專利名稱：能改變大豆油的質(zhì)量和功能的新型基因組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能產(chǎn)生大豆種子的新型脂類組成的新型基因組合，以及由所述大豆種子中提取的油類。所述新型大豆基因組合可以作為一種替代方案，代替生產(chǎn)更加昂貴的油類，以及代替對(duì)油類進(jìn)行化學(xué)改性以便提供特殊的功能品質(zhì)和保健作用。
背景技術(shù)：
植物脂類具有多種工業(yè)和營養(yǎng)用途，并且在植物膜功能和氣候適應(yīng)方面起著重要作用。所述脂類具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)決定了所述脂類的生理學(xué)和工業(yè)特性。上述結(jié)構(gòu)中的很多種是由于能改變所述脂類的不飽和度的代謝過程直接或間接產(chǎn)生的。在不同植物中的不同代謝方式產(chǎn)生了上述不同的脂類，并且為了經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)大量的所需脂類，需要對(duì)外來的植物種進(jìn)行馴化或?qū)r(nóng)藝改良的種進(jìn)行改進(jìn)。
植物脂類主要以三酰甘油形式用作食用油。食用油的具體特性和保健作用主要是由其脂肪酸的組成決定的。源于商業(yè)植物品種的大部分植物油主要是由棕櫚酸(16∶0)，硬脂酸(18∶0)，油酸(18∶1)，亞油酸(18∶2)和亞麻酸(18∶3)組成。棕櫚酸和硬脂酸分別是長16-和18-C的飽和脂肪酸。油酸、亞油酸和亞麻酸是分別含有一個(gè)、兩個(gè)、和三個(gè)雙鍵的18-C的不飽和脂肪酸。油酸被稱作單不飽和脂肪酸，而亞油酸和亞麻酸被稱作多不飽和脂肪酸。常用的食用植物油中的飽和和不飽和脂肪酸的相對(duì)量歸納如下(表1)。
表1在選定油類作物的油中的飽和和不飽和脂肪酸的百分比
最近的很多研究都檢查了飽和和不飽和脂肪酸在減輕冠狀心臟病的危害方面的作用。在過去，人們相信單不飽和脂肪酸與飽和和多不飽和脂肪酸不同，對(duì)血清膽固醇和冠狀心臟病的危害沒有影響。若干最近的人類臨床研究表明，高的單不飽和脂肪和低的飽和脂肪的飲食可以減少“不好的”(低密度脂蛋白)膽固醇，同時(shí)保持“好的”(高密度脂蛋白)膽固醇(Mattson等(1985)脂類研究雜志26194-202)。
總的飽和脂肪酸低而單不飽和脂肪酸高的植物油，可以為消費(fèi)者提供明顯的保健好處，同時(shí)，能為油類加工者帶來經(jīng)濟(jì)上的利益。例如，canola油被認(rèn)為是一種很有保健作用的油。不過，在使用時(shí)，canola油中的大量的多不飽和脂肪酸會(huì)使得這種油不穩(wěn)定，容易氧化，并且容易產(chǎn)生另人討厭的氣味和味道(Gailliard(1980)植物生物化學(xué)4卷，85-116頁，Stumpf,P.K.著，學(xué)術(shù)出版社，紐約)。通過氫化作用可以降低多不飽和脂肪酸的含量，但該工藝的費(fèi)用以及營養(yǎng)上成問題的剩余不飽和脂肪酸的反式異構(gòu)體雜質(zhì)的產(chǎn)生，降低了氫化油類的總體優(yōu)點(diǎn)(Mensink等(1990)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志N323439-445)。如上面的表1所示，大豆油存在類似的問題，商業(yè)大豆油通常含有超過canola油兩倍以上的飽和脂肪含量。
突變育種方法業(yè)已在改變農(nóng)業(yè)品種的食用油中的多不飽和脂肪酸含量方面取得了某些成功。商業(yè)種植品種的例子有高(85％)油酸向日葵和低(2％)亞麻酸亞麻(Knowles(1980)世界脂肪和油類工業(yè)加工生物技術(shù)大會(huì)，Applewhite,T.H著，美國油類化學(xué)家協(xié)會(huì)，35-38頁)。用表1所示其他植物進(jìn)行的類似的商業(yè)方法是另人困惑的，這主要是由于該方法的困難性質(zhì)，以及突變方法對(duì)植物硬度、產(chǎn)量潛力以及低多不飽和性狀的環(huán)境不穩(wěn)定性的多效影響?？傊?，由于不能在不同的季節(jié)以及不同的地點(diǎn)穩(wěn)定地生產(chǎn)具有特定組成的油類，使得低多不飽和大豆油的商業(yè)生產(chǎn)無法實(shí)現(xiàn)。
