專利名稱：C型肝炎診斷制劑和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型C型肝炎病毒(KHCV)cDNA的寡核苷酸及由此編碼的多肽和針對(duì)多肽的抗體;以及利用這些活性制劑，即寡核苷酸、多肽和抗體，制備的診斷產(chǎn)品和疫苗。
大家知道通常病毒性肝炎是指由各種肝炎病毒誘發(fā)的疾病，包括A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、δ型肝炎病毒和E型肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒和E-B病毒。自從1980年以來，這些病毒的基因類型已經(jīng)搞清，為開發(fā)診斷制劑，疫苗和治療制劑提供了方便。
進(jìn)而業(yè)已發(fā)現(xiàn)一種被稱為非A非B型或C型新型肝炎，其中80%-90%的病例是由輸血引起的[Lancet，2，838-841(1975)]，往往這種輸入型肝炎大約50%可發(fā)展成肝硬化或肝癌。
病人血中存在的C型肝炎病毒(HCV)的數(shù)量通常非常少。與HCV相關(guān)的抗原抗體系統(tǒng)的特性還不為人們完全理解，因此，開發(fā)治療和診斷制劑還有許多困難。
后來，許多科學(xué)家對(duì)HCV的研究非常重視(Alter H.J.et al.，Lancet，459-463(1978);Tabor，E.et al.，Lanet，463-466(1978);Hollinger F.B.et al.，Intervirology，10，60-68(1978);Wyke，R.J.et al.，Lancet，520-524(1979);Bradley，D.W.et al.，J.Med.Virol.，9，253-269(1979)]。
Bradley等[Gastroenterology，88，773-779(1985)]確定了HCV的部分生化和生物物理特性。他們用一個(gè)C型肝炎病人的血清感染了一只猩猩(champanzee)，從而獲得了許多血清;再?gòu)倪@些血清中提取了HCV病毒，對(duì)此病毒進(jìn)行了分析和研究。
自那以后，采用Bradley方法分離HCV病毒用于開發(fā)診斷、預(yù)防或/和治療C型肝炎的制劑的研究非常多。
Choo等用C型肝炎病人的血清感染猩猩之后，從其血清中分離出HCV病毒，并對(duì)其部分cDNA片段進(jìn)行了克隆。證明在大腸肝菌和酵母菌體內(nèi)由這段cDNA表達(dá)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)能和C型肝炎病人血清中的抗體發(fā)生免疫活性反應(yīng)。(Science，244，359-362(1989)]。
Kuo等(Science，244，362-364(1989)]由美國(guó)Chiron公司鑒定的部分HCV cDNA片段和超氧化物歧化酶(SOD)基因融合在酵母細(xì)胞中表達(dá)了C100-3蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)與C型肝炎病人血清有免疫學(xué)反應(yīng)，也能與70%的輸入型肝炎病人血清反應(yīng)。
Houghton等進(jìn)一步描述了HCV抗原的用處，特別是C100-3蛋白，它是從患C型肝炎猩猩體內(nèi)分離出的HCV基因序列所編碼的。因此，稱其為美洲型HCV。用此抗原去制備疫苗和能檢測(cè)HCV抗體的診斷試劑(CT WO 89/04669;WO 90/11089);建立一種用這類抗原(如，C100-3)參與的酶免疫測(cè)定診斷法。
以上述為基礎(chǔ)，美國(guó)Ortho診斷系統(tǒng)公司在1990年開發(fā)并檢測(cè)HCV抗體的診斷產(chǎn)品?？墒?，所說的C100-3抗原在用于診斷制劑中活性成份時(shí)僅與慢性C型肝炎病人抗體反應(yīng)，不和急性期病人特別是疾病早期階段的血清反應(yīng)。此外，由于該蛋白中融合有SOD因而常出現(xiàn)一些假陽性結(jié)果[Shimizu，Y.K.et al，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A，86，6441(1990)]。
另一方面，按Houghton等人的方法，部分HCV cDNA克隆也被得到。HCV病毒是從收集的日本C型肝炎病人血清中得到的，包括5′-末端區(qū)和編碼核心蛋白和外膜蛋白的結(jié)構(gòu)基因。已經(jīng)確定了其cDNA克隆的核苷序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與美洲型HCV有約10-15%的不同。這表明的確出現(xiàn)了一種新型，稱為日本型[kubo，Y，et al;Nucl.Acid.Res，17，10367-10372(1989);Kato，N.et al.，Proc.Japan Acd.，65，219-223(1990);Kaneko，S.et al.，Lancet，335，976(1990);Takenchi，K.et al.，Gene，91，287-291(1990);Tekenchi，K.et al.，Nucl.Acid.Res，18，4626(1990);Takamizawa，A et al.，J.Virol.65，1105-1113(1991)];由日本型HCV得到的抗原制備的疫苗和針對(duì)日本型HCV的診斷制劑也已有報(bào)導(dǎo)[Okamoto H.et al.，Japan J.Exp Med.60，167-177(1990)]。
Harada等[J.virol.65，3015(1991)]的報(bào)告指出當(dāng)編碼結(jié)構(gòu)基因5′-末端的核心抗原被用于疑為HCV感染的病人核品中，診斷HCV的抗體時(shí)，該法可能要比用C100-3蛋白檢測(cè)抗體提早6-8周。
Lesniewski等[歐洲專利公開號(hào)72534(1990)]也介紹了一種采用多種抗原的改進(jìn)診斷法，該法要比單用C100-3抗原法敏感和特異。Wang在EP公開號(hào)442394(1991)上介紹了另一種診斷方法，該法中選用了多種由15-65氨基酸組成的表型決定簇多肽作為抗原檢測(cè)HCV抗體。這些多肽是從10個(gè)不同的HCV表型決定簇中挑選出來的。
上述公開物表明可用攜帶不同表型決定簇的多肽混和物替代單一種的抗原，從而改進(jìn)提高HCV的診斷。
然而，以糖蛋白形式存在于病毒表面的外膜蛋白已經(jīng)顯示有可能用于開發(fā)疫苗或診斷制品。因?yàn)榕cHCV很相似的黃病毒(flavivirus)，已知外膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白(ICNS1)在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)中起著重要的作用，而且在把該蛋白結(jié)合到宿主細(xì)胞受體也起著重要作用。[F.Preugschart，J.Virol.65，4749-4758(1991)]此外，業(yè)已報(bào)導(dǎo)針對(duì)外膜蛋白抗體形式密切與C型肝炎康復(fù)有關(guān)[Lesniewski，R.et al，P59;Watanabe et al.，p82，the 3rd International HCV Symposium，Strasbourg，F(xiàn)rance(1991)]。
進(jìn)一步Houghton等攜測(cè)外膜2蛋白(E2)很可能證明是一種重要的抗原用于制備C型肝炎疫苗，為此，所說的E2蛋白質(zhì)有人認(rèn)為與免疫反應(yīng)機(jī)制有密切的關(guān)系。因?yàn)镋2蛋白的氨基端表明的了顯著的種導(dǎo)質(zhì)性(The 3rd International HCV Symposium，p20，Strasbourg，F(xiàn)rance，1991);對(duì)日本型和美洲型HCV基因型的核酸序列比較后發(fā)現(xiàn)，雖然編碼核心蛋白的序列有約91%的同源性，但編碼外膜蛋白的同源性反約74%[Takeuchi，K.et al.，J.Gen.Virol.，71，3027-3033(1990)]。
如前所述，HCV病毒在許多不同國(guó)家被發(fā)現(xiàn)并表現(xiàn)出地區(qū)異質(zhì)性，而這種異質(zhì)性可能在決定疫苗的效力和診斷制劑的敏感性和準(zhǔn)確性上都是非常重要的因素。
據(jù)此，本發(fā)明僅涉及從朝鮮C型肝炎病人(KHCV)分離出的新型HCV的分離和鑒定，不同于已發(fā)現(xiàn)的HCV包括美洲型和日本型。
需倍加說明，本發(fā)明提供了已知KHCV全序列分析cDNA和幾株HCV變異株cDNA的部分定序。從KHCV的部分cDNA序列被用于診斷假定樣品中病毒存在的探針或前導(dǎo)序列(Primer，是指用于PCR檢測(cè)中的引物DNA-譯者注)。使用這種核苷酸序列的診斷試劑盒(kit)和方法也組成了本發(fā)明的內(nèi)容。
除此之外，本發(fā)明提供了由上述cDNA編碼的多肽，這在診斷試驗(yàn)試劑或/和疫苗組成中非常有用。
所說的多肽是指一大類各種不同的多肽，其中包含有重組多肽，如帶有一個(gè)非HCV蛋白的融合多肽所構(gòu)成的KHCV的表型抗原決定簇以及由此而來的各種純化產(chǎn)品。
本發(fā)明另一方面涉及一個(gè)重組表達(dá)載體，該載體是由KHCV cDNA的一個(gè)敞開閱讀框架(ORF)組成。而這個(gè)ORF完全能被自由地聯(lián)接到一個(gè)能與目的宿主微生物相容的調(diào)節(jié)序列。這種載體可包括一段編碼一種非KHCV蛋白的核苷酸序列以用于制備一種與來自KHCV或其它型病毒蛋白或多肽的多核苷酸的融合片段;一株用這種重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;以及由此而產(chǎn)生出的多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步所涉及的內(nèi)容就是生產(chǎn)含有KHCV表型決定簇多肽的方法，即培養(yǎng)含有表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該載體內(nèi)含有編碼KHCV表型決定簇多肽的一段序列;以及由此而生產(chǎn)出的含有KHCV表型決定簇多肽。
本發(fā)明還包括針對(duì)KHCV表型決定簇的單克隆抗體和生產(chǎn)這種單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
由一種以上多肽，其中包含一種以上KHCV表型決定簇組成的診斷制劑作為活性成份用于檢測(cè)假定樣品中KHCV抗體以及由這些試劑構(gòu)成的診斷試劑盒也屬于本發(fā)明的范圍。
由一種或多種針對(duì)KHCV抗原作為活性成份用于檢測(cè)假定樣品中HCV抗原的診斷制劑以及由此而構(gòu)成的診斷試劑盒又是本發(fā)明的另一個(gè)方面。
本發(fā)明還需提及的內(nèi)容就是用于治療或/和預(yù)防HCV感染的一種疫苗，它是由含有KHCV表型決定簇的多肽和滅活或致弱的HCV組成。
附圖簡(jiǎn)要說明本發(fā)明可通過附圖更易理解，其中

圖1表明在KHCV-LBC1上各種KHCV cDNA克隆的相對(duì)位置。
圖2-1到2-16說明了KHCV-LBC1的核苷酸序列和由此編碼的多肽的氨基酸序列。
圖3給出了在KHCV-LBC1上每一個(gè)cDNA克隆開始的核苷酸數(shù)和結(jié)束核苷酸數(shù)。
圖4比較分析了KHCV-LBC1與美洲型和日本型HCV基因組的核苷酸序列。
圖5比較分析了由KHCV-LBC1和美洲型和日本型HCV編碼的氨基酸序列。
圖6比較分析了KHCV-LBC1和美洲型和日本型HCV基因組中5′-末端區(qū)的核苷酸序列。
圖7示cDNA片段NS2-LBC2核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖8示cDNA NS2-LBC3片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖9示cDNA NS2-LBC20片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖10示cDNA NS2-LBC21片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖11示cDNA NS2-LBC23片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖12示cDNA NS2-LBC25片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖13示cDNA NS2-LBC26片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖14示cDNA NS2-LBC27片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖15示cDNA NS2-LBC28片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖16示cDNA NS2-LBC29片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖17示cDNA NS2-LBC30片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖18示cDNA NS2-LBC31片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖19示cDNA NS2-LBC32片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖20示cDNA NS5-LBC20片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖21示cDNA NS5-LBC21片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖22示cDNA NS5-LBC22片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖23示cDNA NS5-LBC25片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖24示cDNA NS5-LBC27片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖25示cDNA NS5-LBC28片段的核苷酸序列和由此編碼的多肽氨基酸序列。
圖26比較分析了包括在KHCV-L1或KHCV-L2亞型中的KHCV變異體cDNA的NS2區(qū)所編碼的多肽的氨基酸序列。
圖27比較分析包括在KHCV-L1中的KHCV變異體cDNA NS2區(qū)的核苷酸序列。
圖28比較分析包括在KHCV-L2中的KHCV變異體cDNA NS2區(qū)的核苷酸序列。
圖29分別比較分析包括在KHCV-L1和KHCV-L2中的KHCV變異體cDNA NS5區(qū)的核苷酸序列。
圖30示為在酵母細(xì)胞中表達(dá)一段KHCV cDNA片段而構(gòu)建的表達(dá)載體。
圖31A表明KHCV cDNA片段在酵母細(xì)胞中表達(dá)后進(jìn)行的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)果。
圖31B示圖31A膠上的蛋白印跡分析結(jié)果。
圖32示在酵母細(xì)胞上生產(chǎn)的KHCV E2N和E2C多肽的SDS-PAGE(圖31A)和蛋白印跡分析(圖31B)的結(jié)果。
圖33示化學(xué)合成的ubiquitine基因核苷酸序列。
圖34示一個(gè)含有trp啟動(dòng)子(promotor)用于在大腸桿菌中表達(dá)一段KHCV cDNA片段的表達(dá)載體。
圖35示一個(gè)含有tac啟動(dòng)子(promotor)用于在大腸桿菌中表達(dá)一段KHCV cDNA片段的表達(dá)載體。
圖36至38示在大腸桿菌中表達(dá)一段KHCV cDNA片段后SDS-PAGE結(jié)果。
圖39至41示圖36-38凝膠上的蛋白印跡分析結(jié)果。
圖42示在大腸桿菌內(nèi)由tac啟動(dòng)子控制下KHCV cDNA片段與MBP基因融合基因表達(dá)后SDS-PAGE結(jié)果。
圖43示圖42凝膠上的蛋白印跡分析結(jié)果。
圖44示酶免疫測(cè)定法(EIA)標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨用于檢測(cè)樣品中HCV抗體使用抗原濃度而變化。
圖45示用單克隆抗體作為樣品中KHCV抗原濃度的函數(shù)進(jìn)行EIA的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
所有此中所引述的參考文獻(xiàn)在整個(gè)文章所需引述都已標(biāo)出。
所有文中使用的下列術(shù)語都應(yīng)具有下列意義“C型肝炎病毒”是指一種引起非A非B型肝炎或C型肝炎的病毒。HCV和NANBV，以及NANB肝炎(NANBH)和C型肝炎可對(duì)應(yīng)互換。
“朝鮮型C型肝炎病毒”或“KHCV”是指一種新型的HCV，它是從朝鮮的C型肝炎病人體上分離而得。它的cDNA有一個(gè)核苷酸序列的敞開的閱讀框架，該序列編碼的氨基酸序列中在842，849和853位置上的氨基酸分別為苯丙氨酸、亮氨酸和蘇氨酸;或分別為亮氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸。
“表型決定簇”是指一個(gè)多肽的抗原決定簇，它能誘發(fā)免疫學(xué)上擔(dān)負(fù)的宿主動(dòng)物的免疫應(yīng)答或/和能特異性將自身連接到相應(yīng)的抗體。本發(fā)明的表型決定簇通常至少由6個(gè)氨基酸組成，最好是7或8個(gè)氨基酸。
“片段”意味著多核苷酸或多肽，它們由本發(fā)明中cDNA或蛋白的亞序列組成。這些片段可以由酶切大分子而產(chǎn)生。限制性內(nèi)切酶用于DNA，蛋白酶用于蛋白質(zhì)分子?？墒?，本發(fā)明的片段沒限制來自任何特殊形式的酶切產(chǎn)品;可能包括亞序列、它們的終點(diǎn)不與任何酶切點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。根據(jù)文中提供的序列資料，這些片段也可由化學(xué)合成法獲得。蛋白片段可由編碼這些蛋白片段的DNA片段表達(dá)而得。本發(fā)明中如果這些蛋白片段包含有足夠多的氨基酸殘基構(gòu)成一個(gè)免疫活性決定簇和/或抗原決定簇，那么它們就非常有用了。
“敞開閱讀框架”是指一段寡核苷酸序列的區(qū)域，在此區(qū)域中連接核苷酸三聯(lián)序列可做為密碼子進(jìn)行閱讀，它們代表著特殊的氨基酸編碼出一個(gè)多肽。
“表達(dá)載體”是指一個(gè)克隆運(yùn)載體，通常被設(shè)計(jì)用于啟動(dòng)寡核苷酸插入物表達(dá)的啟動(dòng)。
“調(diào)節(jié)序列是指一段DNA序列涉及一段寡核苷酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)，例如，調(diào)節(jié)序列是指啟動(dòng)子，核糖體聯(lián)結(jié)位點(diǎn)以及終止子。
“重組KHCV多肽”是指一段多肽，由圖2-1到2-16和圖7至25中KHCV cDNA編碼的至少包含6個(gè)氨基酸，同時(shí)它也可連接到除在KHCV cDNA上編碼的多肽上以外的氨基酸上。
“純化的KHCV多肽”是指KHCV多肽或片段，它們實(shí)際上是純一或均質(zhì)的，是從天然存在的細(xì)胞組份中分離而得。通常，一種純化的KHCV多肽是由超過70-90%的這種多肽組成，更好的純化物則至少高于95%。
其它用于該文中的術(shù)語，正如現(xiàn)有技術(shù)中所用有正常和方便的意義。
本發(fā)明在下面將更專門地加以演示。
KHCV cDNA的克隆KHCV cDNA文庫的制備如下HCV病毒子是用超離心沉淀法從患C型肝炎的朝鮮病人血清中分離而得。再以HCV中抽提出HCV RNA;用一個(gè)隨機(jī)前導(dǎo)片段或寡d(T)前導(dǎo)片段和反轉(zhuǎn)錄酶從HCV RNA中合成了雙股cDNAs;用PCR擴(kuò)增后進(jìn)行克隆或直接克隆到UNI-ZAPXR載體(Stratagene CO.11099 N.Torrey，Pines Rood，CA，USA)，給這個(gè)載體上接上一個(gè)Eco RI接頭后，包裝成病毒顆粒制備出cDNA文庫[Saiki et al.，Science，230，1350(1985)]。
通常，肝炎病毒顆?？蓮母腥靖窝椎牟∪嘶蛐尚筛位蜓逯蟹蛛x出。在本發(fā)明中，HCV是從C型肝炎病人血清分離而得，HCV總RNA是先用超離心沉淀的病毒顆粒，再以酚抽提和酒精沉淀而得。
之后，所說的HCV總NRA所用作制備cDNA的模板。在此反應(yīng)中使用了一個(gè)Zap-cDNA合成試劑盒(Cat.No.200400，Stratagene Co.，11099 N.Torrey Pines Rd.，La Jolla，CA 92037，USA)。
所說的cDNA是由反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)合成的，這期間使用了總NRA和隨機(jī)前導(dǎo)引物序列RANPSHCV或寡聚d(T)前導(dǎo)引物，這里RNAPSHCV引物(5′-TTTTTCATGATTGGTGGTGGAACTGGACCGTCTCGAGNNNNNN-3′，其中的N系指A、G、T或C)和寡聚d(T)引物(5′-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG(T)18-3′)是由6個(gè)隨機(jī)核苷酸片段(RANPSHCV引物)或18T[寡聚d(T)引物]組成cDNA的3′末端區(qū)，其中有一個(gè)Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。
為了引入一個(gè)Eco RI(5′-GAATTC-3′)酶識(shí)別位點(diǎn)到合成的cDNA以方便克隆，Eco RI接頭(5’-CCCCCCGAATTCGGCACGAG-3’)(3’-GGGGGGCTTAAGCCGTGCTC-5’)被連接到合成的cDNA片段上。之后，cDNA片段在引物PSHCV(5′-TTTTCATGATTGGTGGTGGA-3′)和Eco RI引物(Eco RI接頭的上面一段，即5′-3′)存在下進(jìn)行PCR擴(kuò)增;cDNA片段用限制性核酸內(nèi)切酶Eco RI和Xho Ⅰ部分酶切;消化后的cDNA用UNI-ZAPXR載體連接，這種載體是一株λgt 11的變異體，先經(jīng)Eco RI和Xho Ⅰ酶切后與cDNA消化片段對(duì)接。連接后的DNA用Gigapack Ⅱ Gole Packaging試劑盒在體外包裝成λ噬菌體顆粒(Cat.No.200214，Stratagene Co.，USA)感染大腸桿菌進(jìn)一步增殖后即制備出cDNA文庫。
cDNA文庫平覆于大腸桿菌的平皿上以形成噬菌斑，然后用免疫學(xué)方法[Huynh，DNA CloningA Practical Approach，Vol.1，pp.49-78，IRL Press，UK(1985)]進(jìn)行篩選，選出能和C型肝炎病人血清抗體反應(yīng)的噬菌體克隆株。這就提示可能會(huì)生產(chǎn)出源自KHCV cDNA的多肽產(chǎn)品。
另一方面，UNI-ZAPXR載體能夠在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)一步產(chǎn)生噬菌體質(zhì)粒(phagemid)-pBluescript，它含有KHCV cDNA片段[Short et al.，Nucl.Acid.Res.，16，7583-7600(1988)]，這種質(zhì)?？梢愿菀紫笠粋€(gè)正常質(zhì)粒一樣操縱。進(jìn)一步pBluescript可以任意獲得其單股或雙股形式，因?yàn)樗扔蠧ol E1源又有f1復(fù)制源。
從陽性噬斑感染大腸桿菌中分離出的雙股pBuescript DNA用限制性內(nèi)切酶Eco RI和Xho Ⅰ消化后用凝膠電泳以確定插入在Eco RI和Xho Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)之間KHCV cDNA的存在和長(zhǎng)度。用Sanger的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，5463(1977)]進(jìn)行cDNA片段的核苷酸測(cè)序。
后面，我們可以按照cDNA克隆已確定的核苷酸序列合成一些新的寡核苷酸探針以檢測(cè)cDNA文庫用以獲得全部KHCV cDNA其余部分，隨后，用這樣獲得的新cDNA克隆再次用于檢測(cè)篩選，以獲得KHCV cDNA克隆。同時(shí)，KHCV cDNA一部分可以用早期確定的KHCV cDNA序列合成的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得。
重疊的cDNA片段可以相連，這樣就確定KHCV cDNA的全長(zhǎng)序列和一個(gè)敞開閱讀框架隨后就可推出。
這樣獲得的有全長(zhǎng)cDNA序列的KHCV cDNA被稱為KHCV-LBC1，它已經(jīng)在1991年5月14日庫藏入美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，其編號(hào)為ATCC 75008。這是在關(guān)于為專利程序目的國(guó)際微生物保藏鑒別的《布達(dá)佩斯條件》的條款下進(jìn)行上述手續(xù)的。
KHCV-LBC1的全部核苷酸序列和其編碼的蛋白氨基酸序列描述在圖2-1至2-11。在KHCV-LBC1序列上的每一個(gè)cDNA克隆的位置在圖1和圖3中加以表明。KHCV-LBC1有一個(gè)長(zhǎng)的敞開的閱讀框架，它由9030核苷酸堿基組成，5′端計(jì)數(shù)，從第343個(gè)核苷酸(A)開始直至單9372個(gè)核苷酸(G)為止。
給定氨基酸的鑒定數(shù)已經(jīng)被確定，這主要依賴從5′-3′端方向由上述9030核苷酸編碼的多肽中氨基酸的位置所決定。
在KHCV-LBC1的5′-末端區(qū)，按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)要比日本型HCV多出13以上的核苷酸殘基[Kato，N.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，95224(1990)]。象在圖6中所述，和美洲型HCV相比，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)核苷酸以上以及在5′-末端區(qū)構(gòu)建一個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的22個(gè)核苷酸上有3個(gè)核苷酸已確定是不同的。5′-末端區(qū)通常在病毒基因表達(dá)和調(diào)節(jié)中起一個(gè)很重要的作用，組成22個(gè)核苷酸的發(fā)卡結(jié)構(gòu)據(jù)認(rèn)為是復(fù)制酶和核心蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。因此，即使在此區(qū)上有一個(gè)細(xì)小的結(jié)構(gòu)差異。可能在它的作用或特異性上會(huì)出現(xiàn)明顯的和本質(zhì)上的差別。
