種類溶液的液滴不與置于其它突起狀圍壁的液滴保 持用空間部分的液滴混合地保持。(8)⑴ (7)中任1項(xiàng)記載的反應(yīng)治具，其中，使用所述反應(yīng)治具以在屬于同一橫 列的突起狀圍壁的液滴保持用空間中保持同一種類溶液的液滴。(9) (7)或(8)中任1項(xiàng)記載的反應(yīng)治具，其中，所述溶液為含有表面張力降低試劑 的反應(yīng)液或清洗液。(10) (1) (9)中任1項(xiàng)記載的反應(yīng)治具，所述反應(yīng)治具進(jìn)一步具有覆蓋具有所述 突起狀圍壁的表面的覆蓋部件，且進(jìn)一步具有為所述覆蓋部件所覆蓋的空間提供濕氣的保 濕部件。(11)反應(yīng)方法，所述反應(yīng)方法包括使用(1) (10)中任1項(xiàng)記載的反應(yīng)治具，在 與所述基板的具有突起狀圍壁的表面相反一側(cè)的表面使用磁石，使固定于磁珠上的物質(zhì)在 上述突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的含有表面張力降低試劑的溶液的液滴中按順 序移動(dòng)，從而進(jìn)行反應(yīng)和/或清洗。(12)cDNA的合成方法，所述合成方法包括使用1個(gè)縱列中至少設(shè)置有2個(gè)突起狀 圍壁的(1) (10)中任1項(xiàng)記載的反應(yīng)治具，在所述2個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間中按順序分別保持含有表面張力降低 試劑的細(xì)胞溶解用溶液和cDNA合成用溶液的液滴，在與基板的具有突起狀圍壁的表面相反一側(cè)的表面使用磁石，使固定于磁珠上的 mRNA在所述2個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的溶液中按順序移動(dòng)，制得固定于磁珠上的cDNA。(13) (12)中記載的方法，其中，使用在多個(gè)縱列中至少設(shè)置有2個(gè)突起狀圍壁的 反應(yīng)治具，各橫列的突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的溶液為同一種類的溶液，固定于縱列移動(dòng)的磁珠上的mRNA為不同種類的mRNA，作為固定于磁珠上的cDNA，制得多個(gè)不同種類的cDNA。(14) (12)或(13)中任1項(xiàng)記載的方法，其中，所述反應(yīng)治具在1個(gè)縱列中至少設(shè)置有4個(gè)突起狀圍壁，所述4個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間按順序分別保持細(xì)胞溶解用溶液、mRNA清 洗用溶液、cDNA合成用溶液和cDNA清洗用溶液的液滴，將固定于磁珠上的mRNA在所述4個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的溶液 中按順序移動(dòng)。(15) (11) (14)中任1項(xiàng)記載的方法，其中，將具有突起狀圍壁的表面朝下來使 用所述反應(yīng)治具。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可提供在反應(yīng)和清洗等的每次操作中可不清洗或更換移動(dòng)溶液等所 使用的器具而平行進(jìn)行多種反應(yīng)和清洗操作的裝置和方法。實(shí)施發(fā)明的最佳方式[反應(yīng)治具]本發(fā)明涉及基板一側(cè)的表面排列設(shè)置有多個(gè)突起狀圍壁，所述突起狀圍壁具有至 少1個(gè)凹口部，且在內(nèi)部具有可保持液滴的空間的反應(yīng)治具。突起狀圍壁只要具有至少1個(gè)凹口部且在內(nèi)部具有可保持液滴的空間即可。突起 狀圍壁的形狀具體而言如

圖1所示，可根據(jù)用途從各種形狀中選擇。例如，如圖1中的G所 示，可以是凹口部為1個(gè)的突起狀圍壁。凹口部為1個(gè)的突起狀圍壁適合例如反應(yīng)開始位 置和反應(yīng)結(jié)束位置或最終位置。如圖1中的々、(丄4、!1、1^所示，凹口部為2個(gè)的突起狀 圍壁適合在反應(yīng)或清洗等工序的中途使用。如圖1中的J、K所示凹口部為3個(gè)的突起狀圍 壁以及如圖1中的B、L所示凹口部為4個(gè)的突起狀圍壁適合用于例如將反應(yīng)或清洗后的物 質(zhì)分配成2份以上的位置。但是，并無限定于上述使用方法的意圖。另外，1個(gè)反應(yīng)治具中所設(shè)置的突起狀圍壁并不限定于1種，也可適宜設(shè)置多個(gè)具 有不同形狀的突起狀圍壁。突起狀圍壁內(nèi)部所形成的可保持液滴的空間的容量可根據(jù)反應(yīng)治具的用途和突 起狀圍壁的功能適宜設(shè)定，例如可以是0. 