專利名稱：：具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽及編碼其的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。
背景技術(shù)：
：纖維素是單糖葡萄糖通過￠-1,4-鍵共價連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和￠-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機(jī)位置消化纖維素聚合物，使其暴露于纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶繼而從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的^-I,4-連接的葡萄糖二聚體。P-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將含木素纖維素原料(lignocellulosicfeedstock)轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認(rèn)為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。WO2005/074647公開了來自土生梭抱殼(Thielaviaterrestris)的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。WO2005/074656公開了來自橙橘嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。W02007/089290公開了來自里氏木霉(Trichodermareesei)的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。WO2009/085935；WO2009/085859；W02009/085864；和W02009/085868公開了來自嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)的的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。本領(lǐng)域中有對于供用于降解纖維素材料、具有改善性質(zhì)的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的需要。本發(fā)明提供了具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的編碼所述多肽的多核苷酸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其具有與SEQIDNO:2,SEQIDN0:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽至少60%序列同一性；與SEQIDN0:4的成熟多肽至少65%序列同一性；與SEQIDN0:18的成熟多肽至少70%序列同一性；與SEQIDNO:10,SEQIDN0:16，或SEQIDN0:22的成熟多肽至少75%序列同一性；與SEQIDNO:8的成熟多肽至少80%序列同一性；與SEQIDNO:14的成熟多肽至少85%序列同一性；或者與SEQIDNO:20的成熟多肽至少90%序列同；性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等-高，高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDN0:1，SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDN0:11,或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；在高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:13,SEQIDN0:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或者在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交i)SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸具有與SEQIDN0:1,SEQIDN0:5，或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列至少60%序列同一性；與SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列至少65%序列同一性；與SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列至少70%序列同一性；與SEQIDN0:9,SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列至少75%序列同一性；與SEQIDN0:7的成熟多肽編碼序列至少80%序列同一性；與SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列至少85%序列同一性；或者與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列至少90%序列同一性；或者其cDNA序列；(d)變體，其包含SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的成熟多肽的一個或多個(幾個)取代，缺失，和/或插入；和(e)(a)，(b)，(C)，或⑷的多肽具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體，重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生所述多肽的方法。本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在本發(fā)明具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在本發(fā)明具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化所述纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料經(jīng)在本發(fā)明具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物的糖化。本發(fā)明還涉及編碼信號肽的多核苷酸，所述信號肽包含或組成為(consistingof)SEQIDNO:2的氨基酸I至17，SEQIDNO:4的氨基酸I至19，SEQIDNO:6的氨基酸I至17，SEQIDNO:8的氨基酸I至19，SEQIDNO:10的氨基酸I至21，SEQIDNO:12的氨基酸I至24，SEQIDNO:14的氨基酸I至16，SEQIDNO:16的氨基酸I至18，SEQIDNO:18的氨基酸I至22，SEQIDNO:20的氨基酸I至16，或SEQIDNO:22的氨基酸I至19，其可操作地連接于編碼蛋白的基因；涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體，表達(dá)載體，和重組宿主細(xì)胞；和產(chǎn)生蛋白的方法。圖I顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61J多肽的基因的不含內(nèi)含子的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。含有內(nèi)含子的全長基因組DNA序列示于SEQIDNO:I，而推導(dǎo)的氨基酸序列示于SEQIDNO:2。圖2顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61K多肽的基因的不含內(nèi)含子的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。含有內(nèi)含子的全長基因組DNA序列不于SEQIDNO:3,而推導(dǎo)的氨基酸序列不于SEQIDNO:4。圖3顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61L多肽的基因的不含內(nèi)含子的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。含有內(nèi)含子的全長基因組DNA序列不于SEQIDNO:5,而推導(dǎo)的氨基酸序列不于SEQIDNO:6。圖4顯示在不同濃度的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61J，GH61K和GH61L多肽的存在下用里氏木霉纖維素酶混合物水解經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)。圖5顯示pSMail97的限制圖。圖6顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61M多肽的基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDN0:7和8)。圖7顯示在不同濃度的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61M多肽的存在下用里氏木霉纖維素酶混合物水解經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)。圖8顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61N多肽的基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDN0:9和10)。圖9顯示在不同濃度的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61N多肽的存在下用里氏木霉纖維素酶混合物水解經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)。圖10顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH610多肽的基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDN0:11和12)。圖11顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61P多肽的基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:13和14)。圖12顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61R多肽的基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:15和16)。圖13顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61S多肽的基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:17和18)。圖14顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61T多肽的基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:19和20)。圖15顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61U多肽的基因的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:21和22)。定義具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽術(shù)語“具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽”意指增強(qiáng)具有纖維素分解活性的酶水解纖維素材料的GH61。就本發(fā)明而言，通過測量由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料所導(dǎo)致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強(qiáng)活性l_50mg總蛋白/gPCS中的纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的蛋白質(zhì)，在50°C歷時1-7天，與用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強(qiáng)活性(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素)所進(jìn)行的對照水解相比。在一個優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米曲霉(Aspergillusoryzae)P-葡糖苷酶(根據(jù)W002/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白重量的2-3%的煙曲霉(Aspergillusfumigatus)￠-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLASTI.5L(NovozymesA/S，Bagsvaerd，Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽通過降低達(dá)到相同水解程度所需的纖維素分解酶的量而增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少I.01倍，更優(yōu)選至少I.05倍，更優(yōu)選至少I.10倍，更優(yōu)選至少I.25倍，更優(yōu)選至少I.5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，并且最優(yōu)選至少20倍。本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO10,SEQIDNO12,SEQIDNO14,SEQIDNO16,SEQIDNO18,SEQIDN0:20，或SEQIDNO22的成熟多肽的纖維素分解增強(qiáng)活性的至少20%，例如，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，和至少100%。家族61糖苷水解酶術(shù)語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.,和BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。纖維素分解酶或纖維素酶術(shù)語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、3-葡糖苷酶或其組合。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括(I)測量總纖維素分解活性，和(2)測量單獨(dú)的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlookforcellulaseimprovement-Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452-481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括WhatmanNo.I濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用WhatmanNo.I濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurementofcellulaseactivities,PureAppI.Chem.59:257-68)確立的。就本發(fā)明而言，纖維素分解酶活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解的增加來確定l_20mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素在50°C進(jìn)行3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解相比較。典型條件為1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH5，ImMMnSO4,50°C，72小時，通過AMINEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)進(jìn)行糖分析。內(nèi)切葡聚糖酶術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指內(nèi)切-1，4-(1,3;1，4)-P-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-3-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.I.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-^-D-糖苷鍵、混合的P-I,3葡聚糖例如谷類P-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的P-1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過測量底物粘度的減少或由還原糖測定法(Zhang等，2006，BiotechnologyAdvances24:452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)Ghose,1987,PureandAppI.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C，使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。纖維二糖水解酶術(shù)語“纖維二糖水解酶”意指1，4-P-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(I,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.I.91)，其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含￠-1,4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-P-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri,1997，Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,TrendsinBiotechnology15:160-167;Teeri等，1998，Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù)Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279;vanTilbeurgh等，1982，F(xiàn)EBSLetters,149:152-156;vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters,187:283-288;以及Tomme等，1988，Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法確定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，可采用Lever等的方法來評價玉米稻桿中的纖維素水解,而vanTilbeurgh等和Tomme等的方法可用于確定對突光二糖衍生物4-甲基傘形基-D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl-&-D-Iactoside)的纖維二糖水解酶活性。P-葡糖苷酶術(shù)語“3-葡糖苷酶”意指P-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.I.21)，其催化末端非還原3-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放P-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，￠-葡糖苷酶活性是根據(jù)由Venturi等,2002,Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66所述的基本步驟確定的。一單位的P-葡糖苷酶定義為在25°C，pH4.8從作為底物的ImM對硝基苯基-P-D-葡糖吡喃糖苷在含有0.01%TWEEN20的50mM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生I.0微摩爾的對硝基苯酚陰離子。半纖維素分解酶或半纖維素酶術(shù)語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,2003，6(3):219-228)。半纖維素酶是植物生物質(zhì)降解中的關(guān)鍵成分。半纖維素酶的實(shí)例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支化和直鏈多糖的混雜集團(tuán)，這些多糖通過氫鍵鍵合于植物細(xì)胞壁中的纖維素微纖維，將其交聯(lián)為魯棒(robust)的網(wǎng)絡(luò)。半纖維素亦共價地附于木質(zhì)素，與纖維素一同形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變的結(jié)構(gòu)和組織形式需要許多酶的協(xié)同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸側(cè)基酯連接的糖酯酶(CE)。這些催化模塊，基于其一級結(jié)構(gòu)的同源性，可指派為以數(shù)字標(biāo)記的GH和CE家族。一些家族，具有總體上類似的折疊，可進(jìn)一步歸類為宗族(clan)，以字母標(biāo)記(例如，GH-A)。最具信息性和最新的這些和其他糖活性酶的分類可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫獲得。半纖維素分解酶活性可根據(jù)Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752測量。木聚糖降解活性或木聚糖分解活性術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括(I)測定總木聚糖分解活性，和(2)測定單獨(dú)的木聚糖分解活性(例如，內(nèi)切木聚糖酶、￠-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、a-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和a-葡糖醒酸酯酶(a-glucuronylesterase))。最近在木聚糖分解酶測定法的進(jìn)展總結(jié)于幾個公開文獻(xiàn)中，包括Biely和Puchard,Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune,FEBSLetters580(19):4597-4601;Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997,Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta—D—xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375-381?？偰揪厶墙到饣钚钥赏ㄟ^確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。最常見的總木聚糖分解活性測定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992，Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在0.01%TRITONX-100和200mM磷酸鈉緩沖液PH6在37°C中確定。一單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6從作為底物的0.2%AZCL阿拉伯木聚糖在200mM磷酸鈉pH6緩沖液中每分鐘產(chǎn)生I.0微摩爾的天青精。就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述典型條件下造成的樺木木聚糖(SigmaChemicalCo.，Inc.，St.Louis,MO,USA)水解的增加來確定的1ml反應(yīng)，5mg/ml底物(總固形物),5mg木聚糖分解蛋白/g底物，50mM乙酸鈉，pH5,50°C,24小時，如Lever,1972，Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用對輕基苯甲酸酸餅(PHBAH)測定法進(jìn)行糖分析。木聚糖酶術(shù)語“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1，4-P-D-木糖苷連接的內(nèi)水解的1，4-&-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.I.8)。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C在0.01%TRITONX-100和200mM磷酸鈉緩沖液PH6中進(jìn)行確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6從200mM磷酸鈉pH6緩沖液中的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物每分鐘產(chǎn)生I.0微摩爾的天青精(azurine)。^-木糖苷酶術(shù)語“^-木糖苷酶”意指P-D木糖苷木糖水解酶(P-D-xyIosidexylohydrolase)(E.C.3.2.I.37)，其催化短3(I—4)木寡糖(xylooIigosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個單位的￠-木糖苷酶定義為在40°C，pH5從ImM對硝基苯基-P-D-木糖苷作為底物在含有0.01%TWEEN20的IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生I.0微摩爾對硝基苯酚陰離子。乙酰木聚糖酯酶術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.I.I.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶恰⒁阴；咎?、乙酰化葡萄糖、乙酸a-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸對硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸對硝基苯酯作為底物，在含有0.01%TWEEN20的50mM乙酸鈉pH5.0中確定的。一個單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放I微摩爾對硝基苯酹陰離子(p-nitrophenolateanion)的酶量。阿魏酸酯酶術(shù)語“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)”意指4_輕基_3_甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.I.I.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、輕基肉桂酸酯酶(hydroxycinnamoylesterase)>FAE-III>肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE_I或FAE-II。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶是使用50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的阿魏酸酯酶活性等于能夠在pH5，25°C每分鐘釋放出I微摩爾對硝基苯酚陰離子的酶量。a-葡糖醛酸糖苷酶術(shù)語“a-葡糖醛酸糖苷酶”意指a_D_葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolase)(EC3.2.I.139),其催化a-D_葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，a-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)deVries,1998,J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個單位的a_葡糖醒酸糖苷酶等于能夠在pH5，40°C每分鐘釋放出I微摩爾葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶術(shù)語“a_L_阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指a_L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC3.2.I.55)，其催化對a-L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)-鍵的a-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、a-阿拉伯糖苷酶、a-L-阿拉伯糖苷酶、a-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或a-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200V-I中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中5mg的中等粘性小麥阿拉伯木聚糖(MegazymeInternationalIreland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在4CTC進(jìn)行30分鐘，接著通過AMINEX.HPX-87H柱層析(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析來確定的。纖維素材料術(shù)語“纖維素材料”意指包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素,其次最豐富的是半纖維素,而第三是果膠。次生細(xì)胞壁(secondarycellwall)在細(xì)胞停止生長后產(chǎn)生,其同樣含有多糖并通過共價交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強(qiáng)。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈3_(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵鍵合，其幫助穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman編),pp.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.;Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16;Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695-719;Mosier等,,1999,RecentProgressinBioconversionofLignocelIulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主編，Volume65，pp.23-40，Springer-Verlag,NewYork)。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。在一個方面，纖維素材料是草本材料。在另一個方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個方面，纖維素材料是廢紙。在另一個方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個方面，纖維素材料是玉米秸桿。在另一個方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個方面，纖維素材料是橙皮。在另一個方面，纖維素材料是稻桿。在另一個方面，纖維素材料是麥桿。在另一個方面，纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個方面,纖維素材料是芒草屬(miscanthus)。在另一個方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面，纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一個方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個方面，纖維素材料是棉線頭(cottonlinter)。在另一個方面，纖維素材料是無定形的磷酸處理的纖維素。在另一個方面，纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以直接使用或進(jìn)行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，如本文所述。在一個優(yōu)選的方面，預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理的玉米秸桿術(shù)語“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸桿”意指通過用熱和稀硫酸處理的源自玉米秸桿的纖維素材料。含木聚糖材料術(shù)語“含木聚糖材料”意指任何包含含有3-(1-4)連接木糖殘基骨架的植物細(xì)胞壁多肽的材料。陸生植物的木聚糖是具有￠-(14)-D-吡喃木糖骨架、具有短糖鏈分支的雜聚物。其包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、L-阿拉伯糖和/或多種寡糖，由D-木糖、L-阿拉伯糖，D-或L-半乳糖和D-葡萄糖組成。木聚糖類型的多糖可分為同木聚糖(homoxylan)和雜木聚糖(heteroxylan),其包括葡糖醒酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和復(fù)合雜木聚糖(complexheteroxylan)參見例如Ebringerova等，2005，Adv.Polym.Sci.186:167。在本發(fā)明的方法中，可使用任何含木聚糖材料。在一個優(yōu)選的方面，所述含木聚糖材料是木素纖維素。分離的或純化的術(shù)語“分離的”和“純化的”意指從與其天然聯(lián)系的至少一種組分移出的多肽或多核苷酸。舉例而言，多肽如通過SDS-PAGE測定的，可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，或至少95%純，而多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，可為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，或至少95%純。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:2的氨基酸I至17是信號肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1_6),成熟多肽是SEQIDN0:2的氨基酸18至246。在另一個方面,根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:4的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO:4的氨基酸20至334。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:6的氨基酸I至17是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDN0:6的氨基酸18至227。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:8的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO:8的氨基酸20至223。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:10的氨基酸I至21是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO:10的氨基酸22至368。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:12的氨基酸I至24是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO:12的氨基酸25至330。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:14的氨基酸I至16是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO:14的氨基酸17至236。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:16的氨基酸I至18是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO:16的氨基酸19至250。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:18的氨基酸I至22是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO:18的氨基酸23至478。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:20的氨基酸I至16是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO:20的氨基酸17至230。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:22的氨基酸I至19是信號肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDNO:22的氨基酸20至257。本領(lǐng)域中已知宿主細(xì)胞可產(chǎn)生兩種或更多種由相同多核苷酸表達(dá)的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:I的核苷酸I至51編碼信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，見上)，成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:1的核苷酸52至875。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:I的核苷酸52至875中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:3的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:3的核苷酸58至1250。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:3的核苷酸58至1250中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:5的核苷酸I至51編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:5的核苷酸52至795。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDN0:5的核苷酸52至795中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:7的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:7的核苷酸58至974。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:7的核苷酸58至974中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:9的核苷酸I至63編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:9的核苷酸64至1104。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:9的核苷酸64至1104中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:11的核苷酸I至72編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:11的核苷酸73至990。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:11的核苷酸73至990中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:13的核苷酸I至48編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:13的核苷酸49至1218。