相似的，KHCV-LBC1的全長(zhǎng)核苷酸序列和由此編碼的氨基酸序列都和美洲型和日本型HCV進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，以美洲型為例，與KHCV-LBC1核苷酸序列的同源性高達(dá)約78.3%，氨基酸序列大約84.2%同源。以日本型HCV為例，與KHCV-LBC1有90.9%核酸序列同源，氨基酸序列為93%(參見圖4至圖6)。上述結(jié)果清楚地表明KHCV-LBC1是一種新型HCV的cDNA，它完全不同于已經(jīng)鑒定的HCV病毒。
KHCV變異株部分酶切cDNA片段的制備從C型肝炎病人血清中分離出的所說的KHCV中抽提出KHCV RNA，每一個(gè)KHCV RNA的cDNA通過PCR合成得到，相對(duì)應(yīng)于NS2區(qū)域NS5區(qū)域的cDNA片段。每一個(gè)這樣獲得的cDNA片段的長(zhǎng)度是大約分別為340 bp(NS2)和320 bp(NS5)(bp是base pair的縮寫形式，意為堿基對(duì))。
然后將這些cDNA片段插入到M13mp18載體中[Cat，No.408，New England Biolabs，32Tozer Road Beverly，MA 01915-5599，U.S.A.)，以確定它們的核苷酸序列(參見圖7至圖25)。它們的NS2區(qū)的核苷酸序列有91至94%同源性(參見圖27和28)。NS5區(qū)表明96至99%同源性(圖29)而編碼在NS2和NS5區(qū)的氨基酸序列分別有90-94%和93-99%的同源性(參見圖26)。
然而，也已發(fā)現(xiàn)，依照NS2區(qū)編碼的842，849和853位的氨基酸數(shù)，KHCV可以被分成2個(gè)亞型，即KHCV-L1和KHCV-L2包括在KHCV-L1中的KHCV的cDNA編碼苯丙氨酸、亮氨酸和蘇氨酸分別作為842，849和853位鑒定氨基酸，而包括在KHCV-L2的cDNA分別編碼亮氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸。作為KHCV-L1亞型，還包括KHCV-LBC1，KHCV-LBC20，KHCV-LBC23，KHCV-LBC26和KHCV-LBC32，而KHCV-L2亞型包括KHCV-LBC2，KHCV-LBC3，KHCV-LBC21，KHCV-LBC25，KHCV-LBC27，KHCV-LBC28，KHCV-LBC29，KHCV-LBC30和KHCV-LBC31。
應(yīng)該值得注意的是上述那些特征沒能在美洲型HCV中發(fā)現(xiàn)，這幾處的氨基酸為半胱氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸。可是，日本型與KHCV-L2有相同的特征，即在上述位置中的氨基酸分別為亮氨酸，苯丙氨酸和丙氨酸。M13噬菌體群(M13mp 18-NS2L1)內(nèi)含M13mp18噬菌體，它由不包括KHCV-LBC1但包括在KHCV-L1在內(nèi)的每一個(gè)cDNA組成，即KHCV-LBC20，KHCV-LBC23，KHCV-LBC26和KHCV-LBC32在1992年3月13日存入美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，并編號(hào)ATCC75211。內(nèi)含M13mp噬菌體的M13噬菌體群(M13mp18-NS2L2)，它們是由包括在KHCV-L2以內(nèi)每一個(gè)cDNA組成，即，KHCV-LBC2，KHCV-LBC3，LHCV-LBC21，KHCV-LBC25，KHCV-LBC27，KHCV-LBC28，KHCV-LBC29，KHCV-LBC30和KHCV-LBC31都在上述同一天存入ATCC，編號(hào)為ATCC 75212。
本發(fā)明cDNA除了在例子中給的方法之外，即在圖2-1至圖2-16和圖7至25中所提供的核苷酸序列資料，可以采用化學(xué)合成。這種化學(xué)合成可用已知的象磷胺-固相支持法[Matteucci，J.An.Chem.Soc.，103，3185(1991)]來進(jìn)行。
然而，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性(degeneracy)，可以理解有許多潛在核苷酸序列能夠編碼在圖2-1至圖2-16和圖7至圖25的氨基酸序列。
構(gòu)建表達(dá)載體和生產(chǎn)蛋白質(zhì)按照本發(fā)明各種表達(dá)系統(tǒng)可以用于制備含有KHCV cDNA片段的表達(dá)載體，包括能指導(dǎo)生產(chǎn)和其它多肽在一起的融合蛋白而不僅僅是KHCV的蛋白。
例如，通過采用一種最常用的表達(dá)系統(tǒng)可構(gòu)建這樣一種載體系統(tǒng)。在酵母細(xì)胞，ubiquitine已知由ubiquitinase酶在離Arg-Gly-Gly非常近的那個(gè)位點(diǎn)上被切除了[Ozkaynak et al.，Nature，312，663-666(1987)]。Bachmair[Sience，234，178-186(1986)]報(bào)道一個(gè)融合有ubiquitine的外源蛋白也可在離ubiquitine的Arg-Gly-Gly上進(jìn)行切除。
據(jù)此，一個(gè)目的KHCV蛋白可通過在酵母表達(dá)KHCV cDNA片段和ubiquitine基因的融合寡聚核苷酸而獲得。因?yàn)槿诤系牡鞍卓捎胾biquitinase酶被切除從酵母細(xì)胞中移去ubiquitine，結(jié)果，仍僅留下KHCV蛋白。
進(jìn)一步，如果，這個(gè)含有KHCV cDNA片段和ubiquitine基因的融合寡聚核苷酸在大腸桿菌中表達(dá)，則內(nèi)含有ubiquitine的融合蛋白將會(huì)得到。然而，ubiquitine在體外就可用ubiquitinase酶將其切除。并可獲得無ubiquitinaes酶污染的KHCV蛋白。當(dāng)然，融合蛋白本身就能達(dá)到本發(fā)明的目的。只要KHCV仍保持有該蛋白必要的特征，如抗原性，它本身就可被使用。
有效地使用上述表達(dá)系統(tǒng)，若出現(xiàn)目的蛋白不穩(wěn)定和易在宿主細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶降解，則選用ubiquitine作為融合蛋白則可使目的蛋白免遭蛋白酶的攻擊并可穩(wěn)定目的蛋白。
使用ubiquitine系統(tǒng)的表達(dá)載體可通過將KHCV cDNA片段插入到含有ubiquitine基因的表達(dá)載體上而得到。
另一方面，用麥芽糖連接蛋白(MBP)系統(tǒng)的融合表達(dá)載體也可用于本發(fā)明作為表達(dá)載體。在這個(gè)系統(tǒng)中，KHCV cDNA片段被連接到編碼MBP的mal E1基因下游。就可生產(chǎn)出這種MBP和KHCV的融合蛋白[Guam et al.，Gene，67，21-30(1987);Maina et al.，Gene，74，369-373(1988);Amann et al.，Gene，40，183-190(1985);Duplay et al.，J.Biol.Chem.，256，10606-10613(1984)]。
上述的MBP表達(dá)系統(tǒng)非常方便，其原因是含有MBP的融合蛋白可以很容易將MBP親和到麥芽糖上而加以純化;MBP在C末端區(qū)有一個(gè)可被蛋白酶因子Xa切除的位點(diǎn)，這使得KHCV蛋白脫離MBP。
為了獲得KHCV目的蛋白，可用含有KHCV cDNA片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化相容的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在允許表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
一個(gè)用于表達(dá)的KHCV cDNA片段可用限制性核酸內(nèi)切酶或核酸酶制備對(duì)較大的片段或KHCV-LBC進(jìn)行酶切而制備，也可通過以KHCV-LBC1或其它片段作為模板，加入引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增而制備出。每一個(gè)引物的長(zhǎng)度和核苷酸序列可按要表達(dá)的KHCV cDNA位置和長(zhǎng)度進(jìn)行確定。引物完全或部分互補(bǔ)于雙股KHCV cDNA的任何一股。
一旦本發(fā)明KHCV cDNA被制備好和分離出，則進(jìn)一步插入于一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)轉(zhuǎn)移載體上，它含有插入基因序列轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯所必需的結(jié)構(gòu)組成。有用的克隆載體可由其它非KHCV多核苷酸片段包括化學(xué)合成的DNA序列(各種已知細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA以及被修飾用于噬菌體DNA或其它表達(dá)控制序列或酵母質(zhì)粒的組合物)等組成。
選擇一個(gè)合適宿主表達(dá)微生物受許多已知因素的影響。例如，這些因素包括所選載體的相容性，由重組質(zhì)粒編碼蛋白的毒性，目的蛋白可復(fù)性難易程度、蛋白特征、生物安全性和費(fèi)用。必須考慮平衡這些因素，也必須理解不是所有的宿主都對(duì)表達(dá)一個(gè)特定的重組DNA分子有效。
用在本發(fā)明中的合適的宿主生物包括，但不僅限于，植物，哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞和像大腸桿菌類的細(xì)菌。
來自KHCV cDNA的多肽包括所有的核心蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白和外膜蛋白和一種能用于制備診斷制劑和以一種或多種混合制備疫苗的蛋白質(zhì)。在宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的多核苷酸可結(jié)合使用常規(guī)方法，如細(xì)胞破碎、離心、透析、脫鹽、層析、凝膠過濾、電泳和電洗脫等，進(jìn)行分離和純化。
本發(fā)明的多核苷酸也可以KHCV病毒子中分離制備，或采用合適的方法，如，排除固相合成法、部分固相法、片段凝縮或傳統(tǒng)溶液法，進(jìn)行化學(xué)合成。最好采用Merrifield(J.Am.Chem.Soc.85，2149(1963)]所介紹的固相合成法。
另一方面，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸替換并不改變其生物學(xué)和免疫學(xué)活性。這已由Neurath等對(duì)此進(jìn)行了描述(The Proteins，Academic Press，New York(1979)]，這一點(diǎn)特別在圖6上出現(xiàn)。最常見的氨基酸替換是Ala/Ser，Val/Ile/ASP/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Thr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly，以及反過來也是如此。
這種功能上對(duì)等的氨基酸替換是本發(fā)明曲型的體現(xiàn)，也是本發(fā)明范圍之內(nèi)。無論如何，只要最終產(chǎn)品仍保留一個(gè)或更多KHCV抗原決定簇即可。
在這種專門的情況下，標(biāo)準(zhǔn)的單字母或三字母縮寫用于代表核苷酸和氨基酸。這些縮寫的意義可以在標(biāo)準(zhǔn)的生化教科書上找到，如，生物化學(xué)原理(Lehninger，Worth Publishers Inc.，New York，pp.96，798(1984)]。
應(yīng)用C型肝炎KHCV多肽抗原建立的診斷方法檢測(cè)KHCV抗體。
本發(fā)明也涉及一個(gè)診斷方法，該法中使用一個(gè)或更多KHCV抗原表型決定簇的KHCV多肽作為診斷試劑。這種采用KHCV多肽的診斷方法在檢測(cè)C型肝炎患者血清樣品中KHCV抗體時(shí)，比任何其它現(xiàn)有的方法都特異和準(zhǔn)確。
新的診斷方法包括以下各步首先，含有一個(gè)或更多KHCV多肽的診斷試劑被加到一個(gè)固相支持物上，例如，微量反應(yīng)板孔可使已知KHCV抗原吸附到孔表面。
其次，將假定血清樣品用稀釋液稀釋后加到抗原包被孔內(nèi)，如果樣品中有KHCV抗體，則可形成抗原抗體復(fù)合物。
再次，酶(如辣過氧化物酶HRP)標(biāo)抗人IgG加入孔內(nèi)讓HRP-抗人IgG接合到在第二步中形成的復(fù)合物上。
最后，加入酶的底物，如，過氧化物酶的底物為鄰本二胺鹽酸鹽(OPD)和過氧化氫，使孔內(nèi)出現(xiàn)顏色反應(yīng)。當(dāng)樣品中含有KHCV抗體時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)酶和底物的反應(yīng)，結(jié)果出現(xiàn)顏色。加入稀硫酸終止顏色反應(yīng)。
顏色的強(qiáng)弱程度可用微孔板酶標(biāo)讀數(shù)儀測(cè)出，依此，可測(cè)出HCV抗體的存在。診斷方法的固相支持物可以是聚乙烯珠或硝酸纖維素膜。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了C型肝炎診斷試劑盒，它由必要的試劑組成來進(jìn)行上述過程，特別含有KHCV多肽并帶有一個(gè)或更多KHCV表型決定簇的診斷試劑。
抗體的制備本發(fā)明提供針對(duì)源自KHCV cDNA多肽的抗體。簡(jiǎn)單地說，選出適當(dāng)?shù)膭?dòng)物進(jìn)行目的免疫，一定時(shí)間后，動(dòng)物脾臟被切割取出，在選定的條件下將單個(gè)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合。之后，進(jìn)行細(xì)胞的克隆化，將每個(gè)克隆上清液進(jìn)行檢測(cè)看是否分泌針對(duì)抗原目的區(qū)域特異的抗體。
這種動(dòng)物，例如小鼠，可按下述常規(guī)方法進(jìn)行免疫大量純化抗原采用肌肉內(nèi)，腹腔內(nèi)，皮內(nèi)或靜脈內(nèi)注入小鼠。每只注入總量為100至200g的量，間隔14至21天，可再進(jìn)行幾次這樣的免疫。如有必要，可同時(shí)使用常規(guī)弗氏完全或不完全佐劑。在末次免疫后的第三天，移去小鼠脾細(xì)胞和存活率高于95%處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。
細(xì)胞融合按已知的方法進(jìn)行，如Lovborg所述的方法(″單克隆抗體生產(chǎn)和保存，William Heinemann，Medical Books Ltd.(1982))。
這樣獲得的融合細(xì)胞用已知的方法進(jìn)行系列稀釋(“免疫學(xué)的現(xiàn)代策略”，Wiley Interscience(1991))以檢測(cè)出分泌目的抗體的克隆。
目的克隆可由一個(gè)常規(guī)的方法，如酶免疫測(cè)定法、空斑法，斑點(diǎn)法，Ouchelny法和放射免疫法(“雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體”，Research and Development Press，pp 30-53(1982))進(jìn)行篩選。
一個(gè)技術(shù)熟練人員可以很容易從克隆后的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系獲得目的單克隆抗體，進(jìn)一步用象親和層析的常規(guī)方法進(jìn)行純化。
這些抗體對(duì)純化KHCV抗原和開發(fā)改良的診斷方法檢測(cè)樣品中KHCV抗原非常有用。
診斷性寡聚核苷酸探針和試劑盒的制備以圖2-1至2-16和圖7至25所示KHCV cDNA已確定的核苷酸序列為基礎(chǔ)，至少有8個(gè)互補(bǔ)于KHCV cDNA雙股中任何一股的核苷酸片段可通過酶切或人工合成而制備出。寡核苷酸在標(biāo)記后可作為雜交探針，例如用放射性同位素標(biāo)記，或以KHCV cDNAs為模板，此寡核苷酸為引物PCR來檢測(cè)血清樣品中的KHCV。
寡核苷酸既可完全或部分互補(bǔ)于一股KHCV cDNA，這依照具體情況而定。
寡核苷酸應(yīng)該至少有8個(gè)核苷酸，最好為10-12個(gè)，共有20個(gè)左右則更好了。
疫苗的制備和注射方式選用一種已知方法制備滅活或致弱KHCV以及由本發(fā)明中KHCV cDNA片段所編碼的一種或更多的多肽，加入生理上可接受的介質(zhì)液體即可制成疫苗。適宜的介質(zhì)液體包括0.01M至0.1M中性pH的磷酸緩沖液或生理鹽水。
抵抗HCV的強(qiáng)免疫力可通過給疫苗加入一種佐劑或免疫增強(qiáng)劑，或以一種更大形式的多肽，這既包括交叉連接成的復(fù)合物或?qū)⒍嚯呐悸?lián)到成載體狀形式。
免疫接種適宜的佐劑包括，但并不僅限于，佐劑65(含有花生油，mannide單油酸鹽和單硬脂酸鋁)礦物膠，如氫氧化鋁、磷酸鋁和鋁膠;表面活性劑，如十六(烷)基胺(hexadecylamine)，十八(烷)基胺(octadecylamine)，溶血卵磷脂(lysolecithin)，二甲基雙十八(烷)基-氨溴化物(dimethyldioctadecylammonium bromide)，N，N-雙十八(烷)基-N′，N′-雙(2-羥甲基)丙二胺(N，N-dioctadecyl-N′，N′-bis(2-hydroxymethyl)propanediamine)，methoxyhexadecyclglycerd和普盧蘭尼克多烴基化合物(pluronic polyols;聚陰離子，如吡喃，葡聚糖硫酸鹽(dextran sulfate)，poly IC，聚丙酸，carbopol;肽，如胞壁酰二肽，二甲基甘氨酸和tuftsin;和油乳劑。本發(fā)明中的蛋白質(zhì)在它們制成脂質(zhì)體或其它微載體時(shí)也可進(jìn)行預(yù)防注射。
本發(fā)明中蛋白的免疫原性，特別是較小的片段，可以通過交互聯(lián)結(jié)或通過偶聯(lián)到一個(gè)免疫原載體分子(如有能在宿主動(dòng)物體上獨(dú)立激發(fā)免疫應(yīng)答性質(zhì)的大分子物，這些分子可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段共價(jià)連接)。交互聯(lián)結(jié)或偶聯(lián)到一個(gè)載體分子可能是很必要的，因?yàn)樾〉牡鞍灼斡袝r(shí)象半抗原(該分子能特異性接合到抗體上，但不能誘發(fā)抗體產(chǎn)生，即它們沒有免疫原性。這種半抗原偶聯(lián)到免疫載體分子后就可通過通常稱作的“載體效應(yīng)”，賦與這些半抗原有免疫原性。
適宜的載體分子包括蛋白南和天然的或合成的多聚體化合物(多肽、多糖、脂多糖等)。有用的載體之一是被稱作Quil A的糖甙類物，這是由Morein等介紹的Quil A特別適合蛋白分子(Nature，308，457(1984))，包括(但不僅限于此)哺乳動(dòng)物血清蛋白，如鑰孔血藍(lán)素，人和牛的γ球蛋白，人、?；蛲醚灏椎鞍?，甲基化的這些蛋白質(zhì)或其衍生物。其它能用的蛋白質(zhì)載體將很明顯是由操作熟練的人員自行選擇。
用各種已知的方法可將半抗原分子共價(jià)偶聯(lián)到載體分子上，準(zhǔn)確有選擇要由使用的載體分子的性質(zhì)來決定。當(dāng)載體分子是一個(gè)蛋白分子，則本發(fā)明中的蛋白質(zhì)或片段可以由水溶性碳化二亞胺(雙環(huán)己基碳化二亞胺)或戊二醛偶聯(lián)到這樣的載體上。
象這樣的偶聯(lián)劑還可被用于交互聯(lián)結(jié)自身蛋白質(zhì)或片段，結(jié)果避免了使用單獨(dú)的載體分子。在蛋白質(zhì)或其片段間的這種交互聯(lián)結(jié)成的聚集物也可增加其免疫原性。
摻入到脂質(zhì)體或其它微載體，可提供了在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)釋放疫苗的效應(yīng)。
這種疫苗可采用單一劑量接種，或最好采用多劑量接種。在疫苗配方中多肽的有效劑量范圍為約5-200μg，這依照要免疫者的體重，這個(gè)人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的能力，以及所期望達(dá)到的免疫力程度，初次免疫后1至數(shù)月，最好進(jìn)行再次加強(qiáng)免疫，也可反復(fù)多次接種。標(biāo)準(zhǔn)的接種途徑是皮下，皮內(nèi)，肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。
下面給出的例子企圖在不限制本發(fā)明的范圍內(nèi)以特別事例說明本發(fā)明。例中使用的試驗(yàn)方法完全按照下面給出的參考例子進(jìn)行，除非有特別說明。
如果不另外特別指出，在固體混合物中固體物，液體中的液體物，液體中的固體物在上面所給的百分比分別表示wt/wt，vol/vol和wt/vol。
參考例1限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA限制性酶和反應(yīng)緩沖液是從NEB(New England Biolabs，Jolla，MA，U.S.A)公司購(gòu)到。
反應(yīng)通常在滅菌的埃朋導(dǎo)夫管內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)體積在50-100μl之間，反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為370℃和1-2小時(shí)。之后，反應(yīng)物在65℃熱處理15分鐘(或在熱抗性內(nèi)切酶情況下用酚抽提和乙醇沉淀)以滅活限制性核酸內(nèi)切酶。
用于限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的10倍反應(yīng)緩沖液有下列配方10×NEB反應(yīng)緩沖液1100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM DTT，pH 7.010×NEB反應(yīng)緩沖液2100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，500mM NaCl，10mM DTT，pH 7.010×NEB反應(yīng)緩沖液3100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，1000mM NaCl，10mM DTT，pH 7.010×NEB反應(yīng)緩沖液4200mM Tris-乙酸鹽，100mM乙酸鎂，500mM乙酸鉀，10mM DTT，pH 7.0。
參考例2酚抽提和乙醇沉淀在完成酶反應(yīng)后，反應(yīng)混合物用酚抽提，其目的是滅活酶活性或從反應(yīng)混合物中恢復(fù)DNA，這里使用的酚用前先用含有10mM Tris-HCl(pH 8.0)和1mM EDTA緩沖液進(jìn)行平衡。酚抽提即將等體積樣品和酚溶液混合，用力震搖，15，000rpm離心5分鐘，將上層水相移入新試管中。重復(fù)進(jìn)行上述過程2～3次。
最后，水相同等體積氯仿(氯仿∶異戊醇＝24∶1)抽提，再一次分離水相。3M乙酸鈉(0.1個(gè)體積)和乙醇(2.5體積)加入分離水相中，置-70℃ 30分鐘或-20℃ 12小時(shí)，再將該混合物在4℃ 15，000rpm離心20分鐘以恢復(fù)原核酸。
參考例3連接反應(yīng)DNA的連接反應(yīng)是用T4連接酶進(jìn)行的，10×連接反應(yīng)緩沖液(0.5M Tris-HCl，0.1M MgCl2，0.2M DTT，10mM ATP，0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)觀自NEB。反應(yīng)體積通常是20μl，10單位T4連接酶用于連接DNA的粘性末端，而100單位用于連接平端DNA。
在16℃反應(yīng)進(jìn)行5小時(shí)，在4℃進(jìn)行14個(gè)多小時(shí)，反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合物加熱到65℃并維持15分鐘滅活T4 DNA連接酶。
參考例4轉(zhuǎn)化大腸桿菌用于該例中的大腸桿菌菌株包括HB101(ATCC 33694)，W3110(ATCC 27325)，JM 101(ATCC 33876)和JM 105(ATCC 47016)。用一個(gè)已知的方法進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化(Maniatis et al.，in Moleaclar CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.(1982);或Cohen，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A，69，2110(1972))。
參考例5轉(zhuǎn)化酵母菌酵母轉(zhuǎn)化按下面兩屬文獻(xiàn)介紹的方法進(jìn)行。Beggs，Nature，275，104(1978)和Hinnen et al，Proc，Natl，Acad.Sci，U.S.A.，75，1929(1978)。
參考例6寡核苷酸合成用DNA合成儀(Applied Biosystems Inc.，380B，U.S.A)采用自動(dòng)固相磷酰胺化學(xué)法進(jìn)行寡核苷酸合成。
用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(2M脲，12%丙烯酰胺和雙叉丙烯酰胺(29∶1)，50mM Tris，50mM硼酸，1mM EDTA)t SEP-PAK(Waters Inc.，U.S.A)柱層析純化合成的寡核苷酸;在260nm處測(cè)量O.D.值來確定量。
參考例7聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)向10-100ng模板DNA混合物中加入10μl 10×Taq聚合酶反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl，500mM KCl，15mM MgCl2，0.1%(W/V)明膠，pH8.3)，10μl d NTP混合液(d GTP，d ATP，d TTP和d CTP每一樣均為2mM)，每一個(gè)引物2μg(通常，在一個(gè)反應(yīng)中用兩個(gè)引物，為防止萬一，也可用3個(gè)，位于中間部分的引物可用0.02μg)。0.5μl Ampli Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)加入蒸餾水中使最終體積達(dá)到100μl，再加入50μl礦物油以防止反應(yīng)混合物的蒸發(fā)。