5μ 1 200 μ 1的范圍。但是，并無限定于上述范 圍的意圖，可保持液滴的空間的容量可根據(jù)用途適宜決定。作為突起狀圍壁，以具有〃字形突起的形態(tài)為例，根據(jù)以下圖2對(duì)本發(fā)明的反應(yīng) 治具進(jìn)行進(jìn)一步說明。!、字形突起雖然在圖1中并未示出，但具有存在2個(gè)凹口，各凹口所 形成的開口(間隙)的尺寸不同的形狀?？蓪㈤_口的尺寸大的一方例如用作入口，將開口 的尺寸小的一方例如用作出口。如圖2所示，本發(fā)明的反應(yīng)治具100在基板10的一側(cè)表面11上朝同一方向排列 設(shè)置有多個(gè)〃字形突起20。上述多個(gè)突起縱橫地排列設(shè)置。構(gòu)成〃字形突起的縱列的〃字 形突起數(shù)和構(gòu)成〃字形突起的橫列的〃字形突起數(shù)可考慮反應(yīng)治具的用途和同時(shí)處理的 反應(yīng)操作數(shù)、以及基板10的大小和形狀、〃字形突起20的形狀或大小、〃字形突起20之間 的間隔等來適宜決定。構(gòu)成〃字形突起的縱列的〃字形突起數(shù)可以是例如2 10個(gè)，構(gòu)成 〃字形突起的橫列的〃字形突起數(shù)可以是例如2 100個(gè)。但是，并無限定于上述范圍的 意圖。圖2的反應(yīng)治具為縱橫地排列設(shè)置有橫16列、縱8列的〃字形突起的反應(yīng)治具。如圖2所示，〃字形突起經(jīng)由因凹口形成的間隙21而設(shè)置的2個(gè)突起22、23構(gòu)成。 此外，〃字形突起的內(nèi)部具有可保持液滴40的空間30，該空間可保持的液滴的量可以是例如0.5μ1 200μ1的范圍。但是，并無限定于上述范圍的意圖。突起22、23的形狀只要 可在空間30中保持上述量的液滴則無特殊限制。但是，從節(jié)省空間地保持空間30所保持 的液滴的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選部分圓形或部分橢圓形。但是，也可以是一根直線形或由多條直線 構(gòu)成的形狀(例如 字形)。突起22、23的高度只要可在空間30中保持上述量的液滴則無 特殊限制。突起22、23的高度可以是例如0. 1 5mm的范圍。如下所述，間隙21是在將固定在完成處理操作的磁珠上的反應(yīng)物從〃字形突起 內(nèi)部的空間30所保持的液滴移動(dòng)至下一個(gè)〃字形突起內(nèi)部的空間30所保持的液滴時(shí)，使 磁珠與經(jīng)固定的反應(yīng)物一同移動(dòng)的移動(dòng)通路。因此，間隙21的最短間隔可根據(jù)以下觀點(diǎn)決 定磁珠可容易地向下一個(gè)〃字形突起的空間30移動(dòng)，并且〃字形突起可作為移動(dòng)防御提 發(fā)揮作用，以妨礙〃字形突起的空間30所保持的液滴與磁珠一同向下一個(gè)〃字形突起的 空間30移動(dòng)。根據(jù)上述觀點(diǎn)，間隙21的最短間隔可以是例如1 IOmm的范圍。另一方面，從使磁珠的移動(dòng)容易且形成用于保持液滴的空間的觀點(diǎn)出發(fā)，與間隙 21相反一側(cè)的突起22、23的末端優(yōu)選為開口狀態(tài)。從基板容易制備的觀點(diǎn)出發(fā)，本發(fā)明反應(yīng)治具的基板表面的至少保持液滴的面優(yōu) 選與其它基板表面無高低差，并且平坦。但是，本發(fā)明反應(yīng)治具的基板表面的至少保持液滴 的面也可低于其它基板表面，形成凹陷。與平坦的情況相比，通過形成凹陷使液滴的保持變 得容易。但是，具有如下程度的凹陷深度和構(gòu)成凹陷的面的形狀是合適的，所述程度為不妨 礙磁珠從被保持的液滴的移動(dòng)。在構(gòu)成凹陷的面中，如下曲面是合適的，所述曲面的至少通 向突起開口的、存在磁珠移動(dòng)可能性的面無高低差。另 外，凹陷的深度為例如突起開口尺寸 的1/2以下，構(gòu)成凹陷的面的最大傾斜為45°以下是合適的。從空間對(duì)液滴的保持、防止各空間所保持的液滴接觸的觀點(diǎn)出發(fā)，本發(fā)明反應(yīng)治 具的基板表面的至少保持液滴的面對(duì)于純水的接觸角為90 150°的范圍是合適的。液 滴因突起狀圍壁被保持在突起狀圍壁的內(nèi)部，但僅就突起狀圍壁而言，在下述使用磁珠的 反應(yīng)操作中，存在無法良好保持液滴的情況。因此，在本發(fā)明中為了使液滴良好地保持在突 起狀圍壁的內(nèi)部，至少使突起狀圍壁的內(nèi)部面為對(duì)于純水的接觸角為90 150°范圍的表 面。對(duì)于純水的接觸角因形成表面的材料(材質(zhì))和表面狀態(tài)(例如表面糙度或表面形狀 等)而變化。即使材質(zhì)相同，若表面狀態(tài)(例如表面糙度或表面形狀等)不同，則對(duì)于純水 的接觸角也發(fā)生變化。