具有脂肪酶活性的多肽及編碼它的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有脂肪酶活性的分離的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體、載體以及包括這些多核苷酸的宿主細(xì)胞連同產(chǎn)生和使用這些多肽的方法。
【專利說明】具有脂肪酶活性的多肽及編碼它的多核苷酸
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申請包括一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。
[0003] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及具有脂肪酶活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及核 酸構(gòu)建體、載體以及包括這些多核苷酸的宿主細(xì)胞連同產(chǎn)生和使用這些多肽的方法。
[0005] 相關(guān)技術(shù)說明
[0006] 本發(fā)明提供具有脂肪酶活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸。披露于 Glogauer (葛羅高爾）等人 Microbial Cell Factories(微生物細(xì)胞工廠）2011, 10:54 中 的脂肪酶示出與SEQ ID NO:2具有91. 8%的氨基酸序列一致性。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明涉及選自下組的具有脂肪酶活性的分離的多肽，該組由以下各項(xiàng)組成：
[0009] (a)具有與SEQ ID NO:2的成熟多肽至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、 至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的一種多肽；
[0010] (b) -種多肽，該多肽是由一種多核苷酸編碼的，該多核苷酸在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、 中嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、高嚴(yán)謹(jǐn)度格條件下或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與（i) SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列、或（ii)⑴的全長補(bǔ)體雜交；
[0011] (C) -種多肽，該多肽是由一種多核苷酸編碼的，該多核苷酸具有與SEQ ID NO: 1 的成熟多肽編碼序列至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性；
[0012] (d) (a)、（b)或（C)的多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)位置處包括取代、缺 失、和/或插入；以及
[0013] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有脂肪酶活性。
[0014] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸；核酸構(gòu)建體；重組表達(dá)載 體；包括這些多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些多肽的方法。
[0015] 本發(fā)明還涉及多種組合物、生產(chǎn)一種組合物的方法、清潔一個(gè)表面的方法、以及水 解一種脂質(zhì)的方法。
[0016] 定義
[0017] 在詳細(xì)描述本發(fā)明的組合物和方法之前，為了清楚，定義了以下術(shù)語。未定義的術(shù) 語和縮寫應(yīng)與如在本領(lǐng)域中使用的它們普通含義一致。
[0018] 脂肪酶：術(shù)語"脂肪酶（lipase、lipase enzyme) "，"脂肪分解酶"，"脂質(zhì)酯酶"， "脂肪分解多肽"，和"脂肪分解蛋白"是指如由酶命名法定義的類別EC3. 1，1中的一種酶。 它可以具有脂肪酶活性，該脂肪酶活性包括但不局限于甘油三酯脂肪酶活性（EC3. 1. 1.3)、 甘油單酯脂肪酶活性（EC3. I. 1. 23)、磷脂酶活性（若干個(gè)EC)、溶血磷脂酶活性、阿魏酸酯 酶活性、角質(zhì)酶活性（EC3. I. 1. 74)、留醇酯酶活性（EC3. I. 1. 13)和/或蠟-酯水解酶活性 (EC3. 1.1.50)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)實(shí)例中所述的程序確定脂肪酶活性。在一個(gè)方面， 本發(fā)明的變體具有SEQ ID N0:2的成熟多肽的脂肪酶活性的至少20%、例如至少25%、至 少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少100%。
[0019] 等位基因變體：術(shù)語"等位基因變體"是指占用同一染色體位點(diǎn)的一種基因的兩個(gè) 或更多個(gè)替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多 態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊模ㄔ谒幋a的多肽中沒有改變）或可編碼具有改變的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0020] 催化結(jié)構(gòu)域：術(shù)語"催化結(jié)構(gòu)域"是指一種酶的含有該酶的催化機(jī)構(gòu)的區(qū)域。
[0021] CDNA :術(shù)語"CDNA"是指可以通過得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子 的反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早先 的初始RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟 進(jìn)行加工，包括剪接。
[0022] 編碼序列：術(shù)語"編碼序列"是指直接指定一個(gè)多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編 碼序列的邊界一般由一個(gè)開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從一個(gè)起始密碼子（如ATG、 GTG或TTG)開始并且以一個(gè)終止密碼子（如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是一種 基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0023] 控制序列：術(shù)語"控制序列"是指表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每個(gè)控制序列對于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是原生的（即，來自相同基 因）或外源的（即，來自不同基因），或相對于彼此是原生的或外源的。此類控制序列包括 但不局限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至 少，控制序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編 碼一種多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提 供有多個(gè)接頭。
[0024] 表達(dá)：術(shù)語"表達(dá)"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不局限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后 修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0025] 表達(dá)載體：術(shù)語"表達(dá)載體"是指一種直鏈或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼一種 多肽的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達(dá)的控制序列。
[0026] 片段：術(shù)語"片段"是指在一種成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一個(gè)或多 個(gè)（例如若干個(gè)）氨基酸的一種多肽；其中該片段具有脂肪酶活性。在一個(gè)方面，一個(gè)片段 含有成熟多肽的氨基酸數(shù)目的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。
[0027] 高嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語"高嚴(yán)謹(jǐn)度條件"是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針而 言，遵循標(biāo)準(zhǔn) DNA 印跡（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3% SDS、200 微 克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料 最終使用2X SSC、0. 2% SDS，在65°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0028] 宿主細(xì)胞：術(shù)語"宿主細(xì)胞"是指易于用包括本發(fā)明的一種多核苷酸的一種核酸構(gòu) 建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語"宿主細(xì)胞"涵蓋由于復(fù)制 期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0029] 分離的：術(shù)語"分離的"是指處于非天然存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì) 的非限制性實(shí)例包括（1)任何非天然存在的物質(zhì)；(2)至少部分地從與其在自然界中相關(guān) 聯(lián)的一種或多種或全部天然存在的組分中除去的任何物質(zhì)，包括但不局限于任何酶、變體、 核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；（3)相對于自然界中發(fā)現(xiàn)的那種物質(zhì)通過人工手動修飾的任何 物質(zhì)；或者（4)通過相對于與其天然相關(guān)聯(lián)的其他組分增加該物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì) (例如，編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動子更強(qiáng) 的啟動子的使用）。一種分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。
[0030] 低嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語"低嚴(yán)謹(jǐn)度條件"是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針 來說，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/毫升剪切并變性 的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2X SSC、 0. 2% SDS，在50°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0031] 成熟多肽：術(shù)語"成熟多肽"是指在翻譯和任何翻譯后修飾如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一個(gè)方面，成熟多肽是 SEQ ID NO:2的氨基酸1至292。
[0032] 成熟多肽編碼序列：術(shù)語"成熟多肽編碼序列"是指編碼具有脂肪酶活性的一種 成熟多肽的一種多核苷酸。在一個(gè)方面，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO: 1的核苷酸30至 905。
[0033] 中嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語"中嚴(yán)謹(jǐn)度條件"是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針而 言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切和變性的鮭精 DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2X SSC、0. 2% SDS， 在55 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0034] 中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語"中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件"是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸 的探針來說，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/毫升剪切 并變性的鮭魚精子DNA以及或者35%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終 使用2X SSC、0. 2% SDS，在60°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0035] 核酸構(gòu)建體：術(shù)語"核酸構(gòu)建體"意指單鏈-或雙鏈核酸分子，其分離自天然存在 的基因，或其被修飾成以本來在自然界中不存在的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的，其 包含一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0036] 可操作地連接：術(shù)語"可操作地連接"是指一種配置，其中一個(gè)控制序列相對于一 種多核苷酸的編碼序列放置在一個(gè)適當(dāng)位置處，以使得控制序列指引編碼序列的表達(dá)。
[0037] 序列一致性：兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)"序列 一致性"描述。
[0038] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件套 件，Rice (賴斯）等人，2000, Trends Genet.(遺傳學(xué)趨勢）16:276-277)(優(yōu)選 5.0.0 版 或更新版本）的Needle(尼德爾）程序中所實(shí)施的Needleman(尼德爾曼）_Wunsch(翁 施）算法（Needleman (尼德爾曼）和Wunsch (翁施），1970, J. Mol. Biol.(分子生物學(xué) 雜志）48:443-453)來確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。使用的這些參數(shù)是空位 開放罰分10、空位延伸罰分0. 5,以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。 Needle (尼德爾）標(biāo)注的"最長的一致性"的輸出（使用-非簡化選項(xiàng)獲得）被用作百分比 一致性，并且如下計(jì)算：
[0039](一致的殘基X IOOV (比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0040] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件， Rice (賴斯）等人，2000,同上）（優(yōu)選5. 0· 0版或更新版本）的Needle (尼德爾）程序中所 實(shí)施的Needleman (尼德爾曼）-Wunsch (翁施）算法（Needleman (尼德爾曼）和Wunsch (翁 施），1970,同上）來確定兩個(gè)脫氧核苷酸序列之間的序列一致性。使用的這些參數(shù)是空位 開放罰分10、空位延伸罰分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。 Needle (尼德爾）標(biāo)注的"最長的一致性"的輸出（使用-非簡化選項(xiàng)獲得）被用作百分比 一致性，并且如下計(jì)算：