PCR是在一個(gè)熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus，U.S.A)中進(jìn)行。熱循環(huán)按程序重復(fù)25次或更多次。循環(huán)程序?yàn)?5℃1分鐘→55℃1分鐘→72℃2分鐘，最后反應(yīng)在72℃中進(jìn)行10分鐘。
在反應(yīng)被完成后，混合物用酚抽提，用乙醇沉淀法復(fù)原收儲(chǔ)PCR產(chǎn)物。將沉淀物溶解在20μl TE緩沖液中(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)。
例1制備KHCV CDNA KHCV-LBC1。
(1-A)從朝鮮C型肝炎病人血清中分離HCV并進(jìn)一步抽提出病毒基因組RNA。
從患慢性C型肝炎的朝鮮病人體內(nèi)取血清50ml(ALT＜60IU，由朝鮮大學(xué)醫(yī)院和在朝鮮的基督教大學(xué)提供)，進(jìn)一步超速離心沉淀出HCV顆粒。這是按Bradley.D.W.，等推薦的方法進(jìn)行的(Gastroenterology，88，773(1985))。50ml血清用TENB緩沖液(0.05 M Tris.pH8.0，0.001M EDTA，0.1M NaCl)稀釋6倍，在28，000 rpm室溫下離心6小時(shí)，使用Beckman轉(zhuǎn)頭SW28(Beckman Inc.，Model L8-80M)。
從沉淀的病毒顆粒中抽提出病毒基因RNA是按Cholozynski P.，和Sacchi，N.介紹的方法進(jìn)行的(Anal Biochem.，162，pp 156-159(1987))。沉淀的病毒顆粒懸浮在8ml RNA抽提液中(4M硫氰胍，24mM檸檬酸的，pH7.0，0.5% Sarcosyl，0.1M 2-巰基乙醇)，再加入0.8ml 2M乙酸鈉(pH 4.0)，8ml酚(BRL Inc，U.S.A，用蒸餾水事先飽和)和1.6ml氯仿-異戊醇(49∶1，V/V)，并將該混合物以12，000×g 4℃離心15分鐘。上清液吸到一支新管中再加入同樣體積量的異丙醇和糖原(2μg/ml上清液)作為載體，在冷凍盒(-20℃)停留1小時(shí)，然后，以12，000×g 4℃離心20分鐘獲得RNA沉淀物。該沉淀物懸浮于75%乙醇，以上述同樣方式離心，然后在真空泵中抽干10分鐘。病毒RNA沉淀溶解在400μl TE緩沖液(10mM Tris，pH 7.5，1mM EDTA)，用于下一步驟。以后使用的病毒RNA可以-70℃保存。
(1-B)KHCV cDNA文庫的建立(1-B-1)KHCV cDNA的制備為了制備cDNA，使用了Zap-cDNA合成試驗(yàn)盒(Stratagene Inc.，U.S.A)。C型肝炎病毒RNA按例(1-A)制備，用于反轉(zhuǎn)錄酶的模板，用DNA合成的寡聚d(T)引物具有5′-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG(T)18-3′序列和一個(gè)隨機(jī)引物具有5′-TTTTTCATGATTGGTGGTGGTGGAACTGGACCGTCTCGAGNNNNNN-3′序列(在此處N可以是相同的或不同的A，T，C或G，這里被稱為“RANPSHCV”)用在該試驗(yàn)中。
cDNA的第一股制備如下取在例(1-A)中制備的肝炎病毒RNA溶液18μl加入2μl 0.1M CH3Hg OH，該混合物在室溫中放置10分鐘使二級(jí)RNA結(jié)構(gòu)松散，再加入2μl1M的β-巰基乙醇，其混合物室溫下放置5分鐘。之后加入5μl反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液(500mM Tris-HCl，pH8.3，750mM KCl，30mM MgCl2，10mM DTT)，2.5μl10mM dATP，dGTP，dTTP和5-甲基-dCTP，2μl寡-d(T)引物(1.4μg/μl)或2μl PANPSHCV(1.0μg/μl)，15μl用DEPC處理過的蒸餾水和1.0μl RNase抑制劑(1單位/μl，Promega，Inc.，U.S.A.)，依次加入;然后在室溫下放10分鐘使引物與模板相連，然后加入2.5μMMLV反轉(zhuǎn)錄酶(18單位/μl，超錄RNA酶H-反轉(zhuǎn)錄酶，BRL.Inc.，Cat，No.8853SA)，反應(yīng)混合物溫育1小時(shí)(在37℃)以合成cDNA的第一股。
cDNA第二股制備如下40μl 10倍第二股反應(yīng)緩沖液(188mM Tris-HCl，pH6.9，906mM KCl2，46mM MgCl2，1.5mM β-NAD，100mM(NH4)2SO4)，加入45μl上述獲得的第1股溶液中，再加入6.0μl 10mM dNTP混合液(10mM dATP，dCTP，dTTP和dGTP)和298μl蒸餾水，最后沿管壁滴下1.0μl RNase H(4單位/μl)和10.0μl DNA聚合酶Ⅰ(11單位/μl)，不斷混合，在16℃反應(yīng)2.5小時(shí)。
該反應(yīng)液中加入等體積的酚-氯仿(1∶1，V/V)，酚事先已用0.5M Tris-Hcl(pH 7.5)和0.1%(V/V)β-巰基乙醇飽和過。抽提三次。上層水相吸出，加入0.1體積3M乙酸和2倍體積100%乙醇，-20℃過夜，4℃12，000×g離心20分鐘，收集沉淀。
(1-B-2)cDNA文庫的建立為了使在例(1-B-1)中制備的雙股cDNA變成平頭，cDNA沉淀物溶解在43.5μl蒸餾水中，取39μlcDNA液加入5.0μl T 4DNA聚合酶反應(yīng)液(670mM Tris-HCl，pH 8.8，166mM(NH4)2SO4，67mM MgCl2，100mM β-巰基乙醇，67μM EDTA)，2.5μl 2.5mM dNTP混合液和3.5μl T 4DNA聚合酶(2.9單位/μl)，反應(yīng)混合物在37℃放30分鐘，最終產(chǎn)品用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，其方法同例(1-B-1)。
為了在5′端引入一個(gè)限制性酶EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，上述制備的平頭雙股cDNA按以下方法處理給平頭cDNA中加入7.0μl EcoRI接頭(Stratagene Inc.，Zap-cDNA合成試劑盒Cat.No.200400，CA.U.S.A)，1.0μl10倍連接緩沖液，1.0μl T 4DNA連接酶(1000單位/μl)和1.0μ10mM ATP，置4℃過夜，最終產(chǎn)物加熱70℃10分鐘以滅活連接酶。
這樣獲得的cDNA可直接用于克隆，可是在這個(gè)例子所述的cDNA被進(jìn)一步擴(kuò)增然后用于克隆步驟。
為了擴(kuò)增cDNA，按下述方法進(jìn)行擴(kuò)增。向cDNA溶液中加入10μl 10×PCR緩沖液(200mM Tris-HCl，pH 8.3，15mM MgCl2，250mM kCl，0.5% Tween 20，1mg/ml明膠)，10μl 2mM dNTP混合物，5μl PSHCV含有5′-TTTTTCATGATTGGTGGTGGA-3′的序列的引物和5μl Eco RI接頭的上股(5′-CCCCCCGAATTCGGCACGAG-3′)，1μl(2.5單位)Taq DNA多聚酶(Parkin Elmer-Cetus.Inc.761Main Avenue，Norwalk，CT 06859-0010，U.S.A.)和69μl蒸餾水。然后用熱循環(huán)儀(Perkin Elmer-Cetus Inc.U.S.A)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。它的程序?yàn)橹貜?fù)循環(huán)25次;每次為95℃ 30秒→55℃30秒→72℃2分鐘，在完成這個(gè)反應(yīng)后，殘留引物和dNTP用Centricon 100(Amicon Inc.，Cat，No.4200，P.O.Box 91954，Chicago，IL 60693，U.S.A.)除去。最后獲得的產(chǎn)品用氯仿-酚抽提，用乙醇沉淀，然后溶解在16μl TE緩沖液中。
再向最終溶液中加入2μl 10×緩沖液(0.5M NaCl，0.5M Tris-HCl，50mM MgCl2，5mM DTT，pH7.9)，1μl Eco RI和1μl Xho I(New England Biolabs Inc.，30 Tozer Rd.，Berverly，MA，U.S.A.)。然后反應(yīng)液置37℃10分鐘部份消化cDNA，cDNA片段用氯仿-酚抽提，用乙醇沉淀然后溶解在TE緩沖液中。
這樣制備的cDNA片段被克隆到UNI-ZAPXR載體的過程如下向10μl Eco RI Xho I消化的cDNA片段液中加入2.0μl 10×連續(xù)液沖液，2.0μl 10mM ATP，4.0μl事先已用Eco RI/Xho I處理過的UNI-ZAPXR載體溶液(1μg/μl)和2.0μl T4 DNA連接酶(4 Weiss單位/μl)然后在16℃反應(yīng)10個(gè)小時(shí)。
(1-B-3)體外包裝含有cDNA的載體成噬菌體，擴(kuò)增cDNA文庫為了將按例(1-B-2)制備的連接好的DNA成為噬菌體，將在例(1-B-2)中獲得的最終溶液10μl加入Gigapack Ⅱ Gold Packaging Extract(Stratagene Inc.，U.S.A.)中，在室溫下放2小時(shí)。
再向該溶液中加入500μl噬菌體稀釋液(5.8g NaCl，2.0g MgSO4·7H2O，50ml 1M Tris-HCl，pH7.5，5ml 2%明膠加至1升水中)和20μl氯仿(參見kretz et al.，Nucl.Acid.Res.，17，5409(1989))。
按下述方法進(jìn)行感染和擴(kuò)增。PLK-F′(Stratagene Inc.，Zap-cDNA合成試劑盒Cat.No.200400)，大腸桿菌mer A-和mer B-菌株在LB培養(yǎng)基(10g Bactotrypton，5g酵母浸膏，10gNaCl溶至1升水中)上培養(yǎng)至O.D.600值至1.0。取600μl該菌液和200μl包裝混合物，混加在一起，37℃15分鐘使噬菌體感染大腸桿菌。再向大腸桿菌液中加入6.5ml 0.7%NZY融化后保持在48℃的瓊脂(7gNZ胺，5g NaCl，2g MgSO4·7H2O，5g酵母浸膏，16g瓊脂加水至1升)37℃ 5-8小時(shí)以產(chǎn)生噬菌斑。
10ml噬菌體稀釋液傾入該板，在4℃輕晃15分鐘以溶噬菌體至該溶液中，該混合物經(jīng)4，000×g離心沉淀出E.coli菌，收集上清液，向其中加入0.3%氯仿，cDNA文庫的滴度測(cè)量后約為1010-1013PFC(噬斑形成單位)/ml。再向該cDNA文庫液中加入100%二甲基亞砜(DMSO)使最終濃度為7%(V/V)，然后保存于-70℃。
(1-C)用免疫學(xué)方法篩選cDNA文庫和測(cè)cDNA序列。
用免疫學(xué)方法篩選cDNA文庫是按Huynh，T.V.等介紹的方法進(jìn)行(DNA Cloning TechniquesA Practical Approach(D.M.Glover ed)，pp.49-78，IRL Press，Oxford(1985))從例(1-A)制備的6倍稀釋血清經(jīng)離心后上清液經(jīng)過蛋白G親和層析柱(Genex Inc.，U.S.A.)純化獲得HCV抗體。
按例(1-B-3)制備的cDNA文庫溶液稀釋成每個(gè)150mm直徑的平皿上出現(xiàn)5萬個(gè)PFU，再將該液和600μl按例(1-B-2)同樣方法制備的大腸桿菌XL-1 Blue培養(yǎng)液(O.D.600＝0.5以及6.5ml 0.7% NYZ瓊脂混合，每一個(gè)培養(yǎng)材料平鋪40個(gè)NZY瓊脂平皿，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，產(chǎn)生2×106噬菌斑。
此后，將噬菌斑吸附到137mm直徑的尼龍濾膜(Bio-Rad Inc.，Cat.No162-163，U.S.A.)上，再用10mM IPTG(isopropyl-3-D-thiogalactopyranoside)溶液浸透然后在Whatman 3 MM濾膜上吸干。每一張濾膜都放在一個(gè)平皿瓊脂培養(yǎng)，37℃3.5小時(shí)。用噬菌斑印跡的每一個(gè)濾膜用15ml洗液(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，0.05% Tween 20)洗。然后向?yàn)V膜中加入15ml封閉液(1%牛血清白蛋白，20mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl)，在室溫下輕輕振蕩1小時(shí)。之后，每一張濾膜在室溫下用TBST緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.05%(V/V)Tween-20)輕輕振蕩洗5次，每一次5分鐘。再將濾膜放在15ml稀釋過的純化MCV抗體溶液中(最終蛋白濃度為8.2mg/ml)。該抗體溶液的稀釋度為1∶200，稀釋液為TBS緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl)并含有1%(V/V)FBS(胎牛血清)。在室溫下輕輕振蕩1小時(shí)，再用TBST緩沖液洗5次，每張濾膜放入15ml用含有1%(V/V)FBS的TBS稀釋的生物素化山半抗人IgG和1∶2000稀釋的親和素堿性磷酸酶結(jié)合物(Pierce Inc.，U.S.A.Cat.Nos.3177OC，21321C)室溫下輕晃1小時(shí)，再用TBST洗膜5次。然后在whatman 3MM濾膜上吸干。
為顯色，每張濾膜放入15ml顯色液(100mM Tris-HCl，pH 9.5，100mM NaCl，5mMMgCl25mg硝基藍(lán)四氮唑，2.5mg 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽)，暗處室溫顯色30分鐘。紫色的陽性噬菌斑可用肉眼確定，這表明表達(dá)了編碼重組HCV抗原的cDNA。每張濾膜用TBS緩沖液洗一次，加入顏色終止液(20mM Tris-HCl，pH 2.9，1mM EDTA)以終止顯色。在室溫下自然干燥后用類極膜(Polaroid film)記錄結(jié)果。
分離出的陽性噬菌放入噬菌體稀釋液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2)中，在室溫放1-2小時(shí)重復(fù)進(jìn)行上述免疫篩選測(cè)定從而獲得單一噬菌體噬菌斑的克隆。
象過多花精力確定重組HCV基因一樣，確定的每一個(gè)噬菌斑都放入一個(gè)滅菌的微型離心管中，內(nèi)含500μl SM緩沖液(5.8g NaCl，2.0g MgSO4，50μl 1M Tris-HCl，pH 7.5，5ml 2%明膠，加水至1升)，再加20μl的氯仿，然后在室溫下振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)。200μl(＞1×105噬菌體粒子)這樣獲得的溶液與1μl輔助性噬菌體R408(＞1×106PFU/ml，Stratagene Inc.，U.S.A.)和20μl大腸桿菌XL-1細(xì)胞懸液(O.D.600＝1.0)混合，然后在37℃培養(yǎng)15分鐘。之后，再加入5ml 2×YT培養(yǎng)基(10gNaCl，10g酵母浸液，16g細(xì)菌蛋白胨于1升水中)，并在37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，加溫至70℃維持20分鐘，進(jìn)一步做1∶100倍稀釋，200μl稀釋后該液和200μl大腸桿菌XLl-Blue細(xì)胞懸液(O.D.600＝1.0)混合。在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，取100μl該培養(yǎng)液加入含有氨芐青霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基平皿中。37℃10小時(shí)以獲得pBluescript噬菌體質(zhì)粒(phagemid)菌落擁有雙股cDNA。
為了制備單股DNA，pBluescript菌落被培養(yǎng)在含有抗生素四環(huán)素(12.5μg/ml)的LB培養(yǎng)基內(nèi)，再進(jìn)一步篩選出陽性菌落，如此獲得的陽性單一菌落置四環(huán)素+LB肉湯培養(yǎng)基(2-3ml)過夜。再加入0.3ml超級(jí)液體培養(yǎng)基(35g細(xì)菌蛋白胨，20g酵母浸液，5g NaCl，用NaOH調(diào)整至pH7.5)37℃振蕩培養(yǎng)，這樣，該培養(yǎng)物就被輔助性噬菌體R感染。培養(yǎng)8小時(shí)，直至O.D.600達(dá)到0.3。
在完成這個(gè)感染時(shí)，噬菌體/細(xì)菌的比大大依賴于cDNA在pBluescript定居的類型?？赡苁?0∶1，10∶1，1∶1或1∶10。單股DNA可從后來獲得的上清培養(yǎng)液中抽提而得。
分離和純化雙股噬菌體質(zhì)粒和單股噬菌體質(zhì)?？砂碨ambrook，J.等介紹的方法進(jìn)行(Molecular Cloning，1，2.73-2.81，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。
包含在一個(gè)克隆中的cDNA長(zhǎng)度可用Eco RI和Xho I酶切消化雙股噬菌體質(zhì)粒而確定。3個(gè)有cDNA片段和不等長(zhǎng)的克隆也已得到。
3個(gè)重組cDNA核苷酸序列用純化的單股重組pBluescript噬菌體質(zhì)?；螂p股pBluescript噬菌體質(zhì)粒作為模板以及由M13-20聚體，T7引物，KS引物，SK引物或T3引物(Strategene Inc.U.S.A)按Sanger方法(Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，74，5405(1977))進(jìn)行了測(cè)定，其中得到的cDNA片段分別被命名為KHCV426，KHCV 425和KHCV403(參見圖1-3)。
(1-D)用寡核苷酸探針篩選包含有KHCV cDNA的重組噬菌體和核酸定序(1-D-1)分離和KHCV 652重疊的cDNA克隆為了篩選那些不能用免疫學(xué)方法篩選的含HCV cDNA的重組噬菌體，用Benton，W.D.，等介紹的方法進(jìn)行了噬菌斑雜交(Benton，W.D.，et al.，Science，196，180(1977);Connor，B.J.，et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A，80，278(1983)和Jacob，K.，et al，Nature，313，805(1985))。在這個(gè)試驗(yàn)中使用了二個(gè)寡核苷酸片段P 652a(5′-TTCATACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACT-3′)和P652b(5′-GCCATTCCAAGAAGAAGTGTGCGAACTCG-3′)作為探針，這兩個(gè)片段的核苷酸序列是選自例(1-C)所確定cDNA KHCV 652的核苷酸序列。
按例(1-B)制備含5萬PFU的噬菌體文庫溶液，然后和600μl按例(1-B-3)制備的大腸桿菌XL1-BLue(稀釋到O.D.600為0.5)混合，再與0.7% NZY瓊脂凝膠混合，混合物倒入150mm NZY平皿內(nèi)，37℃ 12小時(shí)。從30個(gè)平皿中可獲得1.5×106噬菌斑。
之后，將137mm直徑尼龍膜仔細(xì)地貼在平皿面上，印跡噬菌斑到膜上。然后移去尼龍膜自然干燥。
每一個(gè)膜放在已用0.2M NaOH/1.5M Nacl浸泡過的whatman 3MM濾膜上1-2分鐘，再轉(zhuǎn)放到用0.4M Tris-HCl，pH 7.6和2×SSC(SSC17.53g NaCl，8.82g檸檬酸鈉，pH 7.0溶至1升水中)浸泡過的濾膜上1-2分鐘。最后在真空加熱器80℃2小時(shí)干燥尼龍膜。
干燥后，尼龍膜在室溫下用500ml 3×SSC/0.1%SDS溶液洗3-4次。再用同樣溶液65℃洗2小時(shí)。每一塊尼龍膜放入500ml預(yù)雜交溶液(6×SSC，5×Denhardt液，100μg/ml酵母tRNA，0.05%焦磷酸鈉);標(biāo)記32P的P652a和P652b各30ng加入該溶液中，雜交在48℃進(jìn)行24小時(shí)。
上述所用探針的標(biāo)記如下先將32ng探針混合物中加入7.5μl 10×T4 Kination緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH 7.5，0.1 M MgCl2，50mM DTT，0.5mg/mlBSA)，100μCi(γ-32P)ATP和50單位的T4核苷酸激酶用蒸餾水補(bǔ)至總體積75μl，激發(fā)反應(yīng)在37℃進(jìn)行30分鐘。
在完成雜交后，膜用6×SSC/0.05%焦磷酸鈉溶液在室溫下洗5次，共10分鐘，用同樣溶液在60℃洗30分鐘。進(jìn)一步洗膜，每15分鐘升溫2℃，直至膜用Geiger計(jì)數(shù)器(Ludlum Model 13)檢測(cè)確定完全洗凈為止。洗過的膜用X線膠片(Kadak X-Omat AR)在-70℃曝光24-48小時(shí)。
用上述描述的同一方法把確定為陽性的噬斑挑選出來，獲得一個(gè)單一噬菌斑的噬斑來。
從獲得的陽性噬斑，制備出雙股噬菌體質(zhì)粒和單股噬菌體質(zhì)粒，用例(1-C)定序。
和KHCV652重疊的cDNA克隆被命名為KHCV752和KHCV675。它們的長(zhǎng)度、位置、核酸序列和編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
(1-D-2)分離與KHCV426重疊的cDNA模仿例(1-C)獲得的KHCV426cDNA的核酸序列，合成了寡核苷酸P426a(5′-ACGAGACCTCCCGGGGCACTCGCAAGCACC-3′)和P426b(5′-CGTAATTTGGGTAAGGTCATCGACACCCTC-3′)兩個(gè)片段。將上述兩片段作為探針，以例(1-D-1)同樣的方式進(jìn)行噬斑雜交。與KHCV426重疊的cDNA克隆按例(1-C)法檢測(cè)出來，命名為KHCV240，它的長(zhǎng)度、位置和核苷酸序列以及所編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
(1-D-3)分離與KHCV240重疊的cDNA模仿例(1-D-2)獲得的KHCV240的核酸序列合成了寡核苷酸P240b(5′-GTCCGGGTGCTGGAGGACGGCGTGAACTA-3′)。用P240b作為探針，對(duì)從例(1-B)制備的cDNA文庫按例(1-D-1)方式進(jìn)行篩選。這樣獲得的含約110核苷酸與KHCV240重疊的cDNA克隆稱為KHCV513，它的測(cè)序是按Sanger方法進(jìn)行的，其長(zhǎng)度、位置和序列以及編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列都列在圖1至3。
(1-D-4)分離與KHCV513重疊的cDNA
模仿例(1-D-3)確定的KHCV513序列合成了寡核苷酸P513b(5′-CGCATGGCCTGGGATATGATGATGAACTGG-3′)。以此片段P513b為探針，對(duì)從例(1-B)制備的cDNA文庫按例(1-D-1)方式進(jìn)行篩選。與KHCV513重疊130bp的810bp cDNA克隆命名為KHCV810;測(cè)序是按Sagner法。其長(zhǎng)度、位置和KHCV810核酸序列以及編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
(1-D-5)分離與KHCV 810重疊的cDNA模仿例(1-D-4)確定的KHCV810序列合成了P810b寡核苷酸(5′-AAATGAGACGGACGTGCTGCTCCTTAAC-3′)。以此片段P810b為探針，對(duì)從例(1-B)制備的cDNA文庫按例(1-D-1)方式進(jìn)行篩選。與KHCV 810重疊的650bp cDNA克隆命名為KHCV 798，它的測(cè)序是按Sanger法。其長(zhǎng)度、位置和KHCV798的核酸序列以及編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
(1-D-6)分離與KHCV 403重疊的cDNA模仿例(1-D-5)KHCV 403序列合成了P403A(5′-GAGAAGAATTCGGGGGCCGGAACCTGGCAT-3′)和P403B(5′-GCTGACCTCATTGAGGCCAACCTCTTGT-3′)兩個(gè)片段。以此兩個(gè)片段P403A和P403B為探針，對(duì)從例(1-B)獲得的cDNA文庫按例(1-D-1)方式進(jìn)行篩選。與KHCV403重疊的160bp cDNA克隆被命名為KHCV932，它的測(cè)序是按Sanger法進(jìn)行。其長(zhǎng)度、位置和KHCV 932的核酸序更以及編碼的氨基酸序列見圖1至3。
(1-D-7)分離與KHCV932重疊的cDNA模仿例(1-D-6)KHCV932序列合成了P932b(5′-CCGGGACGTGCTTAAGGAGATGAAGGCGAA-3′)作為探針，對(duì)從例(1-B)獲得的cDNA文庫按例(1-D-1)方式進(jìn)行篩選。與KHCV932重疊的185 bP cDNA克隆命名為KHCV496，它的測(cè)序是按Sanger法進(jìn)行。其長(zhǎng)度、位置和KHCV496的核酸序列以及編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
(1-D-8)分離與KHCV 496重疊的cDNA模仿例(1-D-7)KHCV496序列合成了P496b片段(5′-CGTGTATGCGAGAAGATGGCCCTTTATGAC-3′)作為探針，對(duì)例(1-B)獲得的cDNA文庫按例(1-D-1)方式進(jìn)行篩選。與KHCV 496重疊的160bp共847bp cDNA克隆命名為KHCV 847，測(cè)序是按Sanger法進(jìn)行。其長(zhǎng)度、位置和KHCV847的核酸序列以及編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
(1-D-9)分離與KHCV 847重疊的cDNA模仿例(1-D-8)KHCV 847 DNA3′端的序列合成了P847b(5′-TGCGTGGGAGACAGCTAGACACACTCCAG-3′)片段作為探針對(duì)例(1-B)獲得的cDNA文庫按例(1-D-1)方式進(jìn)行篩選。與KHCV847重疊的94bp的共494bp的cDNA克隆稱為KHCV 494;測(cè)序是按Sanger法進(jìn)行，其長(zhǎng)度，位置和KHCV 494的核酸序列以及編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