在本發(fā)明中，按照對(duì)于純水的接觸角為90 150°的范圍選擇形成 表面的材料(材質(zhì))和表面狀態(tài)(例如表面糙度或表面形狀等)。作為形成表面的材料(材質(zhì))，可使用屬于防水性較高的材料的石蠟樹脂、特氟隆 樹脂或有機(jī)硅樹脂等。可由上述材料構(gòu)成的物質(zhì)也可形成基板本身，基板為其它材料(例 如玻璃基板)，也可在表面上設(shè)置上述石蠟樹脂、特氟隆樹脂或有機(jī)硅樹脂等的涂層。就 上述樹脂而言，只要材料本身的防水性高，并且是平滑的表面，就可顯示出上述范圍的接觸 角。但是，也可根據(jù)需要通過使表面糙度化來調(diào)整接觸角。例如當(dāng)使用石蠟樹脂時(shí)，在圖2的反應(yīng)治具中，在基板10的表面可設(shè)置有在與〃 字形突起的〃的縱向平行的方向上取向的微波形凹凸(表面糙度)。上述微波形凹凸由于 在與〃字形突起的〃的縱向平行的方向上取向，所以具有使磁珠容易移動(dòng)的功能。微波形凹凸只要可發(fā)揮上述功能則無特殊限制，可以是例如高度為Iym Imm范 圍且波長為Iym Imm范圍的微波形凹凸。此外，對(duì)具有微波形凹凸的表面調(diào)整凹凸形狀，以使對(duì)于純水的接觸角為90 150°的范圍。在各〃字形突起20的空間30中，相同或不同種類溶液的液滴可不與置于其它〃 字形突起的〃的空間部分的液滴混合地保持而使用?？臻g30中作為液滴所保持的溶液無 特殊限制，可以是例如反應(yīng)液或清洗液。反應(yīng)液和清洗液的種類可根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)治具 的使用目的適宜選擇。在所使用的反應(yīng)液和清洗液中添加表面張力降低試劑是合適的。表面張力降低試 劑具有使溶液的表面張力減少、在疏水性基板上穩(wěn)定保持液滴的效果。另外，表面張力降低 試劑還具有降低在磁珠組(集団)向液滴外移動(dòng)時(shí)構(gòu)成阻礙的液滴的表面張力的效果。在 本發(fā)明中，如上所述，至少使形成液滴保持空間的表面對(duì)于純水的接觸角為90 150°的 范圍，使之具有較高的防水性，通過向此處所保持的液滴中添加表面張力降低試劑，抑制液 滴向液滴保持空間表面外擴(kuò)展，并且賦予液滴對(duì)液滴保持空間表面的附著性，增大保持力， 由此當(dāng)磁珠向液滴搬入或搬出時(shí)，可維持液滴向液滴保持空間表面的保持。另外，鄰接的突 起狀圍壁和突起狀圍壁之間的表面也同樣可使對(duì)于純水的接觸角為90 150°的范圍，考 慮到磁珠移動(dòng)的容易性等，鄰接的突起狀圍壁和突起狀圍壁之間的表面也可具有不同的性 質(zhì)。另外，通過添加表面張力降低試劑，存在即使在使用磁珠，特別是粒徑較小的磁珠 時(shí)，也可使向液滴的搬出(侵入)容易的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)例如在純水中制成0. 濃度的情況下，表面張力降低試劑為可使玻璃板上的 純水的接觸角(下述表1所示的測(cè)定結(jié)果為42° )下降至30°以下的試劑是合適的。作 為具有這樣的表面張力降低作用的試劑，可列舉出表面活性劑和肺表面活化劑蛋白質(zhì)等脂 蛋白、富含血清白蛋白或脂蛋白的血清等。表面活性劑包括各種表面活性劑，與種類無關(guān)，均可用作表面張力降低試劑。以下 進(jìn)行了例示，但其僅僅是例示，并不限定于這些例示的表面活性劑。(1)陰離子系表面活性劑脂肪酸鈉、單烷基硫酸鹽(2)陽離子系表面活性劑烷基聚氧乙烯硫酸鹽、烷基苯磺酸鹽、單烷基磷酸鹽(3)兩性表面活性劑烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、烷基芐基二甲基銨 鹽、烷基二甲胺氧化物、烷基羧基甜菜堿(4)非離子型表面活性劑聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸脫水山梨糖醇酯、烷基多聚葡 萄糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、氨基單甘油醚作為陰離子表面活性劑的代表例，可列舉出十二 烷基硫酸鋰；作為非離子型表面活性劑的代表例，可列舉出Triton X 100。斟酌上述觀點(diǎn)，也考慮到表面張力降低試劑的種類和液滴保持空間表面對(duì)于純水 的接觸角，表面張力降低試劑的添加量為例如0. 001 的范圍，優(yōu)選0.01 的范 圍。但是，并不受上述范圍限制。本發(fā)明的反應(yīng)治具當(dāng)對(duì)不同種類的樣品進(jìn)行同一反應(yīng)操作處理時(shí)，屬于同一橫列 的〃字形突起的空間可用于保持同種溶液的液滴。本發(fā)明的反應(yīng)治具可進(jìn)一步具有覆蓋具有突起狀圍壁的表面的覆蓋部件，且進(jìn)一 步具有為所述覆蓋部件所覆蓋的空間提供濕氣的保濕部件。