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:13的核苷酸49至1218中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:15的核苷酸I至54編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:15的核苷酸55至930。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:15的核苷酸55至930中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:17的核苷酸I至66編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:17的核苷酸67至1581。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:17的核苷酸67至1581中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:19的核苷酸I至48編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:19的核苷酸49至865。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:19的核苷酸49至865中的cDNA序列。在另一個方面，根據(jù)預(yù)測SEQIDNO:21的核苷酸I至57編碼信號肽的SignalP程序，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:21的核苷酸58至1065。在另一個方面，成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:21的核苷酸58至1065中的cDNA序列。序列同一性參數(shù)“序列同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277),優(yōu)選3.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一I"生(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一丨生百分比，并計算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上文)，優(yōu)選3.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為同一性百分比，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))片段術(shù)語“片段”意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有纖維素分解增強(qiáng)活性。在一個方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽的至少190個氨基酸殘基，例如至少200個氨基酸殘基，或至少210個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:4的成熟多肽的至少265個氨基酸殘基，例如至少280個氨基酸殘基，或至少295個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:6的成熟多肽的至少180個氨基酸殘基，例如至少190個氨基酸殘基，或至少200個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:4的成熟多肽的至少265個氨基酸殘基，例如至少280個氨基酸殘基，或至少295個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:8的成熟多肽的至少170個氨基酸殘基，例如至少180個氨基酸殘基，或至少190個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:10的成熟多肽的至少305個氨基酸殘基，例如至少320個氨基酸殘基，或至少335個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:12的成熟多肽的至少255個氨基酸殘基，例如至少270個氨基酸殘基，或至少285個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:14的成熟多肽的至少190個氨基酸殘基，例如至少200個氨基酸殘基，或至少210個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:16的成熟多肽的至少200個氨基酸殘基，例如至少210個氨基酸殘基，或至少220個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:18的成熟多肽的至少390個氨基酸殘基，例如至少410個氨基酸殘基，或至少430個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDN0:20的成熟多肽的至少180個氨基酸殘基，例如至少190個氨基酸殘基，或至少200個氨基酸殘基。在另一個方面，片段含有SEQIDNO:22的成熟多肽的至少210個氨基酸殘基，例如至少220個氨基酸殘基，或至少230個氨基酸殘基。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”意指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。在一個方面，亞序列含有SEQIDNO:I的成熟多肽編碼序列的至少560個核苷酸，例如至少600個核苷酸,或至少630個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的至少795個核苷酸，例如至少840個核苷酸，或至少885個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:5的成熟多肽編碼序列的至少540個核苷酸，例如至少570個核苷酸,或至少600個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列的至少510個核苷酸，例如至少540個核苷酸，或至少570個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDN0:9的成熟多肽編碼序列的至少915個核苷酸,例如至少960個核苷酸,或至少1005個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面,亞序列含有SEQIDN0:11的成熟多肽編碼序列的至少765個核苷酸，例如至少810個核苷酸，或至少855個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的至少795個核苷酸，例如至少840個核苷酸，或至少885個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列的至少570個核苷酸，例如至少600個核苷酸，或至少630個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:15的成熟多肽編碼序列的至少600個核苷酸,例如至少630個核苷酸,或至少660個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列的至少1170個核苷酸，例如至少1230個核苷酸，或至少1290個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列的至少540個核苷酸，例如至少570個核苷酸，或至少600個核苷酸。在另一個優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列的至少630個核苷酸，例如至少660個核苷酸，或至少690個核苷酸。等位變體(allelicvariant):術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。編碼序列術(shù)語“編碼序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或其他起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。cDNA:術(shù)語“cDNA”意指能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指分離自天然存在的基因的，或受修飾以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段的,或是合成的單鏈或雙鏈的核酸分子。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語“調(diào)控序列”意指對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接。可操作地連接術(shù)語“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞“宿主細(xì)胞”意指任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的任何后代，所述后代由于在復(fù)制中發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不完全相同。變體術(shù)語“變體”意指具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，其包含改變，即在一個或多個(幾個)位置的取代、插入和/或缺失一個或多個(幾個)氨基酸殘基。取代意指用別的氨基酸取代占據(jù)某位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指鄰接于占據(jù)某位置的氨基酸添加一個或多個(幾個)氨基酸，例如1-5個氨基酸。發(fā)明詳述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽本發(fā)明涉及具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其具有與SEQIDNO:2,SEQIDNO:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽至少60%序列同一性；與SEQIDN0:4的成熟多肽至少65%序列同一性；與SEQIDN0:18的成熟多肽至少70%序列同一性；與SEQIDNO:10,SEQIDN0:16，或SEQIDN0:22的成熟多肽至少75%序列同一性；與SEQIDNO:8的成熟多肽至少80%序列同一性；與SEQIDNO:14的成熟多肽至少85%序列同一性；或者與SEQIDNO:20的成熟多肽至少90%序列同；性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等-高，高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDN0:1，SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDN0:11,或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；在高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:13,SEQIDN0:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或者在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交i)SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸具有與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5，或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列至少60%序列同一性；與SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列至少65%序列同一性；與SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列至少70%序列同一性；與SEQIDN0:9,SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列至少75%序列同一性；與SEQIDN0:7的成熟多肽編碼序列至少80%序列同一性；與SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列至少85%序列同一性；或者與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列至少90%序列同一性；或者其cDNA序列；(d)變體，其包含SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的成熟多肽的一個或多個(幾個)取代，缺失，和/或插入；和(e)(a)，(b)，(C)，或(d)的多肽具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。本發(fā)明涉及分離的多肽，其具有與SEQIDNO:2,SEQIDN0:6，或SEQIDN0:12的成熟多肽至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%,至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:4的成熟多肽至少65%，例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%,至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:18的成熟多肽至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%,至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:10,SEQIDNO:16，或SEQIDNO:22的成熟多肽至少75%，例如，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:8的成熟多肽至少80%，例如，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:14的成熟多肽至少85%,例如，至少86%,至少87%,至少88%,至少89%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;或者與SEQIDNO:20的成熟多肽至少90%，例如，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性，并具有纖維素分解增強(qiáng)活性。在一個方面，所述多肽與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDN0:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的成熟多肽相差不超過十個氨基酸，例如相差五個氨基酸，相差四個氨基酸，相差三個氨基酸，相差兩個氨基酸，和相差一個氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含或組成為SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDN0:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的氨基酸序列，或其等位變體；或?yàn)樗鼈兙哂欣w維素分解增強(qiáng)活性的片段。在另一個方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:2，SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDN0:20，或SEQIDN0:22的成熟多肽。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸18至246。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDN0:4的氨基酸20至334。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:6的氨基酸18至227。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDN0:8的氨基酸20至223。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:10的氨基酸22至368。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:12的氨基酸25至330。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:14的氨基酸17至236。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:16的氨基酸19至250。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:18的氨基酸23至478。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:20的氨基酸17至230。在另一個優(yōu)選的方面，多肽包含或組成為SEQIDNO:22的氨基酸20至257。本發(fā)明還涉及具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等-高，高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:1,SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,SEQIDN0:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:I,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDN0:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；在高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列，Qi)包含于SEQIDNO:7,SEQIDNO:9，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或者在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交i)SEQIDN0:19的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:I,SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,SEQIDN0:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDN0:19，或SEQIDNO:21的多核苷酸，或其亞序列，以及SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的氨基酸序列，或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的DNA。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法,可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度上應(yīng)為至少14，例如至少25，至少35，或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，所述核酸探針是至少100個核苷酸的長度，例如，至少200個核苷酸，至少300個核苷酸，至少400個核苷酸，至少500個，至少600個核苷酸，至少700個核苷酸，至少800個核苷酸，或至少900個核苷酸的長度。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以檢測相應(yīng)的基因(例如，用32p、3h、35s、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中。可從由這些其它株(strain)制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:I,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，或SEQIDN0:21,或其亞序列同源的克隆或DNA,將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示多核苷酸在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:1，SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，或SEQIDN0:21；SEQIDN0:1,SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,SEQIDN0:7,SEQIDN0:9,SEQIDN0:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列;包含于SEQIDNO:I,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列；其全長互補(bǔ)鏈；或它們的亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個方面，核酸探針是的成熟多肽編碼序列SEQIDN0:1,SEQIDNO:3,SEQIDN0:5,SEQIDN0:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15,SEQIDNO:17,SEQIDN0:19，或SEQIDNO:21，或其cDNA序列。在另一個方面，核酸探針是SEQIDNO:I的核苷酸52至875，SEQIDNO:3的核苷酸58至1250，SEQIDNO:5的核苷酸52至795，SEQIDNO:7的核苷酸58至974，SEQIDN0:9的核苷酸64至1104，SEQIDN0:11的核苷酸73至990，SEQIDNO:13的核苷酸49至1218，SEQIDNO:15的核苷酸55至930，SEQIDNO:17的核苷酸67至1581，SEQIDNO:19的核苷酸49至865，或SEQIDNO:21的核苷酸58至1065。在另一個方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18,SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的多肽，或其成熟多肽；或其片段。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:I,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，或SEQIDN0:21，或其cDNA序列。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)NRRLB-50301中的質(zhì)粒pSMai216中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50301中的質(zhì)粒pSMai21中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50302中的質(zhì)粒pSMAi217中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50302中的質(zhì)粒pSMai217中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50303中的質(zhì)粒pSMai218中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50303中的質(zhì)粒pSMai218中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50300中的質(zhì)粒pSMai213中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50300中的質(zhì)粒pSMai213中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50320中的質(zhì)粒pAG68中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50320中的質(zhì)粒pAG68中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50321中的質(zhì)粒pAG69中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50321中的質(zhì)粒pAG69中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50322中的質(zhì)粒pAG75中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50322中的質(zhì)粒pAG75中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50323中的質(zhì)粒pAG76中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50323中的質(zhì)粒pAG76中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50324中的質(zhì)粒pAG77中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50324中的質(zhì)粒pAG77中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50325中的質(zhì)粒pAG78中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50325中的質(zhì)粒pAG78中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50326中的質(zhì)粒pAG79中含有的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50326中的質(zhì)粒PAG79中含有的成熟多肽編碼區(qū)。對于長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200毫克/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對于非常低和低嚴(yán)格性為25%的甲酰胺、對于中和中-高嚴(yán)格性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格性為50%的甲酰胺,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在45。。(非常低嚴(yán)格性)，在50°C(低嚴(yán)格性)，在55°C(中嚴(yán)格性)，在60°C(中-高嚴(yán)格性)，在65°C(高嚴(yán)格性)，和在70°C(非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)計算的Tni低大約5°C至大約1(TC，在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP_40，IXDenhardt溶液，ImM焦憐酸鈉(sodiumpyrophosphate),ImM憐酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中最終洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計算的Tm低5°C至I(TC的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。本發(fā)明還涉及由多核苷酸編碼的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽，所述多核苷酸具有與SEQIDN0:1,SEQIDN0:5，或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列至少60%，至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%,至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:3的成熟多肽至少65%，例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%,至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:17的成熟多肽至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:9，SEQIDNO:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽至少75%，例如，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:7的成熟多肽至少80%，例如，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%,至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:13的成熟多肽至少85%，例如，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;或者與SEQIDNO:19的成熟多肽至少90%，例如，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,至少99%,或100%的序列同一性。本發(fā)明還涉及SEQIDN0:2,SEQIDNO:4,SEQIDN0:6,SEQIDN0:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDN0:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸的變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為I至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratl^PR.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法,例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的纖維素分解增強(qiáng)活性以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一丨I"生分析來推斷，所述多肽與親本多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.AcadSci.USA86:2152-2156；W095/17413;或W095/22625公開的那些方法來進(jìn)行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、卩遼菌體展不(例如，Lowman等，1991，Biochemistry30:10832-10837;美國專利No.5，223，409；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法允許快速測定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不多于10，例如1，2，3，4，5，6，7，8或9。所述多肽可為雜合多肽，其中一種多肽的一部分融合于另一種多肽的一部分的N端或C端。所述多肽可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽融合于本發(fā)明多肽的N端或C端。通過將編碼另一個多肽的多核苷酸融合于本發(fā)明的多核苷酸來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的控制下。融合蛋白亦可使用內(nèi)蛋白(intein)技術(shù)構(gòu)建，其中融合物在翻譯后產(chǎn)生(Cooper等，1993，EMBOJ.12:2575-2583;Dawson等，1994，Science266:776-779)。融合多肽還可以包含在兩個多肽之間的切割位點(diǎn)。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點(diǎn)，釋放所述兩個多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括，但不限于，公開于Martin等，2003，J.IndMicrobiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等，1995，Biotechnology13:498-503;和Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381；Eaton等，1986，Biochem.25:505-512);Collins_Racie等，1995，Biotechnology13:982-987；Carter等，1989，Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;以及Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48中的位點(diǎn)。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的來源本發(fā)明的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思應(yīng)為多核苷酸編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生。在一個方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。所述多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的革蘭氏陽性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、地芽抱桿菌屬(Geobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、海洋芽抱桿菌屬(Oceanobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、或鏈霉菌屬(Streptomyces)多肽；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如彎曲桿菌屬(Campylobacter)、大腸桿菌(E.coli)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)或脲原體屬(Ureaplasma)多妝。在一個方面，所述多肽是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)多月太。在另一個方面，所述多肽是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個方面，所述多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(StreptomycesIividans)多月太。所述多肽可以是真菌多肽。例如，所述多肽可為酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉屬(Yarrowia)多肽；或絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria^擬錯菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps^Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cyphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、德抱屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、把齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha^根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂抱屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳燕屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在另一個方面，所述多肽是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum^熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、白把齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces^Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)'Thielaviaperuviana、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、Thielaviasubthermophila、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningi)、長枝木霉(TrichodermaIongbrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多妝。在另一個方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼多肽。在另一個方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的棘孢曲霉NRRL8126多肽，例如包含SEQIDNO:2,SEQIDN0:4，SEQIDNO:6，SEQIDN0:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDN0:20，或SEQIDNO:22的成熟多肽的多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的身份。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)?？梢允褂蒙鲜龅奶结槒钠渌鼇碓?，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得所述多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選另一種微生物的基因組DNA或cDNA文庫或混合的DNA樣品來獲得編碼所述多肽的多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)o多核苷酸本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(NASBA)?？梢詮耐辽箧邭ぞ?，或相關(guān)生物體克隆所述多核苷酸，并且因此可為例如所述多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸具有與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5,或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%,至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%,至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,至少99%，或100%;與SEQIDNO:3的成熟多肽至少65%，例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%,至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%,至少99%，或100%;與SEQIDNO:17的成熟多肽至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:9,SEQIDN0:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽至少75%，例如，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:7的成熟多肽至少80%，例如，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;與SEQIDNO:13的成熟多肽至少85%，例如，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%;或者與SEQIDNO:19的成熟多肽至少90%，例如，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%，其編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸對于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:3,SEQIDN0:5，SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDN0:15,SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列存在的多核苷酸，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體所述取代不導(dǎo)致多肽氨基酸序列的改變，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，PoteinExpssionandPurification〗95-107。