(1-E)用PCR制備cDNA(1-E-1)在KHCV 798和KHCV752之間制備KHCV cDNA為了在KHCV 798的3′端和KHCV 752 5′端克隆HCV cDNA，按KHCV 798 3′端序列合成了引物P798b(5′-CTGGTTCCCGGAGCGGCATAC-3′)和按KHCV 7525′端序列合成了引物P752a(5′-CCAGGTGATGACTTTGGTCTCCAT-3′)。用P798b和P752a作為引物和用例(1-B-1)中以RANPSHCV為引物制備的cDNA文庫，按參考例7那樣進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。反應(yīng)結(jié)束后，將一部份反應(yīng)物加入5%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)以確定cDNA的擴(kuò)增情況。給剩余部分中加入10單位的Klenow片段和DNA聚合酶，該反應(yīng)物37℃30分鐘使之兩端平齊。再做PAGE，并電洗脫出DNA以分離得到純DNA。純化的DNA片段克隆到M13mp18噬菌體并測(cè)定序列。這樣獲得的DNA稱為KHCV 570，它的核酸序列和其編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
例(1-D-2)制備的KHCV 240，例(1-D-3)制備的KHCV 513，例(1-D-4)制備的KHCV 810，例(1-D-5)制備的KHCV 798和用上述方法制備的KHCV 570都相互有部分重疊。因此，它們可以連成一個(gè)長(zhǎng)的敞開閱讀的框架，命名為KHCV 2661。
(1-E-2)制備KHCV 403和KHCV 675之間的KHCV cDNA為了克隆處于例(1-C)制備的KHCV 403和例(1-D-1)制備的KHCV 675之間的HCV cDNA，按KHCV 675的3′端序列合成了兩段引物P675b(5′-TCGATTCTTCGGTCCTGTGTGAGTGT-3′)和P675b2(5′-AAAAAGAATTCGGATCCATGACGCGGGTTGTGCGTGGTAC-3′)，按KHCV 403 5′端序列合成了P403a2引物(5′-CCCCCTCAGAGTCGACTCACTTCACGTTGTCAGTGGTCAT-3′)。用上述制備的P675b，P675b2和P403a2以及例(1-D-6)制備的P403a，按下列程序進(jìn)行PCR。
0.2μg P674b，0.2μg P403a，2μl例(1-B-1)制備的cDNA，加上隨機(jī)引物RANPSHCV中加入10μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液，10μl 2mM dNTP的混合物及2.5單位Taq聚合酶，加蒸餾水至100μl，第一步PCR重復(fù)循環(huán)10次，即95℃2分鐘-55℃2分鐘-72℃3分鐘的循環(huán)。在加入2μg P675b2和2μg P403a于混合物以后，第二步PCR按上述溫度循環(huán)重復(fù)20次。
反應(yīng)完成后，cDNA擴(kuò)增確定下來，按例(1-E-1)的同樣方法測(cè)序。這樣獲得的cDNA稱為KHCV1774，它的核酸序列和編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
(1-E-3)克隆KHCV cDNA 3′端區(qū)并測(cè)序?yàn)榱丝寺?duì)應(yīng)于HCV基因的3′端區(qū)的cDNA，用引物RANPSHCV和DA17PSHCV(5′-TGGTGGTGGAACTGGACCGTA1，-3′)的PCR如下進(jìn)行。
PSHCVSL引物(5′-AAAAGTCGACTGGTGGTGGAACTGGACCGT-3′)含有21個(gè)例(1-B-1)引物RANPSHCV或者DA17PSHCV的固定核苷酸和SalⅠ酶識(shí)別位點(diǎn)(5′-GTCGAC-3′);而KHCVR60引物(5′-GTGTCCGCGCTAAGCTACTGTCC-3′)含有那些來自例(1-D-9)KHCV 494 3′端區(qū)核苷酸序列。在第一步PCR使用PSHCV和KHCVR60引物，按參考例7中的方法進(jìn)行。
在第二步PCR，合成KHCVR6引物(5′-TGTGGCAAGTACCTCTTCAACTGG-3′)該引物是互補(bǔ)于KHCV 494 3′端區(qū)的核苷酸序列并與KHCVR60靠得更近。
10μl KHCVR61加至第一步PCR的混合物中，然后按參考例7相同的方法進(jìn)行第二步PCR。
完成反應(yīng)后，明確cDNA擴(kuò)增，用例(1-E-1)相同的方法測(cè)序。這樣獲得的cDNA有266，稱為KHCV266，它的位置和核酸序列以及所編碼的核酸序列參見圖1至3。在KHCV 266的序列中，發(fā)現(xiàn)了二個(gè)末端終止密碼子，但沒有poly(A)+尾序。
(1-E-4)克隆KHCV cDNA 5′端區(qū)并測(cè)序使用按例(1-C)制備的KHCV 426 5′端側(cè)面序列合成了引物KHCVL 69(5′-GTCCTGTGGGCGGCGGTTGGTGTTACG-3′)制備出單股cDNA，這是按例(1-B-1)相同的方法進(jìn)行的。從上述獲得的50μl混合物，用1ml TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)透析。透析后的溶液用Centricon 100(Amicon Inc.，U.S.A.，＃4200)濃縮至10μl，結(jié)果移出剩余的引物和dNTPs。
為了制備polyd(T)接尾的cDNA或者polyd(G)接尾的cDNA向上述獲得的cDNA溶液10μl中加入4μl5×接尾緩沖液(0.5M二甲胂酸鉀，pH7.2，10mM CoCl2，1mM DTT)，4μl 1mM dTTp或4μl的1mMdGTP和10單位末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(BRL Inc.，U.S.A.，＃80085B);最后加蒸餾水至50μl總體積。反應(yīng)混合物置37℃30分鐘，然后65℃加熱5分鐘。
這樣得到的接有polyd(T)+尾序的cDNA或polyd(G)尾序的cDNA，在引物KHCVL70(5′-TTGAGGTTTAGGATTCGTGCTCAT-3′)，或dC12R1RO5′-AAGGATCCGTCGACATCGATAATACGACTCTATAGGGACCC)-3dT17RIRO(5′-AAGGATCCGTCGACATCGATAATACGACTCACTATAGGGA(T)17-3′)，RO(5′-AAGGATCCGTCGACATC-3′)和R1(5′-GACATCGATAATACGACTCAC-3′)的存在下用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。這些引物均按例(1-C)制備的KHCV 426序列合成的。
在2μl cDNA溶液中加入5μl 10×Taq多聚酶緩沖液(100mM Tris-HCl，pH 8.3，500mM KCl，15mM Mgcl2，0.1%明膠)，5μl 1.5mM dNTPs混合物，2.0μg KHCVL 69和2.0μg dT17R1RO，再加蒸餾水至總體積50μl。在95℃7分鐘后冷至75℃，加入2.5單位Taq DNA聚合酶和30μl礦物油以防蒸發(fā)。將反應(yīng)混合物冷至45℃2分鐘讓引物與單股cDNA互補(bǔ)結(jié)合，72℃ 22分鐘。第一步PCR重復(fù)30次循環(huán)，即95℃45秒-50℃ 25秒-72℃15分鐘。
2μg R0(或R1)引物和2μg KHCVL70加到從上述得到的10μl混合物中。第二步PCR和上述同樣循環(huán)進(jìn)行30次。完成反應(yīng)后，有380bp的cDNA擴(kuò)增經(jīng)確定進(jìn)一步按例(1-E-1)相同的方法進(jìn)行測(cè)序。這樣獲得的cDNA克隆稱為KHCV 366，其位置和序列以及編碼的氨基酸序列參見圖1至3。
將例1獲得的所有KHCV cNDA克隆連接可得到有9372bp的全長(zhǎng)KHCV cNDA稱為KHCV-LBC1，它已于1991年5月14日保藏于ATCC，編號(hào)為75008。
例2制備HCV亞型cDNA(2-A)RNA的抽提從13個(gè)患C型肝炎朝鮮病人收集的血清樣品(樣品＃2，＃3，＃20，＃21，＃23，＃25，＃26，＃27，＃28，＃29，＃30，＃31和＃32)各取100μl加入300μl RNA zol B(Cinna/Biotecx，P.O.Box 1421，F(xiàn)riendwood，Texas，U.S.A.)用以破碎細(xì)胞，然后按例(1-A)同樣的方式抽提出KHCV RNAs。13個(gè)樣品的KHCV RNAs分別命名為L(zhǎng)BC2，LBC3，LBC20，LBC21，LBC23，LBC25，LBC26，LBC27，LBC28，LBC29，LBC30，LBC31和LBC32。
(2-B)cDNA的制備以例(2-A)制備的HCV RNAs為模板，隨機(jī)引物(5′-NNNNNN-3′，這里N可能相同，也可能不同，可以具有相同比例的G，A，T或C)作為反轉(zhuǎn)錄酶的引物，按例(1-B-1)相同的方式制備HCV cDNA。這樣獲得的cDNA分別命名為KHCV-LBC2 cDNA，KHCV-LBC3 cDNA，KHCV-LBC20 cDNA，KHCV-LBC21 cDNA，KHCV-LBC23 cDNA，KHCV-LBC25 cDNA，KHCV-LBC26 cDNA，KHCV-LBC26，KHCV-LBC27 cDNA，KHCV-LBC28 cDNA，KHCV-LBC29 cDNA，KHCV-LBC30 cDNA，KHCV-LBC31 cDNA，KHCV-LBC32 cDNA。
(2-C)以PCR擴(kuò)增KHCV cNDA(2-C-1)引物的設(shè)計(jì)HCV cDNA NS2和NS5區(qū)擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)是按日本型、美洲型病毒和例1制備的KHCV-LBC1核酸序列中共同存的區(qū)進(jìn)行的(kato，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，9524-9528(1990)和Takamizawa et al.，J.Virol.，65，1105-1113(1991);Choo et al.，Science，244，359-363(1989))。以KHCV-LBC1的核酸序列為基礎(chǔ)，給上述制備的核酸序列位置編碼。
HCV cNDA NS2區(qū)擴(kuò)增的引物NS2S1(5′-CGGGAGATGGCCGCATCGTG-3′)對(duì)應(yīng)于KHCV-LBC1第2776至2795號(hào)核酸序列片段的一股，NS2N1(5′-ACCTGCTAGTGCGGCCAGCTTCAT-3′)對(duì)應(yīng)于KHCV-LBC1第3180至3157號(hào)核酸序列片段的互補(bǔ)股。這些都用在HCV cNDA NS2區(qū)第一步擴(kuò)增。NS2S2(5′-TTTTGGATCCGCGGTTTTTGTAGGTCTGGT-3′)對(duì)應(yīng)于KHCV-LBC1第2803至2822號(hào)核酸序列片段的一股，這個(gè)片段為方便克隆是BamH Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)，NS2N2(5′-AAAGTCGACATGAAGACCATTTGGAC-3′)對(duì)應(yīng)于KHCV-LBC1第3159至3142號(hào)核酸序列片段的互補(bǔ)股，它也為克隆方便在5′端有一個(gè)Sal Ⅰ酶識(shí)別位點(diǎn)。NS2S2和NS2N2用于第二步PCR擴(kuò)增。
擴(kuò)增HCV cDNA NS5區(qū)的引物
NS5S1(5′-ATGGGGATCCATATGACACCCGCTG(T/C)TTTGA-3′)這段中T/C表示胸腺核苷和胞核苷以1∶1比例混合存在)片段，從5′端第10個(gè)核苷酸開始至3′端末與KHCV-LBC1第8252至8273片段對(duì)應(yīng)。在NS5N1(5′-CCCCGTCGACCTAGTCATAGCCTCCGTGAA-3′)片段中，從5′端第9個(gè)核苷酸開始至3′端末與KHCV-LBC1第8635至8614片段的互補(bǔ)對(duì)應(yīng)。NS5N1引物用于第一步PCR擴(kuò)增NS5區(qū)。
在NS5S2(5′-TTTGAGGATCCACGGTCACTGAGAA(T/C)GACAT-3′，其中T/C與上述出現(xiàn)過的情況一致)片段中，從第12個(gè)至3′端末的序列與KHCV-LBC1的第8278至8297核苷酸片段相對(duì)應(yīng)。在NS5S2的5′端有BamH Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)。NS5S2引物用于第二步PCR擴(kuò)增。
上述引物是采用自動(dòng)固相磷酰胺化學(xué)法在DNA合成儀中合成的(Applied Biosystems Inc.，Model 380 B，USA)用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離合成引物(2M脲，12%丙烯酰胺和雙叉丙烯酰胺(29∶1，w/w)溶在50mM Tris，50mM硼酸，1mM EDTA-Na2)。通過C18層析柱以乙腈-水(50∶50，v/v)為洗脫液進(jìn)行純化。每一個(gè)引物的濃度用O.D.260測(cè)定。
(2-C-2)PCR擴(kuò)增KHCV cDNA NS2區(qū)第一步PCR按下述方法進(jìn)行按例(2-B)制備的cDNA(KHCV-LBC2，KHCV-LBC3，KHCV-LBC20，KHCV-LBC21，KHCV-LBC23，KHCV-LBC25，KHCV-LBC26，KHCV-LBC27，KHCV-LBC28，KHCV-LBC29，KHCV-LBC30，KHCV-LBC31和KHCV-LBC32)如例(2-B)各取5μl，其內(nèi)加入10μl 10×Taq聚合酶緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.3，500mM HCl，15mM MgCl2，0.1%(w/v)明膠)，10μl 2mM dNTP混合物，0.2μg NS2S1，0.2μg NS2N1和0.5μl Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer-Cetus，USA)，加蒸餾水至最終體積100μl。這樣的溶液每一份各加50μl礦物油以免蒸發(fā)。第一步PCR按溫度循環(huán)進(jìn)行40次，其順序?yàn)?5℃ 2分鐘-55℃2分鐘-72℃3分鐘。用1ml第一步PCR產(chǎn)物以及2μgNS2S2/NS2N2引物反復(fù)25次制備第二步PCR。
最終反應(yīng)物加入等體積酚/氯仿溶液，離心除去殘留的酶，每一份上清液中加入0.1體積的3M乙酸鈉和2.5倍體積的純乙醇。然后離心獲得340bp雙股DNA。
13個(gè)不同模板的DNA片段分別命名為NS2-LBC2，NS2-LBC3，NS2-LBC20，NS2-LBC21，NS2-LBC23，NS2-LBC25，NS2-LBC26，NS2-LBC27，NS2-LBC28，NS2-LBC29，NS2-LBC30，NS2-LBC31和NS2-LBC32。
(2-C-3)PCR擴(kuò)增NS5區(qū)HCV cDNA引物NS5S1和NS5N1用于第一步PCR擴(kuò)增，NS5S2和NS5S1引物用于第二步PCR擴(kuò)增其方法同例(2-C-2)以獲得320bp DNA片段。
來自KHCV-LBC20 cDNA，KHCV-LBC21 cDNA，KHCV-LBC23 cDNA，KHCV-LBC25 cDNA，KHCV-LBC26 cDNA，KHCV-LBC27 cDNA，KHCV-LBC28 cDNA，KHCV-LBC29 cDNA，KHCV-LBC30 cDNA，KHCV-LBC31 cDNA和KHCV-LBC32 cDNA擴(kuò)增得到的DNA片段分別命名為NS5-LBC20，NS5-LBC21，NS5-LBC23，NS5-LBC25，NS5-LBC27，NS5-LBC28，NS5-LBC29，NS5-LBC30，NS5-LBC31和NS5-LBC32。
每一片段都用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ消化，消化后片段克降到M13 mp 19，按Sanger法進(jìn)行測(cè)序。其核酸序列參見圖7至26。
例3制備在酵母菌表達(dá)KHCV cDNA片段的載體(3-A)擴(kuò)增KHCV cDNA片段(3-A-1)K384，K510，K573，K897，K403和K590片段的制備第1步為將ubiquitine基因連接到例(1-C)、(1-D)和(1-E)克隆的每一個(gè)KHCV cDNA片段上(凡連上ubiquitine基因的KHCV cDNA片段都冠有“UB-KHCV”)并將克隆UB-KHCV到酵母表達(dá)載體上，按下述所示合成各種引物。
PCOREUBI引物(5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTATGAGCACGAATCCTAAACC-3′)在5′端有25序列堿基與ubiquitine基因的3′端重疊，其余部分與KHCV-LBC1的第343至360區(qū)的片段對(duì)應(yīng)。
PSALCORE14(5′-GGGGTCGACTATTAGCATGTGAGGGTGTGGGATGAC-3′)含有一終止密碼，正好在第726位核苷酸處終止翻譯，此外，還有一個(gè)Sal Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)。
PSALCORE 17引物(5′-GGGGTCGACTATTAGGGCAGATTCCCTGTTGCATA-3′)含有一終止密碼，正好在第852位核苷酸處終止翻譯，還有一個(gè)Sal Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)。
PSALCORe 22引物(5′-GGGGTCGACTATTAAGCGGAACTGGGGATGGTCAA-3′)含有一終止密碼，正好在第915位核苷酸終止翻譯，還有一個(gè)Sal Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)。
PK403UBI引物(5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGGTGGTACGGGCATGACCACTGACAA-3′)在5′端有25個(gè)核苷酸和PCOREBUI相同，其余核苷酸被設(shè)計(jì)成啟動(dòng)KHCV-LBC1的第6649處核苷酸的翻譯。
PK 573UBI引物(5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGGTGCGGTACATGGACAGGCGCCCTGA-3′)在5′端有25個(gè)核苷酸與PCOREUBI相同，其余核苷酸被設(shè)計(jì)成啟動(dòng)KHCV-LBC1的第7612處核苷酸的翻譯。
PK403SAL引物(5′-GACTGGTCGACTATTACTCTTGCCGCCACAAGAGGTT-3′)被設(shè)計(jì)正好在KHCV-LBC1第7050處核苷酸終止翻譯。有一個(gè)Sal Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)和2個(gè)終止密碼子(TAATAG)。
PK 897UBI引物(5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGCGGTGGAATTCATACCCG-3′)在5′端有25個(gè)核苷酸與PCOREUBI相同，其余核苷酸被設(shè)計(jì)成從KHCV-LBC1的第3916處核苷酸開始啟動(dòng)翻譯。
PK897SAL引物(5′-GACTGGTCGATATTAACACGTATTACAGTCGATCAC-3′)正好設(shè)計(jì)成從KHCV-LBC1第4713處核苷酸終止翻譯。有一個(gè)Sal Ⅰ酶識(shí)別位點(diǎn)，二個(gè)終止密碼子(TAATAG)。
PK573SAL引物(5′-GACTGGTCGACTATTAGTACTGGAATCCGTATGAGGAG-3′)正好設(shè)計(jì)為終止KHCV-LBC1第8184處核苷酸以后的翻譯，有一個(gè)Sal Ⅰ酶識(shí)別位點(diǎn)，在3′端有二個(gè)終止密碼(TAATAG)。
P426B引物(5′-GGGTGGGCAGGATGGCTCCTG-3′)是由KHCV-LBC1的第616到636核苷酸序列區(qū)組成。
P240B引物(5′-CCTGTTGCATAGTTCACGCCGT-3′)是由KHCV-LBC1的第842到821核柑酸序列區(qū)組成。
P652B引物(5′-GTCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCTGCAAAG-3′)是由KHCV-LBC1的第4523至4560核苷酸序列區(qū)組成。
P403B引物(5′-GCTGACCTCATTGAGGCCAACCTCTTGT-3′)是由KHCV-LBC1的第7012至7039核苷酸序列區(qū)組成。
第2步從3個(gè)克隆(即KHCV 426，KHCV 240和KHCV513序列相互重疊)按下述方法制備出單一的cDNA片段。向2.0μg PCOREUBI，0.02μg P426B，2μg的P240B和50ng KHCV-LBC1 DNA混合液中加入10μl 10×Taq聚合酶緩沖液，10μl 10mM dNTP混合物和2.5單位Taq聚合酶，補(bǔ)蒸餾水至總體積100μl。按參考例7的熱循環(huán)重復(fù)25次進(jìn)行第一步PCR。反應(yīng)產(chǎn)物加樣至5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出500bp的PCR產(chǎn)品(稱為“PCR產(chǎn)品A”)，之后，用60ng PCR產(chǎn)品A和50ng KHCV-LBC1 DNA作為模板，以2μg PCOREUBI和2μg PSALCORE 22為引物，在與第一步相同的條件下進(jìn)行第二步PCR。反應(yīng)產(chǎn)物用5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出580bp的最終產(chǎn)品(稱為“PCR產(chǎn)品B”)，然后溶解在50μl TE緩沖液中。
第3步為了進(jìn)一步用第二步獲得的PCR產(chǎn)品B作為模板進(jìn)一步進(jìn)行PCR，準(zhǔn)備3支試管，A管含有2μg PCOREUBI和2μg PASALCORE14，B管含有2μg PCOREUBI和2μl PSALCORE 17，C管含有2μg PCOREUBI和2μg PSALCORE22，再往每支試管中加入50ng PCR產(chǎn)品B。
另一方面，為了用KHCV-LBC1 DNA作為PCR的模板，選用另外3個(gè)試管，D管含有2μg PK 897 SAL，0.02μg P652B和2μg PK 897 UBI，E管含有2μg PK403SAL和2μg PK 403UBI，F(xiàn)管含有2μg PK573SAL，0.022μg P403B和2μg PK573UBI。此外每管中分別加入50ng KHCV-LBC1 DNA。
以后，A到F管每管都加入10μl 10×Taq聚合酶緩沖液，10μl 10mM dNTP混合物和25單位Taq聚合酶，補(bǔ)足蒸餾水至總體積100μl。在與第二步相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
第4步在第3步獲得的PCR產(chǎn)品加樣于5%聚丙烯酰胺凝膠電泳。結(jié)果可以確定在A管中生產(chǎn)出384bp DNA片段，B管中生產(chǎn)出510bp DNA，C管為573 bp DNA，D管中為897 bp DNA，E管中403bp DNA，F(xiàn)管中是590bpDNA。按上一步用相同的PAGE純化DNA片段，并分別命名為K384片段，K510片段，K573片段，K897片段，K403片段和K590片段。
(3-A-2)制備編碼KHCV外膜蛋白的cDNA片段第1步為了將合成的ubiquitine基因分別與E 2N和E 2C基因相連接，以便分別與酵母菌表達(dá)載體克隆，需合成F列引物。E 2N基因?qū)?yīng)于KHCV-LBC1的第1510至2010核苷酸區(qū)，而E 2C基因是KHCV-LBC1的第2011至2529核苷酸區(qū)。
PE2NUBI引物(5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGGGGCGCAAGGTCGGGCCGCT-3′)在5′端區(qū)含有25核苷酸與ubiquitine基因3′重疊，其它核苷酸序列與KHCV-LBC1第1510至1530序列區(qū)對(duì)應(yīng)。
PE2NSAL引物(5′-GACTGGACTATTAATTCATCCAGGTACAACCGAACCA-3′)含有一個(gè)終止密碼正好在KHCV-LBC1的第2010處核苷酸終止密碼，有一個(gè)Sal Ⅰ酶識(shí)別位點(diǎn)。
PE2CUBI引物(5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGGCACTGGGTTCACCAAGACA-3′)在5′端有25個(gè)核苷酸與ubiquitine基因3′端區(qū)相同，其余與KHCV-LBC1的第2011至2031核苷酸區(qū)段相對(duì)應(yīng)。
PE2CSAL引物(5′-GACTGGACTATTACGCGTCCGCCAGAAGAAGGAAGAG-3′)含有一個(gè)終止密碼正好在KHCV-LBC1的第2529核苷酸首終止翻譯，并有一個(gè)SalⅠ酶識(shí)別位點(diǎn)。
第2步A管加入2μg PE2NUBI和2μg PE2NSAL，B管加入2μg PE2CUBI和2μg PE2CSAL，兩管中各加入50μg KHCV-LBC1，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl 10mM dNTP混合物和2.5單位Taq聚合酶，補(bǔ)蒸餾水至總體積100μl。按參考例7相同的熱循環(huán)過程重復(fù)25次PCR反應(yīng)。
第3步第二步獲得的PCR產(chǎn)品上樣至5%PAGE電泳，結(jié)果可以確定在A管中500bp DNA，B管中520bp DNA得到了擴(kuò)增。用上述同樣PAGE純化這些DNA并分別命名為E 2N片段和E 2C片段。
(3-B)制備用于酵母的表達(dá)載體(3-B-1)制備pYLBC-A/G-UB-CORE14，pYLBC-A/G-UB-CORE17，pYLBC-A/G-UB-CORE22，pYLBC-A/G-UB-KHCV897，pYLBC-A/G-UB-KHCV403和pYLBC-UB-KHCV573在NEB緩沖液3中用PstⅠ和SalⅠ酶完全消化2μg pYLBC-A/G-UB-HGH(ATCC 74071)質(zhì)粒，而2μg相同的質(zhì)粒在參考例1NEB緩沖液4中用Pst和SacⅡ完全消化。上樣于0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離出9.8kb和3.4kb片段，并分別命名為PL2和PT2。