[0041] (一致的脫氧核糖核苷酸X 100V (比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0042] 子序列：術(shù)語"子序列"意指使一個(gè)或多個(gè)（例如，若干個(gè)）核苷酸從成熟多肽編 碼序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸，其中該子序列編碼具有脂肪酶活性的一個(gè)片 段。在一個(gè)方面，一個(gè)片段含有編碼該成熟多肽的核苷酸的數(shù)目的至少50%、至少55%、至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。 [0043] 變體：術(shù)語"變體"是指具有脂肪酶活性的、在一個(gè)或多個(gè)（例如，若干個(gè)）位置處 包含改變（即取代、插入和/或缺失）的一個(gè)多肽。取代意指占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸替換 不同的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸；并且插入意指在鄰接并且緊隨占據(jù) 一個(gè)位置的氨基酸之后添加一個(gè)氨基酸。
[0044] 非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語"非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件"是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸 的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42 °C下在5X SSPE、0. 3 % SDS、200微克/ml剪切并 變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2X SSC、0. 2% SDS，在70°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0045] 非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語"非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件"是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸 的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42 °C下在5X SSPE、0. 3 % SDS、200微克/ml剪切并 變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2X SSC、0. 2% SDS，在45°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0046] 發(fā)明詳細(xì)說明
[0047] 具有脂肪酶活性的多肽
[0048] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少92%，例如至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序 列一致性的分離的多肽，這些分離的多肽具有脂肪酶活性。在一個(gè)方面，該多肽與SEQ ID N0:2 的成熟多肽相差不超過 24 個(gè)，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、或24個(gè)氨基酸。
[0049] 本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其等位基因變體或由其組 成；或是其具有脂肪酶活性的片段。在另一個(gè)方面，該多肽包括SEQ ID N0:2的成熟多肽或 由其組成。在另一個(gè)方面中，該多肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸1至292或由其組成。
[0050] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有脂肪酶活性的一種分離的多肽，該多肽是由 一種多核苷酸編碼的，該多核苷酸在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、中嚴(yán)謹(jǐn)度條 件下、中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與（i)SEQ ID N0:1 的成熟多肽編碼序列、或（ii) (i)的全長補(bǔ)體雜交（Sambrook(薩拉布魯克）等人，1989， Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊），第二版，Cold Spring Harbor (冷泉港），紐約）。
[0051] SEQ ID NO: 1的多核苷酸或其子序列，連同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根據(jù) 本領(lǐng)域熟知的方法用于設(shè)計(jì)核酸探針以鑒定和克隆來自不同屬或種的株系的、編碼具有脂 肪酶活性的多肽的DNA。具體而言，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，使用這類探針與感興趣的 細(xì)胞的基因組DNA或cDNA雜交，以便鑒別和分離其中的對應(yīng)基因。這類探針可以明顯短于 完整序列，但是長度應(yīng)為至少15,例如至少25、至少35、或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，該核 酸探針的長度為至少100個(gè)核苷酸，例如長度為至少200個(gè)核苷酸、至少300個(gè)核苷酸、至 少400個(gè)核苷酸、至少500個(gè)核苷酸、至少600個(gè)核苷酸、至少700個(gè)核苷酸、至少800個(gè)核 苷酸、或至少900個(gè)核苷酸。DNA和RNA探針都可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記（例如，用 3午、3!1、355、生物素、或抗生物素蛋白），以檢測相應(yīng)的基因。本發(fā)明涵蓋此類探針。
[0052] 可以針對與以上描述的探針雜交并且編碼出具有脂肪酶活性的多肽的DNA對從 這類其他菌株制備的基因組DNA或cDNA庫進(jìn)行篩選。來自這類其他菌株的基因組DNA或 其他DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術(shù)來分離。來自文庫的DNA 或分離的DNA可轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其他適合的載體材料上。為了鑒別與SEQ ID NO: 1或其子序列雜交的克隆或DNA，將載體材料用于DNA印跡中。
[0053] 出于本發(fā)明的目的，雜交表明多核苷酸在非常低到非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與一種被 標(biāo)記的核酸探針雜交，該探針對應(yīng)于（i) SEQ ID NO: l;(ii) SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序 列；（iii)其全長互補(bǔ)體；或（V)其子序列。可以使用例如X-射線膠片或本領(lǐng)域已知的任 何其他檢測手段來檢測在這些條件下該核酸探針?biāo)s交的分子。
[0054] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及具有脂肪酶活性的分離的多肽，該多肽是由一 種多核苷酸編碼的，該多核苷酸具有與SEQ ID NO: 1的成熟多肽編碼序列至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[0055] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在一個(gè)或多個(gè)（例如，若干個(gè)）位置處包括取代、 缺失、和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的變體。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在一 個(gè)或多個(gè)（例如，若干個(gè)）位置處包括取代、缺失、和/或插入的本發(fā)明的多肽的變體。在 一個(gè)實(shí)施例中，引入SEQ ID N0:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目不超 過 24,例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24個(gè)。 這些氨基酸變化可以具有微小性質(zhì)，即，不會顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守 氨基酸取代或插入；典型地1-30個(gè)氨基酸的較小缺失；較小的氨基-或羧基-末端延伸，如 氨基末端的甲硫氨酸殘基；多達(dá)20-25個(gè)殘基的較小接頭肽；或便于通過改變凈電荷或另 一種功能來純化的較小延伸，如聚組氨酸段（tract)、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0056] 保守取代的實(shí)例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸及組氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、異亮氨酸及纈氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘氨 酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸）。一般不會改變特異性活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域 已知的并且例如由H. Neurath (諾伊拉特）和R. L. Hill (希爾），1979在The Proteins (蛋 白質(zhì)），Academic Press (學(xué)術(shù)出版社），紐約中描述。常見取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/ Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、 Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly〇
[0057] 可替代地，氨基酸改變具有這樣一種性質(zhì)：改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基 酸改變可以提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH，等等。
[0058] 可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變（Cunningham(坎 寧漢）和Wells (威爾斯），1989, Science (科學(xué)）244:1081-1085)來鑒定多肽中的必需氨 基酸。在后一種技術(shù)中，在分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并且測試所得突變分 子的脂肪酶活性以鑒別對分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。還參見，Hilton(希爾頓）等人， 1996, J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志）271:4699-4708。也可結(jié)合假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突 變，如通過以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記進(jìn)行確定的對結(jié)構(gòu)進(jìn) 行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用。參見，例如，de Vos(德弗 斯）等人，1992, Science(科學(xué)）255:306-312 ;Smith(史密斯）等人，1992, J. Mol. Biol. (分子生物學(xué)雜志）224:899-904 ;Wlodaver (烏樂達(dá)維爾）等人，1992, FEBS Lett.(歐洲生 化學(xué)會聯(lián)合會快報(bào)）309:59-64。還可以從與相關(guān)多肽的比對來推斷鑒別必需氨基酸。可以 做出單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組的已知方法進(jìn) 行測試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，如由Reidhaar (里德哈爾）-Olson (奧爾森）和Sauer (薩 奧爾），1988，Science (科學(xué)）241:53-57 ;Bowie (博維）和 Sauer (薩奧爾），1989，Proc. NatLAcad Sci. USA (美國國家科學(xué)院院刊）86:2152-2156 ;W0 95/17413 ;或 WO 95/22625 披露的那些。其他可以使用的方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示（例如Lowman(洛曼）等人， 1991，Biochemistry (生物化學(xué)）30:10832-10837 ;US 5223409 ;W0 92/06204)以及區(qū)域定 向誘變（Derbyshire (德比什爾）等人，1986, Gene (基因）46:145 ;Ner (內(nèi)爾）等人，1988， DNA 7:127)。
[0059] 可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動化篩選方法來檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克 隆的、誘變的多肽的活性（Ness(內(nèi)斯）等人，1999, Nature Biotechnology(自然生物技 術(shù)）17:893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子可以回收自宿主細(xì)胞，并且使用本領(lǐng)域 的標(biāo)準(zhǔn)方法對其進(jìn)行迅速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。
[0060] 該多肽可以是一種雜合多肽，其中一種多肽的一個(gè)區(qū)域在另一種多肽的一個(gè)區(qū)域 的N-末端或C-末端處融合。
[0061] 該多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽在本發(fā)明多肽 的N-末端或C-末端處融合。通過將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷 酸而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽 的編碼序列，這樣使得它們在框內(nèi)并且使得融合多肽的表達(dá)處于相同的一個(gè)或多個(gè)啟動 子和終止子的控制下。融合多肽還可以使用內(nèi)蛋白技術(shù)來構(gòu)建，其中融合多肽在翻譯后 產(chǎn)生（Cooper(庫珀）等人，1993, EMBO J.(歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志）12:2575-2583 ; Dawson (道森）等人，1994, Science (科學(xué)）266:776-779)。