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在中等-高，高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I,SEQIDNO:3,SEQIDN0:5,SEQIDN0:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:I,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDN0:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；在高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或者在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交i)SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDN0:19的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見上文)，如本文所定義的。在一個方面，所述多核苷酸包含SEQIDNO:I,SEQIDNO:3，SEQIDNO:5,SEQIDN0:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，或SEQIDNO:21，或SEQIDN0:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9,SEQIDN0:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，或SEQIDN0:21的亞序列，其分別編碼SEQIDN0:2,SEQIDNO:4,SEQIDN0:6,SEQIDN0:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，如SEQIDNO:I的核苷酸52至875，SEQIDNO:3的核苷酸58至1250，SEQIDNO:5的核苷酸52至795，SEQIDNO:7的核苷酸58至974，SEQIDN0:9的核苷酸64至1104，SEQIDNO:11的核苷酸73至990，SEQIDNO:13的核苷酸49至1218，SEQIDNO:15的核苷酸55至930，SEQIDNO:17的核苷酸67至1581，SEQIDNO:19的核苷酸49至865，或SEQIDNO:21的核苷酸58至1065。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:I或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒pSMai216，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50301，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:3或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒pSMAi217，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50302,其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:5或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒pSMai218，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50303，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDN0:7或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒pSMai213，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50300，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDN0:9或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒PAG68，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50320，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:11或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒pAG69，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50321，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:13或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒pAG75，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50322，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:15或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒PAG76，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50323，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:17或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒PAG77，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50324，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:19或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒pAG78，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50325，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，所述多核苷酸包含或組成為SEQIDNO:21或其成熟多肽編碼序列，其包含于質(zhì)粒pAG79，所述質(zhì)粒包含于大腸桿菌NRRLB-50326，其中所述多核苷酸編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。可以用許多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸插入載體之前對其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可為啟動子序列，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞所識別的多核苷酸。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下述獲得的啟動子解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)和原核3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)o另夕卜的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria〃于Gilbert等,1980,ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,見上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動子構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉P-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉P-木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動子(一種修飾的啟動子，其來自在曲霉屬中編碼中性a-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在曲霉屬(Aspergilli)中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動子，其來自在黑曲霉中編碼中性a-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在構(gòu)巢曲霉或米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992，Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄。所述終止子序列與編碼所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉a-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時其為對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5’-末端?？墒褂迷谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母a因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細(xì)胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號?？墒褂迷谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995，Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號肽，并且指導(dǎo)所述多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼序列。異源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，可使用指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼序列。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌￠-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽從釀酒酵母a因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母a因子的基因獲得前肽編碼序列。當(dāng)信號肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的N端時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽N端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的N端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKAa-淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。多種核苷酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的多核苷酸?？晒┻x擇的是，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸構(gòu)建體來表達(dá)所述多核苷酸。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外,可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)粒或兩個或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA),或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。所述載體優(yōu)選地含有一個或多個(幾個)選擇性標(biāo)記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是八0￡2、11133、1^似、1^32、1^了3、了1^1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷_5’_憐酸脫羧酶)(orotidine_5’-phosphatedecarboxylase)>sC(硫酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。所述載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的多核苷酸，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，400至10，000堿基對，和800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度序列同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此夕卜，整合元件可以是非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator),其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指能夠使質(zhì)粒或載體體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和PAM^I的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARS1，ARS4，ARSI和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175;W000/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接于一個或多個(幾個)指導(dǎo)本發(fā)明多肽的產(chǎn)生的調(diào)控序列。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使所述構(gòu)建體或載體如前所述作為染色體整體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括親本細(xì)胞的任何后代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)和馬鏈球菌獸痕亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221),電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等,1988,NucleicAcidsRes.16:6127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見,例如,Mazodier等，1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，電穿孑L(參見，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisbyjsDictionaryofTheFungi,第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,見上文)。真菌宿主細(xì)胞可為酵母細(xì)胞。“酵母”用在本文包括產(chǎn)子囊酵母(ascospOTogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.編,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。酵母宿主細(xì)胞可為假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)細(xì)胞。真菌宿主細(xì)胞可為絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文,所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。絲狀真菌宿主細(xì)胞可為枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂裙菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可為泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬臘菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium、租金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、熱帶金抱子菌、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芳:側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢殼、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)>變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。可以將真菌細(xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023，Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474,和Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187，AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983，J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是土生梭孢殼的細(xì)胞。在一個更優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是棘孢曲霉。在一個最優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是土生梭孢殼NRRL8126。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，則其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(yàn)(enzymeassay)可用于測定多肽的活性。多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J._C.Janson和LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。在可選的方面，不回收多肽，而將表達(dá)所述多肽的本發(fā)明宿主細(xì)胞作為多肽的來源。植物本發(fā)明還涉及分離的植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘?，同樣可以將含有所述多肽的植物或植物部分用于改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營養(yǎng)價值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties),或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草(grasses),如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa));飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);寒地型牧草(temperategrass),如Agrostis(翦股穎屬)；和谷類,例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco),豆類(legumes),如羽扇豆(lupins),馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae)),如花椰菜(cauliflower),油菜桿(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(shí)(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber),以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments),如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)外體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外,任何植物細(xì)胞，無論什么組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的子代。表達(dá)多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞將編碼多肽的一個或多個(幾個)表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)構(gòu)建體便利地是包含編碼多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對于鑒定宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，在所述宿主細(xì)胞中整合了表達(dá)構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動子和終止子序列和任選地信號或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，舉例來說，基于期望何時、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對于組成性表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素I和稻肌動蛋白I啟動子(Franck等，1980，Cell21:285-294，Christensen等，1992，PlantMo.Biol.18:675-689；Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的啟動子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878),種子特異性啟動子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動子(Wu等，1998，PlantCellPhysiol.39:885-889),來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，J.ofPlantPhysiol.152:708-711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動子(Chen等，1998，PlantCellPhysiol.39:935-941),來自歐洲油菜(Brassicanapus)的忙藏蛋白napA啟動子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其他種子特異性的啟動子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，啟動子可為葉特異性的啟動子，如來自稻或番爺?shù)膔bcs啟動子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991-1000),小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動子(Mitra和Higgins,1994，PlantMol.Biol.26:85-93)，來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995,Mol.Gen.genet.248:668-674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，PlantMol.Biol.22:573-588)。同樣地，所述啟動子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid),和重金屬。啟動子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動子和編碼多肽的多核苷酸之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動蛋白I基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology8:535；Shimamoto等,1989,Nature338:274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer),是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort,1992，PlantMol.Biol.19:15-38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對于這些植物其他的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鶴粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJ.2:275-281；Shimamoto,1994,CurrentOpin.Biotech.5:158-162；VasiI等,1992,Bio/Technology10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,如由Omirulleh等，1993，PlantMol.Biol.21:415-428所描述的。其他用于依照本公開使用的轉(zhuǎn)化方法包括那些描述于美國專利6，395，966和7，151，204的那些(兩者均通過全文提述并入本文)。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有并入的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩個獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點(diǎn)特異性地切除選擇基因。除了用根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體植物基因型之外，還可通過將具有所述構(gòu)建體的植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物雜交來制備轉(zhuǎn)基因植物。舉例而言，可將編碼多肽的構(gòu)建體通過雜交而引入特定植物品種，而根本無需直接轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因此，本發(fā)明不僅涵蓋從依照本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，還包括此類植物的后裔(progeny)。如用于本文，后裔可指依照本發(fā)明制備的親本植物任何世代的后代(offspring)。此種后裔可包含依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體,或依據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體的一部分。雜交導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因通過將起始種系與供體植物種系交叉授粉而引入植物種系。此類步驟的非限制性實(shí)例進(jìn)一步闡述于美國專利7，151，204號。植物可通過回交轉(zhuǎn)化方法生成。舉例而言，植物包括稱作回交轉(zhuǎn)化的基因型、種系、近交體(inbred)或雜交體(hybrid)的植物?？墒褂眠z傳標(biāo)記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個遺傳背景基因滲入(introgression)至另一個。標(biāo)記協(xié)助的選擇提供了相對于常規(guī)育種的優(yōu)勢，在于其可用于避免由表型變異導(dǎo)致的錯誤。進(jìn)一步，遺傳標(biāo)記可在特定雜交的個體后裔中提供有關(guān)良種種質(zhì)相對程度的數(shù)據(jù)。舉例而言，當(dāng)具有所需性狀但除此之外(otherwise)具有非農(nóng)藝學(xué)所需的遺傳背景的植物與良種親本雜交時，可使用遺傳標(biāo)記來選擇不僅具有該目標(biāo)性狀，還具有相對較大比例所需種質(zhì)的后裔。以此方式，使一種或多種性狀基因滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得到最小化。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。去除或減少纖維素分解增強(qiáng)活性本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸或其部分，所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時，與親本細(xì)胞相比突變的細(xì)胞產(chǎn)生較少的所述多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過減少或消除多核苷酸的表達(dá)來構(gòu)建突變體細(xì)胞。在一個優(yōu)選的方面，所述多核苷酸是失活的。待修飾或失活的多核苷酸可以是，例如，編碼區(qū)或其對活性關(guān)鍵的部分，或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響多核苷酸表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子。可以通過向親本細(xì)胞施以誘變，并且選擇其中已將多核苷酸的表達(dá)減少或消除的突變體細(xì)胞來進(jìn)行多核苷酸的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機(jī)的，可以通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過將所述DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時，通常通過如下方法來進(jìn)行所述誘變在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時溫育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。通過導(dǎo)入、取代或去除基因中的一個或多個(幾個)核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)節(jié)元件可以實(shí)現(xiàn)所述多核苷酸的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領(lǐng)域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以實(shí)現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即，直接在表達(dá)待修飾的多核苷酸的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進(jìn)行所述修飾。消除或減少多核苷酸表達(dá)的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源性多核苷酸。可能理想的是所述缺陷性多核苷酸還編碼標(biāo)記，其可用于選擇其中多核苷酸被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體。在特別優(yōu)選的方面，用選擇性標(biāo)記(如本文所述的那些)來破壞所述多核苷酸。本發(fā)明還涉及在細(xì)胞中抑制具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的表達(dá)的方法，包括施于細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。在一個優(yōu)選的方面，所述dsRNA長度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個雙鏈核苷酸。所述dsRNA優(yōu)選為小干擾RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一個優(yōu)選的方面，所述dsRNA是供抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA(siRNA)。在另一個優(yōu)選的方面，所述dsRNA是供抑制翻譯的微小RNA(miRNA)。本發(fā)明還涉及這樣的雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含SEQIDNO:I,SEQIDN0:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,SEQIDNO:9，SEQIDNO:11，SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，SEQIDNO:17,SEQIDN0:19，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列的一部分，以供在細(xì)胞中抑制所述多肽的表達(dá)。盡管本發(fā)明并不限于任何具體的作用機(jī)制，但dsRNA可進(jìn)入細(xì)胞并導(dǎo)致類似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)包括內(nèi)源mRNA的降解。當(dāng)細(xì)胞暴露于dsRNA時，來自同源基因的mRNA通過稱作RNA干擾(RNAi)的過程受選擇性降解。本發(fā)明的dsRNA可用于基因沉默。在一個方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性降解RNA的方法。該過程可在體外、離體或體內(nèi)實(shí)施。在一個方面，所述dsRNA分子可用于在細(xì)胞、器官或動物中生成功能缺失(loss-of-function)的突變。用于制備和使用dsRNA分子以選擇性降解RNA的方法在本領(lǐng)域是公知的；參見，例如美國專利6489127,6506559,6511824和6515109號。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，其包含編碼多肽的多核苷酸或其調(diào)控序列的破壞或缺失，或沉默的編碼該多肽的基因，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比突變體細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。多肽缺陷型突變體細(xì)胞作為表達(dá)天然和異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)突變體細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語“異源多肽”意指對宿主細(xì)胞不是天然的多肽，例如天然蛋白質(zhì)的變體。宿主細(xì)胞可包含多于一個拷貝的編碼天然或異源多肽的多核苷酸。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。本發(fā)明用于產(chǎn)生基本上無纖維素分解增強(qiáng)活性的產(chǎn)物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)例如酶的產(chǎn)生中是特別令人有興趣的。纖維素分解增強(qiáng)-缺陷細(xì)胞也可以用于表達(dá)在制藥上感興趣的異源蛋白質(zhì)例如激素、生長因子、受體等。術(shù)語“真核多肽”不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等。在另外的方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的基本上無纖維素分解增強(qiáng)活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語“富含”表示所述組合物的纖維素分解增強(qiáng)活性，例如，以至少I.I的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物?；蛘撸鼋M合物可以包含多種酶活性，如一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。可以依照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本領(lǐng)域內(nèi)已知方法使納入所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出本發(fā)明的多肽組合物的優(yōu)選用途。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和其他使用所述組合物的條件可基于本領(lǐng)域已知方法來確定。用途本發(fā)明還涉及下述使用具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽或其組合物的方法。本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在本發(fā)明的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料。在一個方面，所述方法還包括回收經(jīng)降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。纖維素材料的降解或轉(zhuǎn)化的可溶性產(chǎn)物可從不溶性纖維素材料使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)如例如離心、過濾和重力沉降來分離。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括(a)在存在本發(fā)明的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的條件下，用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中在存在本發(fā)明的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的條件下，用酶組合物糖化纖維素材料。在一個方面，纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個方面，所述方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的方法可用于將纖維素材料糖化為可發(fā)酵的糖，并將可發(fā)酵的糖轉(zhuǎn)化為許多有用的物質(zhì)，例如燃料，飲用乙醇，和/或發(fā)酵產(chǎn)物(例如酸、醇、酮、氣體等)。從纖維素材料產(chǎn)生所需的發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預(yù)處理，酶水解(糖化)，和發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料的處理可以使用本領(lǐng)域的常規(guī)過程完成。此外，本發(fā)明的方法能使用經(jīng)配置以依照發(fā)明操作的任何常規(guī)生物質(zhì)處理設(shè)備進(jìn)行。水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時，包括但不限于，分開的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分開的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分開的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖、纖維三糖和戊糖，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，纖維素材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵組合在一個步驟中(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization，Wyman，C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan,J.，和Himmel，M.，1999，Enzymes，energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨(dú)的水解步驟，所述步驟可以在同一個反應(yīng)器中進(jìn)行。