在例(3-A-1)制備的K384，K510，K573，K987，K403和K590片段之間，K897，K403和K590片段在NBE緩沖液3中用SalⅠ和SacⅡ完全消化;K384，K510和K573片段在NEB緩沖液3中用SalⅠ完全消化。最后用酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀，溶解在20μl TE緩沖液中。K384，K510和K573片段進(jìn)一步在NBE緩沖液4中用SacⅡ部分酶解10分鐘;其后也用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，溶解于20μl TE緩沖液里。
上述制備的片段按下述步驟進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)管A含有100ng K384片段、管B含100ng K510片段、管C含100ng K573片段，管D含100ng K897片段，管E含100ng K403片段，管F含100ng 573片段。在上述每管中加入100ng PL2片段，100ng PT2片段，2μl 10×連接緩沖液和10單位T4 DNA連接酶，加蒸餾水至總體積20μl，在16℃12小時(shí)進(jìn)行連接。
連接反應(yīng)結(jié)束后，上述每一個(gè)連接后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101株(ATCC 33694)。
含K384的載體被分離后命名為pYLBC-A/G-UB-CORE14，含K510的載體被分離后命名為pYLBC-A/G-UB-CORE17，含K573的載體被分離后命名為pYLBC-A/G-UB-CORE22，含K897的載體被分離后命名為pYLBC-A/G-UB-KHCV897，含K403的載體被分離后命名為pYLBC-A/G-UB-KHCV403，含K590的載體被分離后命名為pYLBC-A/G-UB-KHCV573。(參見圖30)。
(3-B-2)制備pYLBC-A/G-UB-E 2N和pYLBC-A/G-UB-E 2C取2μg pYLBC-A/G-UB-HGH(ATCC74071)質(zhì)粒在NEB緩沖液3中用PstⅠ和SalⅠ完全消化，2μg同一質(zhì)粒在NEB緩沖液4中用PstⅠ和SacⅡ完全消化，然后上樣于0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離出9.8Kb和3.4Kb片段，分別命名為PL2和PT2片段。
在例(3-A-2)中制備的E 2N和E 2C片段各自在NEB緩沖液4中用SacⅡ完全消化，進(jìn)一步在NEB緩沖液3中用SalⅠ部分消化，各自用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，溶解在20μl TE緩沖液里。這兩個(gè)片段被分別命名為E 2N-T2/L和E2C-T2/L片段。
在連接反應(yīng)管G中加入100ng E2N-T2/L、管F中加入100ng E2C-T2/L，每管中各加100ng PL2，100ng PT2，2μl 10×連接反應(yīng)緩沖液，10個(gè)單位的T4 DNA連接酶，補(bǔ)蒸餾水至總體積20μl。該反應(yīng)在16℃進(jìn)行12小時(shí)。大腸桿菌HB101株(ATCC 33694)用上述連接好的載體分別轉(zhuǎn)化。含有E2N-T2/L片段的載體被稱為pYLBC-A/G-UB-E2N，含有E2C-T2/L的被稱為pYLBC-A/G-UB-E2C(參見圖30)。
(3-C)轉(zhuǎn)化酵母菌進(jìn)一步生產(chǎn)出蛋白質(zhì)用參考例5中的相同方法將例(3-B-2)制備的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至酵母菌，在那些轉(zhuǎn)化后的酵母菌中Saccharomyces cerevisiae DC 04經(jīng)pYLBC-A/G-UB-KHCV403轉(zhuǎn)化后，于1991年6月27日保藏于ATCC編目號(hào)為ATCC74079(S.cerevisiae pYLBC-A/G-UB-KHCV403);用pYLBC-A/C-UB-CORE14轉(zhuǎn)化的Saccharomyces cerevisiae DC 04于1991年7月1日保藏，編目號(hào)為ATCC 74081(S.cerevisiae DC 04-UB-CORE14);用pYLBC-A/G-UB-E2C轉(zhuǎn)化后的Saccharomyces cerevisiae DC 04于1991年12月11日保藏，編目號(hào)為ATCC 74117(S.Cerevisiae DC 04-UB-E2C)，上述菌株保藏于ATCC是按國(guó)際專利關(guān)于識(shí)別微生物保藏簽訂的《布達(dá)佩斯公約》的條款進(jìn)行的。
在轉(zhuǎn)化的酵母菌中，將S.cerevisiae DC 04-UB-KHCV 403在3ml無亮氨酸培養(yǎng)基中置于30℃過夜(6.7g酵母菌無氨基酸氮基菌(Difco Inc.，U.S.A.)2.5g/l無亮氨酸的氨基酸混合物，5%葡萄糖)。然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入100yEPD培養(yǎng)基(2%蛋白胨，1%酵母浸膏，2%葡萄糖)30℃過夜以生產(chǎn)出KHCV蛋白質(zhì)。最終培養(yǎng)液O.D.650約為25。其它轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞用同樣的方法培養(yǎng)生產(chǎn)出KHCV其他蛋白質(zhì)。
上述每一種培養(yǎng)物在達(dá)到O.D.650等于10時(shí)收集離心。沉淀物懸浮在400μl緩沖液中[10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，2mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride，苯甲硫氟化物)8M脲]，然后加入等體積玻璃球(直徑0.4mm)劇烈振搖以破壞細(xì)胞壁。這樣抽提的酵母成分用Laemmli法[Laemmli et al.，Nature，277，680(1970)]在15%+二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳(SDS-PAGE)，然后，用考馬期亮蘭R250染色以確定KHCV蛋白的生產(chǎn)情況(參見圖31-A)。
在膠上分離的蛋白質(zhì)印跡在硝酸纖維素膜上。該膜放在PBS(10mM磷酸鹽，pH7.0，0.15M Nacl)，含0.2% Tween 20室溫振搖2小時(shí)以封閉IgG接合到蛋白質(zhì)之間非特異性吸附。再將濾膜放入稀釋的IgG(8.2mg/ml)溶液在室溫下輕搖1小時(shí)使蛋白質(zhì)和IgG反應(yīng)結(jié)合。這些稀釋的IgG是來自朝鮮病人純化后血清經(jīng)200倍PBS稀釋(PBS含有0.5%明膠，0.05% Tween 20)。然后將反應(yīng)的濾膜用含有0.2% Tween 20 PBS洗5分鐘，4次。再在膜上加上辣根過氧化物酶(BTO-Rad Lab.，USA，山羊抗人IgG-HRP)標(biāo)記的抗人IgG(IgG-HRP)室溫下振搖1小時(shí)。該酶標(biāo)抗體是用含0.5%明膠和0.05%Tween 20的PBS經(jīng)200倍稀釋后使用的。最后用含0.2% Tween PBS洗膜5分鐘，4次。再用50mM pH7.0的Tris緩沖液洗2次。
給膜上加入50mM Tris緩沖液，內(nèi)含400μg/ml 4-氯-1-萘酚和0.03%過氧化氫以便產(chǎn)生顏色反應(yīng)。從上述蛋白印跡的結(jié)果參見圖31-B。在圖31-B中，第2條顯示由pYLBC-A/G-UB-CORE14轉(zhuǎn)化的酵母菌提取物的結(jié)果;第3條是由pYLBC-A/G-UB-KHCV897轉(zhuǎn)化的酵母菌提取物的結(jié)果;第5條是pyLBC-A/G-UB-KHCV403轉(zhuǎn)化的酵母菌提取物的結(jié)果;第6條是pYLBC-A/G-UB-KHCV573轉(zhuǎn)化的酵母菌提取物的結(jié)果。第1和4條表明沒有KHCV表達(dá)載體的酵母菌提取物的結(jié)果;第M條是標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子標(biāo)志物(單位道爾頓dlt)。
圖32表明了SDS-PAGE和蛋白印跡結(jié)果確定了E2N和E2C蛋白的產(chǎn)量。在圖32中，第1條表明一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不帶KHCV基因的酵母菌抽提物，第2條表明用pYLBC-A/G-UB-E2N轉(zhuǎn)化的酵母菌提取物。第3至5條表明了pYLBC-A/G-UB-E2N轉(zhuǎn)化的酵母菌提取物;第6條是標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)志物結(jié)果，自上而下為200，97，72，43，29，18和14kd。
例4制備在大腸桿菌表達(dá)KHCV cDNA片段(4-A)制備含trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體(4-A-1)制備KHCV cDNA片段按例(3-A-1)和(3-A-2)制備的K384，K510，K573，K879，E2N和E2C片段用在本試驗(yàn)中。
外膜1(E1)片段定位于KHCV-LBC1第916至1509號(hào)核苷酸區(qū)段，采用例(3-A-1)相同的方法和下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增而成。
PEIUB引物(5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTTATGAAGTGGGCAACGCGTCC-3′)在5′端與KHCV-LBC1第916至936區(qū)段有25個(gè)核苷酸有與ubiquitine基因重疊部分。
PEISAL引物(5′-GACTGGACTATTACCCTGTCACGTGGGTGGTGGTTCC-3′)含有一個(gè)終止密碼以終止KHCV-LBC1第1509號(hào)核苷酸以后的翻譯，并有一個(gè)SalⅠ識(shí)別位點(diǎn)。
(4-A-2)Ubiquitine基因的制備第一步三個(gè)不同的按下述所示的寡核苷酸是按Ozkaynak等[EMBO.J.6，1429-1439(1987)]報(bào)告的Ubiquitine基因資料設(shè)計(jì)的，用DNA合成儀按以下所示序列合成的UBI15′－CCCCATATGCAAATTTTCGTCAAAACTCTAACAGGGAAGACTATAACCC TAGAGGTTGAATCTTCCGACACTATTGACAACGTCAA-3′UBI2:5′-TAGTTGCTTACCAGCAAAAATCAATCTCTGCTGATCCGGAGGGATACCTTCTTTATCTTTGAATTTTACTTTTGACGTTGTCAATAGTCTC-3′UBI3:5′-ACCACCGCGGAGTCTCAACACCAAGTGAAGAGTAGATTCCTTTTGGATGTTGTAGTCAGACAAGGTTCTACCATCTTCTAGTTGCTTACCAGCAAAAA-3′UBI 1被設(shè)計(jì)成在5′端有一個(gè)NdeⅠ(5′-CATATG-3′)并有大約20個(gè)核苷酸與UBI2重疊。UBI3被設(shè)計(jì)了一個(gè)SacⅡ識(shí)別位點(diǎn)(5′-CCGCGG-3′)但絲毫未能改變所編碼的氨基酸序列(參見圖33)。
第2步給2μgUBI1，0.02μg UBI2和2μg UBI3混合物中加入10μl 10×PCR緩沖液，10μl 10mM dNTP混合物和0.5μlTaq聚合酶，加蒸餾水至總體積100μl，按參考例7的相同方式進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后將反應(yīng)混合物上樣至5%PAGE分離出240bpDNA，命名為Ub，分離的Ub片段溶解在20μlTE緩沖液中。
(4-A-3)將ubiquitine基因連接到KHCV cDNA由例(4-A-1)制備的每一種片段按下述方法連接到Ub片段上。
在例(3-A-1)第1步和例(4-A-2)第1步制備的引物被用于PCR引物。
制備以下7支不同的試管管A加入50ng K384片段，50ng Ub，2μg UBI1引物和2μg PSALCORE 14引物;管B加入50ng K510片段，50ng Ub，2μg UBI1引物和2μg PSALCORE17引物;管C加入50ng 573片段，50ng Ub，2μg UBI1引物和2μg PSALCORE 22引物，管D中加入50ng K897片段，50ng Ub片段，2μg UBI1引物和2μg PKHCV 897SAL引物;管E中加入50ngE2N片段，50ng Ub，2μg UBI 1引物和2μg PE2NSAL引物;管F中加入5ng E2C片段，50ngUb，2μg UBI1引物和2μg PE2CSAL引物;管G中加入50ng E1片段，50ng Ub片段，2μgUBI1引物和2μg PEISAL引物。
向上述每一管中各加入10μl 10×聚合酶反應(yīng)緩沖液，10μl 2mM dNTP混合物，0.5μl Taq聚合酶，補(bǔ)蒸餾水至總體積100μl。按例7相同條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每一種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物都用NdeⅠ和SalⅠ酶在NEB緩沖液3中消化，在管A至管G獲得的片段分別稱為UBCORE14，UBCORE17，UBCORE22，UBKHCV897，UBE2N，UBE2C和UBE1。
(4-A-4)表達(dá)載體的制備第1步2μg ptrp 332-HGH(參見朝鮮專利公報(bào)第91-457，KFCC-10667)用Pstl和SalⅠ完全消化;2μg質(zhì)粒在NEB緩沖液4中用PstⅠ和NdeⅠ完全消化。產(chǎn)品在0.7%瓊脂糖電泳分離出1.5kb和0.8kb片段，分別稱為PB和PS。
第2步在上述第1步和例樣(4-A-3)中制備的片段被用于下面的連接反應(yīng)連接反應(yīng)管A中加入100ng UBCORE14，管中加入100ng UBCORE17管C中加入100ngUBCORE22，管D中100ng UBKHCV897，管E中100ng UBE 2N，管F中100ngUBE2C和管G中100ngUBE1，每一管中都加入100ngUBE1，100ngPB，100ng PS，2μl 10×連接反應(yīng)緩沖液和10單位T4DNA連接酶，補(bǔ)蒸餾水至總體積20μl，反應(yīng)后16℃進(jìn)行12小時(shí)。分離連接上的每一個(gè)載體，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli HB101株(ATCC 33694)含有UBCORE14的載體分離后稱為ptrpH-UB-CORE14;含有UB CORE 17的載體分離后稱為ptrpH-UB-CORE17;含有UBE CORE22片段的載體，分離后稱為ptrpH-UB-CORE22;含有UBE2N的載體，分離后稱為ptrpH-UB-E2N;含有UBKHCV897片段的載體分離后稱作ptrpH-UB-KHCV897;含有UBE2C的載體分離后稱為ptrpH-UB-E2C;含有UBE1的載體分離后稱為ptrpH-UB-E1(參見圖34)。
(4-B)制備含有tac啟動(dòng)子pMAL-KHCV載體(4-B-1)擴(kuò)增KHCV cDNA片段第1步為了在大腸桿菌中因tac啟動(dòng)子表達(dá)KHCV cDNA片段成MBP融合蛋白，用DNA合成儀制備出下述引物。
Primer PK426R:5'-CTCCGAATTCGGTGCTTGCGAGTGCCCC-3'Primer PK426X:5'-CACGCTCGAGGCATGTGAGGGTGTCGATGAC-3'Primer PSALCORE17:5'-GGGGTCGACTATTAGGGCAGATTCCCTGTTGC-3'Primer P426B:5'-GGGTGGGCAGGATGGCTCCTG-3'Primer PK513R:5'-CTCCGAATTCGGCACGAGGCTGGAGGACGGCGTGAACT-3'Primer PK513X:5'-CACGCTCGAGAGGCGACCAGTTCATCATCAT-3'Primer PK810R:5′-CTCCGAATTCGGCACGAGGGTTTCCCAGCTGTTCACCTT-3Primer PK810X:5′-CACGCTCGAGATTCAGCCATGTACAACCGAACC-3′Primer PK798R:5′-CTGCGAATTCGGCACGAGGGACGTGCTGCTCCTTAAC-3′Primer PK798X:5′-CACGCTCGAGCAGAAGCAGCGGCCATACGCC-3′PrimerPK754R:5′-AAAAAGAATTCGGCACGAGGCTGCGAGATTGGGCTCACACG-3Primer PK754X:5′-AAAAACTCGAGCCGCATAGTAGTTTCCATAGACTCAACGGG-TATGAATT-3′Primer PK652R:5′-AAAAAGAATTCGGCACGAGGTTCATACCCGTTGAGTCTATG-GAA-3′Primer PK652X:5′-ATTATTGTCGACTATCTATCTACTCGAGTCACAGCTTTGC-AGCGAGCTCGT-3′Primer PK403R:5′-AAAAAGAATTCACGGGCATGACCACTGAC-3′Primer PK403X:5′-ATTATTCTCGAGTATCACTCTTGCCGCCACAAGAG-3′Primer PK271R:5′-AAAAAGAATTCACTAGCCTTACAGGCCGG-3′Primer PK271X:5′-CACGCTCGAGTCACGTGACCAGGTAAAGGTC-3′Primer PK495R:5′-CCCCCGAATTCGGCACGAGCGCTGCGGAGGAAAGCAAGTT-3Primer PK495X:5′-AAAAACTCGAGGACCACGTCATAAAGGGCCA-3′Primer PK494R:5′-AAAAGAATTCGGCACGAGCGATGCATCTGGTAAAAGGGT-3Primer PK494X:5′-AAAACTCGAGATTGGAGTGAGTTTGAGCTT-3′
第2步11個(gè)不同編號(hào)的試管準(zhǔn)備后按下述加入引物管A2μg PK426R引物，2μg PK426×引物，管B2μg PK426R引物，20ng PK426B引物，20μg PSAL CORE17管C2μg PK513R引物，2μg PK513×引物，管D2μg PK810R引物，2μg PK810×引物，管E2μg PK798R引物，2μg PK798×引物，管F2μg PK754R引物，2μg PK754×引物，管G2μg PK652R引物，2μg PK652×引物，管H2μg PK403R引物，2μg PK403×引物，管I2μg PK271R引物，2μg PK271×引物，管J2μg PK495R引物，2μg PK495×引物，管K2μg PK494R引物，2μg PK494×引物，在上述每一管中加入10ng KHCV-LBC1(ATCC 75008)DNA，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl 10mM dNTP混合物和0.5μl(2單位)Taq聚合酶，加蒸餾水至總體積100μl。
每一個(gè)反應(yīng)混合物都加入50μl礦物油防止蒸發(fā)，按參考例樣7相同方式進(jìn)行PLR擴(kuò)增。
(4-B-2)制備表達(dá)載體在NEB緩沖液3中用ECORI和Sal Ⅰ完全消化2μgPMAL-CR C New England Bilabs Inc.Cat.No.800 11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA，U.S.A.)消化物用酚氯仿抽提，乙醇沉淀，溶介在40μlTE緩沖液中。
在例樣(4-B-1)第2步中制備的PCR產(chǎn)品用EcoRⅠ和Xho Ⅰ酶按如下過程消化在管A和管C至管F，管H和管J至管M中，每管加入PCR產(chǎn)品1μg用EcoRⅠ和XhoⅠ完全消化;在管G和管I中PCR產(chǎn)品加入量為3μg用XhoⅠ酶完全消化，用EcoRⅠ部分消化1μg管C中的PCR產(chǎn)品用EcoRⅠ和SalⅠ完全消化。這樣獲得的EcoRI-XhoⅠ以及EcoRI-SalⅠ片段分離后溶解在20μl TE緩沖液，方法同參考例樣1。
用EcoRI-XhoⅠ和EcoRⅠ以及SalⅠ消化的上述CDNA片段各取5μl，每樣中加入2μl10×連接緩沖液，1μl(500ng)用EcoRⅠ和SalⅠ處理的pMal-CR1和10單位T4DNA連接酶;補(bǔ)足蒸餾水至總體積20μl，在16℃反應(yīng)進(jìn)行12小時(shí)。
連接的每一個(gè)載體即重組載體分離后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101株(ATCC 33694)，管A至管K的載體分別稱為PMAL-KHCV426，PMAL-KHCV555，PMAL-KHCV513，PMAL-KHCV810，PMAL-KHCV798，PMAL-KHCV754，PMAL-KHCV652，PMAL-KHCV403，PMAL-KHCV271，PMAL-KHCV495和PMAL-KHCV494。
用上述重組載體的PMAL-CR1載體描述在圖35。
(4-C)在大腸桿菌表達(dá)KHCV cDNA(4-C-1)用含有trp啟動(dòng)子的載體表達(dá)KHCV cDNA，第1步用每一個(gè)在例樣(4-A)中制備的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌W3110株(ATCC 38335)，在它們中間，用ptrpH-UB-KHCV897轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110(E.coli W3110 ptroH-UB-KHCV897)于1991年6月27日保藏在ATCC，編目號(hào)為ATCC 69640，用ptrpH-UB-CORE17轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110株(E.Coli W3110 ptrpH-UB-CORE17)也于1991年6月27日保藏于ATCC，編目號(hào)為ATCC 68641，用PtrpH-UB-CORE 14轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110株(E.coli W3110 ptrpH-UB-CORE14)在1991年6月1日保藏，編目號(hào)為ATCC 68642，用ptrpH-UB-E，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110株(E.coli W3110 ptrpH-UB-E 1)在1991年12月11日保藏，編目號(hào)為ATCC68878;用ptrpH-UB-E2N轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110株(E.coli W3110 ptrpH-UB-E2N)于1992年4月22日保藏，菌種編目號(hào)為ATCC 68966，所有保藏均按國(guó)際專利微生物保藏識(shí)別《布達(dá)佩斯協(xié)定》所規(guī)定的條款進(jìn)行。
用ptrph-UB-CORE 14轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在液體LB培養(yǎng)基(1%細(xì)菌蛋白胨，0.5%酵母浸，1% NaCl)并含有50g/ml氨芐青霉素中37℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。取5ml上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1升M9培養(yǎng)基中(40mM K2HPO4，22mM KH2PO4，8.5mM NaCl，18.7mM NH4Cl，1%葡萄糖，0.1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.4%酪蛋白水解物，10μl/ml維生素B1，40μg/ml氨芐青霉素)，37℃振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)。當(dāng)O.D.650值達(dá)到0.5時(shí)，吲哚丙酸(IAA)加入其內(nèi)，使IAA的最終濃度達(dá)到1.4mM，5小時(shí)后，培養(yǎng)物3000rpm離心25分鐘收集沉淀的大腸桿菌。
其它重組大腸桿菌按上述相同方式培養(yǎng)以生產(chǎn)出KHCV蛋白質(zhì)來。
第2步上述每種細(xì)菌細(xì)胞懸浮在緩沖液內(nèi)，然后在15% SDS-PAGE采用Laemmli法[Nature，227，680(1970)]以確定融合ubiquitine的KHCV蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果見圖36至38。
在圖36，M道是標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)志，即自上向下72，43，29和18kd;第一道是不帶KHCV基因的質(zhì)粒大腸桿菌產(chǎn)物;第2道是ptrpH-VB-CORE 14轉(zhuǎn)化大腸桿菌，23kd的蛋白質(zhì)被翻譯出來。第三道表明由ptrpH-UB-CORE 17轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)物，是一個(gè)27 kd蛋白質(zhì)，第4道是由ptrpH-UB-CORE 22轉(zhuǎn)化大腸桿菌生產(chǎn)的29kd蛋白蛋，第5道是由ptrpH-UB-KHCV 897轉(zhuǎn)化大腸桿菌生產(chǎn)的40kd蛋白質(zhì)。而第6道是純化的KHCV 897蛋白質(zhì)。
在圖37，第一道是不帶KHCV質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)品，第2至第5道是ptrpH-UB-E1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分別從IAA添加不同時(shí)間2，4，6和12小時(shí)后收獲的產(chǎn)品。第6道是代表著標(biāo)準(zhǔn)分子量大小標(biāo)志，即自上而下72，43，29，18和14kd。
在圖38，第1道是不帶KHCV基因質(zhì)粒的大腸桿菌產(chǎn)品，第2道是ptrph-UB-E2C轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)品，第3道是ptrpH-UB-E2N轉(zhuǎn)化大腸桿菌的產(chǎn)品。
蛋白印跡是按例(3-C)相同的方法進(jìn)行是為了確定由上述重組大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能否特異性結(jié)合KHCV抗體。結(jié)果參見圖39至圖41。