例如，如圖2所示，在箱型塑料 箱50的底部開口部設(shè)置薄層玻璃板10，其上貼有具有突起狀圍壁的樹脂膜11，使突起朝向 塑料箱的內(nèi)部。此外，還可設(shè)置覆蓋塑料箱上部開口的覆蓋部件(蓋)60。覆蓋部件(蓋)60的內(nèi)部可設(shè)置有為覆蓋部件所覆蓋的空間提供濕氣的保濕部件(例如濕式濾紙)61。通過 制成上述的結(jié)構(gòu)，即使在操作少量液滴時(shí)，也可抑制水分從液滴中的揮發(fā)，良好地進(jìn)行反應(yīng) 和清洗操作等?？稍谂c基板10的具有突起狀圍壁20的表面相反一側(cè)的表面(圖2的上 面)使用磁石(例如小型釹磁石)70，使磁珠按順序移動(dòng)，進(jìn)行反應(yīng)和清洗等操作。[反應(yīng)方法]本發(fā)明包含使用上述本發(fā)明的反應(yīng)治具的反應(yīng)方法。本發(fā)明的反應(yīng)方法包括在與 基板的具有突起狀圍壁的表面相反一側(cè)的表面使用磁石，將固定于磁珠上的物質(zhì)在突起狀 圍壁(例如上述〃字形突起)的空間所保持的含有表面張力低下試劑的溶液液滴中按順序 移動(dòng)，進(jìn)行反應(yīng)和清洗。進(jìn)行反應(yīng)和清洗的溫度可考慮適合反應(yīng)和清洗的的溫度來適宜決 定，也可在每道工序中上下調(diào)整溫度。此時(shí)，也可根據(jù)需要在例如上述覆蓋部件50和/或 60的外側(cè)或內(nèi)部、和/或薄層玻璃板(10)與樹脂膜(11)之間或與基板具有突起狀圍壁的 表面相反一側(cè)的表面設(shè)置加熱和/或冷卻裝置。在上述本發(fā)明的反應(yīng)方法中，上述反應(yīng)治具優(yōu)選將具有突起狀圍壁的表面朝下使 用。若將具有突起狀圍壁的表面朝下使用，則突起狀圍壁所收納的液滴呈懸滴狀。若在此狀 態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)，則由于蒸氣輕，所以在上部進(jìn)行蒸發(fā)，因此若液滴為懸滴狀，則可抑制蒸發(fā)。 其結(jié)果即使在開放體系下進(jìn)行，室溫下也可相當(dāng)程度地抑制蒸發(fā)。此外，通過將反應(yīng)治具中 具有突起狀圍壁的表面收納于覆蓋部件之中，或?qū)⒎磻?yīng)治具中具有突起狀圍壁的表面設(shè)置 于收納有保濕部件的覆蓋部件之中，可進(jìn)一步防止水從液滴的蒸發(fā)。通過采取上述方法，可 以不像非專利文獻(xiàn)1中記載的那樣使用油，而抑制水分從液滴的蒸發(fā)。若不使用油，則即 使是數(shù)微升的微量反應(yīng)液，由于油不附著于移液管，所以具有可隨時(shí)、容易地進(jìn)行溶液的添 加·回收的優(yōu)點(diǎn)。若在室溫下不吹風(fēng)的條件下，則即使不使用保濕劑，不是封閉體系(不放 入覆蓋部件(容器))的情況下，可維持?jǐn)?shù)微升的懸滴在數(shù)小時(shí)內(nèi)不干燥。但是，進(jìn)行酶反 應(yīng)的溫度高于室溫時(shí)，例如在50°C附近進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)，無法忽視蒸發(fā)。此時(shí)，優(yōu)選放入裝有 保濕劑的容器(覆蓋部件)內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)等操作。當(dāng)將反應(yīng)治具中具有突起狀圍壁的表面收納于覆蓋部件中時(shí)，在進(jìn)行反應(yīng)等操作 之前和操作中，優(yōu)選在不影響反應(yīng)等的范圍內(nèi)將由反應(yīng)治具和覆蓋部件形成的內(nèi)部加熱至 例如30 40°C。因加熱而產(chǎn)生的水蒸氣在基板表面上凝結(jié)形成微小的液滴，具有使磁珠從 液滴中的移動(dòng)流暢的作用。特別是當(dāng)使用表面張力降低能力較低的試劑(具體而言使用表 面活性劑以外的試劑)時(shí)，具有通過上述加熱使磁珠的移動(dòng)更流暢的優(yōu)點(diǎn)。另外，從促進(jìn)基 板表面上的水蒸氣凝結(jié)的觀點(diǎn)出發(fā)，也可冷卻被覆蓋部件所覆蓋的反應(yīng)治具，例如在較低 溫的室內(nèi)進(jìn)行操作。另外，作為使液滴呈懸滴狀的另1個(gè)優(yōu)點(diǎn)，可列舉出促進(jìn)液滴中磁珠的攪拌的優(yōu) 點(diǎn)。若使磁石脫離基板，則被磁石所吸引的液滴中的磁珠因重力落至懸滴狀液滴底部，通過 再次使磁石接觸基板，磁珠從液滴底部聚集于基板表面。通過上述操作，可提高磁珠的清洗 和酶反應(yīng)等的效率。通過磁石進(jìn)行的懸滴狀液滴中磁珠的吸引和落下即使是1次，也可多 次反復(fù)進(jìn)行。磁珠可使用市售的磁珠。磁珠的粒徑可以為例如0. 01 μ m 2mm的范圍，優(yōu)選 0. Ιμπι 0. Imm的范圍。但是，若磁珠的粒徑小至納米級(jí)，則存在向液滴的侵入(搬入)變 難的情況。此時(shí)，通過合用具有更大粒徑的磁珠作為載體，可使向液滴的侵入(搬入)容易。