HHF過程中的步驟可以在不同的溫度進(jìn)行，即，高溫酶糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進(jìn)行SSF。DMC在一個或多個(幾個)步驟中組合了所有三個過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd，L.R.，Weimer,P.J.，vanZyljW.H.，和Pretorius，I.S.，2002，Microbialcelluloseutilization:Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)o在本文可以理解的是，本領(lǐng)域中任何已知的方法，包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。常規(guī)設(shè)備包括補(bǔ)料分批攪拌反應(yīng)器、分批攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes，GisellaMariaZanin和IvoNeitzel，2003，Optimalcontrolinfed—batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.TechnoIogy25:33-38;Gusakov,A.V.，和Sinitsyn，A.P.，1985，Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:I.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess，Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反應(yīng)器(Ryu，S.K.，和Lee,J.M.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由電磁場引起的強(qiáng)烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov,A.V.，Sinitsyn,A.P.，Davydkin,I.Y.，Davydkin,V.Y.，Protas，0.V.，1996，Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應(yīng)器類型包括流化床、升流層(upflowblanket)、固定化和擠出機(jī)型反應(yīng)器以供水解和/或發(fā)酵。預(yù)處理。在本發(fā)明的方法的實(shí)施中，可以使用本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理過程破壞植物細(xì)胞壁的纖維素材料組分(Chandra等，2007，Substratepretreatment:ThekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosicsAdv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93;Galbe和Zacchi，2007，Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65;Hendriks和Zeeman，2009，Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.100:10-18;Mosier等，2005，F(xiàn)eaturesofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.96:673-686;Taherzadeh和Karimi，2008，Pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:Areview,Int.J.ofMol.Sci.9:1621-1651;Yang和Wyman，2008，Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr2:26-40)。纖維素材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行粒度減小、預(yù)浸泡、潤濕、洗滌和/或調(diào)節(jié)。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機(jī)溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界1120、臭氧和Y輻射預(yù)處理。可以在水解和/或發(fā)酵之前預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進(jìn)行?；蛘?，預(yù)處理可以與酶水解同時進(jìn)行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預(yù)處理在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細(xì)胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可接觸纖維素和其它部分，例如，半纖維素。使纖維素材料通過或穿過反應(yīng)容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應(yīng)時間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140-230°C，更優(yōu)選160-200°C，并且最優(yōu)選170-190°C進(jìn)行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于加入的任何化學(xué)催化劑。蒸汽預(yù)處理的停留時間優(yōu)選1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時間依賴于溫度范圍和加入的任何化學(xué)催化劑。蒸汽預(yù)處理允許相對較高的固體加載量，使纖維素材料在預(yù)處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的物質(zhì)的爆炸放料(explosivedischarge)組合,這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的瑞流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff和Murray,1996,BioresourceTechnology855:1-33;Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628;美國專利申請No.20020164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，切割半纖維素乙?；鶊F(tuán)，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成單糖和寡糖。去除木質(zhì)素至有限的程度。經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前加入催化劑如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可減少時間，降低溫度，增加回收率，并改進(jìn)酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508;Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523;Sassner等,2006,EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)?；瘜W(xué)預(yù)處理術(shù)語“化學(xué)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學(xué)預(yù)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理過程的實(shí)例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)和有機(jī)溶劑預(yù)處理。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是&504)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時間后閃變至大氣壓。可以用很多反應(yīng)器設(shè)計進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流式反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(Duff和Murray,1996，supra;Schell等，2004，BioresourceTechnol.91:179-188;Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。還可以使用堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿預(yù)處理包括，但不限于，石灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85-150V的低溫進(jìn)行石灰預(yù)處理，停留時間從I小時到幾天(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966;Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)。WO2006/110891,WO2006/110899,WO2006/110900和WO2006/110901公開了使用氨的預(yù)處理方法。濕法氧化是熱預(yù)處理，通常在180-20(TC進(jìn)行5-15分鐘，加入氧化劑如過氧化氧或過壓氧(Schmidt和Thomsen,1998，BioresourceTechnol.64:139-151;Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17;Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88:567-574;Matin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預(yù)處理以優(yōu)選1-40%干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)，并且最優(yōu)性5-20%干物質(zhì)進(jìn)行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH經(jīng)常會增加。濕法氧化預(yù)處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達(dá)30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預(yù)處理過程中，在一定的停留時間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(W02006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度如90-100°C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨將纖維素材料處理5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35;Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96:219-231;Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141;Teymouri等，2005，BioresourceTechnol.96:2014-2018)。AFEX預(yù)處理導(dǎo)致纖維素解聚，和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素-糖復(fù)合物得到切割。有機(jī)溶劑預(yù)處理通過用含水乙醇(40-60%乙醇)在160-200°C提取30_60分鐘而將纖維素材料去木質(zhì)素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481;Pan等，2006，BiotechnoIBioeng.94:851-86I;Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。經(jīng)常加入硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理中，去除大部分半纖維素。合適的預(yù)處理方法的其他實(shí)例如Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673-686，和美國已公開的申請2002/0164730所述。在一個方面，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選作為酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸(mildacid)處理進(jìn)行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt%酸，更優(yōu)選0.05至10wt%酸，甚至更優(yōu)選0.I至5wt%酸，并且最優(yōu)選0.2至2.0wt%酸的范圍內(nèi)。酸與纖維素材料接觸，并在優(yōu)選160-220°C，和更優(yōu)選165-195°C范圍內(nèi)的溫度保持?jǐn)?shù)秒到數(shù)分鐘，例如I秒-60分鐘的時間。在另一個方面，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行。在另一個方面，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預(yù)處理過程中纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，更優(yōu)選20-70wt%，并且最優(yōu)性30-60wt%，如約50wt%的量存在。預(yù)處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領(lǐng)域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。機(jī)械預(yù)處理術(shù)語“機(jī)械預(yù)處理”指各種類型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、濕磨或振動球磨)。物理預(yù)處理術(shù)語“物理預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理可涉及輻射(例如，微波輻射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)和它們的組合。物理預(yù)處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個方面，高壓指范圍在優(yōu)選約300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，如約450psi的壓力。在另一個方面，高溫指范圍在約100至約300°C，優(yōu)選約140至約235°C的溫度。在一個優(yōu)選的方面，機(jī)械預(yù)處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進(jìn)行。組合的物理和化學(xué)預(yù)處理可以對纖維素材料進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。例如，預(yù)處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。根據(jù)需要，可以順序或同時進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。還可以包括機(jī)械預(yù)處理。因此，在一個優(yōu)選的方面，對纖維素材料進(jìn)行機(jī)械、化學(xué)或物理預(yù)處理，或者它們的任意組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預(yù)處理術(shù)語“生物預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,Wyman,C.E編,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh和Singh,1993，Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295_333;McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,HimmeI,M.E.,Baker,J.0.,和Overend,R.P.,編，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.,編,Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241;Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;和Vallander和Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。趣化。在水解(也稱作糖化)步驟中,將纖維素材料(例如經(jīng)預(yù)處理的)水解以將纖維素或亦將半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶組合物以酶法在本發(fā)明的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下進(jìn)行。組合物的酶可以順序加入。酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進(jìn)行。在一個方面，水解在適于酶的活性，即對于酶最優(yōu)的條件下進(jìn)行。水解可以以補(bǔ)料分批或連續(xù)的過程進(jìn)行，其中將纖維素材料逐漸補(bǔ)入，例如，含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。合適的處理時間、溫度和PH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長達(dá)200小時，但是通常優(yōu)選進(jìn)行約12至約96小時，更優(yōu)選約16至約72小時，并且最優(yōu)選約24至約48小時。溫度的范圍優(yōu)選約25°C至約70°C，更優(yōu)選約30°C至約65°C，并且更優(yōu)選約40°C至約60°C，特別是約50°C。pH的范圍優(yōu)選約3至約8，更優(yōu)選約3.5至約7，并且最優(yōu)選約4至約6,特別是約pH5。干燥固體含量優(yōu)選約5至約50wt%,更優(yōu)選約10至約40wt%,并且最優(yōu)選約20至約30wt%。酶組合物可包含任何可用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的蛋白。在一個方面，酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，半纖維素酶，棒曲霉素(expansin)，酯酶，漆酶，木質(zhì)素分解酶(ligninolyticenzyme),果膠酶,過氧化物酶,蛋白酶和膨脹素。在另一個方面，所述纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶。在另一個方面，所述半纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(幾種)選自下組的酶乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。在另一個方面，酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶。在另一個方面，酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個方面，酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶和一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個方面，酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素分解酶和半纖維素分解酶。在另一個方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個方面，酶組合物包含纖維二糖水解酶。在另一個方面，酶組合物包含3-葡糖苷酶。在另一個方面，酶組合物包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶。在另一個方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶和3-葡糖苷酶。在另一個方面，酶組合物包含纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶。在另一個方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，和￠-葡糖苷酶。在另一個方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，和￠-葡糖苷酶，和具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在另一個方面，酶組合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一個方面，酶組合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一個方面酶組合物包含阿拉伯聚糖酶(例如a-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一個方面，酶組合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一個方面，酶組合物包含香豆酸酯酶。在另一個方面,酶組合物包含阿魏酸酯酶。在另一個方面，酶組合物包含半乳糖苷酶(例如，a-半乳糖苷酶和/或￠-半乳糖苷酶)。在另一個方面，酶組合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如，a-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一個方面，酶組合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一個方面，酶組合物包含甘露聚糖酶。在另一個方面，酶組合物包含甘露糖苷酶(例如3-甘露糖苷酶)。在另一個方面，酶組合物包含木聚糖酶。在一個優(yōu)選的方面，所述木聚糖酶為家族10木聚糖酶。在另一個方面，酶組合物包含木糖苷酶(例如3-木糖苷酶)。在另一個方面，酶組合物包含棒曲霉素。在另一個方面，酶組合物包含酯酶。在另一個方面，酶組合物包含漆酶。在另一個方面，酶組合物包含木質(zhì)素分解酶。在一個優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是錳過氧化物酶。在另一個優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是木質(zhì)素過氧化物酶。在另一個優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是H2O2產(chǎn)生酶。在另一個方面，酶組合物包含果膠酶。在另一個方面，酶組合物包含過氧化物酶。在另一個方面，酶組合物包含蛋白酶。在另一個方面，酶組合物包含膨脹素。在本發(fā)明的方法中，酶可在發(fā)酵之前或過程中添加，例如在糖化過程中或在發(fā)酵微生物繁殖過程中或之后添加。所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可為野生型蛋白、重組蛋白或野生型蛋白和重組蛋白的組合。舉例而言，一種或多種(幾種)組分可為細(xì)胞的天然蛋白，其用作宿主細(xì)胞以重組表達(dá)一種或多種(幾種)酶組合物的其他組分。酶組合物的一種或多種(幾種)組分可作為單組分產(chǎn)生，然后將其組合以形成酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白制備物的組合。用于本發(fā)明方法中的酶可為任何適用的形式，如例如去除或未去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液，含或不含細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解物，半純化或純化的酶制備物，或宿主細(xì)胞，作為酶的來源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護(hù)的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機(jī)酸來穩(wěn)定化。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的酶和多肽的最適量取決于幾個因素，其包括但不限于，組分纖維素分解酶的混合物、纖維素材料、纖維素材料的濃度、纖維素材料的預(yù)處理、溫度、時間、pH和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。在一個優(yōu)選的方面，纖維素分解酶對于纖維素材料的有效量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg,更優(yōu)選約0.5至約25mg,更優(yōu)選約0.75至約20mg,更優(yōu)選約0.75至約15mg,甚至更優(yōu)選約0.5至約IOmg,并且最優(yōu)選約2.5至約IOmg每g纖維素材料。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽對于纖維素材料的有效量是約0.01至約50.Omg,優(yōu)選約0.01至約40mg,更優(yōu)選約0.01至約30mg,更優(yōu)選約0.01至約20mg,更優(yōu)選約0.01至約IOmg,更優(yōu)選約0.01至約5mg,更優(yōu)選約0.025至約I.5mg,更優(yōu)選約0.05至約I.25mg,更優(yōu)選約0.075至約I.25mg,更優(yōu)選約0.I至約I.25mg,甚至更優(yōu)選約0.15至約I.25mg,并且最優(yōu)選約0.25至約I.Omg每g纖維素材料。在另一個優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽對于纖維素分解酶蛋白的有效量是約0.005至約I.Og,優(yōu)選約0.01至約I.Og,更優(yōu)選約0.15至約0.75g，更優(yōu)選約0.15至約0.5g,更優(yōu)選約0.I至約0.5g,甚至更優(yōu)選約0.I至約0.25g,并且最優(yōu)選約0.05至約0.2g每g纖維素分解酶。具有纖維素分解酶活性或半纖維素分解酶活性的多肽以及其他可用于降解纖維素材料的蛋白/多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(在下文中稱為“具有酶活性的多肽”)可源自或獲得自任何合適的來源，包括細(xì)菌、真菌、酵母、植物或哺乳動物來源。術(shù)語“獲得”在本文中意指該酶可從天然產(chǎn)生該酶作為天然酶的生物分離。術(shù)語“獲得”在本文中還意指該酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重組產(chǎn)生,其中經(jīng)重組產(chǎn)生的酶對于宿主生物是天然的或異源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個或多個(幾個)4^,v4iUfl14,Vt4§RK.ffir^N4H-ffiUfl11卜年禪uffiUfl1fl莊Qffir^NRhd,ffi細(xì)琛錤，!!It評磨，Sd艮UOlPJJpopnasj,!I細(xì)朝義篳，13TsOJ,11細(xì)■醚鍥，11細(xì)柵屮,!I嫌#,1|#锫，1|細(xì)迴籬，1|靼成妒,1|劃齙，1|評，1|細(xì)€蛾，sndjsouejas,!I揋猶，!I細(xì)^HJrlllt嗚,鉺評韙剞，lllt4fe,ll迴靡,Spiqls,1IW義，ll^M^,!!細(xì)ir_rll細(xì)岷墘￥煙，!I岷蘭#,slso^03,m每域，snI-Hoqo*rHI-HLP03vg&JPP-PV1I悔rf^^v§*rHp*rHip3p^p,!I悔塑^,p*rHJ§ds〇7CJ4〇g,11靼崁，llltffi,!!迴途！rll細(xì)每，1|迴罔遛袞怒蛾細(xì)彰劃軺趄迆盤蚺賦銀每蛾1|_秕肢韜1|掛勸劁錤，!I掛勸，1|掛勸墘進(jìn)，1|掛勸繳_梂，1|掛勸劃篳〔Sg〕。怒蛾細(xì)遛歆#愁韜細(xì)遛鉑梃，細(xì)遛_H<,細(xì)遛鉺纏，細(xì)嫌遛鉑^^軺趄迆盤蚺賦喇怒蛾閎1職坩〔S32。怒蛾:_■_細(xì)莆遛pirM細(xì)莆遛贓Wv,細(xì)莆遛蔦饉，細(xì)莆ilpir荽軺趄迆盤蚺賦喇怒蛾閎MTH柃軺銀每<-1職坩〔063S。怒蛾細(xì)志迴肽斕俏槍韜細(xì)志崁，細(xì)H-I迴肽粲躬邀，細(xì)H-I迴肽馨轡軺趄迆盤蚺賦喇怒蛾閎irH柃軺銀每<-1坩〔683S。4<叫餓(cdUIScdI-Hdcd2B11拉IJmM(T3JJassJas11細(xì)遲胸恢，(JaCPeqOAn)11細(xì)H-I蓉，(EnJJaCPeqOSry)11細(xì)H-I奪，(EnJJa:PT3qoAT3J&11細(xì)H-lw,(Ja:PT3q8二aH)11細(xì)',(.Ifncn3qoJAdET3s11細(xì)ffiIIP,(3ieT13s)11細(xì)遲U急，(SUOEOPnaSJ)11細(xì)駕時篳，細(xì)H-lfK^4<Ef蛾細(xì)親趄醫(yī)遲川柵軺趄迆盤蚺賦^^怒蛾(SnnTgqOUeSO)11細(xì)H-I迴肽秕避韜(SnnTgqOae11細(xì)H-Ilf執(zhí),(§TPTtsoJs11細(xì)奪，(3。。8。#。^)11細(xì)翁蘇，(snnTOT3qo:PT3q)11￠^,(snoooooJHoq^11悔徵礙，(snoooooI-Hhndcdq^)1|悔徵癖,(S0O旨〇^0J4S)11細(xì)Itil,(sn88cnda^s)11細(xì)莆！I,(SnnTgS11細(xì)H-I迴肽袞怒蛾細(xì)親趄埕遲川柵軺趄迆盤蚺IT喇蛾閎MT袞孽。怒蛾細(xì)親喇蛾軺趄迆盤蚺IT〔8832。拉制軺鰹磘(覺_韜#{輝掃収掃頰袞)?。縚喇軺_圈發(fā)8如軺盤來右m。盤S胡t想柃軔崧氍稍MS呆IlJ筠騒將掃頰韜拉/issiM/蔣￥魃，水堪Xs/3^<寸SOZZSTZo霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼、卵抱梭抱殼、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼、毛梭抱殼、Thielaviasubthermophila、土生梭孢殼、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、綠色木霉或Trichophaeasaccata多肽。還可以使用具有酶活性的多肽經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可以是重組組分，亦即，通過克隆編碼所述單獨(dú)組分的DNA序列并隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)(參見，例如，W091/17243和W091/17244)產(chǎn)生。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對宿主是異源的)，但該宿主在一定條件下也可以是同源宿主(酶對宿主是天然的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過從發(fā)酵液中提純這樣的蛋白質(zhì)來制備。在一個方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包括商業(yè)性纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)的纖維素分解蛋白制備物的實(shí)例包括，例如，CELLICCtec(NovozymesA/S)>CELLUCLAST(NovozymesA/S)、N0V0ZYM188(NovozymesA/S)、CELLUZYME(NovozymesA/S)、CEREFLO(NovozymesA/S)和ULTRAFLO(NovozymesA/S)，ACCELERASE(GenencorInt.)、LAMINEX(GenencorInt.)、SPEZYMECP(GenencorInt.),ROHAMENT7069ff(RohmGmbH),FlBREZYME_LDI(DyadicInternational,Inc.)>FIBREZYMECI.I5R(DyadicInternational,Inc.)或VISCOSTAR150L(DyadicInternational,Inc.)。所述纖維素酶以固體的約0.001到約5.Owt%,更優(yōu)選固體的約0.025到約4.Owt%,且最優(yōu)選固體的約0.005到約2.Owt%的有效量添加?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(WO91/05039；W093/15186;美國專利5，275，944；W096/02551;美國專利5，536，655，W000/70031,WO05/093050)；Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050)jPThermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶V(W005/093050)?？梢杂糜诒景l(fā)明的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253-263;里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶I，GENBANK登錄號M15665);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22;里氏木霉Cel5A，GENBANK登錄號M19373);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563;GENBANK登錄號AB003694);以及里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994,MolecularMicrobiology13:219-228；GENBANK登錄號Z33381);棘抱曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearch18:5884);川地曲霉(Aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439);胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti^,1990,Gene90:9-14);尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號L29381);灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號MAL515703);粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號XM324477);特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V;嗜熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱(basidiomycete)CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢殼NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢殼NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢殼NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢殼NRRL8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭抱殼NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號M15665)?？捎糜诒景l(fā)明的纖維二糖水解酶的示例包括但不僅限于，里氏木霉纖維二糖水解酶I;里氏木霉纖維二糖水解酶II;特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶I、嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶II、土生梭孢殼纖維二糖水解酶II(CEL6A)、嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I以及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II、煙曲霉纖維二糖水解酶I和煙曲霉纖維二糖水解酶II?？捎糜诒景l(fā)明的￠-葡糖苷酶的實(shí)例包括但不僅限于米曲霉￠-葡糖苷酶；煙曲霉@-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888P-葡糖苷酶；黑曲霉葡糖苷酶；以及棘孢曲霉￠-葡糖苷酶。米曲霉￠-葡糖苷酶活性可根據(jù)WO2002/095014獲取。具有P-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可根據(jù)WO2005/047499獲取。具有P-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根據(jù)TO2007/019442獲取。具有P-葡糖苷酶的黑曲霉多肽可根據(jù)Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲取。具有P-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根據(jù)Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288獲取。所述P-葡糖苷酶可為融合蛋白。在一個方面，所述P-葡糖苷酶為米曲霉P-葡糖苷酶變體BG融合蛋白，或根據(jù)WO2008/057637獲得的米曲霉P-葡糖苷酶融合蛋白。其它可用的內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和￠-葡糖苷酶使用根據(jù)HenrissatB.，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316和HenrissatB.和BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696的分類公開于許多糖基水解酶家族中。其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于EP495，257、EP531，315、EP531,372、WO89/09259、WO94/07998、TO95/24471、TO96/11262、W096/29397、TO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、W098/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411、WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、W02000/009707,WO2002/050245,WO2002/0076792,WO2002/101078,W02003/027306,WO2003/052054,WO2003/052055,WO2003/052056,W02003/052057,WO2003/052118、WO2004/016760,WO2004/043980,W02004/048592,WO2005/001065,WO2005/028636、WO2005/093050,W02005/093073,WO2006/074005,WO2006/117432,WO2007/071818、W02007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國專利No.4，435，307、美國專利No.5，457，046、美國專利No.5，648，263、美國專利No.5，686，593、美國專利No.5，691，178、美國專利No.5，763，254以及美國專利No.5，776，757。在一個方面，所述一個或多個(幾個)半纖維素分解酶包含商業(yè)性半纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)性半纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如SHEARZYME(NovozymesA/S)、CELLICHTec(NovozymesA/S)、V丨SCOZYME(NovozymesA/S)、ULTRAFLO(NovozymesA/S)、PULPZYME.HC(NovozymesA/s)、MULTIFECTXylanase(Genencor)、ECOPULPTX-200A(ABEnzymes)、HSP6000Xylanase(DSM)、DEP0L333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)、DEPOL740L.