[0062] 融合多肽可以在兩個(gè)多肽之間進(jìn)一步包括一個(gè)切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌之 時(shí)，該位點(diǎn)被切割，從而釋放出這兩個(gè)多肽。裂解位點(diǎn)的實(shí)例包括但不局限于在以下各 項(xiàng)中披露的位點(diǎn)：Martin (馬?。┑热?，2003，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.(工業(yè)微 生物與生物技術(shù)雜志）3:568-576 ;Svetina(斯韋蒂納）等人，2000, J. Biotechnol.(生 物技術(shù)雜志）76:245-251 ;Rasmussen(拉斯馬森）_Wilson(威爾遜）等人，1997, Appl. Environ. Microbiol.(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)）63:3488-3493 ;Ward (沃德）等人，1995， Biotechnology (生物技術(shù)）13:498-503 ;以及 Contreras (孔特雷拉斯）等人，1991， Biotechnology (生物技術(shù)）9:378-381 ;Eaton(伊頓）等人，1986，Biochemistry (生物 化學(xué)）25:505-512 ;ColIins (柯林斯）-Racie (瑞思）等人，1995，Biotechnology (生 物技術(shù)）13:982-987 ;Carter(卡特）等人，1989，Proteins: Structure，F(xiàn)unction，and Genetics(蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)、功能與遺傳）6:240-248 ;以及Stevens(史蒂文斯），2003, Drug Discovery World(藥物發(fā)現(xiàn)的世界）4:35-48。
[0063] 具有脂肪酶活性多肽的來源
[0064] 本發(fā)明的具有脂肪酶活性的多肽可以從任何屬的微生物獲得。出于本發(fā)明的目 的，如在此結(jié)合一種給定的來源使用的術(shù)語"從...中獲得"應(yīng)是指由多核苷酸編碼的多肽 是由該來源或者由其中已經(jīng)插入來自該來源的多核苷酸的一種菌株產(chǎn)生的。在一個(gè)方面， 獲得自給定來源的多肽被分泌到細(xì)胞外。
[0065] 該多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，該多肽可以是一種革蘭氏陽性細(xì)菌多肽， 如具有脂肪酶活性的芽孢桿菌屬（Bacillus)、梭菌屬（Clostridium)、腸球菌屬 (Enterococcus)、土芽抱桿菌屬（Geobacillus)、乳酸桿菌屬屬（Lactobacillus)、乳球菌 屬（Lactococcus)、海洋芽抱桿菌屬（Oceanobacillus)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、 鏈球菌屬（Streptococcus)、或鏈霉菌屬（Streptomyces)多肽；或一種革蘭氏陰性細(xì) 菌多肽，如彎曲桿菌屬（Campylobacter)、西地西菌屬（Cedecea)、大腸桿菌（E. coli)、 黃桿菌屬（Flavobacterium)(例如約氏黃桿菌（Flavobacterium johnsoniae))、梭桿 菌屬（Fusobacterium)、螺旋桿菌屬（Helicobacter)、泥桿菌屬（Ilyobacter)、奈瑟氏 菌屬（Neisseria)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、沙門氏菌屬（Salmonella)、沙雷氏菌屬 (Serratia)或脲原體屬（Ureaplasma)多肽。
[0066] 在一個(gè)方面，該多肽是嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢 桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌（Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌（Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌（Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌（Bacillus lautus)、遲 緩芽抱桿菌（Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽抱 桿菌（Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、或蘇云金芽抱桿 菌（Bacillus thuringiensis)多月太。
[0067] 在另一個(gè)方面，該多肽是似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、或馬鏈球菌獸瘟 亞種多肽。
[0068] 在另一個(gè)方面，該多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈絲菌、 或變鉛青鏈霉菌多肽。
[0069] 在另一個(gè)方面，該多肽是一種戴氏西地西菌、拉氏西地西菌、西地西菌sp 001 (也 稱為西地西菌物種3)、奈氏西地西菌（以前稱為西地西菌物種4或西地西菌物種002)、西 地西菌sp 012 (也稱為西地西菌物種5)、或西地西菌sp-16640多肽。
[0070] 在另一個(gè)方面，該多肽是一種嗜蟲沙雷氏菌（Serratia entomophila)、無花 果沙雷氏菌（Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola)、格氏沙雷氏 菌（Serratia grimesii)、液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratia marcescens)、氣味沙雷氏菌（Serratia odorifera)、普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica)、變形班沙雷氏菌（Serratia proteamaculans)、食奎尼酸沙雷氏菌 (Serratia quinivorans)、深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea)、共生沙雷氏菌（Serratia symbiotica)多膚。
[0071] 該多肽可以是一種真菌多肽。例如，該多肽可以是酵母多肽，例如假絲酵 母屬（Candida)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、酵母菌屬 (Saccharomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬（Yarrowia) 多肽；或絲狀真菌多肽，例如枝頂孢霉屬（Acremonium)、傘菌屬（Agaricus)、鏈格孢 屬（Alternaria)、曲霉屬（Aspergillus)、短梗霉屬（Aureobasidium)、葡萄座腔菌 屬（Botryospaeria)、擬錯(cuò)菌屬（〇61'1。〇1'；!_〇^818)、毛_殼屬（Chaetomidium)、金抱子 菌屬（Chrysosporium)、麥角菌屬（Claviceps)、旋抱腔菌屬（Cochliobolus)、鬼傘 屬（Coprinopsis)、乳白蟻屬（Coptotermes)、棒囊殼屬（Corynascus)、隱叢赤殼菌屬 (Cryphonectria)、隱球菌屬（Cryptococcus)、色二抱屬（Diplodia)、黑耳屬（Exidia)、 線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮刀菌屬（Fusarium)、赤霉屬（Gibberella)、全鞭毛蟲 屬（Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、耙齒菌屬（Irpex)、蘑燕屬（Lentinula)、 小腔球菌屬（Leptospaeria)、梨抱菌屬（Magnaporthe)、黑果菌屬（Melanocarpus)、 多孔菌屬（Meripilus)、毛霉屬（Mucor)、毀絲霉屬（Myceliophthora)、新美鞭菌 屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、擬青霉屬（Paecilomyces)、青霉菌 屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬（Piromyces)、某真菌屬 (Poitrasia)、假黑盤菌屬（Pseudoplectania)、假披發(fā)蟲屬（Pseudotrichonympha)、 根毛霉菌屬（Rhizomucor)、裂糟菌屬（SchizophylIum)、柱頂孢屬（Scytalidium)^I 節(jié)菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢殼霉屬（Thielavia)、彎頸 霉屬（Tolypocladium)、木霉屬（Trichoderma)、長毛盤菌屬（Trichophaea)、輪枝孢屬 (Verticillium)、小包腳燕屬（Volvariella)或炭角菌屬（Xylaria)多肽。
[0072] 在另一個(gè)方面，該多肽是卡氏酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯維酵 母、諾地酶母、或卵形酵母多肽。
[0073] 在另一個(gè)方面，該多肽是解纖維枝頂孢霉（Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲 霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、構(gòu) 巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、狹邊金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum)、盧克諾文思金孢子菌（Chrysosporium Iucknowense)、莫達(dá)瑞姆金孢 子菌（Chrysosporium merdarium)、租金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、昆士蘭金 抱子菌（Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、 帶紋金抱子菌（Chrysosporium zonatum)、桿抱狀嫌抱（Fusarium bactridioides)、 谷類嫌抱（Fusarium cerealis)、庫威嫌抱（Fusarium crookwellense)、大刀嫌 抱（Fusarium culmorum)、禾谷嫌抱(Fusarium graminearum)、禾赤嫌抱（Fusarium graminum)、異抱嫌抱（Fusarium heterosporum)、合歡木嫌抱（Fusarium negundi)、尖 嫌抱（Fusarium oxysporum)、多枝嫌抱（Fusarium reticulatum)、粉紅嫌抱（Fusarium roseum)、接骨木嫌抱（Fusarium sambucinum)、膚色嫌抱（Fusarium sarcochroum)、擬 分枝抱嫌抱（Fusarium sporotrichioides)、硫色嫌抱（Fusarium sulphureum)、圓嫌抱 (Fusarium torulosum)、擬絲抱嫌抱（Fusarium trichothecioides)、壤片嫌抱（Fusarium venenatum)、灰腐質(zhì)霉（Humicola grisea)、特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)、柔毛腐質(zhì) 霉（Humicola lanuginosa)、白奉巴齒菌（Irpex Iacteus)、米黑毛霉（Mucor miehei)、嗜 熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila)、粗糖鏈抱菌（Neurospora crassa)、繩狀青 霉菌（Penicillium funiculosum)、產(chǎn)紫青霉菌（Penicillium purpurogenum)、黃抱原 毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)、無色梭抱殼霉（Thielavia achromatica)、 阿波梭抱殼菌（Thielavia albomyces)、白毛梭抱殼霉（Thielavia albopilosa)、澳洲 梭抱殼霉（Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭抱殼菌（Thielavia fimeti)、小抱梭 孢殼霉（Thielavia microspora)、卵孢梭孢殼霉（Thielavia ovispora)、秘魯梭孢殼霉 (Thielavia peruviana)、毛梭抱殼霉（Thielavia setosa)、瘤抱梭抱殼霉（Thielavia spededonium)、耐熱梭抱殼（Thielavia subthermophila)、土生梭抱殼霉（Thielavia terrestris)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康寧木霉（Trichoderma koningii)、長 枝木霉（Trichoderma Iongibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或綠色木霉 (Trichoderma viride)多月太。
[0074] 將理解的是，對于以上提到的物種而言，本發(fā)明涵蓋完全狀態(tài)和不完全狀態(tài) (perfect and imperfect states)二者、以及其他分類學(xué)等效物，例如無性型，而不管它們 已知的物種名稱是什么。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地識別適當(dāng)?shù)刃锏纳矸荨?br> [0075] 這些物種的株系可以容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心為公眾所獲得，如ATCC(美 國典型培養(yǎng)物保藏中心）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen 611113!1，03]\12(德國微生物菌種保藏中心）、〇6111:四31131^6311￥〇〇13(311；[111111610_111：1^68,033(荷 蘭菌種保藏中心）、以及NRRL (美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心北方地區(qū)研究中心）。
[0076] 可以使用以上提到的探針從其他來源，包括從自然界（例如，土壤、堆肥、水等等） 分離的微生物或直接從自然材料（例如，土壤、堆肥、水等等）獲得的DNA樣品鑒定和獲得 該多肽。用于從自然生活環(huán)境中直接分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可以 通過類似地篩選另一微生物的基因組DNA或cDNA文庫或混合的DNA樣品來獲得編碼該多 肽的多核苷酸。一旦用一種或多種探針檢測到編碼多肽的多核苷酸，就可以通過使用本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)分離或克隆該多核苷酸（參見例如，Sambrook (薩姆布魯克）等 人，1989,同上）。
[0077] 多核苷酸
[0078] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸，如在此所述。
[0079] 用于分離或克隆多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的并且包括從基因組DNA或 cDNA，或其組合進(jìn)行分離。來自基因組DNA的多核苷酸的克隆可以例如通過使用眾所周知 的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)或用以對具有共有的結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段進(jìn)行檢測的表達(dá)庫 抗體篩選來實(shí)現(xiàn)。參見例如，Innis (伊尼斯）等人，1990，PCR:A Guide to Methods and Application (PCR :方法和應(yīng)用指南），學(xué)術(shù)出版社，紐約?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增程序例如 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄（LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增（NASBA)。這些多核苷 酸可以由西地西菌屬菌株或相關(guān)有機(jī)體克隆，并且因此，例如可以是該多核苷酸的多肽編 碼區(qū)的等位基因或種類變體。