(4-C-2)由含tac啟動(dòng)子的載體表達(dá)KHCV cDNA第1步按例4相同的方法將例(4-B)制備的每一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌D1210株(ATCC 27325)，在它們中間，由pMAL-KHCV 555(E.coli D 1210 pMAL-KHCV 555，)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于1991年6月27日保藏于ATCC其編號(hào)為ATCC 68639，這一行動(dòng)是按國(guó)際專利微生物保藏識(shí)別鑒定的《布達(dá)佩斯協(xié)定》的條款下進(jìn)行的。
在含有50μg/ml氨芐青霉素液體LB培養(yǎng)中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，取5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至1升 M9培養(yǎng)基(在一升溶液中含有6g Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5g NaCl;1gNH4Cl，2μl 1M MgSO4，100μl 20%葡萄糖，0.1ml CaCl2)37℃振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)，當(dāng)O.D.650到達(dá)0.5時(shí)，IPTG加入到培養(yǎng)物中使其終濃度為0.2mM，5小時(shí)后，培養(yǎng)物在3000rpm離心25分鐘收集沉淀的E.coli細(xì)胞。
第2步在緩沖液中懸浮細(xì)胞沉淀物用Laemmli法[Nature 227，680(1970)]上樣進(jìn)15%SDS-PADG以確定KHCV蛋白的表達(dá)。結(jié)果參見圖40。在圖42中，M道是標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)志;第1道是pMAL-CR1轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的40kd蛋白質(zhì)產(chǎn)物;第2道是pMAL-KHCV426轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的65kd蛋白質(zhì)產(chǎn)物(MBP-KHCV 426蛋白);第3道是pMAL-KHCV 555轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的70kd蛋白質(zhì)產(chǎn)物(MBP-KHCV 555蛋白質(zhì));第4道是pMAL-KHCV 513轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的65kd蛋白質(zhì)(MBP-KHCV 513蛋白質(zhì))產(chǎn)物;第5道是pMAL-KHCV810轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的75kd蛋白質(zhì)(MBP-KHCV 810蛋白質(zhì))產(chǎn)物;第6道是pMAL-KHCV 798轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的72kd蛋白質(zhì)產(chǎn)物;第7道是pMAL-KHCV271轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的50kd蛋白質(zhì)產(chǎn)物;第8道是pMAL-KHCV754轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的72kd蛋白質(zhì)(MBP-KHCV 754蛋白質(zhì))產(chǎn)物;第9道是pMAL-KHCV652轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的70kd蛋白質(zhì)(MBP-KHCV652蛋白質(zhì))產(chǎn)物;第10道是pMAL-KHCV403轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的65kd蛋白質(zhì)(MBP-KHCV403蛋白質(zhì))產(chǎn)物;第11道是pMAL-KHCV495轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的70kd蛋白質(zhì)(MBP-KHCV495蛋白質(zhì))產(chǎn)物;第12道是pMAL-KHCV494轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生的70kd蛋白質(zhì)(MBP-KHCV494蛋白質(zhì))產(chǎn)物。
蛋白印跡是按例(3-C)相同方式進(jìn)行的目的是確定上述蛋白質(zhì)能否特異性的與KHCV抗體結(jié)合，結(jié)果參見圖43。
(4-C-3)從融合蛋白消化去除MBPMBP融合的每一種蛋白質(zhì)對(duì)Xa因子緩沖液(20mM Tirs-HCl，pH8.0，100mM NaCl，2mM CaCl2，1mM疊氮化鈉)透析24小時(shí)。0.2μg每一種透析蛋白液(1mg/ml)和0.2μg Xa因子混合(New England Biolabs，Inc.，Cat.＃800-10L);反應(yīng)物室溫24小時(shí)存放。
每一種上述處理混合物100℃5分鐘，按例(1-C)相同方法上樣進(jìn)行SDS-PAGE以確定MBP是否從融合蛋白中移去。移去MBP的蛋白質(zhì)被分別做KHCV 426蛋白，KHCV555蛋白，KHCV513蛋白，KHCV810蛋白，KHCV798蛋白，KHCV271蛋白，KHCV754蛋白，KHCV652蛋白，HCV403蛋白，KHCV495蛋白和KHCV494蛋白。
按上述所述，為了制備表達(dá)載體各種長(zhǎng)度和序列的KHCV cDNA由PCR擴(kuò)張制備而得，這中間使用了各種各樣引物組合。因此，很明顯其它相似的KHCV cDNA片斷以上述揭示的可以很容易由一個(gè)技術(shù)熟練的人合成。既然KHCV抗原蛋白依賴著KHCV cDNA，因此很明顯其它KHCV抗原蛋白質(zhì)也可由一位技術(shù)熟練的人員很容易的合成。進(jìn)而，為制備KHCV cDNA和KHCV抗原蛋白質(zhì)，可能要使用不僅在例中用的酶，接頭(Linker)和其它材料，而且也包括它們的對(duì)應(yīng)物(equivalents)。
例5純化由酵母細(xì)胞表達(dá)的KHCV蛋白(5-A)純化KHCV 403蛋白第1步重組酵母細(xì)胞的培養(yǎng)由含KHCV 403 cDNA片段和ubiquitine基因的載體(PYLBC-A/G-UB-KHCV403)轉(zhuǎn)化的S.cerevisiae DCO4-UB-KHCV403酵母細(xì)胞在10ml無亮氨酸培養(yǎng)基中30℃12小時(shí)培養(yǎng)(0.67%酵母無氨基酸的氮基質(zhì)，5%葡萄糖，和0.25%無亮氨酸的氨基酸的混合物)。然后，該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入100ml含5%葡萄糖YEPD培養(yǎng)基(2%蛋白胨，1%酵母浸膏，5%葡萄糖)振蕩培養(yǎng)在30℃約6小時(shí)，培養(yǎng)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)入一升含5%葡萄糖的YEPD培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)6小時(shí)。獲得了發(fā)酵的種子批培養(yǎng)物。
10升含2%葡萄糖的YEPD培養(yǎng)基被裝入14升發(fā)酵罐(Bench Top FermentorNBS Company U.S.A.)隨后將種子批培養(yǎng)物接種其中在30℃以250rpm速度振蕩培養(yǎng)約48小時(shí)，然后在2500rpm下離心20分鐘，(BeckmanJ-6B，Rotor JS.4.2)獲得重組酵母細(xì)胞膏。
第2步破碎酵母細(xì)胞第1步獲得的重組酵母細(xì)胞懸浮在500ml緩沖液中(50mM Tris，pH8.5，5mM EDTA，10mM β-巰基乙醇，1mM苯甲硫氟化物，1μg/ml pepstatin A，);加入等體積的0.4mm直徑的玻璃珠，用一個(gè)勻漿器在4℃處理5分鐘(珠破碎器，Biospec Product，U.S.A.)以破壞細(xì)胞膜，破碎的細(xì)胞通過濾膜(Whatman 3MM，U.S.A.)以移去玻璃珠獲得酵母勻漿物。
第3步鑒定特異性抗原蛋白在第2步獲得的少量酵母勻漿物進(jìn)行15%SDS-PAGE。結(jié)果表明在細(xì)胞內(nèi)ubiquitines已經(jīng)被切割下來，從KHCV 403 cDNA表達(dá)的蛋白質(zhì)(又稱為KHCV 403蛋白)分子量大約1.7kd。
在膠上分離的蛋白質(zhì)印跡到硝酸纖維素膜，然后，將該膜放入含有0.5% Tween 20的磷酸緩沖鹽水(PBS10mM磷酸鹽，0.15M NaCl，pH7.0)的盤中，輕輕振蕩，室溫2小時(shí)，以封閉IgG非特異性吸附。之后IgG(8.2mg/ml)，親合純化自一位朝鮮C型肝炎病人血清，用含有0.5%明膠和0.05% Tween 20 PBS以1∶200稀釋，稀釋后的IgG溶液10ml加入過濾器。室溫輕蕩盤1小時(shí);用含有0.5%明膠和0.05% Tween 20以1∶200稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG(Bio Red Lab，山羊抗人IgG-HRP)然后加至膜上。室溫下輕蕩1小時(shí)。用含0.5% Tween 20，PBS洗膜四次，每次5分鐘。再用50mM Tris緩沖液(pH7.0)洗2次。加50mM Tris緩沖液(pH7.0)內(nèi)含400μg/ml 4-氯-1-萘酚和0.03%過氧化氫以便出現(xiàn)顏色反應(yīng)。結(jié)果表明全酵母勻漿物中唯有KHCV 403蛋白能和C型肝炎病人血清進(jìn)行免疫學(xué)反出現(xiàn)一條可見的帶，因而，所說的KHCV蛋白是唯一能結(jié)合KHCV抗體的免疫活性蛋白。
第4步除去溶解的雜蛋白在第二步獲得的酵母勻漿物以11000 rpm離心(Beckman，J2-21，Rotor JA14)除去上清液，獲得的不溶性沉淀物中，有KHCV 403蛋白。
第5步用脲溶解和分段分離沉淀物第4步獲得的沉淀物溶在750ml緩沖液中(50mM Tris，pH8.5，5mM EDTA，10mM β-巰基乙醇，1mM苯甲硫氟化物，1μg/ml pepstatin A)，其中含有8M脲。該溶液離心移去不溶物，收集上清液。上清液對(duì)含有2M脲的緩沖液(10mM Tris，pH9.0，2mM EDTA，5mM β-巰基乙醇)，透析，離心除去沉淀，上清液中含有KHCV403蛋白。
第6步第1次DEAE離子交換層析第5步獲得的上清液通過用含有2M脲的緩沖液(10mM Tris，pH9.0，2mM EDTA，5mM β-巰基乙醇)，平衡過的DEAE-Sepharose(瓊脂糖珠)柱(Pharmacia，F(xiàn)F，5cm×15cm，U.S.A)。結(jié)合在柱上的蛋白質(zhì)用含0.2M NaCl的750ml緩沖液(10mM Tris，pH9.0，2mM EDTA，5mM β-巰基乙醇)洗脫，分部收集結(jié)合蛋白質(zhì)。
第7步第2次DEAE離子交換層析收集含有KHCV 403蛋白的蛋白部分，對(duì)緩沖液(10mM Tris，pH9.0，2mM EDTA，5mM β-巰基乙醇)，透析以除去脲，然后，通過上述緩沖液平衡過的DEAE-瓊脂糖珠柱。加入含有0.1M NaCl緩沖液(10mM Tris pH9.0，2mM EDTA，4mM β-巰基乙醇，以分離出洗脫蛋白;有一個(gè)從0.1M到0.2M NaCl的濃度梯度的500ml緩沖液加入，分部分離結(jié)合到柱上的蛋白質(zhì)，各分部收集的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE，以收集含有高純度KHCV 403的部分。
第8步FPLC-苯基層析第7步獲得的分部收集物對(duì)含有1.5M NaCl的緩沖液(50mM Tris，pH7.4，2mM EDTA，5mM β-巰基乙醇)，透析，然后，通過用所說的緩沖液平衡達(dá)的FPLC-苯基superose柱(pharmacia，HR 10/10，1cm×8cm，U.S.A)。含有從1.5到0M NaCl濃度梯度的160ml緩沖液加進(jìn)柱內(nèi)分部洗脫蛋白質(zhì)。每分部收集的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE檢查其純度。含有高純KHCV 403蛋白的部分，單獨(dú)收集，以便能獲得有95%以上純度的KHCV403蛋白質(zhì)。
(5-B)純化KHCV CORE14蛋白質(zhì)第1步培養(yǎng)重組酵母細(xì)胞酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)DCO4-UB-CORE 14是由含有編碼KHCV CPRE 14蛋白和ubiquitine基因的載體(pYLBC-A/G-UB-CORE14)轉(zhuǎn)化而得。將該菌培養(yǎng)在無亮氨酸的含5%葡萄糖的培養(yǎng)基中，其過程與例(5-A)中第一步相同。20ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至100ml含有4%葡萄糖的YEPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩6小時(shí)，再轉(zhuǎn)入1升含有2%葡萄糖的YEPD培養(yǎng)基30℃24-48小時(shí)。離心培養(yǎng)物，收集細(xì)胞沉淀。
第2步破碎酵母細(xì)胞第1步獲得的重組酵母的細(xì)胞沉淀物重新懸浮在30ml緩沖液中(50mMTris，pH7.5，5mM EDTA，10mMβ-巰基乙醇，1mM苯甲硫氟化物，1μg/ml pepstatin)，加入等體積的0.4mm直徑的玻璃珠，在4℃由一個(gè)勻漿器(Bead Beater，Biospec Product，U.S.A)3次處理5分鐘，以破碎細(xì)胞膜獲得酵母勻漿物。
第3步鑒定特定的抗原蛋白質(zhì)在第2步中獲得的酵母勻漿物取少量在15% SDS-PAGE分析，并用考馬斯亮蘭染色，結(jié)果表明ubiquitine已從KHCV上分離開了，KHCV cDNA表達(dá)的蛋白質(zhì)(稱為KHCV CORE 14蛋白質(zhì))分子量約為16，000道爾頓。
蛋白印跡與例(5-A)第3步相同。結(jié)果表明KHCV CORE 14蛋白僅僅能和C型肝炎病人血清進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，顯示出一條可見的帶。
第4步去除可溶性蛋白，洗不溶性沉淀物第2步獲得的酵母勻漿物在11，000rpm離心(Beckman，J2-21，Rotor JA-14)去除可溶性蛋白質(zhì)，收集含有KHCV CORE 14蛋白的不溶性沉淀物。沉淀懸浮在0.5升含有1% Triton-100，1mM EDTA和10mM β-巰基乙醇的PBS中，振蕩10分鐘，離心，沉淀物再用10mM磷酸鹽溶液洗一次(pH6.8)。
第5步用8M脲溶解沉淀物在第4步獲得的不溶性沉淀物懸浮在含有8M脲，1mM EDTA，10mM β-巰基乙醇，10mM磷酸鈉鹽溶液(pH6.5)，4℃攪拌12小時(shí)，溶解出KHCV CORE 14蛋白。該溶液在15，000rpm離心20分鐘(Beckman，J2-21，Rotor，JA20)，收集上清液。
第6步羧甲基(CM)離子交換樹脂層析在第5步獲得的含KHCV CORE 14的溶液以1ml/min的流量通過裝有25ml CM(羧甲基)-Sepharose樹脂的2.5cm×10cm的柱(Pharmacia，Sweden)，該柱事先用含有6M脲，1mM EDTA，10mM β-巰基乙醇和10mM磷酸鹽的緩沖液(pH6.5)平衡過。未吸附到柱上的材料可用所用的平衡緩沖液反復(fù)徹底的洗脫而除去。吸附在柱上的蛋白質(zhì)用500ml已知平衡液，其內(nèi)NaCl的濃度梯度從0至0.5M，以3ml/min流速洗脫。洗脫液用SDS-PAGE分析檢查，結(jié)果表明KHCV CORE 14蛋白存在于大約0.3M NaCl溶液中。含有KHCV CORE 14蛋白的分部收集液收集后供下步使用。
第7步S-200凝膠滲透層析在第6步收集的那部分溶液通過YM5超濾膜(Amicon，USA)將上述溶液濃縮至10ml。該濃縮液再加入已用含6M脲素，1mM EDTA和10mMβ-巰基乙醇PBS平衡過的S-200Sephacryl柱(Pharmacia，Sweden，2.5cm×100cm)流量為0.5ml/min按分子量大小將蛋白質(zhì)加以分離。分部收集的蛋白液用15%SDS-PAGE檢查，含高純KHCV CORE14蛋白的那部分收集后在4℃對(duì)PBS透析以除去脲素，共獲得4mg高純KHCV CORE14蛋白。應(yīng)該明白由其它KHCV cDNA編碼并由酵母菌表達(dá)的蛋白質(zhì)也可由上述描述的相似過程純化而得。
例6純化在大腸桿菌表達(dá)的KHCV蛋白質(zhì)(6-A)純化KHCV UB897蛋白質(zhì)第1步培養(yǎng)重組大腸桿菌用含有KHCV897cDNA和ubiquitine基因的載體(PtrpH-UB-KHCV897)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coliW3110 ptrpH-KHCV897，ATCC68640)在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中(每升中含有10g Bactotriptone，5g酵母浸膏，10g NaCl)振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。取5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移接種至1升含有40μg/ml氨芐青霉素的Mg培養(yǎng)基中(40mM K2HPO4，22mKH2PO4，8.5mM NaCl，18.7mM NH4Cl，1%葡萄糖，0.1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.4%酪蛋白水解物，10μg/ml維生素B1)37℃震蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)。加入吲哚乙烯酸(IAA)使終濃度為0.14mM，當(dāng)培養(yǎng)液OD650到達(dá)0.5時(shí)，說明開始生產(chǎn)了KHCV UB897蛋白。在加入IAA后約5小時(shí)，2500rpm離心20分鐘(Beckman J-6B，Rotor IS 4.2)收集大腸桿菌細(xì)胞沉淀物。用磷酸鹽緩沖生理鹽水(10mM磷酸鹽pH7.0，0.15mM NaCl，)再洗一次沉淀物。
第2步破碎細(xì)胞在第1步獲得的3g大腸桿菌沉淀懸浮在40毫升緩沖液(50mM Tris pH8.5，5mM EDTA，2mM β-巰基乙醇，1mM苯甲硫氟化物，1μg/ml pepstatin A，)。加0.3ml 50mg/ml溶菌酶至懸液中37℃1小時(shí)，在冰上進(jìn)行超聲處理約5分鐘，超聲儀輸出功率為70%(Heat System-Ultrasonics，LnS.，W225，USA)這樣就使細(xì)胞破碎獲得大腸桿菌細(xì)胞的勻漿成份。。
第3步鑒定特定的抗原蛋白第2步中獲得的大腸桿菌細(xì)胞勻漿物，取少許進(jìn)行12%SPS-PAGE，結(jié)果表明，由所說的載體(涉及KHCV UB897蛋白)表達(dá)的KHCV蛋白有3.9kd分子量。
因此，膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，按例(5-A)第3步相同的方法進(jìn)行蛋白印跡。結(jié)果表明只有KHCVUB897蛋白能和C型肝炎病人血清進(jìn)行進(jìn)行免疫學(xué)UB897反應(yīng)并形成一條可見的帶。在結(jié)果的右側(cè)，可以看到所說表達(dá)的KHCV UB 897蛋白是能夠和HCV抗體結(jié)合的免疫反應(yīng)蛋白。
第4步除去可溶性蛋白在第2步獲得的細(xì)胞勻漿物以11，000rpm離心25分鐘(Beckman J2-21，Rotor JA-14)以除去可溶性蛋白獲得不溶性沉淀物。
第5步用曲拉通X-100和Tris緩沖液洗不溶性沉淀物。
第4步獲得的沉淀物懸浮在50ml含1%。曲拉通X-100緩沖液(50mM Tris，5mM EDTA，2mM β-巰基乙醇，pH8.5)中，該懸液在室溫下攪拌30分鐘后以11，000rpm離心25分鐘(Beckman J2-21，Rotor JA14)，以除去上清，收集不溶沉淀物。隨后，沉淀物懸浮在50ml緩沖液(50mM Tris，5mM EDTA，2mMβ巰基乙醇，pH8.5)中。進(jìn)一步攪拌離心以除去上清，收集不溶物。
僅僅通過上述簡(jiǎn)單的洗滌過程，獲得的KHCVUB897蛋白，此時(shí)至少有60%的純度。
第6步用8M脲素溶解不溶性沉淀物含有在第5步獲得的KHCV UB 897蛋白的不溶性沉淀物懸浮在50ml含有8M脲的緩沖液(20mM磷酸鹽，pH6.0.2mMEDTA，2mMβ-巰基乙醇，)室溫下攪拌1小時(shí)，離心除去不溶性沉淀物，收集上清液。
第7步S-Sepharosse離子交換層析第6步獲得的上清液上樣于已用含有4M脲緩沖液(20mM磷酸鹽pH6.0，2mM EDTA，2mM β-巰基乙醇)，平衡過的S-Sepharose柱(Pharmacia，F(xiàn)F，2.5cm×7cm，U.S.A)、用600mlNaCl濃度梯度從0至0.2M的緩沖液洗脫。有蛋白部分的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE，收集含有高純KHCV UB897蛋白的部分。
第8步去除脲素并進(jìn)行FPLC-Mono Q離子交換層析在第7步收集的含有KHCV UB 897蛋白的分部洗出液對(duì)緩沖液(10mM Tris pH8.5，2mM EDTA，2mM β-巰基乙醇，)除去脲素，然后加樣通過已用緩沖液平衡過的FPLC-Mono Q離子交換樹脂柱(Pharmacia，HR5/5)。用40ml有NaCl 0至0.4M濃度梯度的緩沖液洗脫，含有高純KHCV UB 897蛋白部分被收集以便獲得至少90%純度的KHCV UB 897蛋白。
(6-B)純化KHCV UB CORE 17蛋白質(zhì)第1步重組大腸桿菌的培養(yǎng)由含C型肝炎病毒cDNA和Ubiquitine基因的載體(ptrpH-UB-CORE 17)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110株ptrpH-UB-CORE17(ATCC 68641)在含50μg/ml的氨芐青霉素，100μg/ml色氨酸的LB培養(yǎng)基上37℃12小時(shí)培養(yǎng);將50ml的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1升Mg培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)6到8小時(shí)。然后收集細(xì)胞沉淀物，步驟如例(6-A)的第一步所述。
第2步破碎細(xì)胞第1步獲得的3g大腸桿菌細(xì)胞沉淀物在4℃懸浮在20ml緩沖液(50mM Tris，pH7.5，5mM EDTA，10mM β-巰基乙醇，1mM苯甲硫氟化物，1μg/ml pepstatin)。然后加入3mg溶菌酶，攪5分鐘。再在冰浴中超聲處理20分鐘(Heat Systemas-Ultra-sonics，mc.，W225，U.S.A)以破碎細(xì)胞獲得細(xì)胞勻漿。
第3步鑒定特定抗原蛋白質(zhì)在第2步中獲得的大腸桿菌勻漿在15%SDS-PAGE電泳，然后用考馬斯亮蘭染色。結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)生了分子量約為2.7Kd的蛋白質(zhì)(即KHCV UB CORE17蛋白。)其后，將凝膠分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，與例(5-A)第3步相同方法進(jìn)行蛋白印跡。結(jié)果表明在大腸桿菌勻漿中只有KHCV UB CORE 17蛋白與C型肝炎病人血清有免疫學(xué)反應(yīng)，表現(xiàn)出一條可見的帶。
第4步用脲素處理在第2步獲得的細(xì)胞勻漿物經(jīng)12，000rpm離心20分鐘(Beckman J2-21，Rotor JA2)除去不溶性材料，收集上清液。加入9M脲素至終濃度6M，4℃攪12小時(shí)。
第5步酸處理在第4步獲得的溶液中加入1M乙酸鈉(pH4.5)至終濃度10mM，用1M乙酸調(diào)至pH5，攪1小時(shí)后11，000rpm離心(Beckman J2-21，Rotor JA14)除去沉淀，收集上清液。
第6步Mono-S層析第5步獲得的上清液經(jīng)過FPLC Mono-S柱層析(HR5/5，Pharmacia，Sweden)可獲得純品，UB-CORE17蛋白溶液通過一個(gè)事先用含有8M脲，1mM EDTA，1mMβ-巰基乙醇，10mM乙酸的緩沖液A(pH5.0)平衡的柱子。然后，用已知的緩沖液A洗脫。最后，用含有8M脲，1mM EDTA，1mMβ-巰基乙醇，10mM乙酸和1M NaCL的緩沖液B逐漸加入緩沖液A中。前5分鐘，B占A液的17.5%，后來的55分鐘占35%，最后10分鐘占100%，整個(gè)洗脫流速為0.8ml/min，當(dāng)緩沖液B達(dá)到25%，即，NaCl濃度為0.25M時(shí)，KHCV UB-CORE 17蛋白質(zhì)開始洗脫下來。
第7步S-200凝膠滲透層析第6步獲得的蛋白溶液通過一個(gè)用含有6M脲，1mM EDTA和1mM β-巰基乙醇的PBS緩沖液平衡過的S-200 Sephacryl柱(Pharmacia，Sweden，2.5cm×100cm)流速為0.5ml/min，該層析分離是按分子量大小進(jìn)行分離的。分部收集有蛋白的洗脫物。對(duì)含有KHCV UB-CORE 17蛋白的部分進(jìn)行SDS-PAGE。然后，此部分在4℃對(duì)PBS溶液透析以獲得4mg KHCV UB-CORE 17蛋白，至少有90%的純度。
(6-C)純化UB-E1蛋白第一步重組細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)能夠產(chǎn)生KHCVE1蛋白和Ubiquitine(UB)融合蛋白的大腸桿菌W3110ptrpH-UB-E1株(ATCC68878)的培養(yǎng)和收集完全與例(6-A)第一步相同。
第2步破碎細(xì)胞在第1步獲得細(xì)菌細(xì)胞沉淀重新懸浮在50ml緩沖液中(20mM Tris，pH7.5，1mM EDTA，2mM β-巰基乙醇，1mM苯甲硫氟化物，1μg/mlPepstatin A)。加入溶菌酶至終濃度0.2mg/ml38℃30分鐘，并在冰浴中用70%功率超聲處理5分鐘破碎細(xì)胞收集勻漿。