(BiocatalystsLimit,Wales,UK)和DEPOL762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)可用于本發(fā)明方法的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;WO94/21785)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(W02006/078256)和土生梭抱殼(Thielaviaterrestris)NRRL8126木聚糖酶(W02009/079210)?？捎糜诒景l(fā)明方法的P-木糖苷酶的實(shí)例包括但不限于里氏木霉(Trichodermareesei)0-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登錄號Q92458)，埃默森踩節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登錄號Q8X212)和粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)(SwissProt登錄號Q7S0W4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的乙酰木聚糖酯酶的實(shí)例包括但不限于紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(W02005/001036)、粗糙脈孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登錄號q7s259)、土生梭孢殼NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(W02009/042846)、球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q2GWX4)、細(xì)麗毛殼菌(Chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登錄號AAB82124)、穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號Q0UHJ1)和特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800乙酰木聚糖酯酶(W02009/073709)。可用于本發(fā)明方法的阿魏酸酯酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿魏酸酯酶(W02009/076122)、粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登錄號Q9HGR3)和費(fèi)希新薩托菌(Neosartoryafischer)阿魏酸酯酶(UniProt登錄號A1D9T4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(W02009/073383)和黑曲霉(Aspergillusniger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登錄號AAR94170)?？捎糜诒景l(fā)明方法的a-葡糖醛酸糖苷酶的實(shí)例包括但不限于棒曲霉(Aspergillusclavatus)a-葡糖醒酸糖苷酶(UniProt登錄號alccl2)、里氏木霉(Trichodermareesei)a-葡糖醒酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q99024)、埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)a-葡糖醒酸糖苷酶(UniProt登錄號Q8X211)、黑曲霉(Aspergillusniger)a-葡糖醒酸糖苷酶(Uniprot登錄號Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus)a-葡糖醒酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q0CJP9)和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)a-葡糖醒酸糖苷酶(SwissProt登錄號Q4WW45)。用于本發(fā)明方法的酶和蛋白可通過使用本領(lǐng)域已知方法(參見，例如Bennett,J.W和LaSure,L(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991),在含有合適碳源和氮源和無機(jī)鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上發(fā)酵上述指出的微生物菌株來產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得，或可根據(jù)已公開的組成制備(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如Bailey,J.E.和Ollis,D.F.，BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986)。所述發(fā)酵可以是任何其結(jié)果為酶或蛋白表達(dá)或分離的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述酶得以表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得的酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過常規(guī)方法純化。發(fā)璧?？赏ㄟ^一種或多種(幾種)能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物發(fā)酵自經(jīng)水解的纖維素材料獲得可發(fā)酵糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是分開的或同時的。在本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需的發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來選擇所述材料，如本領(lǐng)域中所公知的。術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是(6和/或(5發(fā)酵生物體，或它們的組合。Cf^PC5發(fā)酵生物體均在本領(lǐng)域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成所需的發(fā)酵產(chǎn)品。產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物體的實(shí)例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。能發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，優(yōu)選釀酒酵母。能發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物體的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的C5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株,如樹干畢赤酵母CBS5773;假絲酵母屬，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的菌株。其它發(fā)酵生物體包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas),如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis);漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala);克魯維酵母屬，如脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe);大腸桿菌，特別是已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾而改進(jìn)乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌；梭菌屬(Clostridium),如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum),Chlostridiumthermocellum,和Chlostridiumphytofermentans;地芽孢桿菌屬菌種(Geobacillussp.);熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter),如解糖熱厭氧桿菌(ThermoanaerobactersaccharoIyticum);和芽抱桿菌屬(Bacillus),如凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)。在一個優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個優(yōu)選的方面,酵母是克魯維酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是假絲酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(ClavisporaIusitaniae)。在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞋管囊酵母(Pachysolentannophilus)。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在另一個更優(yōu)選的方面,酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,Wyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，例如，運(yùn)動發(fā)酵單胞菌和丙酮丁醇梭菌，Clostridiumthermocellum,Chlostridiumphytofermentans,地芽抱桿菌屬菌種，解糖熱厭氧桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌(Philippidis,1996，見上文)。在一個優(yōu)選的方面,細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌屬。在更優(yōu)選的方面,細(xì)菌是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，細(xì)菌是梭菌屬。在另一個更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是熱纖維梭菌。商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如ETHANOLRED酵母(RedStar/Lesaffre,USA)、FALI(Fleischmann，sYeast,USA)、SUPERSTART和THERMOSACC新鮮酵母(EthanolTechnology,WI,USA)、BIOFERMAFT和XR(NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA),GERTSTRAND(GertStrandAB,Sweden)和FERMIOL(DSMSpecialties)。在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen和Ho,1993,CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147;Ho等,1998,GeneticalIyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859;Kotter和Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783;Walfridsson等,1995,Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190;Kuyper等,2004,MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,FEMSYeastResearch4:655_664;Beall等，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303;Ingram等，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214;Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis,Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470;WO2003/062430，xyloseisomerase)。在一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。在另一個優(yōu)選的方面,所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母菌種。本領(lǐng)域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。通常向降解的木素纖維素或水解物加入發(fā)酵微生物，并進(jìn)行約8至約96小時，如約24至約60小時發(fā)酵。溫度通常為約26°C至約60°C，特別是約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，如約pH4-5,6或7。在一個優(yōu)選的方面，對降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進(jìn)行約12至約96小時，如通常為24-60小時發(fā)酵。在一個優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約60°C，更優(yōu)選約25°C至約50°C，并且最優(yōu)選約32°C至約50°C，特別是約32°C或50°C，并且pH通常為約pH3至約pH7，優(yōu)選約pH4-7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細(xì)菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-IO12,優(yōu)選約IO7-IOltl,特別是約2xl08活細(xì)胞計數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的進(jìn)一步指導(dǎo)可以在例如“TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall編,NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)中找到，其通過提述并入本文。對于乙醇生產(chǎn)，在發(fā)酵后蒸餾發(fā)酵的漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵工藝，而且特定地，改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“發(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長的刺激劑。優(yōu)選的用于生長的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、卩比唆醇(pyridoxine)、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D^PE。參見,例如，Alfdnore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed—batchprocess,Springer-Verlag(2002),其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇?？衫斫獾氖?，術(shù)語“醇”包括包含一個或多個羥基基團(tuán)的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，Gong,C.S.，Cao,N.J.，DujJ.，和Tsao，G.T.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper，T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207_241;Silveira，M.M.,和Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408;Nigam，P.，和Singh，D.，1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute,ProcessBiochemistry30(2):117-124;Ezeji,T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595-603。在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是有機(jī)酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是朽1檬酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是甲酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是反丁烯二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是蘋果酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見，例如，Chen,R.,和Lee,Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435—448。在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是酮?？衫斫獾氖切g(shù)語“酮”涵蓋含有一個或多個酮基的物質(zhì)。在另一個更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，Qureshi和Blaschek,2003,見上文。在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氨基酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，Richard,A.，和Margaritis,A.，2004，Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501-515。在另一個優(yōu)選的方面，所述發(fā)酵產(chǎn)物是氣體。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見，例如，Kataoka,N.，A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7):41-47;和GunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1~2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。通|。可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇?？梢垣@得純度高達(dá)約96vol%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇，即，中性飲料酒,或工業(yè)乙醇。洗滌劑組合物本發(fā)明具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽可添加至洗滌劑組合物而成為洗滌劑組合物的組分。本發(fā)明的洗滌劑組合物可配制為例如手洗或機(jī)洗的洗衣洗滌劑組合物，其包含適于預(yù)處理玷污的織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物柔軟劑(softener)組合物，或可配制為用于一般家用硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或可配制為用于手動或機(jī)械洗碗操作。因此，本發(fā)明還涉及用于清洗或洗滌硬表面或衣物的方法，包括將所述硬表面或衣物與本發(fā)明的洗滌劑組合物相接觸。在一個具體方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多肽的洗滌劑添加劑。所述洗滌劑添加劑以及所述洗滌劑組合物還可包含一種或多種選自下組的酶淀粉酶、阿拉伯糖酶、纖維素酶、角質(zhì)酶、半乳聚糖酶、半纖維素酶、漆酶、脂質(zhì)酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果膠酶、蛋白酶、和木聚糖酶。一般而言所選酶的性質(zhì)應(yīng)與所選洗滌劑相容(即最適pH，與其他酶或非酶成分的相容性等)，且所述酶應(yīng)以有效量存在。纖維素酶合適的纖維素酶包括那些細(xì)菌或真菌起源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如US4,435，307,US5，648，263,US5，691，178,US5，776，757號和WO89/09259中公開的，由特異腐質(zhì)酶、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶是具有色彩維護(hù)(colourcare)益處的堿性或中性纖維素酶。此類纖維素酶的例子有EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中記載的纖維素酶。其它例子有纖維素酶變體，如WO94/07998、EP0531315、US5，457，046、US5，686，593、US5，763，254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中記載的那些。商業(yè)性使用的纖維素酶包括CELLUZYME和CAREZYME(NovozymesA/S)、CLAZINASE和PURADAXHA(GenencorInternationalInc.)和KAC-500(B)(KaoCorporation)。蛋總塵:合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的那些。優(yōu)選微生物來源。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草桿菌蛋白酶，特別是源自芽孢桿菌屬的那些，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo,枯草桿菌蛋白酶Carlsberg,枯草桿菌蛋白酶309，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和WO89/06270和WO94/25583中所述的鐮孢屬蛋白酶。有用的蛋白酶的實(shí)例是WO92/19729,WO98/20115,WO98/20116和WO98/34946中所述的變體，特別是在下述一個或多個位置有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得的蛋白酶包括ALCALASE、SAVINASE、PRIMASE、DURALASE、ESPERASE和KANNASE(NovozymesA/S)、MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、PROPERASE,PURAFECT,PURAFECT0XP、FN2和FN3(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶合適的脂肪酶包括那些細(xì)菌或真菌起源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。有用的脂肪酶的例子包括來自腐質(zhì)霉屬(同物異名嗜熱霉屬(Thermomyces))的脂肪酶，例如記載于EP258068和EP305216的來自疏棉狀腐質(zhì)霉(H.lanuginosa)(細(xì)毛嗜熱霉(T.Ianuginosus))或來自記載于WO96/13580的特異腐質(zhì)霉的脂肪酶，假單胞菌屬脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)和類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，024)、熒光假單胞菌(P.fIuorescens)、假單胞菌屬菌種菌株SD705(W095/06720和W096/27002)、威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis)(W096/12012)的脂肪酶，或芽孢桿菌屬的脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993)，BiochemicaetBiophysicaacta1131，253-260),嗜熱脂肪芽抱桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(W091/16422)的脂肪酶。其它實(shí)例為脂肪酶變體，如WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中記載的那些。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得的脂肪酶包括LIP0LASE和LIP0LASEULTRA(NovozymesA/S)。淀粉酶:合適的淀粉酶(a和/或P)包括那些細(xì)菌或真菌起源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。淀粉酶包括例如得自芽孢桿菌屬例如在GBI,296，839中更詳細(xì)所述的地衣芽孢桿菌特定菌株的a-淀粉酶。有用的淀粉酶的實(shí)例為WO94/02597,WO94/18314,WO96/23873和WO97/43424中所述的變體，尤其是在一個或多個以下位置具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業(yè)上可獲得的淀粉酶有DURAMYL、TERMAMYL、FUNGAMYL和BAN(NovozymesA/S)、RAPIDASE和PURASTAR(來自GenencorInternationalInc.)。過氧化物酶/氧化酶:合適的過氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細(xì)菌或真菌起源的。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。有用的過氧化物酶的例子包括來自鬼傘屬(Coprinus)的過氧化物酶,例如來自灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶及其變體,如WO93/24618、WO95/10602、和W098/15257中記載的那些。商業(yè)上可獲得的過氧化物酶包括GUARDZYME(NovozymesA/S)。可以通過添加分開的、含有一種或多種酶的添加劑或通過添加組合的、包含所有這些酶的添加劑將洗滌劑酶包含于洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即單獨(dú)的添加劑或組合的添加劑，可配制為例如顆粒、液體、漿料等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑配制物是顆粒，特別是無粉塵的顆粒、液體特別是穩(wěn)定化的液體，或漿料。無粉塵的顆粒可以例如如US4，106,991和4，661，452中公開的產(chǎn)生，并且可以任選地通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法進(jìn)行包覆。蠟質(zhì)包覆材料的實(shí)例是具有1000至20000的平均摩爾重量的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG);具有16至50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20個碳原子且其中存在15至80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯。適于通過流化床技術(shù)施用的成膜包覆材料的實(shí)例在GB1483591中給出。例如，可以通過根據(jù)已確立的方法添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來使液體酶制備物穩(wěn)定。受保護(hù)的酶可根據(jù)EP238，216中公開的方法來制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如，條、片劑、粉末、顆粒(granule)、糊劑(paste)或液體。液體洗滌劑可以是水性的，通常含有多至70%水和0_30%有機(jī)溶劑，或是非水性的。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，所述表面活性劑可以是非離子的(包括半-極性的)和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的。表面活性劑通常以按重量計0.1%至60%的水平存在。當(dāng)包含于其中時，洗滌劑通常會含有約1%至約40%的陰離子表面活性劑，例如直鏈燒基苯磺酸酯(linearalkylbenzenesulfonate)>a-鏈烯烴磺酸酯、燒基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯(alcoholethoxysulfate)、仲燒基磺酸酯(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸甲酯、燒基-或烯基琥拍酸或阜類(soap)。當(dāng)包含于其中時，洗滌劑將通常含有約0.2%至約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、壬基酹乙氧基化物、燒基聚苷(alkylpolyglycoside)、燒基二甲胺氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇酸胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡糖酰胺(glucamides)”)。洗滌劑可以含有0-65%的洗滌劑增效劑(builder)或絡(luò)合劑例如沸石、二磷酸鹽/酯、三磷酸鹽/酯、膦酸鹽/酯(phosphonate)、碳酸鹽/酯、檸檬酸鹽/酯、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、燒基-或烯基琥拍酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(例如來自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。實(shí)例是羧甲基纖維素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸鹽/酯(polycarboxylate)例如聚丙烯酸鹽/酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可含有漂白體系，所述體系可包含H2O2源例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，可將其與形成過酸的漂白活化劑例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyIoxybenzenesulfonate)組合?；蛘?，漂白體系可包含過氧酸，例如酰胺、二酰亞胺或砜型的過氧酸?？梢允褂贸Ｒ?guī)穩(wěn)定劑使本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶穩(wěn)定化，所述穩(wěn)定劑例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物例如4_甲酰苯基硼酸，并且所述組合物可按例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制。洗滌劑也可含有其它常規(guī)洗滌劑成分例如織物調(diào)節(jié)劑，包括粘土、泡沫促進(jìn)劑(foambooster)、抑泡劑(sudssuppressor)、抗腐蝕劑、懸污劑(soil-suspendingagent)、防污物再沉積劑(anti-soilredepositionagent)、染料、殺菌劑、光學(xué)增亮劑、助水溶物(hydrotrope)、晦暗抑制劑(tanishinhibitors)或香料。在洗滌劑組合物中，可以以相當(dāng)于0.Ol-IOOmg酶蛋白每升洗滌液，優(yōu)選0.05_5mg酶蛋白每升洗滌液，特別是0.I-Img酶蛋白每升洗滌液的量添加任何酶。在洗滌劑組合物中，可以以相當(dāng)于每升洗滌液0.OOl-IOOmg蛋白、優(yōu)選0.005_50mg蛋白，更優(yōu)選0.01_25mg蛋白，甚至更優(yōu)選0.05_10mg蛋白，最優(yōu)選0.05_5mg蛋白，且甚至最優(yōu)選0.Ol-Img蛋白的量添加本發(fā)明具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。還可將本發(fā)明具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽并入WO97/07202中公開的洗滌劑配制物，將WO97/07202通過提述并入本文。信號肽本發(fā)明還涉及編碼信號肽的多核苷酸，所述信號肽包含或組成為SEQIDN0:2的氨基酸I至17，SEQIDNO:4的氨基酸I至19，SEQIDNO:6的氨基酸I至17，SEQIDNO:8的氨基酸I至19，SEQIDNO:10的氨基酸I至21，SEQIDNO:12的氨基酸I至24，SEQIDNO:14的氨基酸I至16，SEQIDNO:16的氨基酸I至18，SEQIDNO:18的氨基酸I至22，SEQIDNO:20的氨基酸I至16，或SEQIDNO:22的氨基酸I至19。所述多核苷酸還可包含編碼蛋白質(zhì)的基因，其可操作地連接于所述信號肽。所述蛋白質(zhì)優(yōu)選對于所述信號肽是外源的。本發(fā)明還涉及包含此種多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)培養(yǎng)包含此種多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)對于宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在本文的意思不是指特定長度的編碼產(chǎn)物，并且因此包含肽、寡肽和多肽。術(shù)語“蛋白質(zhì)”還包含組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種或更多種多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽和融合多肽。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報道蛋白(reporter)。例如,所述蛋白質(zhì)可為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構(gòu)酶或連接酶，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、￠-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、￠-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。基因可以從任何原核、真核或其它來源獲得。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例材料用作緩沖液和底物的化學(xué)品為至少試劑級的商品。菌株將土生梭孢殼NRRL8126用作具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族61多肽的來源。將米曲霉JaL355菌株(W02002/40694)用于表達(dá)編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的土生梭孢殼家族61基因。培養(yǎng)基和溶液PDA平板包含39g的馬鈴薯右旋糖瓊脂，和蒸餾水加至I升。NNCYP培養(yǎng)基包含5.Og的NaNO3,3.Og的NH4Cl,2.Og的MES，2.5g的檸檬酸，0.2g的CaCl22H20，I.Og的BactoP印tone，5.Og的酵母提取物，0.2g的MgSO47H20，4.0g的K2HPO4,1.Oml的COVE微量元素溶液，2.5g的葡萄糖，和蒸餾水加至I升?；九囵B(yǎng)基(MM)平板包含6g的NaNO3,0.52g的KCl，I.52g的KH2PO4,Iml的COVE微量元素溶液，20g的Noble瓊脂，20ml的50%葡萄糖，2.5ml的MgSO4*7H20,20ml的0.02%生物素溶液，和蒸餾水加至I升。COVE微量元素溶液包含0.04g的Na2B4O7IOH20,0.4g的CuSO45H20,I.2g的FeSO47H20，0.7g的MnSO4H20,0.8g的Na2MoO22H20,IOg的ZnSO47H20，和蒸餾水加至I升°M410培養(yǎng)基包含50g的麥芽糖，50g的葡萄糖，2g的MgSO4.IW2Q,4g的無水檸檬酸粉末，2g的KH2PO4,8g的酵母提取物，2g的尿素，0.5g的CaCl2,0.5ml的AMG微量金屬溶液，和蒸餾水加至I升。AMG微量金屬溶液包含14.3g的ZnSO47H20，2.5g的CuSO45H20，0.5g的NiCl26H20,13.8g的FeSO47H20，8.5g的MnSO47H20，3g的檸檬酸，和蒸餾水加至I升。實(shí)施例I:關(guān)于土生梭孢殼NRRL8126的DNA序列信息的來源基因組序列信息由U.S.DepartmentofEnergyJointGenomeInstitute(JGI)生成。從JGI下載基因組的初級匯編(assembly),并使用Pedant-ProSequenceAnalysisSuite(BiomaxInformaticsAG,Martinsried,Germany)分析。使用通過軟件構(gòu)建的基因模型作為起始點(diǎn)以供檢測基因組中的GH61同源物。使用多種已知的GH61蛋白序列作為指引構(gòu)建更精確的基因模型。實(shí)施例2:土生梭孢殼NRRL8126基因組DNA提取為了生成供PCR擴(kuò)增的基因組DNA，將土生梭孢殼NRRL8126在42°C和200rpm在帶擋板的搖瓶中的補(bǔ)充1%葡萄糖的50ml的NNCYP培養(yǎng)基中生長24小時。菌絲體通過過濾收獲，在TE(IOmMTris-ImMEDTA)中洗滌兩次，并在液氮下凍結(jié)。將豌豆大小的凍結(jié)的菌絲體塊懸于0.7ml的TE中的1%十二燒基硫酸鋰，并通過在FastPrepFP120(ThermoSavant,Holbrook,NY,USA)中用等體積的0.Imm二氧化錯/二氧化娃珠(BiospecProducts,Inc.,Bartlesville,OK,USA)攬拌45秒來破壞。通過以13,OOOxg離心10分鐘來去除碎塊，并將經(jīng)清除的上清配至2.5M乙酸銨，并在冰上溫育20分鐘。在溫育期之后，通過添加2體積的乙醇來沉淀核酸。在4°C在微型離心機(jī)中離心15分鐘之后，將沉淀在70%乙醇中洗滌，并風(fēng)干。將DNA重懸于120ill的0.IXTE，并在37°C用I的不含DNase的RNaseA溫育20分鐘。添加乙酸銨至2.5M，并用2體積的乙醇沉淀DNA。將沉淀在70%乙醇中洗滌，風(fēng)干，并重懸于TE緩沖液。實(shí)施例3:含有編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61J多肽的土生梭孢殼NRRL8126基因組序列的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼NRRL8126gh6j基因。使用IN-FUSIONCloningKit(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)以將片段直接克隆入表達(dá)載體pAlLo2(TO2004/099228)，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。Ttghlj-F(065367):5，-actggatttaccATGAAGTTCTCACTGGTGTC3J(SEQIDNO:23)Ttgh6Ij-R(065368)5，-TCACCTCTAGTTAATTAATCAGCAGGAGATCGGGGCGG-3，(SEQIDNO:24)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)包含IOOng的土生梭抱殼NRRL8126基因組DNA,PfxAmplificationBuffer(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),各0.4mM的dATP，dTTP,dGTP,和dCTP，ImMMgCl2,和2.5單位的PfxDNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),最終體積為50yI。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(EppendorfScientific,Inc.,Westbury,NY,USA)進(jìn)行擴(kuò)增，其程序?yàn)?