[0080] 編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的修飾對于合成實(shí)質(zhì)上類似于該多肽的多肽可以是 必需的。術(shù)語"基本上類似于"該多肽是指該多肽的非天然發(fā)生的形式。這些多肽可能以 某種工程化方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如在比活性、熱穩(wěn)定性、PH最佳值等 方面不同的變體。這些變體可以基于以SEQ ID N0:1的成熟多肽編碼序列（例如其子序 列）形式呈現(xiàn)的多核苷酸，和/或通過引入不會改變該多肽的氨基酸序列，但對應(yīng)于預(yù)定用 于產(chǎn)生該酶的宿主有機(jī)體的密碼子使用的核苷酸取代，或通過引入可能產(chǎn)生不同氨基酸序 列的核苷酸取代來構(gòu)建。對于核苷酸取代的一般描述，參見例如Ford(福德）等人，1991， Protein Expression and Purification(蛋白表達(dá)與純化）2:95_107。
[0081] 核酸構(gòu)建體
[0082] 本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，這些核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制 序列的本發(fā)明的多核苷酸，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導(dǎo)編碼序列在合 適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0083] 可以按多種方式操縱多核苷酸，以提供多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在其插入載 體以前操縱多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù) 是本領(lǐng)域熟知的。
[0084] 該控制序列可以是一個(gè)啟動子，即，被宿主細(xì)胞識別以對編碼本發(fā)明多肽的多核 苷酸進(jìn)行表達(dá)的一種多核苷酸。該啟動子包含轉(zhuǎn)錄控制序列，這些序列介導(dǎo)了該多肽的表 達(dá)。該啟動子可以是在宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及 雜合型啟動子，并且可以是由編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因 獲得。
[0085] 用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例 是從以下基因中獲得的啟動子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢桿 菌α-淀粉酶基因（amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因（penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽 糖淀粉酶基因（amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和 xylB基因、蘇云金芽孢桿菌cryllIA基因 （Agaisse (阿蓋塞）和Lereclus (勒爾克呂）， 1994，Molecular Microbiology (分子微生物學(xué)）13:97-107)、大腸桿菌 Iac 操縱子、大 腸桿菌trc啟動子（Egon(埃貢）等人，1988, Gene(基因）69:301-315)、天藍(lán)色鏈霉菌 瓊脂水解酶基因（dagA)、以及原核β-內(nèi)酰胺酶基因（Villa(維拉）_Kamaroff (卡馬 洛夫）等人，1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院院刊）75:3727-3731)、以 及tac啟動子（DeBoer (德波爾）等人，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué) 院院刊）80:21-25)。其他啟動子描述在Gilbert (吉爾伯特）等人，1980, Scientific American (科學(xué)美國人）242:74-94 的"Useful proteins from recombinant bacteria (來 自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)以及在Sambrook(薩姆布魯克）等人，1989,同上中。串聯(lián)啟 動子的實(shí)例披露于WO 99/43835中。
[0086] 用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí) 例是從以下各項(xiàng)的基因獲得的啟動子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲 霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲 霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶（WO 96/00787)、鑲片 鐮孢淀粉葡糖苷酶（W0 00/56900)、鑲片鐮孢Daria(W0 00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W) 00/56900)、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏 木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi) 切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚 糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉 木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動子（一種修飾的啟動子，其來自曲霉屬中性α-淀粉酶基 因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由曲霉屬丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)序列替代；非限 制性實(shí)例包括修飾的啟動子，其來自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序 列由構(gòu)巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)序列替代）；以及其突變型啟 動子、截短型啟動子、以及雜合型啟動子。
[0087] 在酵母宿主中，有用的啟動子從以下的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶（ΕΝ0-1)、釀酒 酵母半乳糖激酶（GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ADHUADH2/GAP)、釀 酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶（TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白（CUPl)、以及和釀酒酵母3-磷酸甘油 酸激酶。Romanos (羅馬諾斯）等人，1992, Yeast (酵母）8:423-488描述了酵母宿主細(xì)胞的 其他有用的啟動子。
[0088] 控制序列還可以是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的一種轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子可操 作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的3' -末端。在該宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可 以用于本發(fā)明中。
[0089] 用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶（aprH)、地衣芽 孢桿菌α-淀粉酶（amyL)、以及大腸桿菌核糖體RNA(rrnB)的基因獲得。
[0090] 絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：構(gòu)巢曲霉鄰氨基 苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢鐮刀 菌胰蛋白酶樣蛋白酶。
[0091] 用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從以下各項(xiàng)的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶、釀酒 酵母細(xì)胞色素 C (CYCl)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。用于酵母宿主細(xì)胞的其他有 用的終止子由羅馬努斯等人，1992,見上文描述。
[0092] 控制序列還可以是啟動子下游和基因的編碼序列上游的mRNA穩(wěn)定子區(qū)，其增加 該基因的表達(dá)。
[0093] 適用的mRNA穩(wěn)定子區(qū)的實(shí)例是從以下獲得的：蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因（W0 94/25612)和枯草芽抱桿菌SP82 基因 （Hue (化）等人，1995，Journal of Bacteriology (細(xì) 菌學(xué)雜志）177:3465-3471)。
[0094] 該控制序列還可以是一個(gè)前導(dǎo)子，一種對宿主細(xì)胞翻譯很重要的非翻譯mRNA區(qū) 域。該前導(dǎo)序列可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的5'-末端?？梢允褂迷谒拗骷?xì)胞 中具有功能的任何前導(dǎo)子。
[0095] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)子是從米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷 酸異構(gòu)酶的基因獲得。
[0096] 適用于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)子從以下各項(xiàng)的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶 (EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子、以及釀酒酵母醇脫氫酶/甘油 醛-3-磷酸脫氫酶（ADH2/GAP)。
[0097] 控制序列還可以是一種聚腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3' -末端 并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號的序列。在 宿主細(xì)胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可以使用。
[0098] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列是從以下各項(xiàng)的基因獲得：構(gòu)巢曲 霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及 尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。
[0099] 針對酵母宿主細(xì)胞的有用多腺苷酸化序列在Guo(郭）和Sherman(謝爾曼）， 1995, Mol. Cellular Biol.(分子和細(xì)胞生物學(xué)）15:5983-5990中有過描述。
[0100] 控制序列也可以是編碼與多肽的N-端連接并指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路的信 號肽的信號肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5' -末端可以固有地包括在翻譯閱讀框架 中與編碼多肽的編碼序列的區(qū)段天然地連接的一個(gè)信號肽編碼序列?？商娲?，編碼序列 5末端可以包括對于該編碼序列是外源的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信 號肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號肽編碼序列?？商娲?，外源信號肽編碼序列可 簡單地替換天然的信號肽編碼序列以便增強(qiáng)該多肽的分泌。然而，指導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入 宿主細(xì)胞的分泌路徑中的任何信號肽編碼序列都可以使用。
[0101] 用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因獲得的信號肽編 碼序列：芽孢桿菌屬NCIB 11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣 芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶 (nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢桿菌prsA。Simonen (西蒙納）和Palva (帕爾瓦），1993, Microbiological Reviews (微生物學(xué)評論）57:109-137描述了另外的信號肽。
[0102] 用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是獲得自以下項(xiàng)的基因的信 號肽編碼序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì) 霉（Humicola insolens)纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、柔毛腐質(zhì)霉（Humicola lanuginosa)脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0103] 對于酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽獲得自以下項(xiàng)的基因：釀酒酵母α-因子和釀酒 酵母轉(zhuǎn)化酶。上文的羅馬諾斯等人（1992)描述了其他有用的信號肽編碼序列。
[0104] 該控制序列還可以是編碼位于多肽的N-末端處的前肽的一個(gè)前肽編碼序 列。生成的多肽被稱為前體酶（proenzyme)或多肽原（或者在一些情況下被稱為酶原 (zymogen))。多肽原通常是無活性的并且可以通過從該多肽原上催化切割或自動催化切割 前肽而被轉(zhuǎn)化成一種活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得：枯草芽孢桿菌 堿性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶（W0 95/33836)、米 黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α因子。
[0105] 在信號肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰多肽的 N-末端并且該信號肽序列定位成緊鄰該前肽序列的N-末端。
[0106] 還可以希望添加調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表 達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激而引起基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉的那些，包括 調(diào)節(jié)化合物的存在。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)序列包括lac、tac、以及trp操縱子系統(tǒng)。在酵母 中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、 米曲霉TAKA α -淀粉酶啟動子、以及米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調(diào)節(jié)序列的其他實(shí)例是允 許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉 酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼該多肽的多核苷 酸將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。
[0107] 表達(dá)載體