第3步鑒定特定抗原的表達(dá)第2步獲得的勻漿進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明有一約2.7Kd(即US-E1蛋白)蛋白由載體表達(dá)。
凝膠分離的蛋白質(zhì)印跡到Immobilon P膜上(MILLIPORE，Cat.NO IPUH OOOIO，孔經(jīng)0.45μm)并按例(5-A)第3步相同的方式進(jìn)行免疫印跡。
結(jié)果表明在全細(xì)胞勻漿中只有UB-E1蛋白能和C型肝炎、病人備清進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生一條可見一帶。
第4步制備細(xì)胞勻漿以11.000rpm離心25分鐘(BeckmanJ2-21，RotorJA14)除去上請(qǐng)收集沉淀物。
第5步洗不溶性沉淀物第4步獲得的沉淀物懸浮在30ml含1%曲拉通X-100緩沖液(20m Tris，pH7.5，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇)，室溫?cái)嚢?0分鐘再以11，000rpm離心25分鐘(Beckman，J2-21，Rotor JA14)除去溶解在1%曲拉通X-100的可溶性蛋白。沉淀蛋白進(jìn)一步懸浮在30毫升所述的緩沖液1，攪拌并離心，收集不溶沉淀物。
UB-E1蛋白用這樣簡(jiǎn)單洗滌過程可獲得至少60%純度。
第6步不溶性沉淀物的溶解和分部分離在第5步獲得的含有UB-E1蛋白不溶性沉淀物懸浮在含8M鹽酸胍的50ml緩沖液2中(50mM Tris，pH9.0，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇)。懸液在室溫下攪30分鐘后11，000rpm離心25分鐘以除去不溶性沉淀物，收集上清液，上清液用緩沖液2稀釋至鹽酸胍終濃度為0.5M;離心、收集含UM-E1蛋白的沉淀物第7步溶解不溶性沉溶物在第6步獲得的含UB-E1蛋白不溶性沉淀物懸浮在20ml含有8M脲的緩沖液3中(50mM碳酸鈉，pH9.5，1mM EDTA、2mMβ-巰基乙醇)。室溫?cái)?小時(shí)，除去不溶沉淀物經(jīng)11，000rpm，25分離心(Backman J2-21，Rotor 5A147)收集上清液。
第8步Q-Sepharose離子交換層析第7步收集的上清液通過一個(gè)事先已用緩沖液平衡過的Q-Sepharose柱(pharmacla，F(xiàn)F，1.2cm x 7cm)。有一個(gè)0至0.4M NaCl濃度梯度的100ml緩沖液用于洗脫蛋白，有蛋白的洗出液進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳，收集含有UB-E1蛋白的部分，大約UB-E1蛋白的純度至少90%。
(6-D)純化KHCV UB-CORE14蛋白第1步重組大腸桿菌的培養(yǎng)由含有KHCV cDNA和ubiquitine基因的載體(ptrpH-UB-CORE14)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110ptr pH-UB-CORE 14株(ATCC68642)在含有50ug/ml氨芐青霉素和100μg/ml色氨酸的LB培養(yǎng)基中37%℃培養(yǎng)12小時(shí);50ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1升Mq培養(yǎng)基37℃6-8小時(shí)按例(6-A)第1步相同過程收集細(xì)菌沉淀物(paste)。
第2步破碎細(xì)胞4克從第1步中得到的大腸桿菌細(xì)胞在4℃懸浮在20ml緩沖液(50mM Tris，pH7.5，5mM EDTA，10mM β-巰基乙醇，1mM苯甲硫氟化物，1μg/ml pepstatin)向其內(nèi)加入4mg溶菌霉，攪拌5分鐘，然后在冰浴中超聲處理20分鐘以破碎細(xì)胞。
第3步鑒定特定的抗原蛋白取少量第2步制備的細(xì)胞勻漿物進(jìn)行如前所述的15%SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮蘭染色，結(jié)果表明表達(dá)載體生產(chǎn)出一個(gè)約為2.3Kd蛋白質(zhì)，以下稱為KHCV UB-CORE 14蛋白)。
之后，凝膠分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，該膜按例(5-A)相同的方法進(jìn)行蛋白印跡。結(jié)果表明在全大腸桿菌細(xì)胞勻漿中只有KHCV UB-CORE 14可以和C型肝炎病人血清起免疫學(xué)反應(yīng)顯示出一條可見的帶。
第4步用脲處理第2步獲得的勻漿以12，000rpm離心20分鐘(Beckman J2-21，Rotor JA-20)除去不溶性材料收集上清液。再在上清中加入9M脲使終濃度成為8M，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。
第5步用酸處理在第4步獲得的溶液中加入1M乙酸鈉(pH4.5)至終濃度為10mM，之后再加入1M乙酸調(diào)pH至5.0室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后11，000rpm離心(Bdeckman Js-21，Rotor JA-14)除去沉淀，收集上清液。
第6步CM離子換交層析在第5步得到的含有KHCV UB-CORE 14溶液，加入到含25ml CM-Sepharose樹脂的層析柱中(2.5cm×10cm)(Pharmacia，SWeden)以1ml/min流速流入，該柱事先用含有8M脲1mM EDTA，10mM巰基乙醇，和10mM乙酸鹽的緩沖液(pH5.0)平衡過。以自由形式存在在柱中的材料徹底用平衡緩沖液洗。在柱中吸附的蛋白質(zhì)用500ml有0至0.5MNaCl濃度梯度的平衡緩沖液以流速3ml/min洗脫。洗脫物用SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果表明在大約0.3MNaCl，濃度時(shí)KHCV UB-CORE 14蛋白從柱上洗脫下來。收集這部分含有KHCV UB-CORE 14的蛋白用于下一步。
第7步S-200凝膠滲透層析從第6步收集的那部分洗脫蛋白通過YM5超濾膜(Amicon，U.S.A.)濃縮體積至10ml。濃縮物再通過事先已用含有6M脲，1mM EDTA和1mM β-巰基乙醇的PBS平衡過的S-200Sephacryl層析柱(2.5cm×100cm，Pharmacia，Sweden)流速為0.5ml/min。該層析是以分子量大小來分離蛋白質(zhì)的。收集的具有蛋白質(zhì)部分進(jìn)行SD-PAGE電泳。收集含有KHCV UB-CORE14蛋白的那部分洗脫液。
第8步Mono-S層析在第7步獲得的KHCV UB-CORE 14蛋白液進(jìn)一步用FPLC Mono-S柱(HR5/5，Pharmacia，Sweden)純化。該柱事先用含有6M脲，1mM EDTA，1mM β-巰基乙醇和10mM磷酸鹽的緩沖液A平衡過(pH7.0)，并用相同容積的緩沖液A稀釋，然后，加樣于柱中，先用緩沖液A洗脫，之后，使含有6M脲，1mM EDTA，1mMβ-巰基乙醇，10mM磷酸鹽和0.4M NaCl的緩沖液B在A液中的比例逐漸占35%的混合液洗脫5分鐘，提高該比例至70%時(shí)洗脫55分鐘，最后10分鐘，用100%緩沖液2洗脫。流速為0.8ml/min。在緩沖液B占60%時(shí)，即氯化鈉為0.25M，KHCV UB-CORE14蛋白被洗脫下來。
洗脫下來的這部分蛋白對(duì)PBS 4℃透析可獲得4mg純度至少為90%的KHCVUB-CORE 14蛋白。
(6-E)純化UB-E2N蛋白第1步重組細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)能夠產(chǎn)生KHCV E2N和ubiquitine融合蛋白的大腸桿菌W3110 ptrpH-UB-E2N(ATCC 68966)株在含有50μg/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。取10毫升培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至含有2%酪氨酸和10μg/ml色氨酸，1升M9培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)約3小時(shí)，向其內(nèi)加入吲哚丙酸(IAA)至終濃度為50μg/ml，此時(shí)的培養(yǎng)基OD650值應(yīng)達(dá)到0.2，IAA能誘導(dǎo)產(chǎn)生重組UB-E2N蛋白。加入IAA5小時(shí)后，以3，500rpm離心培養(yǎng)物25分鐘(BeckmanJ6，RotorHS4)，收集細(xì)胞沉淀物，并用PBS離心洗一次。
第2步鑒定特定抗原上述制備菌體勻心物經(jīng)SDS-PAGE(15%)電泳表明表達(dá)的UB-E2N分子量大約為28，000道爾頓(28Kd)。
隨后，將凝膠分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至Immobilone P膜上(Millipore，Cat.No.IPUH00010，孔徑0.45μm)。該膜放入含有0.5%Tween20的PBS液中(10mM磷酸鹽，pH7.0，0.15MNaCl)室溫振蕩2小時(shí)以封閉IgG的非特異性吸附。用含有0.5%明膠和0.05%Tween20的PBS液以1∶20稀釋如前所述的C型肝炎病人血清，然后將10ml該稀釋血清與膜進(jìn)行反應(yīng)。室溫1小時(shí)振蕩后，用含0.05%Tween20 PBS洗膜4次，每次5分鐘。用含0.5%明膠和0.05%Tween20 PBS以1∶1000比例稀釋堿性磷酸鹽標(biāo)記的抗人IgG(Boehringer Manheim，Cat.No.605415，抗人IgG-Alp)，然后將10ml的稀釋液加至膜上。室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，用含0.05%Tween20PBS洗四次，再用100mM Tris緩沖液(pH9.5，5mM MgCl2，100mM NaCl)洗二次，每次5分鐘。
最后給膜上加入100mM Tris緩沖液，內(nèi)含125μg/ml硝基藍(lán)四氮唑(Pierce，NBT)和25μg/ml溴氯吲哚磷酸鹽(Pierce，BGIP)，以便產(chǎn)生顏色反應(yīng)。結(jié)果在全細(xì)胞勻漿中只有UB-E2N蛋白能與C型肝炎病人血清進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)并出現(xiàn)一條可見的帶。
第3步破碎細(xì)胞并除去可溶性蛋白從第1步估計(jì)可獲約3克細(xì)胞沉淀物，把它們懸浮在50ml緩沖液1中(20mM Tris，pH7.5，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇，1mM苯甲硫氟化物，1μg/ml pepstatin A);加入溶菌酶使其終濃度為0.2mg/ml，37℃反應(yīng)30分鐘，70%功率冰浴對(duì)上述菌懸液進(jìn)行超聲處理5分鐘，獲得細(xì)菌勻漿物。然后以11，000rpm離心25分鐘(Beckman J2-21，Rotor JA 14)除去可溶性蛋白，收集不溶沉淀物。
第4步用曲拉通X-100和Tris緩沖液洗不溶沉淀物第3步獲得的沉淀物懸浮在30ml含1%曲拉通X-100的緩沖液1(20mM Tris，pH7.5，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇)，室溫?cái)嚢?0分鐘后以11，000rpm離心25分鐘(Beckman J2-21，RotorJA-14)除去可溶性蛋白，收集沉淀蛋白。沉淀物重新懸浮在30ml緩沖液1中。攪拌后離心收集不溶蛋白質(zhì)。
通過上述簡(jiǎn)單的洗洗過程至少有70%純度的UB-E2N蛋白被獲得。
第5步用8M脲溶解不溶性沉淀物在第4步獲得的含有UB-E2N蛋白不溶性沉淀物懸浮在40ml含8M脲的緩沖液2(50mM Tris，pH9.0，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇)中。室溫下攪拌1小時(shí)后，離心除去不溶性沉淀物，收集上清液。
第6步S-200凝膠滲透層析在第5步獲得的含UB-E2N 40ml 8M脲溶液用超濾膜YM10(Amicon)濃縮至5ml體積。然后通過用含有4M脲的緩沖液2平衡過的S-200樹脂柱(2.5cm×90cm，Pharmacia，1USA)，流速為每小時(shí)40ml，每管收集2毫升。收集各管用SDS-PAGE分析后其中含有UB-E2N蛋白。
第7步Q-Sepharose離子交換層析在第6步獲得的含UB-E2N蛋白的溶液通過已事先用含4M脲的緩沖液2平衡過的Q-Sepharose柱(FF，1.2cm×7cm，Pharmacia，USA)。150毫升含0至1.0M NaCl濃度梯度的緩沖液洗脫蛋白組份。各收集管用SDS-PAGE檢查并UB-E2N純度至少為80%的組份管。
第8步除去脲后進(jìn)行FPLC-苯基層析在第7步獲得的含UB-E2N的4M溶液用YM10超濾膜濃縮至8毫升(Amicon)用透析膜(Spectum，Medical Industries，Inc.，M.W.cut off 6，000～8，000)對(duì)緩沖液3透析(20mM Tris，pH9.0，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇，0.2M NaCl)除去脲。然后在該液中加入氯化鈉至終濃度1M。再上樣通過FPLC-苯基Sepharose柱(Pharmacia，HR5/5，0.5cm×5cm);40ml含有從1.0至0M的NaCl濃度梯度的緩沖液用于洗脫分離上述蛋白。洗出液進(jìn)行SDS-PAGE收集含有UB-E2N蛋白的部分，它們的純度至少為90%。
(6-F)純化UB-E2C蛋白第1步重組細(xì)胞的培養(yǎng)能產(chǎn)生KHCV E2C蛋白和ubiquitine融合蛋白在含有50μg/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中12小時(shí)。20毫升培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1升含2%酪氨酸和10μg/ml色氨酸M9培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)2小時(shí)(37℃)，當(dāng)OD650在室0.3已誘導(dǎo)產(chǎn)生重組UB-E2C蛋白，向培養(yǎng)物中加入吲哚丙酸(IAA)至終濃度50μg/ml。從加入IAA3小時(shí)后，以3，500離心培養(yǎng)物25分鐘(BEckman J6，Rotor HS-4)收集細(xì)胞沉淀，再用PBS洗一次沉淀物。
第2步鑒定特定抗原制備少許沉淀物進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明UB-E2C蛋白分子量約為25，000道爾頓。
之后，用膠分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至Immobilone P膜(Millipore，cat.＃.IPUH00010，孔徑0.45μm)上，再將膜放置含0.5%Tween20的PBS中，室溫振蕩2小時(shí)封閉IgG非特異性吸附。用含有0.5%明膠和0.05%Tween20的PBS以1∶20比例稀釋C型肝炎病人血清10ml加入其中，室溫下輕蕩1小時(shí)后，用含有0.05%Tween20PBS洗膜4次，每次5分鐘。經(jīng)用含0.5%明膠和0.05%Tween20的PBS以1∶500稀釋抗人IgG辨根過氧化物酶標(biāo)記物(Bio-Rad Lab.，抗人IgG-HRP)10ml加在膜上室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，用含0.05%Tween20的PBS洗膜4次，再用50mM Tris緩沖液(pH7.0)洗2次，每次洗膜5分鐘。
加濾膜中50mM Tris緩沖液，內(nèi)含400μg/ml4-氯-1-萘酚和0.03%過氧化氫引發(fā)展顏色反應(yīng)。結(jié)果只有UB-E2C蛋白在全細(xì)胞勻漿中能和C型肝炎病人血清起免疫學(xué)反應(yīng)并出現(xiàn)一條可見的帶。
第3步破碎細(xì)胞和除去可溶性蛋白第1步獲得了約1克細(xì)胞沉淀物，把它們懸浮在50ml的溶菌緩沖液，內(nèi)含20mM Tris，pH7.5，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇，1mM苯甲硫氟化物和1μg/ml pepstatin A，)再向內(nèi)加入溶菌酶至終濃度0.5μg/ml，37℃30分鐘，70%功率，在冰浴中超聲處理以破碎細(xì)胞以約5分鐘，獲得勻漿物。最后以11，000rpm離心25分鐘移去可溶性蛋白，收集不溶性沉淀。
第4步用曲拉通X-100和Tris緩沖液洗不溶性沉淀物以第3步獲得的沉淀物懸浮在20ml含10%曲拉通X-100的緩沖液1(20mM Tris，pH7.5，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇)。懸液室溫下30分鐘以11，000rpm離心25分鐘(Beckman J2-21，RotorJA-14)以除去可溶蛋白獲得沉淀蛋白。將沉淀懸浮在30ml緩沖液1中，攪拌后再離心獲得不溶性蛋白。
第5步用8M脲溶解不溶性沉淀物在第4步中獲得的含有UB-E2C蛋白質(zhì)的不溶性沉淀物懸浮在含有8M脲的20ml緩沖液2中(50mM碳酸鹽緩沖液，pH9.5，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇)。室溫?cái)嚢?小時(shí)，離心除去沉淀，收集上清液。
第6步FPLC-MonoQ離子交換層析第5步獲得的上清液通過事先用緩沖液2平衡過的(含有0.1M NaCl)FPLC-MonoQ柱(Pharmacia，HR5/5，0.5cm×5cm，USA)。之后，用含有0.1至0.4MNaCl濃度梯度的緩沖液40ml洗脫結(jié)合蛋白。各組份進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，收集純度至少為80%的蛋白組份。
第7步除去脲并進(jìn)行FPLC-苯基層析通過YM10超濾膜，可使第6步獲得的含有UB-E2C的8M脲溶液濃縮成14ml體積，然后對(duì)緩沖液3(20mM Tris，pH9.0，1mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇，0.2M NaCl)透析(透析膜Sepectum Medical Industrieo，Inc.，M.W.cut off截流分子量6，000-8，000)以除去脲。再向該液中加入NaCl使終濃度為1M。再通過FPLC-苯基Sepharose柱(Pharmacia，HR5/5，0.5cm×5cm)，用40ml有NaCl濃度梯度1M至0的緩沖液加入洗脫結(jié)合蛋白，并對(duì)各組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，收集純度至少為90%含有UB-E2C蛋白的組份。
例7用KHCV重組蛋白檢測(cè)KHCV抗體(7-A)混合陰陽性血清樣品對(duì)抗原不同濃度的反應(yīng)性用50mM硼酸鈉緩沖液(pH9.0)對(duì)KHCV403、KHCV897，和KHCV UB-CORE 14蛋白分別以下述3種濃度0.25μg/ml，2.0μg/ml和2.0μg/ml為起點(diǎn)2倍倍比系列稀釋。稀釋的蛋白溶液加入至微量反應(yīng)板孔(Dynatech，Immunolon type Ⅰ微反應(yīng)板)、每孔200μl，用封口膜(para-film)將板密封后37℃溫育2小時(shí)。封膜的目的是防止水份蒸發(fā)。
包被2小時(shí)的板用含有0.05%(V/V)Tween20的PBS(pH7.4，又稱為洗液)洗板一次。然后將含0.1%明膠(V/V)PBS加入板孔，每孔210μl37℃溫育2小時(shí)，每板孔加入300μl洗液洗2次，再用含0.25%明膠，1mMEDTA，1.0%(V/V)Triton X-100和0.02%硫柳汞的PBS 190μl/孔洗2次，HCV病人陽性血樣或陰性血樣每孔加入10μl，37℃1小時(shí)，再用Ortho公司(Ortho Diagnostic Systems，Raritan，NJ88869，USA)C型肝炎診斷試劑盒檢測(cè)，該試劑盒使用C-100抗原。血清樣品是由朝鮮Yonsei大學(xué)附屬Severance醫(yī)院提供血清樣品。
37℃反應(yīng)1小時(shí)的板孔用300μl洗液洗孔5次。再加入用含10%胎牛血清，1%Ficoll(Sigma，V/V)，0.02%硫柳汞和0.05%Tween20PBS1∶5000倍稀釋的抗人IgG r-鏈標(biāo)記辨根過氧化物酶標(biāo)記物(Bio-Rad公司，Richmond，CA94804，USA，0.1mg蛋白/ml)，每孔200μl，37℃溫育1小時(shí)，用洗液洗孔五次。之后，加入200μl鄰苯二胺(OPD，Sigma)(以10mg/ml溶解在50mM檸檬酸鹽緩沖液，并用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH至5.5)于每個(gè)孔中，暗中室溫溫育30分鐘。即刻每孔加入50μl 4N硫酸終止顏色反應(yīng)。在492nm波長(zhǎng)用Dynatech微量反應(yīng)板讀數(shù)儀測(cè)定每孔的光密度值(參見圖19)。
(7-B)制備診斷試劑盒KHCV UB-CORE 14，KHCV 897和KHCV403蛋白純化的抗原被用于制備診斷盒。這些抗原都是在前述經(jīng)過純化的。將該抗原用50mM硼酸鹽緩沖液(pH9.0)或10mM碳酸鈉緩沖液(pH9.5)稀釋成最適濃度，加至Immolon typel微量反應(yīng)96孔板各孔中(Dynatech)，每孔150μl至200μl，4℃孵育，12-18小時(shí)讓抗原吸附至板孔中。
對(duì)于每個(gè)抗原最適濃度KHCV UB-CORE 14蛋白為0.18至0.75μg/ml，KHCV897蛋白為0.06至0.3μg/ml，KHCV 403蛋白為0.12至0.5μg/ml。本例中每一種抗原均使用0.3μg/ml。
用抽吸儀去除每孔內(nèi)容物。用含0.05%(W/V)Tween20PBS(PBS，pH7.4)洗板再用含0.1%(w/v)明膠緩沖液(210μg/孔，pH7.4)阻斷2小時(shí)37℃，用洗液洗板三次。板里殘留濕氣用吸抽裝置去除。
每孔加入190μl含有1%牛血清緩沖液(10mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，0.2%曲拉通x-100，0.1mM EDTA，0.02%硫柳汞和10μl血清樣品，37℃ 60分鐘使樣品中HCV抗體和吸附在板孔上的抗原結(jié)合。用含0.05%Tween20(v/v)的PBS(pH7.4)洗板5次，加入用含10%牛血清白蛋白(w/v)的緩沖液(10mM Tris，PH7.5，150mM NaCl，0.02%硫柳汞，1%聚遮糖(Ficoll))稀釋抗人IgG-HRP(山羊抗人IgG-HRP，BIO-Rad Lab;U.S.A)每孔200μl，37℃60分鐘，用含0.05%Tween20(v/v)的PBS(pH7.4)洗板孔。加入200μl OPD液于每孔室溫30分鐘。最后加入50μl 4N硫酸中止反應(yīng)然后，在OD492波長(zhǎng)處測(cè)定結(jié)果。確定陰陽性標(biāo)準(zhǔn)的OD值稱為結(jié)果判定值(Cut-off value)已確定為0.4加陰性對(duì)照樣品的OD值。
對(duì)于每一種KHCV蛋白和混合抗原與上述對(duì)應(yīng)的結(jié)果列在表1。比較對(duì)照用的商品試劑來自O(shè)rtho Diagnostic Systoms，使用按制造商說明書。
表1用酶免疫法確定KHCV蛋白與KHCV抗體的反應(yīng)性樣品號(hào)(詳見附后的表1)注1)++++判定值+1.5≤光密度吸收值(OD)+++判定值+1.0≤OD＜判定值+1.5++判定值+0.5≤OD＜判定值+1.0+判定值≤OD＜判定值+0.5-OD＜判定值2)對(duì)于KHCV897抗原的判定值為0.32，對(duì)于KHCV UB-CORE 14蛋白為0.27，對(duì)于KHCV403蛋白為0.35，對(duì)混合抗原為0.483，對(duì)ortho診斷試劑盒為0.4533)Ortho HCV診斷試劑盒來自O(shè)rtho Diagnostic Systems，USA的商品。
(7-C)診斷的準(zhǔn)確性為了演示現(xiàn)診斷方法獲得結(jié)果的準(zhǔn)確性，用由Ortho Diagnostic Systems制造和出售的HCV診斷試劑盒確定為陽性的17個(gè)血清樣品再用本發(fā)明診斷試劑盒進(jìn)行診斷，也用免疫印跡試劑盒檢查(Chiron，RIBA HCV Test System，第二代，Ortho診斷Systems制造，產(chǎn)品號(hào)933491)，該法用來驗(yàn)證，由除SOD對(duì)照抗原以外，4種抗原組成(參見Van der Poel，C.L.et al，Lancet，337，317-319(1991)該結(jié)果列在表2，表明本發(fā)明診斷方法比Ortho HCV診斷試劑盒有較低假陽性結(jié)果。
表2.Ortho第二代免疫印跡試劑盒和本發(fā)明診斷試劑盒診斷結(jié)果比較(詳見附后的表2)＊如果發(fā)現(xiàn)有一個(gè)以上+，即，表明除OD對(duì)照外至少有2個(gè)抗原有陽性反應(yīng)就被判為陽性。
＊＊以例(7-13)制備的混合抗原用在本試劑中。
例8用聚合酶鏈反應(yīng)和基因探針確定HCV的存在(8-A)從HCV病毒抽提RNA向一待檢血清100μl加入TNE溶液(100mM TrisHCl，pH8.0，0.2mM EDTA，0.2M NaCl)100μl，RNAzol溶液300μl(TMCinna Scientific，Inc，Texas 77546，USA)和氯仿300μl，徹底搖混。然后，15，000rpm離心5分鐘(4℃，Eppendorf離心機(jī))形成沉淀收集上清，用300μl酚和300μl氯仿抽提，離心沉淀，沉淀物用10μlTE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0，0.1mM EDTA)溶解負(fù)70℃保存。
(8-B)用聚合酶鏈反應(yīng)檢查HCV的存在上述抽提的RNA加入4μl蒸餾水和1μl 0.1M CH3HgOH、室溫10分鐘。然后加入0.5μl 1Mβ-巰基乙醇，10μl RNasin，5μl x RT緩沖液CBRL，Gaitherburg，MD20877，USA)，1.25μl d NTP(10mM dGTP，dTTP，dCTP和dATP)，1μg隨機(jī)引物，1.25μl(18單位/μl)SuperscvipTH反向轉(zhuǎn)錄酶(BRL.U.S.A)補(bǔ)足蒸餾水至總體積25μl，42℃反應(yīng)1小時(shí)。
反應(yīng)后，將該反應(yīng)物加熱至65℃維持15分鐘以滅活酶和用于PCR.