個循環(huán)，在98°C進(jìn)行3分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在98°C進(jìn)行30秒，60°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行I.5分鐘。然后加熱塊進(jìn)入4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-ImMEDTA二鈉鹽(TAE)緩沖液分離，其中將908bp的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MINELUTEGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入NcoI和PacI消化的pAlLo2，得到pSMai207，其中土生梭孢殼gh61j基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2_tpi啟動子(一種來自編碼黑曲霉中中性a-淀粉酶的基因的啟動子，其中未翻譯的先導(dǎo)序列由來自編碼構(gòu)巢曲霉中的丙糖磷酸異構(gòu)酶的未翻譯的先導(dǎo)序列所取代)的調(diào)控之下。連接反應(yīng)(50iU)包含IXIN-FUSIONBuffer(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA),IXBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA),IUIofIN-FUSION酶(I:10稀釋)(BDBiosciences,PaloAlto，CA，USA)，IOOng用NcoIandPacI消化的PAlLo2，和50ng的土生梭孢殼gh61j純化的PCR產(chǎn)物。將反應(yīng)在室溫溫育30分鐘。使用一UI的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlOSOLOPACKGoldSupercompetent細(xì)胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。含有pSMai207的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體通過限制性消化檢測，而質(zhì)粒DNA使用BIOROBOT9600(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)制備。pSMai207中的土生梭孢殼gh61j插入通過DNA測序來確認(rèn)。亦將相同的908bp土生梭孢殼gh61jPCR片段使用TOPOTACLONINGKit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)克隆入pCR2.1-T0P0載體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),以生成pSMai216。土生梭孢殼gh61j插入通過DNA測序確認(rèn)。大腸桿菌pSMai216于2009年8月3日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)石開究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA),并分配登錄號NRRLB-50301。實(shí)施例4:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61J多肽的土生梭孢殼NRRL8126基因組序列的表征土生梭抱殼NRRL8126gh61j基因組克隆的DNA測序用AppliedBiosystemsModel3700AutomatedDNASequencer使用版本3.IBIG-DYE終止子化學(xué)(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA,USA)和dGTP化學(xué)(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA,USA)和引物步移策略進(jìn)行。就品質(zhì)審視核苷酸序列數(shù)據(jù)，并以PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)的協(xié)助將所有序列互相比較。獲得的序列與來自JGI的序列相同。土生梭孢殼gh61j基因的核苷酸序列(SEQIDNO:I)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)示于圖I。編碼序列為878bp，包含終止密碼子，并由66和71bp的內(nèi)含子間隔。編碼的預(yù)測的蛋白為246個氨基酸?；蚓幋a序列(包含內(nèi)含子)的％G+C為63%G+C，而成熟多肽編碼序列為63%。使用SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1-6)，預(yù)測了17個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白含有229個氨基酸，具有24.5kDa的預(yù)測的分子量和7.85的等電點(diǎn)pH。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61J多肽的土生梭孢殼基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自特異腐質(zhì)霉的預(yù)測的GH61家族蛋白的推導(dǎo)的氨基酸序列(登錄號geneSeqp:ADM97935)分享57.7%的同一性(排除間隔)。實(shí)施例5:在米曲霉JaL355中表達(dá)土生梭孢殼NRRL8126家族61糖基水解酶61j基因米曲霉JaL355(TO2002/40694)原生質(zhì)體根據(jù)Christensen等，1988，Bio/Technology6:1419-1422的方法制備。將大約2yg的pSMai207轉(zhuǎn)化入米曲霉JaL355。用pSMai207轉(zhuǎn)化米曲霉JaL355產(chǎn)生約30個轉(zhuǎn)化體。將十個轉(zhuǎn)化體分離至單個基本培養(yǎng)基平板。用5ml的0.01%TWEEN20洗滌每個轉(zhuǎn)化體的匯合的基本培養(yǎng)基平板，并分別接種入125ml玻璃搖瓶中的25ml的M410培養(yǎng)基，并在34°C，250rpm溫育。在5日溫育之后，用CRITERIONCell(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA，USA)在CRITERIONTris-HCl凝膠(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)上根據(jù)生產(chǎn)商的指不分析5iil的來自每個培養(yǎng)的上清。將所得的凝膠用BIO-SAFECoomassieStain(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)染色。培養(yǎng)物的SDS-PAGE概貌顯示多數(shù)轉(zhuǎn)化體具有預(yù)期的24KDA條帶大小。用IOml的0.01%TWEEN80洗滌轉(zhuǎn)化體3的匯合的平板，并接種入含有500ml的M410培養(yǎng)基的2升Fernbach以生成用于表征酶的培養(yǎng)液。在第5日收獲培養(yǎng)物，并使用0.22umEXPRESSPLUSMembrane(Mi11ipore,Billerica,MA,USA)過濾。實(shí)施例6:含有編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61K多肽的土生梭孢殼NRRL8126基因組序列的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼NRRL8126gh61k基因。使用IN-FUSI0NCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體PAlLo2，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。Ttghlk-F(065465)5，-actggatttaccATGAGGACGACATTCGCCGCCGCGT3J(SEQIDNO:25)Ttgh6Ik-R(065466)5，-TCACCTCTAGTTAATTAACTAAGAAGAAGGGGCGCACT_3，(SEQIDNO:26)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)包含IOOng的土生梭孢殼NRRL8126基因組DNA，PfxAmplificationBuffer,各0.4mM的dATP，dTTP,dGTP,和dCTP，ImMMgCl2,和2.5單位的PfxDNA聚合酶，最終體積為50yl。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進(jìn)行擴(kuò)增，其程序?yàn)镮個循環(huán)，在98°C進(jìn)行3分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在98°C進(jìn)行30秒，60°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行I.5分鐘。然后加熱塊進(jìn)入4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用TAE緩沖液分離，其中將1283bp的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MINELliTE⑧GelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入NcoI和PacI消化的pAlLo2，得到pSMai208，其中土生梭孢殼gh61k基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。連接反應(yīng)(50ill)包含IXIN-FUSIONBuffer,IXBSA,IuIofIN-FUSI0N酶(I10稀釋)，IOOng用NcoIandPacI消化的pAlLo2,和50ng的土生梭孢殼gh61k純化的PCR產(chǎn)物。將反應(yīng)在室溫溫育30分鐘。使用一的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlOSOLOPACKGoldSupercompetent細(xì)胞。含有pSMai208的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體通過限制性消化檢測,而質(zhì)粒DNA使用BIOROBOT9600制備。pSMai208中的土生梭孢殼gh61k插入通過DNA測序來確認(rèn)。亦將相同的1283bp土生梭孢殼gh61kPCR片段使用T0P0TACLOMNGKit克隆入pCR2.1-T0P0載體，以生成pSMai217。土生梭孢殼gh61k插入通過DNA測序確認(rèn)。大腸桿菌pSMai217于2009年8月3日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)石開究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA),并分配登錄號NRRLB-50302。實(shí)施例7:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61K多肽的土生梭孢殼NRRL8126基因組序列的表征土生梭抱殼NRRL8126gh61k基因組克隆的DNA測序用AppliedBiosystemsModel3700AutomatedDNASequencer使用版本3.1BIG-DYE終止子化學(xué)和dGTP化學(xué)和引物步移策略進(jìn)行。就品質(zhì)審視核苷酸序列數(shù)據(jù)，并以PHRED/PHRAP軟件的協(xié)助將所有序列互相比較。獲得的序列與來自JGI的序列相同。土生梭孢殼gh61k基因的核苷酸序列(SEQIDNO:3)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:4)示于圖2。編碼序列為1253bp，包含終止密碼子，并由96，84，和68bp的內(nèi)含子間隔。編碼的預(yù)測的蛋白為334個氨基酸?；蚓幋a序列(包含內(nèi)含子)的％G+C為66.6W+C，而成熟多肽編碼序列為69.3%。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了19個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白含有315個氨基酸，具有31.7kDa的預(yù)測的分子量和6.68的等電點(diǎn)pH。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61K多肽的土生梭孢殼基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自巴西青霉的預(yù)測的￠-葡糖苷酶蛋白的推導(dǎo)的氨基酸序列(登錄號geneseqpAWW27060)分享64.8%的同一丨丨生(排除間隔)。實(shí)施例8:在米曲霉JaL355中表達(dá)土生梭孢殼NRRL8126家族61糖基水解酶61k基因米曲霉JaL355(TO2002/40694)原生質(zhì)體根據(jù)Christensen等.，1988，見上的方法制備。將其用大約2iig的pSMai208轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化產(chǎn)生約25個轉(zhuǎn)化體。將十個轉(zhuǎn)化體分離至單個基本培養(yǎng)基平板。用5ml的0.01%TWEEN20洗滌每個轉(zhuǎn)化體的匯合的基本培養(yǎng)基平板，并分別接種入125ml玻璃搖瓶中的25ml的M410培養(yǎng)基，并在34°C，250rpm溫育。在5日溫育之后，用CRITERIONCell在CRITERIONTris-HCl凝膠上根據(jù)生產(chǎn)商的指示分析5ill的來自每個培養(yǎng)的上清。將所得的凝膠用BIO-SAFECoomassieStain染色。培養(yǎng)物的SDS-PAGE概貌顯示多數(shù)轉(zhuǎn)化體具有預(yù)期的32KDA條帶大小。用IOml的0.01%TWEEN80洗滌轉(zhuǎn)化體5的匯合的平板，并接種入含有500ml的M410培養(yǎng)基的2升Fernbach以生成用于表征酶的培養(yǎng)液。在第5日收獲培養(yǎng)物，并使用.22umEXPRESSPLUSMembrane過濾。實(shí)施例9:含有編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61L多肽的土生梭孢殼NRRL8126基因組序列的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼NRRL8126gh611基因。使用IN-FUSI0NCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體PAlLo2，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。Ttghll-Fl(066276)5，-actggatttaccATGAAGCTGAGCGTTGCCATCGCC-3，(SEQIDNO:27)Ttgh611-R(065736)5，-TCACCTCTAGTTAATTAATTAGCACGTCTCAGCCGGCG-3，(SEQIDNO:28)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)包含IOOng的土生梭孢殼NRRL8126基因組DNA，PfxAmplificationBuffer,各0.4mM的dATP，dTTP,dGTP,和dCTP，ImMMgCl2,和2.5單位的PfxDNA聚合酶，最終體積為50yl。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進(jìn)行擴(kuò)增，其程序?yàn)镮個循環(huán)，在98°C進(jìn)行3分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在98°C進(jìn)行30秒，60°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行I.5分鐘。然后加熱塊進(jìn)入4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用TAE緩沖液分離，其中將828bp的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用VnNE.LUTEGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入NcoI和PacI消化的pAlLo2，得到pSMai209，其中土生梭孢殼gh611基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。連接反應(yīng)(50iil)包含IXIN-FUSIONBuffer,IXBSA,IuIofIN-FUSI0N酶(I10稀釋)，IOOng用NcoIandPacI消化的PAlLo2，和50ng的土生梭孢殼gh611純化的PCR產(chǎn)物。將反應(yīng)在室溫溫育30分鐘。使用一UI的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlOSOLOPACICGoldSupercompetent細(xì)胞。含有pSMai212的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體通過限制性消化檢測，而質(zhì)粒DNA使用BIOROBOT9600制備。pSMai212中的土生梭孢殼gh611插入通過DNA測序來確認(rèn)。亦將相同的828bp土生梭孢殼gh61IPCR片段使用T0P0TACLONINGKit克隆入pCR:2.1-T0P0載體，以生成pSMai218。土生梭孢殼gh611插入通過DNA測序確認(rèn)。大腸桿菌pSMai218于2009年8月3日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)，并分配登錄號NRRLB-50303。實(shí)施例10:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61L多肽的土生梭孢殼NRRL8126基因組序列的表征土生梭抱殼NRRL8126gh611基因組克隆的DNA測序用AppliedBiosystemsModel3700AutomatedDNASequencer使用版本3.1BIG-DYE終止子化學(xué)和dGTP化學(xué)和引物步移策略進(jìn)行。就品質(zhì)審視核苷酸序列數(shù)據(jù)，并以PHRED/PHRAP軟件的協(xié)助將所有序列互相比較。獲得的序列與來自JGI的序列相同。土生梭孢殼gh611基因的核苷酸序列(SEQIDNO:5)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:6)示于圖3。編碼序列為798bp，包含終止密碼子，并由55和59bp的內(nèi)含子間隔。編碼的預(yù)測的蛋白為227個氨基酸?；蚓幋a序列(包含內(nèi)含子)的％G+C為60.8%G+C，而成熟多肽編碼序列為62.6%。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了17個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白含有210個氨基酸，具有22.6kDa的預(yù)測的分子量和8.84的等電點(diǎn)pH。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61L多肽的土生梭孢殼基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自土生梭孢霉的預(yù)測的￠-葡糖苷酶蛋白的推導(dǎo)的氨基酸序列(登錄號geneseqpADM97933)分享59.2%的同一丨丨生(排除間隔)。實(shí)施例11:在米曲霉JaL355中表達(dá)土生梭孢殼NRRL8126家族61糖基水解酶611基因米曲霉JaL355(TO2002/40694)原生質(zhì)體根據(jù)Christensen等.，1988，見上的方法制備。將其用大約2iig的pSMai212轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化產(chǎn)生約17個轉(zhuǎn)化體。將十七個轉(zhuǎn)化體分離至單個基本培養(yǎng)基平板。用5ml的0.01%TWEEN20洗滌每個轉(zhuǎn)化體的匯合的基本培養(yǎng)基平板，并分別接種入125ml玻璃搖瓶中的25ml的M410培養(yǎng)基，并在34°C，250rpm溫育。在5日溫育之后，用CRITERIONCell在CRlTER丨ONTris-HCl凝膠上根據(jù)生產(chǎn)商的指示分析5ill的來自每個培養(yǎng)的上清。將所得的凝膠用BIO-SAFECoomassieStain染色。培養(yǎng)物的SDS-PAGE概貌顯示多數(shù)轉(zhuǎn)化體具有預(yù)期的23KDA條帶大小。用IOml的0.01%TWEEN80洗滌轉(zhuǎn)化體14的匯合的平板，并接種入含有500ml的M410培養(yǎng)基的2升Fernbach以生成用于表征酶的培養(yǎng)液。在第5日收獲培養(yǎng)物，并使用.22umEXPRESSPLUSMembrane過濾。實(shí)施例12:經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿的水解由具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61J,GH61K，和GFH61L多肽增強(qiáng)培養(yǎng)液如實(shí)施例5,8,和11中所述制備，并使用Amicon超濾裝置(Mi11ipore,Bedford,MA,USA,IOkDa聚醚砜膜，40psi,4°C)濃縮大約20倍。在SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色之后通過光密度法估計蛋白濃度。如W02005/074647中所述預(yù)處理玉米秸桿并將其作為測定底物制備，以生成經(jīng)預(yù)處理玉米秸桿(PCS)。用于測定增強(qiáng)活性的基礎(chǔ)(base)纖維素酶混合物從里氏木霉菌株SMA135(W02008/057637)制備。PCS的水解使用I.6ml深孔板(Axygen,SantaClara,CA,USA)使用I.Oml的總反應(yīng)體積和ImM硫酸錳_50mM乙酸鈉pH5.0中的50mg/ml的PCS濃度來進(jìn)行。將土生梭孢殼多肽(GH61J，GH61K和GFH61L)以0至25%或0至32%濃度范圍的基礎(chǔ)纖維素酶混合物的蛋白濃度分別添加至基礎(chǔ)纖維素酶混合物。溫育在50°C進(jìn)行72小時。測定重復(fù)進(jìn)行三次。離心等分試樣，并通過使用平板離心機(jī)(SORVALLRT7,ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)以3000rpm離心10分鐘(MULTISCREENHV0.45um,Mi11ipore,Billerica,MA,USA)來過濾上清液體。當(dāng)不立即使用時，將過濾的水解物等分試樣凍結(jié)于_20°C。稀釋于含0.05%w/w苯甲酸的0.005MH2SO4中的樣品的糖濃度在用含0.05%w/w苯甲酸的0.005MH2SO4在60°C以0.6ml/分鐘的流速從4.6x250mmAM丨NEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)洗脫之后測量，其中通過將從純糖樣品(AbsoluteStandardsInc.，Hamden,CT,USA)校準(zhǔn)的折光率檢測(CHEMSrAl.ION,AG丨LENT1100HPLC,AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)所得的葡萄糖和纖維二糖信號進(jìn)行積分來進(jìn)行定量。所得的當(dāng)量用于計算對于每個反應(yīng)的纖維素轉(zhuǎn)化百分比。纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖加上纖維二糖的程度(轉(zhuǎn)化，%)使用下式計算轉(zhuǎn)化(%)=(葡萄糖+纖維二糖xl.053)(mg/ml)xl00xl62/(纖維素(mg/ml)xl80)=(葡萄糖+纖維二糖xl.053)(mg/ml)xlOO/(纖維素(mg/ml)xl.Ill)在該式中，因子I.Ill反映了在纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖中的重量增加，而因子1.053反映了在纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖中的重量增加。PCS中的纖維素通過PCS的限制消化以釋放葡萄糖和纖維二糖來確定。將增加量的土生梭孢殼多肽分別添加至基礎(chǔ)纖維素酶混合物的結(jié)果示于圖4。土生梭孢殼GH61J和GH61K在25%添加水平的添加分別提供了I.14和I.13的刺激因子。土生梭孢殼GH61L多肽在32%添加水平提供了I.13的刺激因子。實(shí)施例13:含有編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61M多肽的土生梭孢殼NRRL8126基因組序列的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼NRRL8126gh61m基因。使用IN-FUSIONCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體pAlLo2(W02004/099228)，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。Ttghlm-Fl(063567)5，-actggatttaccATGAAGCTGTCATCCCAGCTCGCC-3，(SEQIDNO:29)Ttgh61m-Rl(063568)5，-TCACCTCTAGTTAATTAACTAGCACTGAAAGACCGCCG'-3J(SEQIDNO:30)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)包含IOOng的土生梭孢殼NRRL8126基因組DNA，PfxAmplificationBuffer,各0.4mM的dATP，dTTP,dGTP,和dCTP，ImMMgCl2,和2.5單位的PfxDNA聚合酶，最終體積為50yl。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333進(jìn)行擴(kuò)增，其程序?yàn)镮個循環(huán)，在98°C進(jìn)行3分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在98°C進(jìn)行30秒，60°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行I.5分鐘。然后加熱塊進(jìn)入4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用TAE緩沖液分離，其中將1007bp的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MINELUTEGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入NcoI和PacI消化的pAlLo2，得到pSMail97(圖5)，其中土生梭孢殼gh61m基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。連接反應(yīng)(50uI)包含IXIN-FUSIONBuffer,IXBSA,IuIofIN-FUSIONSI(I:10稀釋)，IOOng用NcoIandPacI消化的pAlLo2,和50ng的土生梭抱殼gh61m純化的PCR產(chǎn)物。將反應(yīng)在室溫溫育30分鐘。使用一iiI的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlOSOLOPACKGoldSupercompetent細(xì)胞。含有pSMail97的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體通過限制性消化檢測,而質(zhì)粒DNA使用BIOROBOT9600制備。pSMail97中的土生梭孢殼gh61m插入通過DNA測序來確認(rèn)。亦將相同的1007bp土生梭孢殼gh61mPCR片段使用T0P0TACLONINGKit克隆入pCR_2.1-T0P0載體，以生成pSMai213。土生梭孢殼gh61m插入通過DNA測序確認(rèn)。大腸桿菌pSMai213于2009年8月3日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)石開究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA),并分配登錄號NRRLB-50300。實(shí)施例14:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61M多肽的土生梭孢殼NRRL8126基因組序列的表征土生梭抱殼NRRL8126gh61m基因組克隆的DNA測序用AppliedBiosystemsModel3700AutomatedDNASequencer使用版本3.1BIG-DYE終止子化學(xué)和dGTP化學(xué)和引物步移策略進(jìn)行。就品質(zhì)審視核苷酸序列數(shù)據(jù)，并以PHRED/PHRAP軟件的協(xié)助將所有序列互相比較。獲得的序列與來自JGI的序列相同。土生梭孢殼gh61m基因的核苷酸序列(SEQIDNO:7)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:8))示于圖6。編碼序列為977bp，包含終止密碼子，并由85，96，和124bp的內(nèi)含子間隔。編碼的預(yù)測的蛋白為223個氨基酸?；蚓幋a序列(包含內(nèi)含子)的％G+C為62.6%G+C,而成熟多肽編碼序列為62.2%。使用SignalP程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了19個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白含有204個氨基酸，具有22.2kDa的預(yù)測的分子量和6.58的等電點(diǎn)pH。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61M多肽的土生梭孢殼基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自Podosporaanserina的預(yù)測的￠-葡糖苷酶蛋白的推導(dǎo)的氨基酸序列(登錄號UniProtB2ADY5)分享76.5%的同一性(排除間隔)。實(shí)施例15:在米曲霉JaL355中表達(dá)土生梭孢殼NRRL8126家族61糖基水解酶61m基因米曲霉JaL355(TO2002/40694)原生質(zhì)體根據(jù)Christensen等，1988，見上的方法制備。將其用大約2iig的pSMail97轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化產(chǎn)生約17個轉(zhuǎn)化體。將十個轉(zhuǎn)化體分離至單個基本培養(yǎng)基平板。用5ml的0.01%TWEEN20洗滌每個轉(zhuǎn)化體的匯合的基本培養(yǎng)基平板，并分別接種入125ml玻璃搖瓶中的25ml的M410培養(yǎng)基，并在34°C，250rpm溫育。在5日溫育之后，用CRITERIONCell在CRITERIONTris-HCl凝膠上根據(jù)生產(chǎn)商的指示分析5ill的來自每個培養(yǎng)的上清。將所得的凝膠用BIO-SAFECoomassieStain染色。培養(yǎng)物的SDS-PAGE概貌顯示多數(shù)轉(zhuǎn)化體具有預(yù)期的22KDA條帶大小。用IOml的0.01%TWEEN80洗滌轉(zhuǎn)化體9的匯合的平板，并接種入含有500ml的M410培養(yǎng)基的2升Fernbach以生成用于表征酶的培養(yǎng)液。在第5日收獲培養(yǎng)物，并使用.22umEXPRESSPLUSMembrane過濾。實(shí)施例16:經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿的水解由具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼NRRL8126GH61M多肽增強(qiáng)培養(yǎng)液如實(shí)施例15中所述制備，并使用Amicon超濾裝置(Mi11ipore,Bedford,MA,USA,IOkDa聚醚砜膜，40psi,4°C)濃縮大約20倍。在SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色之后通過光密度法估計蛋白濃度。如W02005/074647中所述預(yù)處理玉米秸桿并將其作為測定底物制備，以生成經(jīng)預(yù)處理玉米秸桿(PCS)。用于測定增強(qiáng)活性的基礎(chǔ)纖維素酶混合物從里氏木霉菌株SMA135(W02008/057637)制備。PCS的水解使用1.6ml深孔板(Axygen,SantaClara,CA,USA)使用I.0ml的總反應(yīng)體積和ImM硫酸錳_50mM乙酸鈉pH5.0中的50mg/ml的PCS濃度來進(jìn)行。將土生梭孢殼多肽(GH61M)以O(shè)至25%濃度范圍的基礎(chǔ)纖維素酶混合物的蛋白濃度分別添加至基礎(chǔ)纖維素酶混合物。溫育在50°C進(jìn)行72小時。測定重復(fù)進(jìn)行三次。離心等分試樣，并通過使用平板離心機(jī)(SORVALLThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)以3000rpm離心10分鐘(MULT丨SCREENHV0.45ym)來過濾上清液體。當(dāng)不立即使用時，將過濾的水解物等分試樣凍結(jié)于_20°C。稀釋于含0.05%w/w苯甲酸的0.005MH2SO4中的樣品的糖濃度在用含0.05%w/w苯甲酸的0.005MH2SO4在60°C以0.6ml/分鐘的流速從4.6x250mmAMINEXHPX-87H柱洗脫之后測量，其中通過將從純糖樣品(AbsoluteStandardsInc.,Hamden,CT,USA)校準(zhǔn)的折光率檢測所得的葡萄糖和纖維二糖信號進(jìn)行積分來進(jìn)行定量。所得的當(dāng)量用于計算對于每個反應(yīng)的纖維素轉(zhuǎn)化百分比。纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖加上纖維二糖的程度(轉(zhuǎn)化，％)使用下式計算轉(zhuǎn)化(%)=(葡萄糖+纖維二糖xl.053)(mg/ml)xIOOx162/(纖維素(mg/ml)xl80)=(葡萄糖+纖維二糖xl.053)(mg/ml)xlOO/(纖維素(mg/ml)xl.Ill)在該式中，因子I.Ill反映了在纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖中的重量增加，而因子1.053反映了在纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖中的重量增加。PCS中的纖維素通過PCS的限制消化以釋放葡萄糖和纖維二糖來確定。將增加量的土生梭孢殼GH61M多肽添加至基礎(chǔ)纖維素酶混合物的結(jié)果示于圖7。土生梭孢殼GH61M多肽在25%添加水平的添加提供了I.27的刺激因子。實(shí)施例17:含有用于土生梭孢殼家族GH61N基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼家族GH61N基因。使用IN-FUSIONCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體PA1L02，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。正向引物5’-ACTGGATTTACCATGCCTTCTTTCGCCTCCAA3(SEQIDNO:31)反向引物5，-TCACCTCTAGTTAATTAATCAGTTTGCCTCCTCAGCCC-3，(SEQIDNO:32)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)含有Iyg的土生梭孢殼基因組DNA，1XADVANTAGEGC-MeltLABuffer(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA),Iul的dATP，dTTP,dGTP,和dCTP的IOmM混合物，和I.25單位的ADVANTAGEGCGenomicLAPolymeraseMix(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA),最終體積為25yl。擴(kuò)增條件為一個循環(huán)，在94°C進(jìn)行I分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行30秒，60.5°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行I分鐘。然后將加熱塊維持在72°C進(jìn)行5分鐘，接著進(jìn)行4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物通過使用TAE緩沖液的I.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，其中將大約I.Ikb的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MINELUTEGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入pAlLo2。用NcoI和PacI消化載體。將片段通過使用TAE緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化，從凝膠切出，并使用QiAQU丨CK_GelExtractionKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)純化。在反應(yīng)中將基因片段和消化的載體合并在一起，得到表達(dá)質(zhì)粒PAG66，其中家族GH61N基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。重組反應(yīng)物(20ill)包含IXIN-FUSIONBuffer,IXBSA,I的IN-FUSION酶(1:10稀釋)，186叩用叱0I和PacI消化的pAlLo2，和96.6ng的土生梭孢殼GH6IN純化PCR產(chǎn)物。反應(yīng)在37°C溫育15分鐘，然后在50°C溫育15分鐘用40yl的TE緩沖液稀釋反應(yīng)物，并使用2.5iiI的稀釋反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOCompetent細(xì)胞(Stratagene,LaJolla,CA，USA)。通過限制酶消化鑒定了含有pAG66(GH61N基因)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并使用BIOROBOT9600制備質(zhì)粒DNA。亦使用TOPOTACLONINGKit將相同的I.Ikb土生梭孢殼gh61nPCR片段克隆入pCR'2.1-T0P0載體，以生成pAG68。通過DNA測序確認(rèn)了土生梭孢殼gh61n插入。大腸桿菌PAG68于2009年9月18日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)，并分配登錄號NRRLB-50320。實(shí)施例18:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61N多肽的土生梭孢殼基因組序列的表征具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼GH61N多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:9)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:10)示于圖8。基因組多核苷酸為1107bp，包含終止密碼子，并編碼368個氨基酸的多肽。全長編碼序列和成熟編碼序列的％G+C分別為68.1%和68.3%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了21個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟的蛋白含有347個氨基酸，具有35.OkDa的分子量。用Interproscan程序(Mulder等，2007，NucleicAcidsRes.35:D224_D228)分析具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61N多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列顯示所述GH61N多肽含有糖基水解酶家族61的特征序列(InterPro登錄號IPR005103)。該特征序列見于成熟多肽(Pfam登錄號PF03443)的大約殘基I至221。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示土生梭孢殼GH61N多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自黑曲霉的另一種預(yù)測的家族61糖基水解酶的推導(dǎo)的氨基酸序列(UniProt登錄號A2QZE1)分享72.3%的同一性(排除間隔)。實(shí)施例19:在米曲霉JaL355中表達(dá)編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61N多肽的土生梭孢殼基因組DNA。