[0108] 本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組 表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生一個(gè)重組表達(dá)載體，這一重組 表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處插入或取代編碼 該變體的多核苷酸?？商娲兀摱嗪塑账峥梢酝ㄟ^將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核 酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來表達(dá)。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時(shí)，該編碼序列是位于該 載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。
[0109] 重組表達(dá)載體可以是任何載體（例如，質(zhì)?；虿《荆?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA 程序，并且能夠引起多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載 體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是一種線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0110] 載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色 體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體、或人工染色體。該載體可以包含用于確保自 我復(fù)制的任何裝置?？商娲?，該載體可以是這樣一種載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時(shí)， 被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染色體一起復(fù)制。此外，可以使用 單一載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒（這些載體或質(zhì)粒共同包含有待引入到宿主 細(xì)胞的基因組中的總DNA)或轉(zhuǎn)座子。
[0111] 該載體優(yōu)選包含允許容易選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或類似細(xì)胞的一個(gè) 或多個(gè)選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗 性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型、等。
[0112] 細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因、或賦予抗生素 抗性（例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、或四環(huán)素抗性）的標(biāo)記。用 于酵母宿主細(xì)胞的適合的標(biāo)記包括但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及 URA3。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包含但不局限于amdS(乙酰胺酶）、 argB (鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶）、bar (草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶）、hph (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）、 niaD(硝酸還原酶）、pyrG(乳清苷-5' -磷酸脫羧酶）、sC(硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶）、以及 trpC(鄰氨基苯甲酸合酶）、連同其等效物。優(yōu)選在曲霉屬細(xì)胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米曲 霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus) bar基因。
[0113] 載體優(yōu)選含有允許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因 組自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。
[0114] 對于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或 者通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件?？商娲?，該載體 可以包含用于指導(dǎo)通過同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中的一 個(gè)或多個(gè)精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置處整合的可能性，這些整合 的元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10, 〇〇〇個(gè)堿基對、400至10, 000個(gè)堿基對、以 及800至10, 000個(gè)堿基對，這些堿基對與對應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源 重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此 夕卜，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一個(gè)方面，該載體可以通過非 同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
[0115] 對于自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù) 制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語 "復(fù)制起點(diǎn)"或"質(zhì)粒復(fù)制子"意指使質(zhì)?；蜉d體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0116] 細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、 以及PACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，以及允許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060、以 及ρΑΜβ 1的復(fù)制起點(diǎn)。
[0117] 用于在酵母宿主細(xì)胞中使用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)ARS1、ARS4、 ARSl與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。
[0118] 有用于絲狀真菌細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI (Gems (格姆斯）等人， 1991，Gene (基因）98:61-67 ;CulIen (卡倫）等人，1987，Nucleic Acids Res.(核酸研 究）15:9163-9175 ;W0 00/24883)。根據(jù)WO 00/24883中披露的方法可以實(shí)現(xiàn)AMAl基因的 分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建。
[0119] 可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個(gè)的拷貝插入到宿主細(xì)胞中以增加多肽的產(chǎn) 生。通過將序列的至少一個(gè)另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過包含一個(gè)與該多 核苷酸的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得增加的多核苷酸拷貝數(shù)目，其中通過在適當(dāng)選 擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞、以及由 此該多核苷酸的另外的拷貝。
[0120] 用于連接以上所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員熟知的（參見，例如，薩姆布魯克等人，1989,同上文）。
[0121] 宿主細(xì)胞
[0122] 本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞包括本發(fā)明的多核苷酸，該多核 苷酸可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列，該一個(gè)或多個(gè)控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn) 生。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持 作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所描述。術(shù)語"宿主細(xì)胞"涵蓋 由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大 程度上取決于編碼該多肽的基因及其來源。
[0123] 該宿主細(xì)胞可以是有用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真 核細(xì)胞。
[0124] 原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但 不局限于：芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿 菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不局限于：彎曲桿菌 屬、西地西菌屬、大腸桿菌、黃桿菌菌、梭桿菌菌、螺旋桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單 胞菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、以及脲原體屬。
[0125] 細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞，包括但不局限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉 芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦 爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿 菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
[0126] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌細(xì)胞，包括但不局限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球 菌、乳房鏈球菌、以及馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。
[0127] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不局限于：不產(chǎn)色鏈霉菌、阿維 鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌以及變鉛青鏈霉菌細(xì)胞。
[0128] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何西地西菌屬細(xì)胞，包括但不局限于戴氏西地西菌、拉 氏西地西菌、西地西菌sp 001 (也稱為西地西菌物種3)、奈氏西地西菌（以前稱為西地西 菌物種4或西地西菌物種002)、西地西菌sp 012 (也稱為西地西菌物種5)、或西地西菌 sp-16640 多膚。
[0129] 細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何沙雷氏菌細(xì)胞，包括但不局限于嗜蟲沙雷氏菌、無花 果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、格氏沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、氣味沙雷氏菌、 普城沙雷氏菌、變形班沙雷氏菌、食奎尼酸沙雷氏菌、深紅沙雷氏菌、共生沙雷氏菌多肽。
[0130] 將DNA引入芽孢桿菌屬細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見 例如，Chang(張）和Cohen(科恩），1979，Mol. Gen. Genet.(分子遺傳學(xué)與基因組 學(xué)）168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（參見，例如，Young(楊格）和Spizizen(斯 皮宰曾），1961，J.Bacteriol.(細(xì)菌學(xué)雜志）81:823-829 ;或 Dubnau(杜拜努）以 及Davidoff-Abelson(大衛(wèi)杜夫-阿貝爾森），1971，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜 志）56:209-221)、電穿孔（參見，例如，Shigekawa(茂川）和 Dower(道爾），1988， Biotechniques (生物技術(shù)）6:742-751)、或者接合（參見，例如Koehler (克勒）和 Thorne(Thorne)，1987, J.Bacteriol.(細(xì)菌學(xué)雜志）169:5271-5278)。將 DNA 引入大腸 桿菌細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（參見例如，Hanahan(哈納汗），1983, J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志）166:557-580)或電穿孔（參見例如，Dower (道爾）等人， 1988, Nucleic Acids Res.(核酸研究）16:6127-6145)?？梢酝ㄟ^原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔 (參見，例如，Gong (貢）等人，2004, Folia Microbiol.(葉線形微生物學(xué)（Praha (普拉 哈）））49:399-405)、共軛（例如，Mazodier (馬佐迪耶）等人，1989，J. Bacteriol.(細(xì)菌 學(xué)雜志）171:3583-3585)、或者轉(zhuǎn)導(dǎo)（參見，例如，Burke (伯克）等人，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院院刊）98:6289-6294)實(shí)現(xiàn)DNA到鏈霉菌細(xì)胞中的引入?？?以通過電穿孔（參見，例如，Choi(蔡）等人，2006, J.Microbiol.Methods(微生物學(xué)方法 雜志）64:391-397)、或者共軛（例如，Pinedo(皮內(nèi)多）和Smets(斯梅茨），2005, Appl. Environ. Microbiol.(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)）71:51-57)實(shí)現(xiàn)DNA到假單孢菌細(xì)胞中的引 入?？梢酝ㄟ^如下方式實(shí)現(xiàn)將DNA引入鏈球菌細(xì)胞中：天然感受態(tài)（參見例如，Perry (佩 里）和Kuramitsu (藏滿），1981, Infect. Immun.(傳染與免疫）32:1295-1297)、原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化（例如，Catt (卡特）和 Jollick (約里克），1991，Microbios (微生物）68:189-207)、 電穿孔（參見，例如，Buckley (布克萊）等人，1999, Appl. Environ. Microbiol.(應(yīng)用與環(huán) 境微生物學(xué)）65:3800-3804)、或接合（參見，例如，Clewell (克萊懷爾），1981，Microbiol. Rev.(微生物學(xué)綜述）45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將DNA引入宿主細(xì) 胞中的任何方法。