9在作為載體合用的珠上未固定有物質(zhì)，但也可合用固定有物質(zhì)的載體珠。此外，在磁珠的表面對(duì)作為通過本發(fā)明的反應(yīng)方法進(jìn)行反應(yīng)處理的對(duì)象物的物質(zhì) 進(jìn)行固定。物質(zhì)的固定可根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行。作為反應(yīng)處理的對(duì)象物的物質(zhì)無特殊限制，可 列舉出核酸(DNA、RNA等)、肽、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、復(fù)合糖脂(複合糖脂質(zhì))、天然低分子、 合成低分子、高分子化合物、金屬等。本法可應(yīng)用于核酸、蛋白、脂質(zhì)、糖質(zhì)、復(fù)合糖質(zhì)、化學(xué) 物質(zhì)的大規(guī)?！の⒘窟B續(xù)反應(yīng)，也可用于固定細(xì)胞(1至十幾個(gè))的免疫染色。作為反應(yīng)處理對(duì)象物的物質(zhì)對(duì)磁珠的固定量可考慮物質(zhì)的種類和反應(yīng)的種類等 來適宜決定。作為本發(fā)明的反應(yīng)方法的一個(gè)實(shí)例，可列舉出cDNA的合成方法。本發(fā)明的cDNA的合成方法使用1個(gè)縱列上至少設(shè)置有2個(gè)突起狀圍壁的上述本 發(fā)明的反應(yīng)治具。上述合成方法包括上述2個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間中按順序分 別保持含有表面張力降低試劑的細(xì)胞溶解用溶液和含有表面張力降低試劑的cDNA合成用 溶液的液滴，在與基板的具有突起狀圍壁的表面相反一側(cè)的表面使用磁石，使固定于磁珠 上的mRNA在上述2個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的溶液中按順序移動(dòng)，制得固定 于磁珠上的cDNA。在上述本發(fā)明的cDNA合成方法中，如上所述，反應(yīng)治具優(yōu)選將具有突起狀圍壁的 表面朝下使用。若將具有突起狀圍壁的表面朝下使用，則突起狀圍壁所收納的液滴呈懸滴 狀，可獲得抑制水分蒸發(fā)和促進(jìn)磁珠攪拌的效果。上述本發(fā)明的cDNA的合成方法優(yōu)選使用1個(gè)縱列上至少設(shè)置有4個(gè)突起狀圍壁 的反應(yīng)治具。上述4個(gè)突起狀圍壁(例如〃字形突起)的空間中按順序分別保持有細(xì)胞溶 解用溶液、mRNA清洗用溶液、cDNA合成用溶液和cDNA清洗用溶液的液滴(參照?qǐng)D3)，在與 基板的設(shè)置有突起的相反一側(cè)的表面使用磁石，使固定于磁珠上的mRNA在上述4個(gè)突起狀 圍壁的空間所保持的溶液中按順序移動(dòng)。由此，制得固定于磁珠上的cDNA。本發(fā)明cDNA合成方法所使用的反應(yīng)治具的〃字形突起空間容量例如為0. 5 100 μ 1的范圍是合適的。第1個(gè)〃字形突起的空間所保持的細(xì)胞溶解用溶液可以是例如含有IOOmM Tris HCl (pH7. 5)、500mM LiCl、1 %十二烷基硫酸鋰、5mM 二硫蘇糖醇的總量為3 μ 1的溶液。第2個(gè)〃字形突起的空間所保持的mRNA清洗用溶液可以是含有IOmM Tris HCl (ρΗ7. 5)、0· 15Μ LiCl、0. 1 %十二烷基硫酸鋰的總量為3 μ 1的溶液。第3個(gè)〃字形突起的空間所保持的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用清洗液可以是含有50mM Tris HCl (pH8. 3)、75mM KCl、3mM MgCl2、0. 1% TritonX-100,0. 5mM dNTP、5mM DTT、2 單位 RNA 酶 抑制劑的總量為3μ1的溶液。第4個(gè)〃字形突起的空間所保持的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液可以是含有50mM Tris HCl (pH8. 3)、75mM KCl、3mM MgCl2、0. 1% Triton X_100、0. 5mM dNTP、5mM DTT、2 單位 RNA 酶 抑制劑、8單位superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶的總量為3μ 1的溶液。但是，這些均為例示，并無限定于這些溶液的意圖。準(zhǔn)備固定于磁珠上的mRNA。mRNA的種類和長度等無特殊限制?？墒褂酶鞣N源自生 物的mRNA。作為磁珠，可使用例如粒子系統(tǒng)2. 8 μ m、表面共價(jià)結(jié)合有oligo dT25的磁珠。 mRNA向磁珠的固定可如下實(shí)施。