根據(jù)Christensen等，1988，見上的方法制備米曲霉JaL355原生質(zhì)體,將其用5yg的pAG43轉(zhuǎn)化。將三個轉(zhuǎn)化體分離至單獨(dú)的PDA平板。從三個轉(zhuǎn)化體每一個的起始轉(zhuǎn)化平板取栓，并分別添加至24孔板中的Iml的M410培養(yǎng)基，將其在34°C溫育。在溫育之后五日，使用CRITERION無染色，8-16%梯度SDS-PAGE,(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)根據(jù)生產(chǎn)商的指不分析來自每個培養(yǎng)的7.5ill的上清。培養(yǎng)物的SDS-PAGE概貌顯示幾個轉(zhuǎn)化體具有大約70kDa和35kDa的新的主要條帶。用5ml的0.01%JWEEN20洗滌兩個轉(zhuǎn)化體的匯合的PDA平板，并接種入五個含有IOOml的M410培養(yǎng)基的500mlErlenmeyer燒瓶，并溫育以生成用于表征酶的培養(yǎng)液。在第3日和第5日收獲燒瓶，并使用0.22iimstericup吸濾器(Mi11ipore,Bedford,MA,USA)過濾。實(shí)施例20:經(jīng)預(yù)處理的玉米秸桿的水解由具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼GH61N多肽增強(qiáng)培養(yǎng)液如實(shí)施例19中所述制備，并使用Amicon超濾裝置(Mi11ipore,Bedford,MA,USA,10kDa聚醚砜膜，40psi,4°C)濃縮大約20倍。在SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色之后通過光密度法估計蛋白濃度。如W02005/074647中所述預(yù)處理玉米秸桿并將其作為測定底物制備，以生成經(jīng)預(yù)處理玉米秸桿(PCS)。用于測定增強(qiáng)活性的基礎(chǔ)纖維素酶混合物從里氏木霉菌株SMA135(W02008/057637)制備。PCS的水解使用I.6ml深孔板(Axygen,SantaClara,CA)使用I.Oml的總反應(yīng)體積和ImM硫酸錳_50mM乙酸鈉pH5.0中的50mg/ml的PCS濃度來進(jìn)行。將土生梭孢殼多肽(GH61N)分別以0至100%濃度范圍的基礎(chǔ)纖維素酶混合物的蛋白濃度分別添加至基礎(chǔ)纖維素酶混合物。溫育在50°C進(jìn)行72小時。測定重復(fù)進(jìn)行三次。離心等分試樣，并通過使用平板離心機(jī)(SORVAT,T,(R)RT7,ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)以3000rpm離心10分鐘(MULTISCREENHV0.45um,Millipore,Billerica,MA,USA)來過濾上清液體。當(dāng)不立即使用時，將過濾的水解物等分試樣凍結(jié)于_20°C。稀釋于含0.05%w/w苯甲酸的0.005MH2SO4中的樣品的糖濃度在用含0.05%w/w苯甲酸的0.005MH2SO4在600C以0.6ml/分鐘的流速從4.6x250mmAMINEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)洗脫之后測量,其中通過將從純糖樣品(AbsoluteStandardsInc.，Hamden,CT,USA)校準(zhǔn)的折光率檢測(CHE.MSTATK)N_,AGILENTI則HPLC,AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)所得的葡萄糖和纖維二糖信號進(jìn)行積分來進(jìn)行定量。所得的當(dāng)量用于計算對于每個反應(yīng)的纖維素轉(zhuǎn)化百分比。纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖加上纖維二糖的程度(轉(zhuǎn)化，%)使用下式計算轉(zhuǎn)化(%)=(葡萄糖+纖維二糖xl.053)(mg/ml)xl00xl62/(纖維素(mg/ml)xl80)=(葡萄糖+纖維二糖xl.053)(mg/ml)xlOO/(纖維素(mg/ml)xl.Ill)在該式中，因子I.Ill反映了在纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖中的重量增加，而因子1.053反映了在纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖中的重量增加。PCS中的纖維素通過PCS的限制消化以釋放葡萄糖和纖維二糖來確定。將增加量的土生梭孢殼多肽分別添加至基礎(chǔ)纖維素酶混合物的結(jié)果示于圖9。土生梭孢殼GH61N在50%添加百分比的添加提供了I.30的最大刺激優(yōu)勢(maximumstimulatorybenefit)。實(shí)施例21:含有用于土生梭孢殼家族GH610基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼家族GH610基因。使用IN-FUSIONCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體PA1L02，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。正向引物5’-ACTGGATTTACCATGCCGCCCGCACTCCCTCA.-3'(SEQIDNO:33)反向引物5，-TCACCTCTAGTTAATTAACTAACCCCGCCGATCATACC-3，(SEQIDNO:34)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)含有IUg的土生梭孢殼基因組DNA，IXADVANTAGE(;C-MeltLABuffer,IiiI的dATP，dTTP,dGTP，和dCTP的IOmM混合物，和I.25單位的ADVANTAGEGCGenomicLAPolymeraseMix，最終體積為25iU。擴(kuò)增條件為一個循環(huán)，在94°C進(jìn)行I分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行30秒，60.5°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行I分鐘。然后將加熱塊維持在72°C進(jìn)行5分鐘，接著進(jìn)行4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用TAE緩沖液分離，其中將大約Ikb的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用M丨NELUTE(S)GelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入pAlLo2。用NcoI和PacI消化載體。將片段通過瓊脂糖凝膠電泳和QIAQUIC_IC_GelExtractionKit純化。在反應(yīng)中將基因片段和消化的載體合并在一起，得到表達(dá)質(zhì)粒PAG67，其中家族GH610基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。重組反應(yīng)物(20ill)包含IXIN-FUSIONBuffer,IX85八，1111的爪4舊1(^111酶(1:10稀釋)，1861^用叱0I和PacI消化的pAlLo2，和90.6ng的土生梭孢殼GH610純化PCR產(chǎn)物。反應(yīng)在37°C溫育15分鐘，然后在50°C溫育15分鐘用40ill的TE緩沖液稀釋反應(yīng)物，并使用2.5ill的稀釋反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOCompetent細(xì)胞。通過限制酶消化鑒定了含有pAG67(GH610基因)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體,并使用BIOROBOT9600制備質(zhì)粒DNA。亦使用TOPOTACLONINGKit將相同的Ikb土生梭孢殼gh61oPCR片段克隆入pCR2.1-T0P0載體，以生成pAG69。通過DNA測序確認(rèn)了土生梭孢殼gh61o插入。大腸桿菌PAG69于2009年9月18日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)，并分配登錄號NRRLB-50321。實(shí)施例22:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH610多肽的土生梭孢殼基因組序列的表征具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼GH610多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:11)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:12)示于圖10?；蚪M多核苷酸為993bp，包含終止密碼子，并編碼330個氨基酸的多肽。全長編碼序列和成熟編碼序列的％G+C均為69.4%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了24個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟的蛋白含有306個氨基酸，具有32.IkDa的分子量。用Interproscan程序(Mulder等，2007，見上)分析具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH610多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列顯示所述GH610多肽含有糖基水解酶家族61的特征序列(InterPro登錄號IPR005103)。該特征序列見于成熟多肽(Pfam登錄號PF03443)的大約殘基I至245。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示土生梭孢殼GH610成熟多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自Podosporaanserina的另一種預(yù)測的家族61糖基水解酶的推導(dǎo)的氨基酸序列(UniProt登錄號B2AVC8)分享56.5%的同一性(排除間隔)。實(shí)施例23:含有用于土生梭孢殼家族GH61P基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼家族GH61P基因。使用IN-FUSIONCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體pAlLo2(WO2005/074647)，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。正向引物5，-ACTGGATTTACCATGAAGACATTCACCGCCCTCCTG-3,(SEQIDNO:35)反向引物5，-TCACCTCTAGTTAATTAATCAGCAAGTAAAGACCGCCG_3，(SEQIDNO:36)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)含有Iyg的土生梭孢殼基因組DNA，IXADVANTAGE'GC-MeltLABuffer,IiiI的dATP，dTTP,dGTP，和dCTP的IOmM混合物，和I.25單位的ADVANTAGE_GCGenomicLAPolymeraseMix，最終體積為25iU。擴(kuò)增條件為一個循環(huán)，在94°C進(jìn)行I分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行30秒，58.5°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行5分鐘。然后將加熱塊維持在72°C進(jìn)行5分鐘，接著進(jìn)行4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用TAE緩沖液分離，其中將大約I.2kb的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MINE.LUTEGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入pAlLo2。用NcoI和PacI消化載體。將片段通過瓊脂糖凝膠電泳和Q丨AQUlCK⑧GelExtractionKit純化。在反應(yīng)中將基因片段和消化的載體合并在一起，得到表達(dá)質(zhì)粒PAG70，其中家族GH61P基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。重組反應(yīng)物(IOiU)包含IXIN-FUSIONBuffer,IXBSA,0.5uI的IN-FUSI0N酶(1:10稀釋)，93耶用叱0I和PacI消化的pAlLo2，和2yI的土生梭孢殼GH6IP純化PCR產(chǎn)物。反應(yīng)在37°C溫育15分鐘，然后在50°C溫育15分鐘用40yl的TE緩沖液稀釋反應(yīng)物,并使用2.I的稀釋反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOCompetent細(xì)胞。通過限制酶消化鑒定了含有pAG70(GH61P基因)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并使用BIOROBOT9600制備質(zhì)粒DNA。亦使用TOPOTACLONINGKit將相同的I.2kb土生梭孢殼gh61pPCR片段克隆入pCR2.1-T0P0載體，以生成pAG75。通過DNA測序確認(rèn)了土生梭孢殼gh61p插入。大腸桿菌PAG75于2009年9月18日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)，并分配登錄號NRRLB-50322。實(shí)施例24:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61P多肽的土生梭孢殼基因組序列的表征具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼GH61P多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:13)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:14)示于圖11?；蚪M多核苷酸為1221bp，包含終止密碼子，且編碼序列由231，75，和96bp的三個內(nèi)含子間隔。預(yù)測的編碼序列編碼236個氨基酸的多肽。全長編碼序列(包含內(nèi)含子)和成熟編碼序列的％G+C分別為60.2%和59.8%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了16個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟的蛋白含有220個氨基酸，具有23.6kDa的分子量。用Interproscan程序(Mulder等，2007，見上)分析具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61P多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列顯示所述GH61P多肽含有糖基水解酶家族61的特征序列(InterPro登錄號IPR005103)。該特征序列見于成熟多肽(Pfam登錄號PF03443)的大約殘基I至212。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示土生梭孢殼GH61P成熟多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自粗糙脈孢霉的另一種預(yù)測的家族61糖基水解酶的推導(dǎo)的氨基酸序列(UniProt登錄號Q7SA19)分享80.3%的同一性(排除間隔)。實(shí)施例25:含有用于土生梭孢殼家族GH61R基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼家族GH61R基因。使用IN-FUSIONCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體pAlLo2(W02005/074647)，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。正向引物5，-ACTGGATTTACCATGGCCTTGCTGCTCTTGGCAGGC-3,(SEQIDNO:37)反向引物5，-TCACCTCTAGTTAATTAATCACCCATCCCATATCGGCC_3，(SEQIDNO:38)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)含有Iyg的土生梭孢殼基因組DNA，IXADVANTAGEGC-MeltLABuffer,Iyl的dATP，dTTP,dGTP，和dCTP的IOmM混合物，和I.25單位的ADVANTAGEGCGenomicLAPolymeraseMix，最終體積為25Ul。擴(kuò)增條件為一個循環(huán)，在94°C進(jìn)行I分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行30秒，59.4°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行5分鐘。然后將加熱塊維持在72°C進(jìn)行5分鐘，接著進(jìn)行4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用TAE緩沖液分離，其中將大約Ikb的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MINELUTEGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入pAlLo2。用NcoI和PacI消化載體。將片段通過瓊脂糖凝膠電泳和Q丨AQU丨CKGelExtractionKit純化。在反應(yīng)中將基因片段和消化的載體合并在一起，得到表達(dá)質(zhì)粒PAG71，其中家族GH61R基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。重組反應(yīng)物(IOiU)包含IXIN-FUSIONBuffer,IXBSA,0.5uI的IN-FUSI0N酶(1:10稀釋)，93耶用叱0I和PacI消化的pAlLo2，和2yI的土生梭孢殼GH6IR純化PCR產(chǎn)物。反應(yīng)在37°C溫育15分鐘，然后在50°C溫育15分鐘用40yl的TE緩沖液稀釋反應(yīng)物,并使用2.I的稀釋反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOCompetent細(xì)胞。通過限制酶消化鑒定了含有pAG71(GH61R基因)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并使用BIOROBOT9600制備質(zhì)粒DNA。亦使用TOPOTACLONINGKit將相同的Ikb土生梭孢殼gh61rPCR片段克隆入pCR2.1-T0P0載體，以生成pAG76。通過DNA測序確認(rèn)了土生梭孢殼gh61r插入。大腸桿菌PAG76于2009年9月18日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)，并分配登錄號NRRLB-50323。實(shí)施例26:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61R多肽的土生梭孢殼基因組序列的表征具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼GH61P多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:15)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:16)示于圖12。基因組多核苷酸為933bp，包含終止密碼子，且編碼序列由72，53，和55bp的三個內(nèi)含子間隔。預(yù)測的編碼序列編碼250個氨基酸的多肽。全長編碼序列(包含內(nèi)含子)和成熟編碼序列的％G+C分別為61.8%和61.6%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了18個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟的蛋白含有232個氨基酸，具有26.OkDa的分子量。用Interproscan程序(Mulder等，2007，見上)分析具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61R多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列顯示所述GH61R多肽含有糖基水解酶家族61的特征序列(InterPro登錄號IPR005103)。該特征序列見于成熟多肽(Pfam登錄號PF03443)的大約殘基I至224。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示土生梭孢殼GH61R成熟多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自ChrysosporiumIucknowense的另一種預(yù)測的家族61糖基水解酶的推導(dǎo)的氨基酸序列(GeneSeqP登錄號AWI36233)分享72.8%的同一性(排除間隔)。實(shí)施例27:含有用于土生梭孢殼家族GH61S基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼家族GH61S基因。使用IN-FUSIONCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體PA1L02，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。正向引物5，-ACTGGATTTACCATGATGCCGTCCCTTGTTCGCTTC_3'(SEQIDNO:39)反向引物5’-TCACCTCTAGTTAATTAATCAACCATGTCTCCTGTCCC_3’(SEQIDNO:40)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)含有Iyg的土生梭孢殼基因組DNA，IXADVANTAGEGC-MeltLABuffer,IiiI的dATP，dTTP,dGTP，和dCTP的IOmM混合物，和I.25單位的ADVANTAGE.GCGenomicLAPolymeraseMix，最終體積為25Ul。擴(kuò)增條件為一個循環(huán)，在94°C進(jìn)行I分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行30秒，58.5°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行5分鐘。然后將加熱塊維持在72°C進(jìn)行5分鐘，接著進(jìn)行4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用TAE緩沖液分離，其中將大約I.3kb的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MINELUTEGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入pAlLo2。用NcoI和PacI消化載體。將片段通過瓊脂糖凝膠電泳和Q丨AQUICKGelExtractionKit純化。在反應(yīng)中將基因片段和消化的載體合并在一起，得到表達(dá)質(zhì)粒PAG72，其中家族GH61S基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。重組反應(yīng)物(IOiU)包含IXIN-FUSIONBuffer,IXBSA,0.5uI的IN-FUSI0N酶(1:10稀釋)，93耶用叱0I和PacI消化的pAlLo2，和2yI的土生梭孢殼GH6IS純化PCR產(chǎn)物。反應(yīng)在37°C溫育15分鐘，然后在50°C溫育15分鐘用40yl的TE緩沖液稀釋反應(yīng)物,并使用2.I的稀釋反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOCompetent細(xì)胞。通過限制酶消化鑒定了含有pAG72(GH61S基因)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并使用BIOROBOT9600制備質(zhì)粒DNA。亦使用TOPOTACLONINGKit將相同的I.3kb土生梭孢殼gh61sPCR片段克隆入pCR.2.1-T0P0載體，以生成pAG77。通過DNA測序確認(rèn)了土生梭孢殼gh61s插入。大腸桿菌PAG77于2009年9月18日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)，并分配登錄號NRRLB-50324。實(shí)施例28:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61S多肽的土生梭孢殼基因組序列的表征具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼GH61S多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:17)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:18)示于圖13。基因組多核苷酸為1584bp，包含終止密碼子，且編碼序列由64和83bp的兩個內(nèi)含子間隔。預(yù)測的編碼序列編碼478個氨基酸的多肽。全長編碼序列(包含內(nèi)含子)和成熟編碼序列的％G+C分別為63.9%和64.0%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了信號肽，但其確切位置不明確。絕大多數(shù)GH61成熟多肽以組氨酸殘基起始，因此最可能的信號肽是殘基I至22。預(yù)測的成熟的蛋白含有456個氨基酸，具有48.7kDa的分子量。用Interproscan程序(Mulder等，2007，見上)分析具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61S多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列顯示所述GH61S多肽含有糖基水解酶家族61的特征序列(InterPro登錄號IPR005103)。該特征序列見于成熟多肽(Pfam登錄號PF03443)的大約殘基108至222。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示土生梭孢殼GH61S成熟多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自球毛殼菌的另一種預(yù)測的家族61糖基水解酶的推導(dǎo)的氨基酸序列(UniProt登錄號Q2GZM2)分享65.1%的同一性(排除間隔)。實(shí)施例29:含有用于土生梭孢殼家族GH61T基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼家族GH61T基因。使用IN-FUSIONCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體PA1L02，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。正向引物5’-ACTGGATTTACCATGCAGCTCCTCGTGGGCTT3(SEQIDNO:41)反向引物5，-TCACCTCTAGTTAATTAATCAGCCACTCCACACCGGCG—3，(SEQIDNO:42)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)含有Iyg的土生梭孢殼基因組DNA，IXADVANTAGEGC-MeltLABuffer,IiiI的dATP，dTTP,dGTP，和dCTP的IOmM混合物，和I.25單位的ADVANTAGE.GCGenomicLAPolymeraseMix，最終體積為25Ul。擴(kuò)增條件為一個循環(huán)，在94°C進(jìn)行I分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行30秒，60.5°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行5分鐘。然后將加熱塊維持在72°C進(jìn)行5分鐘，接著進(jìn)行4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用TAE緩沖液分離，其中將大約900bp的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MiNELUTEGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入pAlLo2。用NcoI和PacI消化載體。將片段通過瓊脂糖凝膠電泳和QIAQUICIC_GelExtractionKit純化。在反應(yīng)中將基因片段和消化的載體合并在一起，得到表達(dá)質(zhì)粒PAG73，其中家族GH61T基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。重組反應(yīng)物(IOiU)包含IXIN-FUSIONBuffer,IXBSA,0.5iiI的IN-FUSI0N酶(1:10稀釋)，93ng用NcoI和PacI消化的pAlLo2，和2uI的土生梭孢殼GH61T純化PCR產(chǎn)物。反應(yīng)在37°C溫育15分鐘，然后在50°C溫育15分鐘用40ill的TE緩沖液稀釋反應(yīng)物，并使用2.5ill的稀釋反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOCompetent細(xì)胞。通過限制酶消化鑒定了含有pAG73(GH61T基因)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并使用BIOROBOT9600制備質(zhì)粒DNA。亦使用TOPOTACLONINGKit將相同的900bp土生梭孢殼gh61tPCR片段克隆入pCR'2.1-T0P0載體，以生成PAG78。通過DNA測序確認(rèn)了土生梭孢殼gh61t插入。大腸桿菌PAG78于2009年9月18日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)，并分配登錄號NRRLB-50325。實(shí)施例30:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61T多肽的土生梭孢殼基因組序列的表征具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼GH61T多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:19)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:20)示于圖14。基因組多核苷酸為868bp，包含終止密碼子，且編碼序列由76和99bp的兩個內(nèi)含子間隔。預(yù)測的編碼序列編碼230個氨基酸的多肽。全長編碼序列(包含內(nèi)含子)和成熟編碼序列的％G+C分別為61.5%和61.4%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了16個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟的蛋白含有214個氨基酸，具有23.IkDa的分子量。用Interproscan程序(Mulder等，2007，見上)分析具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61T多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列顯示所述GH61T多肽含有糖基水解酶家族61的特征序列(InterPro登錄號IPR005103)。該特征序列見于成熟多肽(Pfam登錄號PF03443)的大約殘基71至197。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氨基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示土生梭孢殼GH61T成熟多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自球毛殼菌的另一種預(yù)測的家族61糖基水解酶的推導(dǎo)的氨基酸序列(UniProt登錄號Q2GUT0)分享87.4%的同一性(排除間隔)。實(shí)施例31:含有用于土生梭孢殼家族GH61U基因的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計了如下所示的兩種合成的寡核苷酸引物以從實(shí)施例2中制備的基因組DNA來PCR擴(kuò)增土生梭孢殼家族GH61U基因。使用IN-FUSIONCloningKit以將片段直接克隆入表達(dá)載體PA1L02，而無需進(jìn)行限制性消化和連接。正向引物5，-ACTGGATTTACCATGAAGCTGTACCTGGCGGCCTTT-3'(SEQIDNO:43)反向引物5，-TCACCTCTAGTTAATTAATCAACCAGTCCACAGCGCTG_3，(SEQIDNO:44)粗體字母代表編碼序列。剩余序列同源于PAlLo2的插入位點(diǎn)。將五十皮摩爾的上述每種引物用于PCR反應(yīng)，所述反應(yīng)含有Iyg的土生梭孢殼基因組DNA，IXADVANTAGEGC-MeltLABuffer,Iyl的dATP，dTTP,dGTP,和dCTP的IOmM混合物，和I.25單位的ADVANTAGE'GCGenomicLAPolymeraseMix，最終體積為25Ul。擴(kuò)增條件為一個循環(huán)，在94°C進(jìn)行I分鐘；和30個循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行30秒，58.5°C進(jìn)行30秒，和72°C進(jìn)行5分鐘。然后將加熱塊維持在72°C進(jìn)行5分鐘，接著進(jìn)行4°C浸沒循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物在I.0%瓊脂糖凝膠上使用TAE緩沖液分離，其中將大約Ikb的產(chǎn)物條帶從凝膠切出，并使用MINELUTEGelExtractionKit根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入pAlLo2。用NcoI和PacI消化載體。將片段通過瓊脂糖凝膠電泳和QIAQUICKGelExtractionKit純化。在反應(yīng)中將基因片段和消化的載體合并在一起，得到表達(dá)質(zhì)粒PAG74，其中家族GH6IU基因的轉(zhuǎn)錄處于NA2-tpi啟動子的調(diào)控之下。重組反應(yīng)物(IOiU)包含IXIN-FUSIONBuffer,IXBSA,0.5iiI的IN-FUSI0N酶(1:10稀釋)，93ng用NcoI和PacI消化的pAlLo2,和2ill的土生梭孢殼GH61U純化PCR產(chǎn)物。反應(yīng)在37°C溫育15分鐘，然后在50°C溫育15分鐘用40ill的TE緩沖液稀釋反應(yīng)物，并使用2.5ill的稀釋反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOCompetent細(xì)胞。通過限制酶消化鑒定了含有pAG74(GH61U基因)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并使用BIOROBOT9600制備質(zhì)粒DNA。亦使用TOPOTACLONINGKit將相同的Ikb土生梭孢殼gh61uPCR片段克隆入pCR2.1-T0P0載體，以生成pAG79。通過DNA測序確認(rèn)了土生梭孢殼gh61j插入。大腸桿菌PAG79于2009年9月18日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter,Peoria,IL,USA)，并分配登錄號NRRLB-50326。實(shí)施例32:編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族GH61U多肽的土生梭孢殼基因組序列的表征具有纖維素分解增強(qiáng)活性的土生梭孢殼GH61U多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:21)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:22)示于圖15?；蚪M多核苷酸為1068bp，包含終止密碼子，且編碼序列由64，52，96和82bp的四個內(nèi)含子間隔。預(yù)測的編碼序列編碼257個氨基酸的多肽。全長編碼序列(包含內(nèi)含子)和成熟編碼序列的％G+C分別為59.7%和59.3%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測了19個殘基的信號肽。預(yù)測的成熟的蛋白含有238個氨基酸，具有26.6kDa的分子量。用Interproscan程序(Mulder等，2007，見上)分析具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61T多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列未顯示所述GH61U多肽含有糖基水解酶家族61的特征序列(InterPro登錄號IPR005103)。然而，針對Pfam數(shù)據(jù)庫的直接檢索產(chǎn)生了與GH61家族(Pfam登錄號PF03443)的明顯命中(significanthit)(4.3xl(T8的e值)。如EMBOSS的Needle程序中，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62矩陣執(zhí)行的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定了氛基酸序列的比較性逐對全局比對。比對顯示土生梭孢殼GH61U成熟多肽的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自球毛殼菌的另一種預(yù)測的家族61糖基水解酶的推導(dǎo)的氨基酸序列(UniProt登錄號Q2HHT1)分享74.4%的同一性(排除間隔)。生物材料的保藏下述的生物材料已經(jīng)依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)，Peoria,IL,USA,并給予下述的登錄號保藏登錄號保藏日期大腸桿菌(pSMai216)NRRLB-503012009年7月15日大腸桿菌(pSiV1ai217)NRRLB-503022009年7月15日大腸桿菌(pSiV1ai218)NRRLB-503032009年7月15日大腸桿菌(pSiV1ai213)NRRLB-503002009年7月15日大腸桿菌(pAG68)NRRLB-503202009年9月18日大腸桿菌(pAG69)NRRLB-503212009年9月18日大腸桿菌(pAG75)NRRLB-503222009年9月18日大腸桿菌(pAG76)NRRLB-503232009年9月18日大腸桿菌(pAG77)NRRLB-503242009年9月18日大腸桿菌(pAG78)NRRLB-503252009年9月18日大腸桿菌(pAG79)NRRLB-503262009年9月18日所述菌株于下述條件下保藏確保在本專利申請未決期間，依據(jù)該外國專利法律的授權(quán)的人能夠獲得所述培養(yǎng)物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本，或其后續(xù)文本的國家，依據(jù)該外國專利法律可以獲得所述保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對實(shí)施本發(fā)明的許可，實(shí)施本發(fā)明是對政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。通過下述段落進(jìn)一步描述本發(fā)明[I]一種具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其具有與SEQIDNO:2,SEQIDNO:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽至少60%序列同一性；與SEQIDN0:4的成熟多肽至少65%序列同一性；與SEQIDNO:18的成熟多肽至少70%序列同一性；與SEQIDNO:10,SEQIDN0:16，或SEQIDN0:22的成熟多肽至少75%序列同一性；與SEQIDNO:8的成熟多肽至少80%序列同一性；與SEQIDNO:14的成熟多肽至少85%序列同一性；或者與SEQIDNO:20的成熟多肽至少90%序列同；性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等-高，高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:I,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDN0:1，SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDN0:11,或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；在高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:7,SEQIDN0:9,SEQIDNO:13,SEQIDN0:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或者在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交i)SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；(C)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸具有與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5，或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列至少60%序列同一性；與SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列至少65%序列同一性；與SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列至少70%序列同一性；與SEQIDN0:9,SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列至少75%序列同一性；與SEQIDN0:7的成熟多肽編碼序列至少80%序列同一性；與SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列至少85%序列同一性；或者與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列至少90%序列同一性；或者其cDNA序列；(d)變體，其包含SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的成熟多肽的一個或多個(幾個)氨基酸的取代，缺失，和/或插入；和(e)(a)，(b)，(C)，或(d)的多肽具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。