[0131] 宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細(xì)胞。
[0132] 宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。如在此所用的"真菌"包括子囊菌門（Ascomycota)、 擔(dān)子菌門（Basidiomycota)、壺菌門（Chytridiomycota)、以及接合菌門（Zygomycota)、連 同卵菌門（Oomycota)和全部有絲分裂孢子真菌（如由Hawksworth(霍克斯沃思）等人在 Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi (安斯沃思和拜斯比真菌詞典），第 8版，1995，CAB International (國際應(yīng)用生物科學(xué)中心），University Press (大學(xué)出版 社），Cambridge (劍橋），英國中進(jìn)行定義的）。
[0133] 該真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。如在此所用的"酵母"包括產(chǎn)子嚢酵母（內(nèi)孢 霉目）、產(chǎn)擔(dān)子酵母和屬于半知菌類（芽孢綱）的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變， 因此出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)如Biology and Activities of Yeast (酵母的生物學(xué)和活 性）（Skinner (斯金納）、Passmore (帕斯莫爾）、以及Davenport (達(dá)文波特）編輯，5〇〇· App. Bacteriol. Symposium Series No. 9 (應(yīng)用細(xì)菌學(xué)學(xué)會討論會系列號9)，1980)中所描 述來定義。
[0134] 酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母（Candida)、漢遜酵母（Hansenula)、克 魯維酵母（Kluyveromyces)、畢赤酵母（Pichia)、酵母屬（Saccharomyces)、裂殖 酵母（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母（Yarrowia)細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces Iactis)、卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母、糖化 酵母（Saccharomyces diastaticus)、道格拉斯酵母（Saccharomyces douglasii)、克魯 維酵母（Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母（Saccharomyces norbensis)、卵形酵母 (Saccharomyces oviformis)、或解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica)細(xì)胞。
[0135] 真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌門（Eumycota)和卵菌 門的亞門（如由霍克斯沃思等人，1995,見上文所定義）的所有絲狀形式。絲狀真菌通常 的特征在于由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體 壁。營養(yǎng)生長是通過菌絲延長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母（如釀酒酵母）的 營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽（budding)，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。
[0136] 絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬、擬蠟菌屬、金 孢子菌屬、鬼傘菌屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、線黑粉酵母屬（FiIibasidium)、鐮刀菌屬、腐質(zhì) 霉屬、稻瘟菌屬、毛霉菌屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌 屬、白腐菌屬、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼菌屬、彎頸 霉屬、檢囷屬、或木霉屬的細(xì)胞。
[0137] 例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢 曲霉、黑曲霉、米曲霉、煙管菌、干擬錯(cuò)菌、卡內(nèi)基擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsiscaregiea)、 淺黃擬錯(cuò)孔菌、潘諾希塔擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsispannocinta)、環(huán)帶擬錯(cuò) 菌（Ceriporiopsisrivulosa)、微紅擬錯(cuò)菌（Ceriporiopsissubrufa)、蟲擬錯(cuò) 菌、狹邊金孢子菌（Chrysosporiuminops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、拉克悼金孢子菌 (Chrysosporiumlucknowense)、奠狀金抱子菌（Chrysosporiummerdarium)、租金抱子菌、女 王杜香金孢子菌（Chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰蓋鬼 傘、毛云芝菌、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢 鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮刀菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮 刀菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮刀菌、鑲片鐮孢菌、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、 嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、射紋革菌、杏鮑菇、土生梭孢殼、長絨 毛栓菌、變色栓菌（Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、或綠 色木霉的細(xì)胞。
[0138] 可以將真菌細(xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、以及細(xì)胞壁再生的方法 以本身已知的方式轉(zhuǎn)化。在EP 238023和Yelton(意爾頓）等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學(xué)院院刊）81:1470-1474,以及Christensen(克里斯滕森）等人， 1988, Bio/Technology (生物/技術(shù)）6:1419-1422中描述了對于曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞 轉(zhuǎn)化而言適合的程序。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬物種的適合方法由Malardier (馬拉迪爾）等人， 1989, Gene (基因）78:147-156、以及WO 96/00787描述?？梢允褂糜扇缫韵挛墨I(xiàn)描述的程 序轉(zhuǎn)化酵母：Becker (貝克爾）和Guarente (瓜倫特），在Abelson (阿貝爾森），J. N.和 Simon(西蒙），Μ·Ι·編，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(酵母遺傳學(xué)與 分子生物學(xué)指南），Methods in Enzymology (酶學(xué)方法），第194卷，第182-187頁，Academic Press, Inc.(學(xué)術(shù)出版社有限公司），紐約；Ito (伊藤）等人，1983, J. Bacteriol.(細(xì)菌學(xué) 雜志）153:163 ;以及 Hinnen (伊嫩）等人，1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國科學(xué)院院 刊）75:1920。
[0139] 產(chǎn)生方法
[0140] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括（a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下 培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生該多肽；并且（b)回收該多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面， 該細(xì)胞是一種西地西菌屬細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，該細(xì)胞是一種西地西菌sp-16640細(xì) 胞。
[0141] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括（a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下 培養(yǎng)一個(gè)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；并且（b)回收該多肽。
[0142] 這些宿主細(xì)胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多肽的一種營養(yǎng)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)的。例如，可以通過在適合的培養(yǎng)基中和在允許表達(dá)和/或分離該多肽的條件下， 進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，或者在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵（包括連續(xù)，分批， 分批補(bǔ)料，或固態(tài)發(fā)酵）來培養(yǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合營養(yǎng) 培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包含碳和氮來源及無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或 可以根據(jù)公開的組成（例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中）制備。如果多肽分泌 到該營養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可從細(xì) 胞裂解液中進(jìn)行回收。
[0143] 可以使用特異性針對該多肽的本領(lǐng)域已知的方法來檢測該多肽。這些檢測方法包 括但不局限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定 來確定該多肽的活性。
[0144] 可以使用本領(lǐng)域已知的方法來回收多肽。例如，該多肽可以通過常規(guī)程序，包括但 不局限于，收集、離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從該營養(yǎng)培養(yǎng)基回收。
[0145] 可以通過本領(lǐng)域中已知的多種程序來純化該多肽以獲得基本上純的多肽，這些程 序包括但不局限于：色譜法（例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以 及尺寸排阻色譜）、電泳程序（例如，制備型等電點(diǎn)聚焦）、差別溶解度（例如，硫酸銨沉 淀）、SDS_PAGE、或萃?。▍⒁娎?，Protein Purification (蛋白質(zhì)純化），Janson (詹森） 和 Ryden (賴登）編輯，VCH Publishers (VCH 出版社），紐約，1989)。
[0146] 在一個(gè)替代性方面中，沒有回收該多肽，而是將表達(dá)該多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞 用作該多肽的來源。
[0147] 植物
[0148] 本發(fā)明還涉及分離的植物，例如轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，這些植物包括 本發(fā)明的多肽，從而表達(dá)并且產(chǎn)生可回收的量的多肽或結(jié)構(gòu)域。多肽或結(jié)構(gòu)域可從植物或 植物部分回收。作為替代方案，包括該多肽或結(jié)構(gòu)域的植物或植物部分可以按原樣用于改 善食品或飼料的質(zhì)量，例如改善營養(yǎng)價(jià)值、可口性及流變學(xué)特性，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因素。
[0149] 轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的（雙子葉植物）或單子葉的（單子葉植物）。單子葉 植物的實(shí)例是草，如草地早熟禾（meadow grass)(藍(lán)草（blue grass),早熟禾屬（Poa)); 飼用牧草（forage grass),如羊茅屬（Festuca)、黑麥草屬（Lolium);溫帶草（temperate grass),如翦股穎屬（Agrostis);以及谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱、以及玉 蜀黍（玉米）。
[0150] 雙子葉植物的實(shí)例是煙草、豆類（如羽扇豆（lupins)、馬鈴薯、糖甜菜（sugar beet)、豌豆、豆（bean)和大豆（soybean))、以及十字花科植物（十字花科（family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及緊密相關(guān)的模型生物擬南芥）。
[0151] 植物部分的實(shí)例是莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子、以及塊莖、以及包括這些部分 的獨(dú)立組織，例如，表皮、葉肉、薄壁組織（parenchyme)、維管組織、分生組織。特定植物細(xì)胞 區(qū)室，如葉綠體、質(zhì)外體（apoplast)、線粒體、液泡、過氧化物酶體以及細(xì)胞質(zhì)也被認(rèn)為是植 物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無論是何種組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部 分，如分離以有助于本發(fā)明的利用的特定組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚、胚乳、 糊粉和種皮。
[0152] 同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的是這類植物、植物部分以及植物細(xì)胞的子代。
[0153] 可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建表達(dá)該多肽或結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡 而言之，通過將編碼該多肽或結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體結(jié)合到植物宿主基因組或葉 綠體基因組中并且將所得改性植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞來構(gòu)建植 物或植物細(xì)胞。