10
將磁珠在細(xì)胞溶解用溶液中混懸成濃度為10mg/ml，向其中加入1至100個(gè)細(xì)胞。 通過上述操作，細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)由其polyA尾結(jié)合于固定在磁珠上的oligo dT25。在與基板的設(shè)置有突起的表面相反一側(cè)的表面使用磁石，使固定于磁珠上的mRNA 在上述4個(gè)〃字形突起的空間所保持的溶液(液滴)中按順序移動(dòng)。作為磁石，可使用例 如小型釹磁石。使其在各液滴中滯留反應(yīng)或清洗所必需的時(shí)間。反應(yīng)或清洗所需要的時(shí)間 因反應(yīng)條件、清洗條件而不同，可以是例如1秒 1小時(shí)的范圍。上述反應(yīng)和清洗可在常溫(室溫)下進(jìn)行，但根據(jù)需要也可進(jìn)行溫度調(diào)節(jié)。此外， 當(dāng)液滴的量為少量時(shí)，由于溶液中的溶劑可能會(huì)蒸發(fā)，所以優(yōu)選將反應(yīng)治具放入密閉容器， 通過使容器中的濕度保持恒定，防止溶劑的蒸發(fā)。為使容器中的濕度保持恒定，可使含有水 或適當(dāng)?shù)乃芤旱娜萜鞴泊嬗谏鲜雒荛]容器中。使固定于磁珠上的mRNA按順序滯留和通過上述4個(gè)〃字形突起的空間所保持的 溶液(液滴)，由此可制得固定于磁珠上的cDNA。制得的cDNA可不從磁珠上取下而用于以 后的工序。在上述cDNA的合成方法中，使用在多個(gè)(例如2 50個(gè))的縱列上至少設(shè)置有 4個(gè)〃字形突起的反應(yīng)治具，各橫列的〃字形突起所保持的溶液相同，固定于縱列移動(dòng)的磁 珠上的mRNA為不同種類的mRNA ；作為固定于磁珠上的cDNA，可制得多個(gè)不同種類的cDNA。使用抗體結(jié)合磁珠的反應(yīng)例如圖4所示。圖4是從下部觀察反應(yīng)治具時(shí)的圖，液 滴呈懸滴狀。在該反應(yīng)中，利用結(jié)合有與目的抗原相對(duì)應(yīng)的特異性抗體的磁珠。事先在第1列點(diǎn)加抗體磁珠(0. 1 % Triton X-100、150mM NaClUOmM磷酸鈉-鉀 緩沖液，PH7. 0，粒子系2.8μπι LOym的抗體結(jié)合磁珠25 μ g/3 μ 1)，在第2列點(diǎn)加分析 物樣品，在第3列點(diǎn)加清洗液(0. 1% Triton X_100、150mM NaCl、IOmM磷酸鈉-鉀緩沖液， PH7. 0)，在第4列點(diǎn)加標(biāo)記抗體(其為對(duì)目的抗原具有特異性，與固定于磁珠的抗體識(shí)別不 同的抗原表位的抗體。是進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記、過氧化物酶標(biāo)記、熒光色素標(biāo)記或金粒子等 標(biāo)記的抗體)，在第5列點(diǎn)加清洗液，在第6列點(diǎn)加發(fā)色液。需說明的是，形成點(diǎn)的各溶液的 組成只是例示，并無限定于上述組成的意圖。使用小型磁石，使第1列液滴內(nèi)的抗體磁珠移動(dòng)至第2列的分析物樣品液滴中，進(jìn) 行例如室溫下10分鐘至60分鐘的抗原-抗體反應(yīng)。在此期間，將板翻轉(zhuǎn)或用磁石使落至 液滴底部的磁珠移動(dòng)至板上部，對(duì)磁珠進(jìn)行攪拌。使磁珠移動(dòng)至第3列的清洗液中后，對(duì)磁珠進(jìn)行例如5分鐘的攪拌·清洗。使磁珠移動(dòng)至第4列的標(biāo)記抗體液滴中后，進(jìn)行例如室溫下10分鐘至60分鐘的 抗原-抗體反應(yīng)。在此期間，將板翻轉(zhuǎn)或用磁石使落至液滴底部的磁珠移動(dòng)至板上部，對(duì)磁 珠進(jìn)行攪拌。使磁珠移動(dòng)至第5列的清洗液中后，對(duì)磁珠進(jìn)行例如5分鐘的攪拌·清洗。使磁珠向第6列的發(fā)色液滴移動(dòng)后，進(jìn)行對(duì)應(yīng)于標(biāo)記化合物的發(fā)色或化學(xué)發(fā)光反 應(yīng)。當(dāng)磁珠妨礙檢測(cè)時(shí)，停止反應(yīng)時(shí)，也可使磁珠向第7列移動(dòng)，測(cè)定第6列液滴的發(fā)色或 化學(xué)發(fā)光。如此可使用抗體結(jié)合磁珠進(jìn)行反應(yīng)。在圖5中示出了在1種樣品中檢測(cè)出多個(gè)抗原的方法的實(shí)例。其中，示出了從1 種分析物同時(shí)檢測(cè)出3種抗原的實(shí)例。