第一步PCR擴(kuò)增按下進(jìn)行0.5μl Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，USA)加入10μl 10×Tag聚合酶緩沖液(10mMM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，155mM MgCl2，0.1%(v/v)明膠)，10μl 1.25mM dNTP混合物，2μg引物A(5'1-CATAGTGGTCTGCGGAACCG-3')，2μg引物B(5'-TTG-AGGTTTAGGATTCGTGC-3')和75μl蒸餾水。加入50μl礦物油以防溶液的蒸發(fā)。以下面溫度循環(huán)重復(fù)40次進(jìn)行第一步PCR96℃2分鐘→55℃2分鐘→72℃3分鐘。
第2步PCR是在取第1步PCR產(chǎn)品1μl加入1μg引物C(5'-TACACCGGAATTGCCAGGAC-3')和1μg引物D(51-TCATGGTGCACGGTCTACGAG-3')后按第一步PCR相同的反應(yīng)條件重復(fù)進(jìn)行40次溫度循環(huán)。
約5μl第2步PCR產(chǎn)品用于7%PAGE電泳以確定HCV病毒的存在(陽性樣品應(yīng)展示出一條182bp的DNA帶來。
(9-A)例四制備特異性針對(duì)C型肝炎KHCV蛋白抗原免疫溶解在生理鹽水中的KHCV897蛋白和等量的費(fèi)氏完全佐劑混合，含有50μg這種蛋白的0.2ml混懸液腹腔內(nèi)注入約10周齡的Bal b/c系小鼠。30μg該蛋白和費(fèi)氏不完全佐劑混合后在間隔2-3同時(shí)再行腹腔接種。二次免疫后兩周，從鼠尾抽少量血進(jìn)行免疫酶測(cè)定以確定抗體滴度。當(dāng)抗體滴度達(dá)到10000，在0.5ml生理鹽水中溶解50-100μg這種蛋白進(jìn)一步接種?？贵w滴度被定義為在ELISA方法中0.2吸收單位產(chǎn)生的血清稀釋。3-4天后，收集小鼠脾細(xì)胞用于制備生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞。
(9-B)細(xì)胞融合免疫過的脾細(xì)胞和P3×63-Ag8.653株小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合(ATCC CRL 1580)融合。5×107免疫鼠脾細(xì)胞和2×107骨髓瘤細(xì)胞混合后300g離心10分鐘。細(xì)胞沉淀物用IMDM培養(yǎng)基離心洗，棄去上清液，沉淀細(xì)泡中滴入1ml50%PEG(Kodak，分子量1450dlt)，邊滴邊攪1分鐘以上，再離心2分鐘(200g)，在3分鐘以上緩慢加入5ml IMDM培養(yǎng)基，再加入含胎牛血清(10%)的5ml IMDM培養(yǎng)基，邊加邊攪，5分鐘內(nèi)完成。
含10%胎牛血清的IMDM掊養(yǎng)基隨后加至總體積為50ml，離心10分鐘。棄上清。加10%胎血血清，100μM次黃嘌呤，0.4μM氨基喋呤和16μM%胸腺嘧啶至IMDM培養(yǎng)基，用此培養(yǎng)基稀釋細(xì)胸成每毫升5×105P3×63-Ag8.653細(xì)胞。然后，將該液以0.1ml/孔的量加入細(xì)胞培養(yǎng)的96孔板。含1×105個(gè)細(xì)胞/ml腹腔巨噬胞的0.1ml加入板孔，此外這些巨噬細(xì)胞在融合之前應(yīng)制備好并培養(yǎng)一天。骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
據(jù)此，能在HAT培養(yǎng)基生長(zhǎng)的細(xì)胞就是融合細(xì)胞。當(dāng)雜交瘤生長(zhǎng)至10-50%水平時(shí)，上清取樣檢查抗體活性。
(9-c)單克隆抗體滴度檢測(cè)在第9-B步生產(chǎn)的單克隆抗體，可采用下列的酶免疫測(cè)定法來檢測(cè)其滴度。
第1步將KHCV897蛋白溶解在50mM硼酸鹽緩沖液(pH9.0)中，使其終濃度為2μg/ml給Immunolon type Ⅰ板(Dynatech)每孔加入上述溶液100μl37℃溫育2小時(shí)。
第2步然后，用含有0.05%Tween 20(v/v)的PBS(pH7.4，稱為洗液)洗板孔一次，再加入含0.1%明膠(w/v)PBS液，各孔200μl，以封閉殘留在板孔中的蛋白吸附位點(diǎn)，同樣在37℃溫育2小時(shí)。
第3步第2步各板孔用洗液洗2次后，回入50μl含0.25%明膠(w/v)，1.0mM EDTA，1%m曲拉通X-100(v/v)和0.02%硫柳汞的PBS液，之后每孔再加入50μl已經(jīng)生長(zhǎng)后的融合細(xì)胞上清液，37℃溫育1小時(shí)。
第4步第3步中處理的板孔用洗液洗5次。以1∶5000比例用含10%胎牛血清(v/v)，1%聚蔗糖(v/v)，0.02%硫柳汞(w/v)和0.05% Tween 20(v/v)PBS稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠IgG-HRP(Boehringer Manheim，Cat.No.705-250)。然后每孔加入稀釋的IgG-HRP液100μl 37℃1小時(shí)。反應(yīng)后，用洗液洗板5次。
第5步每孔加入含10mg/5ml OPD(Sigma Chemical Co.)的50mM檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH5.5)100μl室溫避光反應(yīng)30分鐘，再加入50μl 2N硫酸以終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)492處測(cè)完每孔的光吸收值。具有所需抗體活性的雜交瘤轉(zhuǎn)入并生長(zhǎng)在一個(gè)六孔板或24孔板上，若必要可加入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞用于提供融合細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子。
(9-D)抗體的生產(chǎn)4個(gè)細(xì)胞系(Lucky1.1，1.2，1.3和1.4)它們都能分泌所需的單克隆抗體在上步中獲得。
本發(fā)明所用抗體既來自用常規(guī)方法細(xì)胞培養(yǎng)雜交瘤克隆株的上清液也來自生長(zhǎng)在Balb/c小鼠腹腔中的雜交瘤克隆的腹水。
2.5×106融合細(xì)胞注入于7-14天前已用Pristane(Sigma)預(yù)處理過的一只Balb/c小鼠腹腔內(nèi)。1-2周后，收集腹水，用常規(guī)方法分離抗體。
(9-E)單克隆抗體特性檢查在例(9-D)中獲得的每一株克隆制備出的單克隆抗體其特性鑒定按下述過程進(jìn)行。
第1步抗體的亞類用雜交瘤亞-異型試劑盒(Calbiochem，USA)確定這些小鼠抗體的亞類，結(jié)果見表3。
第2步酶免疫測(cè)定將KHCV897蛋白溶解在50mM硼酸鈉緩沖液中，使其終濃度為2μg/ml，給微量反應(yīng)板(Dynatech Immunolon type Ⅰ)每孔加入200μl上清液，37℃溫育2小時(shí)。用含有0.05%Tween 20(v/v)的PBS洗板。從每一個(gè)克隆收集的抗體經(jīng)用常規(guī)方法純化后調(diào)整其深度為1mg/ml，用含0.25%明膠(w/v)，1.0%曲拉通X-100，0.02%硫柳汞和1mM EDTA的PBS二倍倍比系列稀釋。每孔加入210μl含0.1%明膠的PBS 37℃1小時(shí)，然后用洗液洗板。
獎(jiǎng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG(Boehringer Manheim，Cat.No.605-250)溶解在含10%FBS(v/v)，1%聚蔗糖(v/v)和0.05% Tween 20的PBS中，每孔加入200μl 37℃1小時(shí)。按例(9-C)相同的方式進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)OD值(495nm)高于1.0時(shí)每一種抗體的EIA效力以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)來表示。結(jié)果見表3。
第3步確定分子量每一個(gè)雜交瘤克隆用板或小鼠腹腔培養(yǎng)，獲得的上清液或腹水通過蛋白G Sepharlse柱進(jìn)行親和層析分離出IgG，然后進(jìn)行SDS-PAGE以確定上述獲得的小鼠抗體重鏈和輕鏈的分子量。結(jié)果見表3。
第4步確定表位決定簇(epitope)KHCV897 cDNA在不同地方被切割，并構(gòu)建了許多編碼下列蛋白的克隆體，在本發(fā)明中每一種單克隆抗體與這些蛋白的反應(yīng)性也進(jìn)行了檢查。
(1)KHCV897蛋白一種由KHCVLBC1編碼的氨基酸序列中第1192至1457號(hào)區(qū)段的蛋白質(zhì)。
(2)KHCV290蛋白一種由KHCV-LBC1編碼的氨基酸序列中第1192至1289號(hào)區(qū)段的蛋白質(zhì)。
(3)KHCV430蛋白一種由KHCV-LBC1編碼的氨基酸序列中第1192至1335號(hào)區(qū)段的蛋白質(zhì)。
(4)KHCV570蛋白一種由KHCV-LBC1編碼的氨基酸序列中第1192至1382號(hào)區(qū)段的蛋白質(zhì)。
(5)KHCV652蛋白一種由KHCV-LBC1編碼的氨基酸序列中第1192至1407號(hào)區(qū)段的蛋白質(zhì)。(6)KHCV150蛋白，一種由KHCV-LBC1編碼的氨基酸序列中第1408至1457號(hào)區(qū)段的蛋白質(zhì)。
(7)KHCV257蛋白一種由KHCV-LCBC1編碼的氨基酸序列中第1371至1457號(hào)區(qū)段的蛋白質(zhì)。
(8)KHCV518蛋白質(zhì)一種由KHCV-LBC1編碼的氨基酸序列中第1285至1457號(hào)區(qū)段的蛋白質(zhì)。
SDS-PAGE樣品的制備是將緩沖液[Laemmli，U.K.，Nature 277，680(1970)]加入表達(dá)每一種KHCV cDNA片段的大腸桿菌細(xì)胞中，然后100℃煮沸5分鐘。制備樣品對(duì)抗體的反應(yīng)性檢查是采用免疫印跡法[Towbin，H.，J.Immunol.Metbods，72，313-340(1984)]。結(jié)果見表3和表4。
從這個(gè)結(jié)果可以看出從Lucky1.1株獲得的抗體對(duì)C型肝氨基酸序列的第1192至1289區(qū)段為識(shí)別位點(diǎn);而Lucky1.2，1.3和1.4株獲得的抗體對(duì)第1371至1407區(qū)段為識(shí)別位點(diǎn)。對(duì)相互有不同表位的單克隆抗體可用以制備試劑盒，用以盒試劑可用于檢測(cè)血清樣品中的抗原，使用方法為夾心法酶免疫檢測(cè)。
表3本發(fā)明單克隆抗體的特性檢查(詳見附后的表3)表4不同KHCV897 cDNA切割構(gòu)建的表達(dá)載體產(chǎn)生的各種蛋白質(zhì)與單克隆抗體之間的免疫反應(yīng)性(詳見附后的表4)。
Lucky1.1和Lucky1.2細(xì)胞系于1991年12月18日按國(guó)際專利《布達(dá)佩斯條約》有關(guān)條款保藏于美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，其編目號(hào)為ATCC 10949和ATCC 10950。
例10由針對(duì)KHCN抗原的抗體組成的診斷試劑第1步辣根過氧化物酶標(biāo)記Lucky1.1株產(chǎn)生的單克隆抗體首先，所說的Lucky1.1細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體用辣根過氧化物酶標(biāo)記是采用如下所述的過碘酸鹽法[Nakane et al.，J.Histochem.Cytochem.，22，1084(1974)]將0.3ml在10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中的0.1M過碘酸鈉溶液加入至1.2ml溶有5mg過氧化物酶的蒸餾水中。該混合物在室溫下反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)物對(duì)1mM乙酸鈉緩沖液透析16小時(shí)。將1.5ml過氧化物酶溶液和1ml被標(biāo)記抗體混合。該抗體已事先溶解在20mM碳酸鈉溶液(pH9.5)中，終濃度為10mg/ml。上述酶和抗體混合物在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。加入100μl4mg/ml溶解在蒸餾水中的單水化鈉(Sodium monohydride)以減少未反應(yīng)的Schiff堿。然后對(duì)PBS(pH7.4)透析過夜，再上樣于Sephacryl S300層析柱以除去未柱記上的單克隆抗體。
第2步吸附Lucky1.2單克隆抗體到微量反應(yīng)板上取200μl用PBS稀釋的Lucky1.2抗體液加入每一個(gè)板孔中在37℃2小時(shí)讓其吸附到孔壁上。
第3步封閉非特并性吸附位點(diǎn)第2步制備的微量反應(yīng)板用含0.05% Tween 20和0.02%硫柳汞PBS液(稱為洗液)洗板一次，然后每板孔加入含0.1%明膠的200μlPBS包被蛋白吸附位點(diǎn)1小時(shí)，再用洗液洗板2次。
第4步診斷抗原的存在KHCV897抗原用含0.25%(w/v)明膠，1.0%(v/v)曲拉通X-100，1mMEDTA和0.02%硫柳汞的PBS從200mg/ml開始2倍倍比系列稀釋，每孔加入200μl。為比較起見，將KHCV蛋白加入到一個(gè)正常血樣中使其終濃度為400mg/ml;含有KHCV抗原的正常血樣也進(jìn)行2倍倍比系列稀釋，100μl稀釋血樣和100μl所說緩沖液混合后加入每一個(gè)孔中。這企圖表明血液樣品中C型肝炎抗原能夠用已制備抗體建立的夾心法酶免疫測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)。未加KHCV897抗原的正常血樣被用于陰性對(duì)照。板在37℃溫育1小時(shí)后用洗液洗5次。
第5步用標(biāo)記過氧化物酶的Lucky1.1抗體檢測(cè)抗原用含有10%(v/v)胎牛血清，1%聚蔗糖0.05%Tween20和0.02%硫柳汞的PBS稀釋Lucky1.1抗體成終濃度5μg/ml，取200μl加至每一個(gè)板孔中，37℃溫育1小時(shí)。
第6步顯色反應(yīng)第5步處理的板用洗液洗5次。取鄰苯二胺加入50mM檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH5.5)中使其終濃度為2mg/ml，每孔加入200μl上述溶液，避光室溫30分鐘顯色。之后加入50μl 4N硫酸終止反應(yīng)。在492nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。結(jié)果見圖43。
例11用夾心法酶免疫測(cè)定檢測(cè)C型肝炎病人血清100μl待檢血清和100μl例樣10第4步所用緩沖液混合后加入用例樣10中相同過程制備的已吸附單克隆抗體的微量反應(yīng)板孔。血清中抗原的檢測(cè)和例樣10相同，結(jié)果見表5。
231個(gè)樣品中有220樣品(220/231)在492nm波長(zhǎng)處光吸收值低于0.15;另外11個(gè)樣品的OD值變化范圍為0.15-0.8，并被判為陽性。與Halbert法[Halbert，S.P.et al.Clin.Clim.Acta 1271，69(1983)]一致，結(jié)果判定值(cut-off value)定在0.15。
有15個(gè)樣品(包括上述11個(gè)樣品)按例7相同的過程測(cè)定了KHCV的抗體。結(jié)果見表6。
用夾心ELISA法測(cè)定KHCV897抗原很有用，并可用于早期測(cè)定KHCV的感染。同EIA測(cè)定抗體一道使用，測(cè)抗原的ELISA用于HCV患者的治療和預(yù)防。
表5夾心法酶免疫測(cè)定確定樣品的吸收值(詳見附后的表5)其中注1)百分率(%)＝ (檢查樣品數(shù))/(總樣品數(shù))表6C型肝炎抗體和抗原的檢測(cè)(詳見附后的表6)
其中注1)抗原診斷的結(jié)果判定值定在0.15光吸收值，抗體診斷定在0.33據(jù)此，本發(fā)明的KHCV蛋白，特別是含有3種蛋白的混合抗原比表1中所列的已商品化的HCV診斷試劑盒對(duì)KHCV抗體有更強(qiáng)的反應(yīng)性。本發(fā)明所建立的試劑盒比已商品化的試劑盒所獲結(jié)果的準(zhǔn)確度更高的多。像列在表2中的那樣也比確定結(jié)果測(cè)完的試劑盒更方便和經(jīng)濟(jì)。
本發(fā)明涉及的微生物和細(xì)胞系，已保藏在ATCC，另外也保藏在中國(guó)典型微生物保藏中心(武漢)(CCTCC)(6月9日1992)。其中涉及三個(gè)個(gè)組，即Saccharomyces cerevisiae DC04(pYCBC-A/G-UB-KHCV)它包括用pYLBC-A/G-UB-KHCV4-3轉(zhuǎn)化的S.cerevisiae DC04，用pYLBC-A/G-UB-CORE14轉(zhuǎn)化的S.cerevisiae DC 04，以及用pYLBC-A/G-UB-E2C轉(zhuǎn)化的S.cerevisiae DC 04;大腸桿菌(E.coli)W3110(ptrpH-UB-KHCV)，它包括用ptrpH-UB-KHCV897轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110，用ptrpH-UB-CORE17轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110，用ptrpH-UB-CORE14轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110，用ptrpH-UB-E1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌;用ptrpH-UB-E2N轉(zhuǎn)化的大腸桿菌以及用KHCV-LBC1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌;和含Lucky1.1和Lucky1.2雜交瘤細(xì)胞系的Lucky1C。
雖然本發(fā)明已描述了某些特定的實(shí)施例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到它可進(jìn)行各種明顯的改動(dòng)和變化，但均落入本發(fā)明限定的權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種含其自身片段的朝鮮型C型肝炎病毒(KHCV)cD-NA。
2.如權(quán)利要求1中的KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架分別在842，849和853氨基酸數(shù)目處編碼苯丙氨酸，亮氨酸和蘇氨酸。
3.如權(quán)利要求2中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一種多肽，其氨基酸的序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro His Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Phe Ile Trp Trp Leu GlnTyr Leu Ile Thr Arg Thr Glu Ala His LeuGln Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Val Ile Leu Leu ThrCys Ala Val Tyr Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Leu Leu Leu Ala Thr Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Leu IleArg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ser Gly LeuIle Arg Ala Cys Met Leu Val Arg Lys ValAla Gly Gly His Tyr.
4.如權(quán)利要求2中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一種多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro His Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Phe Ile Trp Trp Leu GlnTyr Leu Ile Thr Arg Thr Glu Ala His LeuGln Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu AlaCys Ala Val His Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Ser Ile IleArg Val Pro Tyr Ser Val Arg Ala Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg LysAla Ala Gly Gly His Tyr.
5.如權(quán)利要求2中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一種多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro His Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Phe Ile Trp Trp Leu GlnTyr Leu Ile Thr Arg Thr Glu Ala His LeuGln Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu ThrCys Val Val His Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Ser Ile IleArg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg LysVal Ala Gly Gly His Tyr.
6.如權(quán)利要求2中KHCVcDNA，它的敞開閱讀框架編碼一種多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro His Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Phe Val Trp Trp Leu GlnTyr Leu Ile Thr Arg Thr Glu Ala His LeuGln Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Thr Leu Leu ThrCys Val Val His Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Tyr Leu Leu Ala Ile Phe GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Ile ThrArg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg LysVal Ala Gly Gly His Tyr.
7.如權(quán)利要求2中KHCV cDNA是指KHCV-LBC1。
8.如權(quán)利要求2中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼分別在842，849和853氨基酸數(shù)目處編碼亮氨酸苯丙氨酸和丙氨酸。
9.如權(quán)利要求8中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一條多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Phe Thr Leu Ser Pro His Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu GlnTyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His LeuGln Val Trp Ile Pro Pro Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu ThrCys Ala Val His Ser Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Leu ThrArg Val Pro Tyr Phe Val Ser Ala Gln GlyLeu Ile.
10.如權(quán)利要求8中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一條多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu GlnTyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His LeuGln Val Trp Ile Pro Pro Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu AlaCys Ala Val His Pro Glu Pro Ile Phe AspIle Thr Lys Tyr Leu Leu Ala Ile Phe GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Ile ThrArg Val Pro Tyr Phe Trp Arg Aal Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Ala Arg LysVal Ala Gly Gly His Tyr.
11.如權(quán)利要求8中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一條多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro His Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Leu Met Trp Trp Leu GlnTyr Phe Leu Thr Arg Ala Glu Ala His LeuGln Val Trp Val Pro Ser Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu ThrCys Ala Val Tyr Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Leu Leu Leu Ala Thr Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln ala Gly Leu ThrArg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg LysVal Val Gly Gly His Tyr.
12.如權(quán)利要求8中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一條多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys ValLeu Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu GlnTyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His LeuGln Val Trp Ala Pro Pro Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu MetCys Val Val His Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Ile Leu Leu Ala Val Leu GlyPro Leu Thr Val Leu Gln Ala Gly Ile ThrArg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln TrpLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg AsnIle Ala Gly Gly His Tyr.
13.如權(quán)利要求8中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一條多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro His Tyr Lys ValPhe Leu Ala Ser Leu Met Trp Trp Leu GlnTyr Phe Leu Thr Arg Ala Glu Ala His LeuGln Val Trp Val Pro Ser Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu ThrCys Ala Val Tyr Pro Glu Leu Ile Leu AspIle Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Ser Ile IleArg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg LysAla Ala Gly Gly His Tyr.
14.如權(quán)利要求8中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一條多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro His Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Leu Thr Trp Trp Leu GlnTyr Phe Leu Thr Arg Ala Glu Ala His LeuGln Val Trp Val Pro Ser Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu ThrCys Ala Val Tyr Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Leu Leu Leu Ala Thr Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Leu ThrArg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg LysVal Ala Gly Gly His Tyr.
15.如權(quán)利要求8中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一條多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu GlnTyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His LeuGln Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu ThrCys Ala Val Tyr Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Ser Ile IleArg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg LysAla Ala Gly Val Asn Tyr.
16.如權(quán)利要求8中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一條多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Phe Thr Leu Ser Pro His Cys Lys ValPhe Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu GlnTyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His LeuGln Val Trp Ile Pro Pro Leu Asn Val ArgGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu AlaCys Ala Val His Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Ser Ile IleArg Val Pro Tyr Leu Tyr Arg Ala Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg LysAla Ala Gly Gly His Tyr.
17.如權(quán)利要求8中KHCV cDNA，它的敞開閱讀框架編碼一條多肽，其氨基酸序列為L(zhǎng)eu Phe Asn Leu Ser Pro His Tyr Lys ValPhe Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu GlnTyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His LeuGln Val Trp Ile Pro Pro Leu Asn Val GlnGly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu AlaCys Ala Val His Pro Glu Leu Ile Phe AspIle Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Leu GlyPro Leu Met Val Leu Gln Ala Ser Ile IleArg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln GlyLeu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg LysAla Ala Gly Gly His Tyr.
18.一條編碼KHCV表位決定簇的多肽。
19.一個(gè)重組表達(dá)載體，含有權(quán)利要求18中多核苷酸的敞開閱讀框架的，其中，敞開閱讀框架能操作連接一個(gè)調(diào)節(jié)序列，該序列與所選宿主生物體相匹配。
20.如權(quán)利要求19中的載體，其中敞開閱讀框架含有一個(gè)與權(quán)利要求18中多核苷酸融合的編碼ubiquitine的多核苷酸。
21.如權(quán)利要求20中的載體是指下列酵母表達(dá)載體
22.如權(quán)利要求20中的載體是指下列大腸桿菌表達(dá)載體ptrpH-UB-CORE14，ptrpH-UB-CORE22，ptrpH-UB-KHCV897，ptrpH-UB-E2N或ptrpH-UB-E2C。
23.如權(quán)利要求19中的載體，其中敞開閱讀框架含有一個(gè)與權(quán)利要求18中多核苷酸融合的編碼一個(gè)麥芽糖結(jié)合蛋白的多核苷酸。
24.如權(quán)利要求23中的載體是指下列大腸桿菌表達(dá)載體pMAL-KHCV 426，pMAL-KHCV 555，pMAL-KHCV 513，pMAL-KHCV 810，pMAL-KHCV 789，pMAL-KHCV 754，pMAL-KHCV 652，pMAL-KHCV 403，pMAL-KHCV 271，pMAL-KHCV 495，或pMAL-KHCV 494。
25.一種由權(quán)利要求19中的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求25中的宿主細(xì)胞是指由權(quán)利要求21中載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求25中的宿主細(xì)胞是指由權(quán)利要求22中載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求25中的宿主細(xì)胞是指權(quán)利要求22中載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。
29.一條含與KHCV上的一個(gè)表位決定簇具有相同免疫學(xué)作用的表位決定簇的多肽。
30.如權(quán)利要求29中的多肽，是一個(gè)重組的KHCV多肽。
31.如權(quán)利要求29中的多肽，是由權(quán)利要求1中cDNA及其片段編碼。
32.如權(quán)利要求30中的多肽，是一個(gè)含有一段KHCV多肽的融合多肽。
33.如權(quán)利要求29中的多肽，是由權(quán)利要求25中的宿主細(xì)胞生產(chǎn)的。
34.如權(quán)利要求33中的多肽，是指下列蛋白KHCV-UB 897蛋白，KHCV 897蛋白，UB E1蛋白，KHCV 403蛋白，KHCV CORE 14蛋白，KHCV 573蛋白，KHCV UB CORE 17蛋白，E2N蛋白，E2C蛋白，UB-E2N蛋白，UB-E2C蛋白，KHCV 426蛋白，KHCV 555蛋白，KHCV 513蛋白，KHCV 810蛋白，KHCV 798蛋白，KHCV 271蛋白，KHCV 754蛋白，KHCV 652蛋白，KHCV 403蛋白，KHCV 495蛋白和KHCV 494蛋白。
35.一條純化的KHCV多肽。
36.如權(quán)利要求35中的多肽是指下列蛋白KHCV403蛋白，KHCV CORE 14蛋白，KHCVUB 897蛋白，KHCV UB CORE 17蛋白，UB E1蛋白，UB-E2N蛋白，UB-E2C蛋白，KHCV UB-CORE 14蛋白和KHCV 897蛋白。
37.用于生產(chǎn)權(quán)利要求29中多肽的方法，包括在允許所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求25中的宿主細(xì)胞。
38.一種檢測(cè)待檢樣品中針對(duì)KHCV抗原的抗體的診斷試劑，該樣品中含有做為活性組份的如權(quán)利要求29中所述的多肽。
39.如權(quán)利要求中38中的診斷試劑，包括權(quán)利要求29至權(quán)利要求36中兩個(gè)或以上多肽。
40.如權(quán)利要求38中的診斷試劑包括從KHCV UB-CORE14蛋白，KHCV897蛋白和KHCV403蛋白的中選出的一種或一個(gè)以上的多肽。
41.一種含權(quán)利要求38中的診斷試劑的診斷試劑盒。
42.一種用于檢測(cè)待檢樣品中針對(duì)KHCV抗原的抗體的診斷方法，其步驟為(a)吸附一種多肽至一種固相支持物上，這種多肽完全與在KHCV包含的表位決定簇具有相同的免疫活性;(b)將待檢樣品加至所述的固相支持物上形成抗原抗體復(fù)合物;以及(c)確定復(fù)合物的量。
43.如權(quán)利要求42中的診斷方法，其中權(quán)利要求41中的試劑盒被用在每一步驟中。
44.如權(quán)利要求43中的診斷方法，其中試劑盒含有權(quán)利要求40中的診斷試劑。
45.一種針對(duì)KHCV表位決定簇的單克隆抗體。
46.如權(quán)利要求45中的抗體，它包括在一個(gè)IgG亞類。
47.如權(quán)利要求45中的抗體，是針對(duì)KHCV897蛋白。
48.如權(quán)利要求47中抗體，與下列氨基酸的序列具有免疫反應(yīng)性 Ala Val Glu Phe Ile Pro Val Glu Ser MetGlu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe ThrAsp Asn Pro Ser Pro Pro Ala Val Pro GlnThr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala ProThr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Arg Val ProAla Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys ValLeu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala ThrLeu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys AlaHis Gly Ile Asp Pro Asn Leu Arg Thr GlyVal Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala.
49.如權(quán)利要求47中的抗體，與下列氨基酸的序列具有免疫反應(yīng)性Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala IlePro Ile Glu Ala Ile Lys Gly Gly Arg HisLeu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys CysAsp Glu Leu Ala Ala Lys Leu.
50.一株生產(chǎn)針對(duì)一個(gè)KHCV表位決定簇的細(xì)胞系。
51.如權(quán)利要求50中的細(xì)胞株是指Lucky1.1和Lucky1.2細(xì)胞株。
52.一種檢測(cè)樣品中KHCV表位決定簇的診斷試劑，該樣品含有的作為活性成份的權(quán)利要求45中的抗體。
53.一種使用權(quán)利要求52中的診斷試劑檢測(cè)待檢樣品中KHCV表位決定簇的方法。
54.一種用于治療或預(yù)防KHCV感染的疫苗，它包括一種滅活性的純化KHCV。
55.一種用于治療或預(yù)防KHCV感染的疫苗，包括用做為活性組份的權(quán)利要求37中的方法制備的多肽。
56.如權(quán)利要求55中的疫苗，包括由E2N或/和E2C蛋白作為活性成份。
57.一種用于檢測(cè)待檢樣品中KHCV的多核苷酸的試劑盒，包括源自KHCV cDNA的8或8個(gè)以上核苷酸序列。
58.一種檢測(cè)待檢樣品中KHCV的多核苷酸的方法，該法使用了權(quán)利要求58中的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了源自稱為KHCV的新型C型肝炎病毒cDNA制備的多核苷酸，和由此編碼的多肽以及針對(duì)這些多肽的抗體。此外也提供了用上述任何材料作為活性成分制備的診斷試劑和疫苗。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1068335SQ92104338
公開日1993年1月27日 申請(qǐng)日期1992年6月10日 優(yōu)先權(quán)日1991年6月10日
發(fā)明者曹重明, 李庸范, 林國(guó)鎮(zhèn), 蘇弘燮, 金成澤, 樸榮祜, 崔德永, 金天炯, 梁宰榮 申請(qǐng)人:吉祥有限公司