[0154] 表達(dá)構(gòu)建體方便地是核酸構(gòu)建體，它包括編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，該多核 苷酸可操作地與選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸所需的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列連接。而 且，表達(dá)構(gòu)建體可包含用于鑒別整合了此表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞的選擇性標(biāo)記，和將此構(gòu) 建體引入所討論的植物所必需的DNA序列（后者取決于所用的引入DNA的方法）。
[0155] 例如基于希望在何時(shí)、何處、和怎樣表達(dá)該多肽或結(jié)構(gòu)域來確定調(diào)節(jié)序列，例如啟 動子和終止子序列以及任選的信號序列或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇。例如編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的基因 的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或者可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物 可以被靶向至特定組織或植物部分，例如種子或葉。調(diào)控序列由例如Tague(塔格）等人， 1988, Plant Physiology (植物生理學(xué)）86:506 描述。
[0156] 對于組成型表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1、或稻肌動蛋白1啟動子 (Franck(弗蘭克）等人，1980，Cell (細(xì)胞）21:285-294 ;Christensen(克里斯滕森）等 人，1992, Plant Mol. Biol.(植物分子生物學(xué)）18:675-689 ;Zhang(張）等人，1991，Plant Cell (植物細(xì)胞）3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是例如：來自貯藏庫組織（storage sink tissue)(如種子、馬鈴薯塊莖、以及果實(shí)）（Edwards (愛德華茲）和Coruzzi (科魯 茲），1990, Ann. Rev.Genet.(遺傳學(xué)年度綜述）24:275-303)、或代謝庫組織（metabolic sink tissue)(如分生組織）的啟動子（Ito (伊藤）等人，1994, Plant Mol. Biol.(植物 分子生物學(xué)）24:863-878);種子特異性啟動子，如來自稻的谷蛋白、醇溶蛋白（prolamin)、 球蛋白（globulin)、或白蛋白啟動子（Wu(吳）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物 細(xì)胞生理學(xué)）39:885-889);來自豆球蛋白M和來自蠶豆的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動 子（Conrad(康拉德）等人，1998，J. Plant Physiol.(植物生理學(xué)雜志）152:708-711); 來自種子油體蛋白的啟動子（Chen(陳）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物細(xì)胞 生理學(xué)）39:935-941);來自歐洲油菜（Brassica napus)的藏蛋白napA啟動子、或本

【技術(shù)領(lǐng)域】已知的任何其他種子特異性啟動子，例如，如在WO 91/14772中所描述。此外， 啟動子可以是葉特異性啟動子，如來自稻或番爺?shù)膔bcs啟動子（Kyozuka(京冢）等人， 1993, Plant Physiol.(植物生理學(xué)）102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基 因啟動子（Mitra(麥卓）和Higgins(希金斯），1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物 學(xué)）26:85-93)、來自稻的aldP基因啟動子（Kagaya (加賀屋）等人，1995,Mol. Gen. Genet (. 分子遺傳學(xué)與基因組學(xué)）248:668-674)、或傷口誘導(dǎo)型啟動子（如馬鈴薯pin2啟動子） (Xu(許）等人，1993, Plant Mol. Biol.(植物分子生物學(xué)）22:573-588)。同樣地，該啟動 子可以通過非生物處理來誘導(dǎo)，如溫度、干旱、或鹽度變化，或通過外源施加的激活該啟動 子的物質(zhì)來誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素、植物激素（如乙烯、脫落酸和赤霉酸）、以及重金屬。
[0157] 還可使用啟動子增強(qiáng)子元件，從而在植物中達(dá)到多肽或結(jié)構(gòu)域的更高表達(dá)。例如， 啟動子增強(qiáng)子元件可以是位于啟動子和編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列之間的內(nèi)含子。 例如Xu(徐）等人，1993,同上披露了使用水稻肌動蛋白1基因的第一內(nèi)含子來增強(qiáng)表達(dá)。
[0158] 該選擇性標(biāo)記基因及該表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分可以選自本領(lǐng)域中可用的那 些。
[0159] 可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體結(jié)合到植物基因組中，這些常規(guī) 技術(shù)包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化、以及電 穿孔（Gasser (加塞爾）等人，1990, Science (科學(xué)）244:1293 ;Potrykus (波特里庫斯）， 1990, Bio/Technology (生物 / 技術(shù)）8:535 ;Shimamoto (島本）等人，1989, Nature (自 然）338:274)。
[0160] 目前根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物（關(guān)于綜述， 請參見 Hooykas (霍伊卡）和 Schilperoort (施爾伯魯特），1992，PlantMol. Biol.(植物 分子生物學(xué)）19:15-38)并且用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法，但對于這些植物還常常使用其 他的轉(zhuǎn)化方法。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是粒子（涂覆有轉(zhuǎn)化DNA的微觀金或 鶴粒子）轟擊胚愈傷組織或發(fā)育中的胚（Christou(克里斯托），1992, Plant J.(植物 雜志）2:275^28I ;Shimamoto (島本），1"4，Curr. Opin. Biotechnol.(生物技術(shù)當(dāng)前述 評）5:158-162 ;Vasil (瓦西爾）等人，1992, Bio/Technology (生物 / 技術(shù)）10:667-674)。 用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的替代方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh(奧米儒勒）等人， 1993, Plant Mol. Biol.(植物分子生物學(xué)）21:415-428所描述。另外的轉(zhuǎn)化方法包括US 6395966和US 7151204(兩者都通過引用以其全文結(jié)合于此）中所描述的那些。
[0161] 在轉(zhuǎn)化后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選出已并入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體，并使其再 生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化程序用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性 消除選擇基因：例如，使用帶有兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或利用特異性重組酶位 點(diǎn)特異性地切除選擇基因。
[0162] 除用本發(fā)明的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化特定植物基因型外，還可以通過使具有該構(gòu)建體的 植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物進(jìn)行雜交來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以通過雜交將編碼 多肽或結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體引入特定植物品種中，無需總是直接地轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因 此，本發(fā)明不僅涵蓋了從根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，而且還涵蓋了這類 植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根據(jù)本發(fā)明制備的親本植物的任何代的后代。此 類后代可以包括根據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體。雜交導(dǎo)致通過供體植物系與起始系交叉授 粉，將轉(zhuǎn)基因引入植物系。此類步驟的非限制性實(shí)例描述于US 7151204中。
[0163] 植物可以通過回交轉(zhuǎn)化方法生成。例如，植物包含被稱為回交轉(zhuǎn)化的基因型、種 系、近交體、或雜交體的植物。
[0164] 可以使用遺傳標(biāo)記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個(gè)遺傳背景滲入到另 一個(gè)。標(biāo)記協(xié)助的選擇提供了相對于常規(guī)育種的優(yōu)勢，在于其可以用于避免由表型變異導(dǎo) 致的錯(cuò)誤。另外，遺傳標(biāo)記可以在具體雜交的個(gè)別后代中提供有關(guān)良種種質(zhì)相對程度的數(shù) 據(jù)。例如，當(dāng)具有所希望性狀并且另外具有非農(nóng)藝學(xué)所希望的遺傳背景的植物與良種親本 雜交時(shí)，可以使用遺傳標(biāo)記來選擇不僅具有感興趣的性狀，還具有相對較大比例所希望種 質(zhì)的后代。以此方式，使一種或多種性狀滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得以最小化。
[0165] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽或結(jié)構(gòu)域的方法，這些方法包括（a)在有益于產(chǎn) 生該多肽或結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編 碼該多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸；并且（b)回收該多肽或結(jié)構(gòu)域。
[0166] 組合物
[0167] 下文闡述的組合物組分的非限制性列表適合用于這些組合物中，并且在此的方法 可以合宜地并入本發(fā)明的某些實(shí)施例中，例如用以輔助或增強(qiáng)清潔性能，用于處理有待清 潔的底物，或用以在與香料、著色劑、染料或類似物一起的情況下修飾該組合物的美感。摻 入組合物中的任何此類組分的水平是除了先前引用的用于摻入的任何材料之外的。這些額 外組分的精確性質(zhì)、其摻入水平將取決于組合物的物理形式和將在其中使用組合物的清潔 操作的性質(zhì)。除非另外指明，按百分率計(jì)的量是按組合物的重量（wt%)計(jì)。適合的組分材 料包括但不局限于表面活性劑、助洗劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、分散劑、酶、以及酶穩(wěn)定 齊U、催化材料、漂白活化劑、過氧化氫、過氧化氫源、預(yù)形成的過酸、聚合物分散劑、粘土去除 /抗再沉積劑、增亮劑、泡沫抑制劑、染料、調(diào)色染料、香料、香料遞送系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)彈力劑、織物 軟化劑、載體、助水溶物、加工助劑、溶劑和/或顏料。除了以下披露之外，此類其他組分的 適合實(shí)例以及使用水平發(fā)現(xiàn)于US 5576282、US 6306812、和US6326348中，據(jù)此通過引用將 這些文獻(xiàn)結(jié)合。
[0168] 因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明不包含以下附屬材料的一種或多種：表面活性劑、 助洗劑、螯合劑、染料轉(zhuǎn)移抑制劑、分散劑、另外的酶、以及酶穩(wěn)定劑、催化材料、漂白活化 齊?、過氧化氫、過氧化氫源、預(yù)形成的過酸、聚合物分散劑、粘土去除/抗再沉積劑、增亮劑、 泡沫抑制劑、染料、香料、香料遞送系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)彈力劑、織物軟化劑、載體、助水溶物、加工助 齊U、溶劑和/或顏料。然而，當(dāng)一種或多種組分存在時(shí)，這樣的一種或多種組分可以是如下 文詳述的存在的：
[0169] 表面活性劑-根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包括表面活性劑或表面活性劑系統(tǒng)，其中 該表面活性劑可以選自非離子型表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性 表面活性劑、兼性離子表面活性劑、半極性非離子表面活性劑、及其混合物。當(dāng)存在時(shí)，表面 活性劑典型地是以從〇.1被 (％至6〇￥1:(%、從1￥1:(%至5〇￥1:(%或從5￥1: (%至4〇￥1:(%的水平存 在。
[0170] 適合的陰離子去污表面活性劑包括硫酸鹽和磺酸鹽去污表面活性劑。
[0171] 適合的磺酸鹽去污表面活性劑包括烷基苯磺酸鹽，在一個(gè)方面為Cich13烷基苯磺酸 鹽?？梢酝ㄟ^磺化可商購的直鏈烷基苯（LAB)獲得適合的烷基苯磺酸鹽（LAS);適合的LAB 包括低碳2-苯基LAB，例如Isochem?或Petrelab?，其他適合LAB包括高碳2-苯基LAB， 例如Hyblene?。一種適合的陰離子洗滌劑表面活性劑是通過DETAL催化工藝獲得的烷基 苯磺酸鹽，但其他合成途徑（如HF)也可以是適合的。在一個(gè)方面，使用LAS的鎂鹽。
[0172] 適合的硫酸鹽去污表面活性劑包括烷基硫酸鹽，在一個(gè)方面，為C8_18烷基硫酸鹽， 或王要為C 12燒基硫酸鹽。
[0173] 另外的適合的硫酸鹽去污表面活性劑是燒基燒氧基化硫酸鹽，在一個(gè)方面為燒基 乙氧基化硫酸鹽，在一個(gè)方面為C 8_18燒基燒氧基化硫酸鹽，在另一個(gè)方面為C 8_18燒基乙氧 基化硫酸鹽，典型地烷基烷氧基化硫酸鹽具有從0. 5至20或從0. 5至10的平均烷氧基化 度，典型地烷基烷氧基化硫酸鹽是C8_18烷基乙氧基化硫酸鹽，具有從0. 5至10、從0. 5至7、 從0. 5至5或甚至從0. 5至3的平均乙氧基化度。
[0174] 燒基硫酸鹽、燒基燒氧基化硫酸鹽和燒基苯橫酸鹽可以是直鏈或支鏈的、取代或 未取代的。
[0175] 去污表面活性劑可以是中鏈分支的去污表面活性劑，在一個(gè)方面為中鏈分支的陰 離子去污表面活性劑，在一個(gè)方面為中鏈分支的烷基硫酸鹽和/或中鏈分支的烷基苯磺酸 鹽，例如中鏈分支的烷基硫酸鹽。在一個(gè)方面，中鏈分支是(V 4烷基，典型地為甲基和/或 乙基基團(tuán)。
[0176] 適合非離子去污表面活性劑是選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成=C8-C18烷基乙氧基 化物，例如NEODOL?; C6-C12烷基苯酚烷氧基化物，其中該烷氧基化物單元可以是乙烯氧 基單元，丙烯氧基單元或其混合物；C 12-C18醇和C 6-C12烷基苯酚與環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段 聚合物的縮合物，例如Pluronic?; C14-C2^鏈分支的醇；C 14-C22中鏈分支的烷基烷氧基化 物（典型地具有從1至30的平均烷氧基化度）；烷基多糖，在一個(gè)方面為烷基多糖苷；多羥 基脂肪酸酰胺；醚封端的聚（烷氧基化）醇表面活性劑；及其混合物。