11
在第1列的液滴保持用突起1、2、3中點(diǎn)加對(duì)抗原A、B、C具有特異性的抗體磁珠。事先在第2列點(diǎn)加分析物樣品，在第3列點(diǎn)加清洗液(0. 1% Triton X_100、150mM NaCl、IOmM磷酸鈉-鉀緩沖液，pH7. 0)，在第4列點(diǎn)加標(biāo)記抗體(其為對(duì)目的抗原具有特異 性，與固定于磁珠的抗體識(shí)別不同的抗原表位的抗體。是進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記、過氧化物酶 標(biāo)記、熒光色素標(biāo)記或金粒子等標(biāo)記的抗體)，在第5列點(diǎn)加清洗液，在第6列點(diǎn)加發(fā)色液。 需說明的是，形成點(diǎn)的各溶液的組成只是例示，并無限定于上述組成的意圖。使第1列的液滴保持用突起1的抗體磁珠移動(dòng)至第2列的分析物樣品液滴。進(jìn)行 例如室溫下10分鐘至60分鐘的反應(yīng)使抗原A結(jié)合于磁珠1后，使磁珠移動(dòng)至第3列的清 洗液滴1。使第1列的液滴保持用突起2的抗體磁珠移動(dòng)至第2列的分析物樣品液滴。進(jìn)行 例如室溫下10分鐘至60分鐘的反應(yīng)使抗原B結(jié)合于磁珠2后，使磁珠移動(dòng)至第3列的清 洗滴2。使第1列的液滴保持用突起3的抗體磁珠移動(dòng)至第2列的分析物樣品液滴。進(jìn)行 例如室溫下10分鐘至60分鐘的反應(yīng)使抗原C結(jié)合于磁珠3后，使磁珠移動(dòng)至第3列的清 洗滴3。使磁珠1、2、3分別移動(dòng)至第4列的標(biāo)記抗體液滴1、2、3后，進(jìn)行例如室溫下10分 鐘至60分鐘的抗原-抗體反應(yīng)。使磁珠1、2、3分別移動(dòng)至第5列的清洗液滴1、2、3。使磁珠1、2、3分別移動(dòng)至第6列的發(fā)色液滴1、2、3，進(jìn)行一定時(shí)間的發(fā)色或化學(xué)發(fā) 光反應(yīng)，用檢測(cè)器測(cè)定得到的發(fā)色或發(fā)光。這樣可實(shí)施檢測(cè)多個(gè)抗原的方法。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。如圖2所示，切下塑料板(127mmX86mmX15mm)50的底面，在此嵌入薄層玻璃板 (厚度0. 15mm) 10或塑料板(厚度0. 15mm)。由于小型釹磁石的磁力不足，所以將板底面換
成薄板。在上述薄層玻璃板上壓合石蠟樹脂膜(商品名parafilm(4 > ^ ))11。對(duì) 于石蠟樹脂膜而言，在與伸縮方向垂直的方向形成有細(xì)微的溝，此溝在磁珠移動(dòng)時(shí)發(fā)揮導(dǎo) 向作用。石蠟樹脂膜使得郁金香形突起等的制備容易。在上述石蠟樹脂膜上預(yù)先使用治具形成所需要數(shù)量的郁金香形突起。石蠟樹脂膜 上所形成的本突起(本突起)是使磁珠的清洗、酶反應(yīng)等所使用的溶液穩(wěn)定保持于膜上的 〃字形突起。參照?qǐng)D2。具有1 16列、A行 H行的郁金香形突起。石蠟樹脂膜對(duì)于純 水的接觸角為112°。需說明的是，石蠟樹脂、特氟隆樹脂、有機(jī)硅樹脂、玻璃板、丙烯酸酯板和銅板對(duì)于 純水的接觸角和對(duì)于0. 1% Triton X 100 (表面活性劑)水溶液的接觸角如下表1所示。測(cè)定如下進(jìn)行。通過顯微鏡對(duì)將3μ 1純水在各種材料表面靜置5分后的液滴狀 態(tài)進(jìn)行觀察。測(cè)定液滴的高度A和與材料表面接觸的邊的長度B，通過以下計(jì)算式求出水的 接觸角θ。
[數(shù)1]
權(quán)利要求
反應(yīng)治具，其特征在于基板一側(cè)的表面排列設(shè)置有多個(gè)突起狀圍壁，所述突起狀圍壁至少具有1個(gè)凹口部，且在內(nèi)部具有可保持液滴的空間，并且所述基板表面的至少保持所述液滴的面對(duì)于純水的接觸角為90～150°的范圍。
2.權(quán)利要求1的反應(yīng)治具，其中，所述多個(gè)突起狀圍壁至少部分或全部縱橫地排列設(shè)置。
3.權(quán)利要求1或2的反應(yīng)治具，其中，所述突起狀圍壁的液滴保持用空間可保持 0. 5 μ L 200 μ L范圍的量的液滴。
4.權(quán)利要求1 3中任1項(xiàng)的反應(yīng)治具，其中，突起狀圍壁具有2個(gè)或3個(gè)凹口部，所 述凹口部開口的間隔為0.5 IOmm的范圍。
5.權(quán)利要求1 4中任1項(xiàng)的反應(yīng)治具，其中，所述基板表面由石蠟樹脂、特氟隆樹脂 或有機(jī)硅樹脂構(gòu)成。