[2]段I的多肽，其與SEQIDNO:2，SEQIDNO:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽具有至少60%序列同一性。[3]段2的多肽，其與SEQIDNO:2,SEQIDNO:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽具有至少65%序列同一性。[4]段3的多肽，其與SEQIDNO:2,SEQIDNO:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽具有至少70%序列同一性。[5]段4的多肽，其與SEQIDNO:2,SEQIDN0:6，或SEQIDN0:12的成熟多肽具有至少75%序列同一性。[6]段5的多肽，其與SEQIDNO:2,SEQIDNO:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽具有至少80%序列同一性。[7]段6的多肽，其與SEQIDNO:2,SEQIDNO:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽具有至少85%序列同一性。[8]段7的多肽，其與SEQIDNO:2,SEQIDN0:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽具有至少90%序列同一性。[9]段8的多肽，其與SEQIDNO:2,SEQIDN0:6，或SEQIDN0:12的成熟多肽具有至少95%序列同一性。[10]段9的多肽，其與SEQIDN0:2,SEQIDN0:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽具有至少97%序列同一性。[11]段I的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少65%序列同一性。[12]段11的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70%序列同一性。[13]段12的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少75%序列同一性。[14]段13的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少80%序列同一性。[15]段14的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少85%序列同一性。[16]段15的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少90%序列同一性。[17]段16的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少95%序列同一性。[18]段17的多肽，其與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少97%序列同一性。[19]段I的多肽，其與SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少70%序列同一性。[20]段19的多肽，其與SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少75%序列同一性。[21]段20的多肽，其與SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少80%序列同一性。[22]段21的多肽，其與SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少85%序列同一性。[23]段22的多肽，其與SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少90%序列同一性。[24]段23的多肽，其與SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少95%序列同一性。[25]段24的多肽，其與SEQIDNO:18的成熟多肽具有至少97%序列同一性。[26]段I的多肽，其與SEQIDNO:10,SEQIDNO:16，或SEQIDNO:22的成熟多肽具有至少75%序列同一丨丨生。[27]段26的多肽，其與SEQIDNO:10,SEQIDNO:16，或SEQIDNO:22的成熟多肽具有至少80%序列同一性。[28]段27的多肽，其與SEQIDNO:10，SEQIDNO:16，或SEQIDNO:22的成熟多肽具有至少85%序列同一性。[29]段28的多肽，其與SEQIDNO:10，SEQIDNO:16，或SEQIDNO:22的成熟多肽具有至少90%序列同一性。[30]段29的多肽，其與SEQIDNO:10,SEQIDNO:16，或SEQIDNO:22的成熟多肽具有至少95%序列同一性。[31]段30的多肽，其與SEQIDNO:10，SEQIDNO:16，或SEQIDNO:22的成熟多肽具有至少97%序列同一性。[32]段I的多肽，其與SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少80%序列同一性。[33]段32的多肽，其與SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少85%序列同一性。[34]段33的多肽，其與SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少90%序列同一性。[35]段34的多肽，其與SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少95%序列同一性。[36]段35的多肽，其與SEQIDNO:8的成熟多肽具有至少97%序列同一性。[37]段I的多肽，其與SEQIDNO:14的成熟多肽具有至少85%序列同一性。[38]段37的多肽，其與SEQIDNO:14的成熟多肽具有至少90%序列同一性。[39]段38的多肽，其與SEQIDNO:14的成熟多肽具有至少95%序列同一性。[40]段39的多肽，其與SEQIDNO:14的成熟多肽具有至少97%序列同一性。[41]段I的多肽，其與SEQIDNO:20的成熟多肽具有至少90%序列同一性。[42]段41的多肽，其與SEQIDNO:20的成熟多肽具有至少95%序列同一性。[43]段42的多肽，其與SEQIDNO:20的成熟多肽具有至少97%序列同一性。[44]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:I,SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。[45]段44的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:I，SEQIDN0:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。[46]段45的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:I,SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。[47]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。[48]段47的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。[49]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。[50]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I,SEQIDNO:5，或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少60%序列同一性。[51]段50的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5,或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少65%序列同一性。[52]段51的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5，或SEQIDNOill的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少70%序列同一性。[53]段52的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5，或SEQIDNOill的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少75%序列同一性。[54]段53的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5，或SEQIDN0:11的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少80%序列同一性。[55]段54的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5，或SEQIDNOill的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少85%序列同一性。[56]段55的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5，或SEQIDN0:11的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少90%序列同一性。[57]段56的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5，或SEQIDNOill的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少95%序列同一性。[58]段57的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:I,SEQIDN0:5，或SEQIDNOill的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少97%序列同一性。[59]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少65%序列同一性。[60]段59的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少70%序列同一性。[61]段60的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少75%序列同一性。[62]段61的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少80%序列同一性。[63]段62的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少85%序列同一性。[64]段63的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少90%序列同一性。[65]段64的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少95%序列同一性。[66]段65的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少97%序列同一性。[67]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少70%序列同一性。[68]段67的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少75%序列同一性。[69]段68的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:17的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少80%序列同一性。[70]段69的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:17的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少85%序列同一性。[71]段70的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:17的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少90%序列同一性。[72]段71的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少95%序列同一性。[73]段72的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:17的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少97%序列同一性。[74]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:9,SEQIDN0:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少75%序列同一性。[75]段74的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:9,SEQIDN0:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少80%序列同一性。[76]段75的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:9,SEQIDN0:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少85%序列同一性。[77]段76的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:9,SEQIDN0:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少90%序列同一性。[78]段77的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:9,SEQIDN0:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少95%序列同一性。[79]段78的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:9,SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少97%序列同一性。[80]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:7的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少80%序列同一性。[81]段80的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少85%序列同一性。[82]段81的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少90%序列同一性。[83]段82的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少95%序列同一性。[84]段83的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少97%序列同一性。[85]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少85%序列同一性。[86]段85的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:13的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少90%序列同一性。[87]段86的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:13的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少95%序列同一性。[88]段87的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:13的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少97%序列同一性。[89]段I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少90%序列同一性。[90]段89的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:19的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少95%序列同一性。[91]段90的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDN0:19的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列具有至少97%序列同一性。[92]段1-91任一項的多肽，包含或組成為SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22。[93]段1-91任一項的多肽，包含或組成為SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的成熟多肽。[94]段93的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸18至246，SEQIDNO:4的氨基酸20至334，SEQIDNO:6的氨基酸18至227，SEQIDN0:8的氨基酸20至223，SEQIDNO:10的氨基酸22至368，SEQIDNO:12的氨基酸25至330，SEQIDNO:14的氨基酸17至236，SEQIDNO:16的氨基酸19至250，SEQIDNO:18的氨基酸23至478，SEQIDNO:20的氨基酸17至230，或SEQIDNO:22的氨基酸20至257。[95]段I的多肽，其為SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，或SEQIDNO:22的片段，其中所述片段具有纖維素分解增強(qiáng)活性。[96]段I的多肽,其由多核苷酸編碼,所述多核苷酸包含于pSMai216,其包含于大腸桿菌NRRLB-50301;所述多核苷酸包含于pSMai217，其包含于大腸桿菌NRRLB-50302；所述多核苷酸包含于pSMai218，其包含于大腸桿菌NRRLB-50303;所述多核苷酸包含于pSMai213，其包含于大腸桿菌NRRLB-50300;所述多核苷酸包含于pAG68，其包含于大腸桿菌NRRLB-50320;所述多核苷酸包含于pAG69，其包含于大腸桿菌NRRLB-50321;所述多核苷酸包含于PAG75，其包含于大腸桿菌NRRLB-50322;所述多核苷酸包含于pAG76，其包含于大腸桿菌NRRLB-50323;所述多核苷酸包含于pAG77，其包含于大腸桿菌NRRLB-50324；所述多核苷酸包含于PAG78，其包含于大腸桿菌NRRLB-50325;或所述多核苷酸包含于pAG79，其包含于大腸桿菌NRRLB-50326。[97]一種組合物，其包含段1-96任一項的多肽。[98]一種分離的多核苷酸,其編碼段1-96任一項的多肽。[99]一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其包含段98的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于一個或多個(幾個)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)所述多肽在表達(dá)宿主中的產(chǎn)生。[100]一種重組宿主細(xì)胞，其包含段98的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于一個或多個調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)所述多肽的產(chǎn)生。[101]一種產(chǎn)生段1-96任一項的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。[102]一種產(chǎn)生具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含段98的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。[103]一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼段1-96任一項的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。[104]一種產(chǎn)生具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)段103的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。[105]一種產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，包括使編碼段1-96任一項的多肽的多核苷酸失活，其導(dǎo)致所述突變體與親本細(xì)胞相比較產(chǎn)生較少的多肽。[106]一種突變體細(xì)胞，其由段105的方法產(chǎn)生。[107]段106的突變體細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼天然或異源蛋白的基因。[108]一種產(chǎn)生蛋白的方法，其包括(a)在有助于所述蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)段106或107的突變體細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白。[109]一種雙鏈抑制RNA(dsRNA)分子，其包含段98的多核苷酸的亞序列，其中dsRNA任選地為siRNA或miRNA分子。[110]段109的雙鏈抑制RNA(dsRNA)分子，其為長約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更長的雙鏈體核苷酸。[111]一種抑制具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)段109或110的雙鏈RNA(dsRNA)分子。[112]一種通過段111的方法產(chǎn)生的細(xì)胞[113]段111的細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼天然或異源蛋白的基因。[114]一種產(chǎn)生蛋白的方法，其包括(a)在有助于蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)段112或113的細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白。[115]一種分離的多核苷酸，其編碼信號肽，所述信號肽包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸I至17，SEQIDNO:4的氨基酸I至19，SEQIDNO:6的氨基酸I至17，SEQIDNO:8的氨基酸I至19，SEQIDNO:10的氨基酸I至21，SEQIDNO:12的氨基酸I至24，SEQIDNO:14的氨基酸I至16，SEQIDNO:16的氨基酸I至18，SEQIDNO:18的氨基酸I至22，SEQIDNO:20的氨基酸I至16，或SEQIDNO:22的氨基酸I至19。[116]一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其包含編碼蛋白的基因，所述基因可操作地連接于段115的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號肽的多核苷酸是外源的。[117]一種重組宿主細(xì)胞，其包含段115的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號肽的多核苷酸是外源的。[118]一種產(chǎn)生蛋白的方法，其包括(a)在有助于所述蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含段115的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號肽的多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白。[119]一種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括在段1-96任一項的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。[120]段119的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。[121]段119或120的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。[122]段121的方法，其中所述纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶。[123]段121的方法，其中所述半纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[124]段119-123任一項的方法，進(jìn)一步包括回收經(jīng)降解的纖維素材料。[125]段124的方法，其中所述經(jīng)降解的材料是糖。[126]段125的方法，其中所述糖選自下組葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。[127]一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法,包括(a)在段1_96任一項具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。[128]段127的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。[129]段127或128的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。[130]段129的方法，其中所述纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶。[131]段129的方法，其中所述半纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[132]段127-131任一項的方法，其中步驟(a)和(b)在同時糖化和發(fā)酵中同時進(jìn)行。[133]段127-132任一項的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。[134]一種發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料經(jīng)在段1-96任一項的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物的糖化。[135]段134的方法，其中所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。[136]段135的方法，進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[137]段134-136任一項的方法，其中所述纖維素材料在糖化之前經(jīng)預(yù)處理。[138]段134-137任一項的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的酶纖維素酶、半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶和膨脹素。[139]段138的方法，其中所述纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和3-葡糖苷酶。[140]段138的方法，其中所述半纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。[141]段134-140任一項的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。[142]一種洗滌劑組合物，其包含段1-96任一項的多肽，和表面活性劑。[143]段142的組合物，進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶淀粉酶、阿拉伯糖酶、糖酶、纖維素酶、角質(zhì)酶、半乳聚糖酶、半纖維素酶、漆酶、脂質(zhì)酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果膠酶、蛋白酶和木聚糖酶。[144]段142或143的方法，其配制為棒型或條形劑(bar)、片劑、散劑、顆粒劑、糊劑或液體。[145]一種用于清理或洗滌硬表面或衣物的方法，所述方法包括將所述硬表面或所述引物與段142-144任一項的組合物相接觸。本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文公開的具體方面的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些方面旨在作為本發(fā)明幾個方面的說明。旨在將任何等同的方面包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改也旨在落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準(zhǔn)。權(quán)利要求1.一種分離的多肽，其具有纖維素分解增強(qiáng)活性，選自下組(a)多肽其具有與SEQIDNO:2,SEQIDN0:6，或SEQIDNO:12的成熟多肽至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%,至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；與SEQIDNO:4的成熟多肽至少65%，例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；與SEQIDNO:18的成熟多肽至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；與SEQIDNO:10,SEQIDNO:16，或SEQIDNO:22的成熟多肽至少75%，例如，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；與SEQIDNO:8的成熟多肽至少80%，例如，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%,至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；與SEQIDNO:14的成熟多肽至少85%，例如，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；或者與SEQIDNO:20的成熟多肽至少90%，例如，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一I"生;(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等-高，高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:11，或SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；在高或非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:7,SEQIDNO:9,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，或SEQIDN0:21的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；或者在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交i)SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；(c)一種多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸具有與SEQIDN0:1,SEQIDN0:5，或SEQIDNO:11的成熟多肽編碼序列至少60%，至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列至少65%，例如，至少70%，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；與SEQIDNO:17的成熟多肽編碼序列至少70%，例如，至少75%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%,至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；與SEQIDNO:9，SEQIDNO:15，或SEQIDNO:21的成熟多肽編碼序列至少75%，例如，至少80%,至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性’與SEQIDNO:7的成熟多肽編碼序列至少80%，例如，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；與SEQIDNO:13的成熟多肽編碼序列至少85%，例如，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%序列同一性；或者與SEQIDNO:19的成熟多肽編碼序列至少90%，例如，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的序列同一性；或其cDNA序列；(d)變體，其包含SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO:10，SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDN0:20，或SEQIDNO:22的成熟多肽的一個或多個(幾個)氨基酸的取代，缺失，和/或插入；和(e)(a),(b)，(c)，或(d)的多肽具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段。2.權(quán)利要求I的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含于pSMai216,其包含于大腸桿菌NRRLB-50301;所述多核苷酸包含于pSMai217，其包含于大腸桿菌NRRLB-50302；所述多核苷酸包含于pSMai218，其包含于大腸桿菌NRRLB-50303;所述多核苷酸包含于pSMai213，其包含于大腸桿菌NRRLB-50300;所述多核苷酸包含于pAG68，其包含于大腸桿菌NRRLB-50320;所述多核苷酸包含于pAG69，其包含于大腸桿菌NRRLB-50321;所述多核苷酸包含于PAG75，其包含于大腸桿菌NRRLB-50322;所述多核苷酸包含于pAG76，其包含于大腸桿菌NRRLB-50323;所述多核苷酸包含于pAG77，其包含于大腸桿菌NRRLB-50324；所述多核苷酸包含于PAG78，其包含于大腸桿菌NRRLB-50325;或所述多核苷酸包含于pAG79，其包含于大腸桿菌NRRLB-50326。3.一種組合物，其包含權(quán)利要求I或2的多肽。4.一種分離的多核苷酸,其編碼權(quán)利要求I或2的多肽。5.一種重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于一個或多個調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)所述多肽在表達(dá)宿主中的產(chǎn)生。6.—種產(chǎn)生權(quán)利要求I或2的多肽的方法,其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。7.—種產(chǎn)生具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求4的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。8.—種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼權(quán)利要求I或2的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。9.一種產(chǎn)生具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。10.一種產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，包括使編碼權(quán)利要求I或2的多肽的多核苷酸失活，其導(dǎo)致所述突變體與親本細(xì)胞相比較產(chǎn)生較少的多肽。11.一種雙鏈抑制RNA(dsRNA)分子，其包含權(quán)利要求4的多核苷酸的亞序列，其中dsRNA任選地為siRNA或miRNA分子。12.—種抑制具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求11的雙鏈抑制RNA(dsRNA)分子。13.一種分離的多核苷酸，其編碼信號肽，所述信號肽包含或組成為SEQIDNO:2的氨基酸I至17，SEQIDNO:4的氨基酸I至19，SEQIDNO:6的氨基酸I至17，SEQIDNO:8的氨基酸I至19，SEQIDNO:10的氨基酸I至21，SEQIDNO:12的氨基酸I至24，SEQIDNO:14的氨基酸I至16，SEQIDNO:16的氨基酸I至18，SEQIDNO:18的氨基酸I至22，SEQIDNO:20的氨基酸I至16，或SEQIDNO:22的氨基酸I至19。14.一種產(chǎn)生蛋白的方法，其包括(a)在有助于所述蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求13的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號肽的多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白。15.一種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括在權(quán)利要求I或2的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。16.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括回收經(jīng)降解的纖維素材料。17.一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在權(quán)利要求I或2的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。18.—種發(fā)酵纖維素材料的方法,包括用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料經(jīng)在權(quán)利要求I或2的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物的糖化。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。20.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。21.一種洗滌劑組合物，其包含權(quán)利要求I或2的多肽，和表面活性劑。全文摘要本發(fā)明涉及具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。文檔編號C11D3/386GK102770534SQ201080052019公開日2012年11月7日申請日期2010年9月16日優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日發(fā)明者P.哈里斯,R.克雷默,S.梅于蘭申請人:諾維信股份有限公司