[0177] 適合的非離子去污表面活性劑包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。
[0178] 在一個(gè)方面，非離子去污表面活性劑包括烷基烷氧基化醇，在一個(gè)方面為(：8_ 18烷 基燒氧基化醇，例如〇8_18燒基乙氧基化醇，該燒基燒氧基化醇可以具有從1至50、從1至30、 從1至20、或從1至10的平均烷氧基化度。在一個(gè)方面，烷基烷氧基化醇可以是C 8_18烷基 乙氧基化醇，具有從1至10、從1至7,更多是從1至5或從3至7的平均乙氧基化度。烷 基烷氧基化醇可以是直鏈或支鏈的、以及取代或未取代的。適合的非離子表面活性劑包括 Lutensol?。
[0179] 適合的陽離子去污表面活性劑包括烷基吡啶鎗化合物、烷基季銨化合物、烷基季 鱗化合物、烷基三锍化合物、及其混合物。
[0180] 適合的陽離子去污表面活性劑是具有以下通式的季銨化合物：(R) (R1) (R2) (R3) N+X^其中R是直鏈或支鏈的、取代或未取代的C6_18烷基或烯基部分，R JP R 2獨(dú)立地選自甲 基或乙基部分,R3是羥基、羥甲基或羥乙基部分，X是提供電荷中性的陰離子，適合的陰離子 包括鹵化物，例如氯化物；硫酸鹽；以及磺酸鹽。適合的陽離子去污表面活性劑是單_(： 6_18烷 基單-羥乙基二甲基季銨氯化物。高度合適的陽離子去污表面活性劑是單-C8_ 1(l烷基單-羥 乙基二甲基季銨氯化物、單-Cich12烷基單-羥乙基二甲基季銨氯化物以及單-C 1(|烷基單-羥 乙基二甲基季銨氯化物。
[0181] 適合的兩性表面活性劑/兼性離子表面活性劑包括氧化胺和甜菜堿。本發(fā)明的胺 中和的陰離子表面活性劑-陰離子表面活性劑以及附屬的陰離子共表面活性劑可以按酸 形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本發(fā)明洗滌劑組合物的表面活性劑 鹽。典型的用于中和的試劑包括金屬反離子堿，例如氫氧化物，如NaOH或Κ0Η。用于中和本 發(fā)明的陰離子表面活性劑和處于其酸形式的附屬陰離子表面活性劑或共表面活性劑的另 外優(yōu)選的試劑包括氨、胺、或烷醇胺。優(yōu)選烷醇胺。適合的非限制性實(shí)例包括單乙醇胺、二 乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本領(lǐng)域中已知的直鏈或支鏈的烷醇胺；例如，高度優(yōu)選的烷醇 胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、單異丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以進(jìn)行 到完全或部分的程度，例如，陰離子表面活性劑混合物的部分可以被鈉或鉀中和，并且陰離 子表面活性劑混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。
[0182] 包含一種或多種陰離子表面活性劑以及另外一種或多種非離子表面活性劑、并可 任選地與另外的表面活性劑例如陽離子表面活性劑的混合物的表面活性劑系統(tǒng)可以是優(yōu) 選的。優(yōu)選的陰離子與非離子表面活性劑的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。
[0183] 助洗劑-本發(fā)明的組合物可以包括一種或多種助洗劑、共助洗劑、助洗劑系統(tǒng) 或其混合物。當(dāng)使用助洗劑時(shí)，清潔組合物將典型地包括至少lwt%、從2wt%至60wt% 或從5wt%至10wt%的助洗劑。在洗滌餐具清潔組合物中，助洗劑的水平典型地是 40wt% -65wt%，或是50wt% -65wt%。該組合物可以是基本上不含助洗劑；基本上不含 意為"沒有有意添加的"沸石和/或磷酸鹽。典型的沸石助洗劑包括沸石A、沸石P和沸石 MAP。典型的磷酸鹽助洗劑是三聚磷酸鈉。
[0184] 助洗劑和/或共助洗劑可以具體是形成具有Ca和Mg的水溶性復(fù)合物的螫合劑。 可以使用本領(lǐng)域中已知用于洗滌劑中的任何助洗劑和/或共助洗劑。助洗劑的非限制性實(shí) 例包括沸石、二磷酸鹽（焦磷酸鹽）、三磷酸鹽（如三磷酸鈉（STP或STPP))、碳酸鹽（如 碳酸鈉）、可溶性硅酸鹽（如偏硅酸鈉）、層狀硅酸鹽（例如來自赫斯特公司（Hoechst)的 SKS-6)、乙醇胺（如2-氨基乙-1-醇（MEA)、亞胺基二乙醇（DEA)和2, 2'，2"-次氨基三乙 醇（TEA))、以及羧甲基菊粉（CMI)、以及其組合。
[0185] 清潔組合物可以單獨(dú)地包括一種共助洗劑，或與一種助洗劑，例如沸石助洗劑組 合。共助洗劑的非限制性實(shí)例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚（丙烯酸） (PAA)或共聚（丙烯酸/馬來酸）（PAA/PMA)。另外的非限制性實(shí)例包括檸檬酸鹽，螯合劑， 例如氨基羧酸鹽、氨基多羧酸鹽和膦酸鹽，以及烷基-或鏈烯基琥珀酸。另外的具體實(shí)例 包括2, 2'，2"-次氨基三乙酸（NTA)、乙二胺四乙酸（EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸（DTPA)、 亞氨二琥珀酸（IDS)、乙二胺-Ν，Ν'-二琥珀酸（EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸（MGDA)、谷氨 酸-Ν，N-二乙酸（GLDA)U-羥乙烷-1，1-二基雙（膦酸）（HEDP)、乙二胺四（亞甲基）四 (膦酸）（EDTMPA)、二亞乙基三胺五（亞甲基）五（膦酸）（DTPMPA)、Ν-(2-羥乙基）亞氨基 二乙酸（EDG)、天冬氨酸-N-單乙酸（ASMA)、天冬氨酸-Ν，N-二乙酸（ASDA)、天冬氨酸-N-單 丙酸（ASMP)、亞氨二琥珀酸（IDA)、N-(2-磺甲基）天冬氨酸（SMAS)、N-(2-磺乙基）天 冬氨酸（SEAS)、N-(2-磺甲基）谷氨酸（SMGL)、N-(2-磺乙基）谷氨酸（SEGL)、N-甲基亞 氨基二乙酸（MIDA)、α-丙氨酸-N，N-二乙酸（α-ALDA)、絲氨酸-N，N-二乙酸（SEDA)、 異絲氨酸-N，N-二乙酸（ISDA)、苯丙氨酸-N，N-二乙酸（PHDA)、鄰氨基苯甲酸-N，N-二乙 酸（ANDA)、對氨基苯磺酸-N，N-二乙酸（SLDA)、氨基乙磺酸-N，N-二乙酸（TUDA)和磺甲 基-N，N-二乙酸（SMDA)、N-(羥乙基）-亞乙基二胺三乙酸鹽（HEDTA)、二乙醇甘氨酸（DEG)、 二亞乙基三胺五（亞甲基膦酸）（DTPMP)、氨基三（亞甲基膦酸）（ATMP)、以及其組合和鹽。 另外的示例性助洗劑和/或共助洗劑描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
[0186] 盩合劑和晶體牛長抑制劑-在此的組合物可以包含螯合劑和/或晶體生長抑制 齊U。適合的分子包括銅、離子和/或錳螯合劑及其混合物。適合的分子包括DTPA (二亞乙基 三胺五乙酸）、HEDP (羥基乙烷二膦酸）、DTPMP (二亞乙基三胺五（亞甲基膦酸））、1，2-二羥 基苯-3, 5-二磺酸二鈉鹽氫氧化物、乙二胺、二亞乙基三胺、乙二胺二琥珀酸（EDDS)、N-羥 基乙基乙二胺三乙酸（HEDTA)、三亞乙基四胺六乙酸（TTHA)、N-羥基乙基亞氨基二乙酸 (HEIDA)、二羥基乙基甘氨酸（DHEG)、亞乙基二胺四丙酸（EDTP)、羧甲基菊粉以及2-膦羧基 丁烷1，2, 4-三羧酸（Bayhibit? AM)及其衍生物。典型地，該組合物可以包括從0. 005wt% 至15wt%或從3. Owt%至10wt%的螯合劑或晶體生長抑制劑。
[0187] 漂白組分-適合用于并入本發(fā)明的方法和組合物中的漂白組分包括多于一種漂 白組分中的一種或混合物。適合的漂白組分包括漂白催化劑、光漂白劑、漂白活化劑、過氧 化氫、過氧化氫源、預(yù)形成的過酸及其混合物?？傊?dāng)使用一種漂白組分時(shí)，本發(fā)明的組合 物可以包括從0.00001界1: (%至90￥1:(%、0.0001￥1:(%至50￥1:(%或從0.001￥1: (%至25￥1:(%的漂 白組分。適合的漂白組分的實(shí)例包括：
[0188] (1)預(yù)先形成的過酸：適合的預(yù)先形成的過酸包括但不局限于選自下組的化合 物，該組由預(yù)先形成的過氧酸或其鹽組成，典型地是過氧羧酸或其鹽或過氧硫酸或其鹽。
[0189] 預(yù)先形成的過氧酸或其鹽優(yōu)選是一種過氧羧酸或其鹽，典型地具有對應(yīng)于以下化 學(xué)式的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0190]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有脂肪酶活性的分離的多膚，該多膚選自下組，該組由w下各項(xiàng)組成： (a)具有與SEQ ID NO:2的成熟多膚至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的一種多膚； 化）一種多膚，該多膚是由一種多核巧酸編碼的，該多核巧酸在低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、中嚴(yán) 謹(jǐn)度條件下、中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、高嚴(yán)謹(jǐn)度格條件下或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與（i)SEQ ID NO: 1的成熟多膚編碼序列、或（ii) (i)的全長補(bǔ)體雜交； (C) 一種多膚，該多膚是由一種多核巧酸編碼的，該多核巧酸具有與SEQ ID NO: 1的成 熟多膚編碼序列至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性； (d) (a)、化）或（C)的多膚的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)位置處包括取代、缺失、和 /或插入；W及 (e) (a)、化）、（C)或（d)的多膚的一個(gè)片段，該片段具有脂肪酶活性。
2. 如權(quán)利要求1所述的多膚，包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多膚或由其組 成。
3. 如權(quán)利要求2所述的多膚，其中該成熟多膚是SEQ ID NO:2的氨基酸1至292。
4. 一種組合物，該組合物包括如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多膚。
5. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其中與缺乏脂肪酶的等效組合物相比，所述組合物更 有效地去除一個(gè)表面上存在的多種脂質(zhì)污物。
6. 如權(quán)利要求4-5中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包括一種或多種二價(jià)陽離子，該些 二價(jià)陽離子優(yōu)選地選自巧（Ca")、鎮(zhèn)（Mg")和鐵-II (化"）。
7. 如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包括選自下組的一種或多種表面活 性劑，該組由W下各項(xiàng)組成；陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑、兼 性離子表面活性劑。
8. 如權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)所述的組合物，其中該表面活性劑包括選自下組的一種或 多種表面活性劑，該組由W下各項(xiàng)組成；十二焼基苯賴酸軸、氨化挪油酸軸、月桂醇離硫酸 軸、C12-14鏈焼醇聚離-7、C12-15鏈焼醇聚離-7、C12-15鏈焼醇聚離硫酸軸、W及C14-15 鏈焼醇聚離-4。
9. 如權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的組合物，在從8. 0至11的抑下配制。
10. 如權(quán)利要求4-9中任一項(xiàng)所述的組合物，其中該組合物選自下組，該組由W下各項(xiàng) 組成；洗衣清潔組合物、洗碗清潔組合物、硬表面清潔組合物和個(gè)人護(hù)理清潔組合物。
11. 如權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)所述的組合物，其中該組合物的形式是選自下組，該組 由W下各項(xiàng)組成；液體、凝膠、皂?xiàng)l、粉末、顆粒狀固體、片劑、或其任何組合。
12. 如權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)所述的組合物，其中該組合物在從約10°C至90°C的溫度 下，在水解脂質(zhì)方面是有效的。
13. 如權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)所述的組合物，其中與包括替代Liprl39脂肪酶的疏棉 狀嗜熱絲抱菌脂肪酶（Lipolase?)的等效組合物相比，在水解脂質(zhì)底物方面，該組合物更 有效。
14. 如權(quán)利要求4-13中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包括選自W下各項(xiàng)的一種或多種 酶；半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磯脂酶、醋酶、角質(zhì)酶、 果膠酶、甘露聚糖酶、果膠裂解酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酷氧化酶、脂加氧酶、木質(zhì)素 酶、支鏈淀粉酶、稼酸酶、聚戊糖酶、馬拉納酶、目-葡聚糖酶、阿拉伯糖巧酶、透明質(zhì)酸酶、軟 骨素梅、漆酶、淀粉酶、或其混合物。
15. 如權(quán)利要求4-14所述的組合物，其中與包含替代具有與SEQ ID NO: 2至少92% - 致性的脂肪酶的疏棉狀嗜熱絲抱菌脂肪酶的等效組合物中的疏棉狀嗜熱絲抱菌脂肪酶的 穩(wěn)定性相比，具有與SEQ ID N0:2至少92% -致性的脂肪酶的穩(wěn)定性更大，優(yōu)選地，其中在 最終組合物和/或最終洗涂介質(zhì)中測量穩(wěn)定性。
16. 產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求4-15中任一項(xiàng)所述的組合物的一種方法，該方法包括添加具有 與SEQ ID N0:2至少92%-致性的脂肪酶和表面活性劑。
17. 清潔表面的一種方法，該方法包括使該表面上存在的待清潔的一種脂質(zhì)污物與根 據(jù)權(quán)利要求4-15中任一項(xiàng)所述的組合物接觸。
18. 水解表面上臟物和/或污物中存在的脂質(zhì)的一種方法，該方法包括使該臟物和/或 污物與如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多膚或如權(quán)利要求4-15中任一項(xiàng)所述的組合物接 觸。
19. 一種分離的多核巧酸，該多核巧酸編碼如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多膚。
20. -種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，該核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包括如權(quán)利要求19所述的 多核巧酸，該多核巧酸可操作地連接至指導(dǎo)該多膚在一個(gè)表達(dá)宿主內(nèi)的產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè) 控制序列。
21. -種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括如權(quán)利要求19所述的多核巧酸，該多核 巧酸可操作地連接至指導(dǎo)該多膚的產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控制序列。
22. -種產(chǎn)生如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多膚的方法，該方法包括： (a)在有益于產(chǎn)生該多膚的條件下培養(yǎng)一種細(xì)胞，該細(xì)胞W其野生型形式產(chǎn)生該多膚； 并且 化）回收該多膚。
23. -種產(chǎn)生具有脂肪酶活性的多膚的方法，該方法包括： (a)在有益于產(chǎn)生該多膚的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求21所述的宿主細(xì)胞；并且 化）回收該多膚。
【文檔編號】C11D3/386GK104471048SQ201380037105
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月12日
【發(fā)明者】R·P·奧林斯基, P·尼爾森, K·博爾奇, A·V·賴澤, C·H·漢森, L·鮑恩斯加德 申請人:諾維信公司