6.權(quán)利要求1 4中任1項(xiàng)的反應(yīng)治具，其中，所述基板具有由石蠟樹脂、特氟隆樹脂 或有機(jī)硅樹脂構(gòu)成的涂層。
7.權(quán)利要求1 6中任1項(xiàng)的反應(yīng)治具，其中，使用所述反應(yīng)治具以在各突起狀圍壁的 液滴保持用空間中，將相同或不同種類溶液的液滴不與置于其它突起狀圍壁的液滴保持用 空間部分的液滴混合地保持。
8.權(quán)利要求1 7中任1項(xiàng)的反應(yīng)治具，其中，使用所述反應(yīng)治具以在屬于同一橫列的 突起狀圍壁的液滴保持用空間中保持同一種類溶液的液滴。
9.權(quán)利要求7或8的反應(yīng)治具，其中，所述溶液為含有表面張力降低試劑的反應(yīng)液或清 洗液。
10.權(quán)利要求1 9中任1項(xiàng)的反應(yīng)治具，所述反應(yīng)治具進(jìn)一步具有覆蓋具有突起狀圍 壁的表面的覆蓋部件，且進(jìn)一步具有為所述覆蓋部件所覆蓋的空間提供濕氣的保濕部件。
11.反應(yīng)方法，所述反應(yīng)方法包括通過使用權(quán)利要求1 10中任1項(xiàng)的反應(yīng)治具，在與所述基板的具有突起狀圍壁的表面相反一側(cè)的表面使用磁石，使固定于磁珠上的 物質(zhì)在上述突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的含有表面張力降低試劑的溶液的液滴 中按順序移動(dòng)，從而進(jìn)行反應(yīng)和/或清洗。
12.cDNA的合成方法，所述合成方法包括使用1個(gè)縱列至少設(shè)置有2個(gè)突起狀圍壁的權(quán) 利要求1 10中任1項(xiàng)的反應(yīng)治具，在所述2個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間中按順序分別保持含有表面張力降低試劑 的細(xì)胞溶解用溶液和cDNA合成用溶液的液滴， 在與基板的具有突起狀圍壁的表面相反一側(cè)的表面使用磁石，使固定于磁珠上的mRNA 在所述2個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的溶液中按順序移動(dòng)， 制得固定于磁珠上的cDNA。
13.權(quán)利要求12的方法，其中，使用多個(gè)縱列中至少設(shè)置有2個(gè)突起狀圍壁的反應(yīng)治具，各橫列的突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的溶液為同一種類的溶液， 固定于縱列移動(dòng)的磁珠上的mRNA為不同種類的mRNA， 作為固定于磁珠上的cDNA，制得多個(gè)不同種類的cDNA。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中，所述反應(yīng)治具在1個(gè)縱列中至少設(shè)置有4個(gè)突起狀圍壁，所述4個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間按順序分別保持細(xì)胞溶解用溶液、mRNA清洗用 溶液、cDNA合成用溶液和cDNA清洗用溶液的液滴，將固定于磁珠上的mRNA在所述4個(gè)突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的溶液中按 順序移動(dòng)。
15.權(quán)利要求11 14中任1項(xiàng)的方法，其中，將具有突起狀圍壁的表面朝下來使用所 述反應(yīng)治具。
全文摘要
本發(fā)明提供每次操作不需要清洗或更換移動(dòng)溶液等所使用的器具，可平行進(jìn)行多種反應(yīng)和清洗操作的裝置和方法。本發(fā)明提供如下反應(yīng)治具，其中基板一側(cè)的表面排列設(shè)置有多個(gè)突起狀圍壁，所述突起狀圍壁至少具有1個(gè)凹口部，且在內(nèi)部具有可保持液滴的空間，并且所述基板表面的至少保持所述液滴的面對(duì)于純水的接觸角為90～150°的范圍。本發(fā)明還提供如下反應(yīng)方法，所述方法包括使用所述反應(yīng)治具，在與所述基板的具有突起狀圍壁的表面相反一側(cè)的表面使用磁石，使固定于磁珠上的物質(zhì)在所述突起狀圍壁的液滴保持用空間所保持的含有表面張力降低試劑的溶液的液滴中按順序移動(dòng)，從而進(jìn)行反應(yīng)和/或清洗。
文檔編號(hào)B08B3/04GK101939427SQ200980102879
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者磯部正治, 黑澤信幸 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人富山大學(xué)