一種用于決定以定向方式向大豆種子的組成脂類中引入第二個(gè)(國際專利公開號(hào)WO94/11516)和第三個(gè)(國際專利公開號(hào)WO93/11245)雙鍵的酶的表達(dá)方法的發(fā)現(xiàn)，使得人們能夠生產(chǎn)具有高的單不飽和脂肪酸，極低的多不飽和脂肪酸含量，特別是極低的亞麻酸含量的大豆。在本發(fā)明中披露的以上兩種轉(zhuǎn)基因特征的遺傳組合，產(chǎn)生了具有低的多不飽和脂肪酸和高的單不飽和脂肪酸和種子脂肪酸的極高度的環(huán)境穩(wěn)定性特征的大豆品系。
業(yè)已披露了通過突變育種(Erickson,E.A.等(1994)遺傳雜志79465-468；Schnebly,S.R.等(1994)作物科學(xué)34829-833；和Fehr,W.R.等(1991)作物科學(xué)3188-89)和轉(zhuǎn)基因改良(US5530186)產(chǎn)生的具有較低含量飽和脂肪酸的大豆。由于在本發(fā)明的單一大豆品系中證實(shí)了以上兩種特征的組合，可以生產(chǎn)出具有高的單不飽和脂肪酸、低的飽和脂肪酸油的保健優(yōu)點(diǎn)的大豆。
盡管從提供保健飲食的角度考慮，具有低的飽和脂肪酸含量的油類是理想的，但在某些食品中需要室溫下為固體的脂肪的功能特性。所述用途包括人造奶油和糊狀制品的生產(chǎn)，以及在糖果和烘烤中的多種用途。很多動(dòng)物和乳品脂肪具有必須的物理特性，但它們同時(shí)含有膽固醇和生膽固醇的中等鏈脂肪酸。用作固體脂肪用途的理想的甘油三酯應(yīng)當(dāng)含有大量的熔點(diǎn)極高的長鏈脂肪酸硬脂酸，以及平衡的單不飽和脂肪酸和很少量的多不飽和脂肪。天然植物固體脂肪級(jí)份通常具有這樣的甘油三酯結(jié)構(gòu)飽和脂肪酸占據(jù)該甘油三酯的sn-1和sn-3位置，而不飽和脂肪酸占據(jù)sn-2位置。這種總體上的脂肪酸組成和甘油三酯結(jié)構(gòu)，能產(chǎn)生最佳的固體脂肪結(jié)晶結(jié)構(gòu)和最大的熔點(diǎn)，具有少量的飽和脂肪酸含量。
這種高熔點(diǎn)植物脂肪的天然脂肪原型是可可脂?？煽芍闹舅峤M成為26％棕櫚酸(16∶0)，34％硬脂酸(18∶0)，35％油酸(18∶1)，和3％亞油酸(18∶2)。這種脂肪酸組成使得可可脂的熔點(diǎn)為25-36℃，這要取決于其精確的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。由于可可脂的高價(jià)格，以及供應(yīng)的不穩(wěn)定，導(dǎo)致了若干生產(chǎn)可可脂替代品和人造奶油原料的方法，該方法通過分離具有較高18∶0含量的其他油類或?qū)Ω叩亩嗖伙柡椭舅嵊瓦M(jìn)行催化氫化，然后分離該制品而完成。
能夠直接生產(chǎn)高的硬脂酸，低的多不飽和脂肪酸油類的油用種子的優(yōu)點(diǎn)是，可以避免氫化作用的成本，以及氫化作用的不理想的副產(chǎn)品--反式單不飽和脂肪酸。另外，如果所生產(chǎn)的植物脂肪的熔點(diǎn)范圍足夠高的話，還可以使得上述分離工藝的成本更經(jīng)濟(jì)或者可以取消該步驟。
業(yè)已對(duì)植物中油類的生物合成做過充分的研究(參見Harwood(1989)植物科學(xué)重點(diǎn)綜述，8(1)卷1-43)。棕櫚酸、硬脂酸和油酸的生物合成是在質(zhì)體中由“ACP”途徑上的三種重要的酶相互作用進(jìn)行的棕櫚酰-ACP延伸酶，硬脂酰-ACP脫飽和酶和?；?ACP硫酯酶。
在以上三種類型的酶中，?；?ACP硫酯酶起到從載體蛋白(ACP)上除去?；湹淖饔?，并因此將其從該代謝途徑中除去。油酰-ACP硫酯酶以較高的速度催化油酰-ACP硫酯的水解，不過它還能以更低的速度催化棕櫚酰-ACP和硬脂酰-ACP的水解。這種多重活性導(dǎo)致了這些酶之間的底物競(jìng)爭(zhēng)，正是由于酰基-ACP硫酯酶和棕櫚酰-ACP延伸酶對(duì)同一種底物的競(jìng)爭(zhēng)以及?；?ACP硫酯酶和硬脂酰-ACP脫飽和酶對(duì)同一種底物的競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致了存在于植物油中的甘油三酯中的棕櫚酸和硬脂酸的產(chǎn)生。
脂肪酸一旦從ACP途徑中除去，就被外排到細(xì)胞質(zhì)中，在這里將其用于合成脂酰輔酶A。所述脂酰輔酶A是至少三種不同甘油?；?甘油-3-P酰基轉(zhuǎn)移酶，1-酰基-甘油-3-P?；D(zhuǎn)移酶和二?；视王；D(zhuǎn)移酶)的?；w，它能在油類的生物合成過程中將?；糠纸Y(jié)合到三酰甘油上。
所述酰基轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出明顯的結(jié)合在飽和脂肪酸的sn-1和sn-3位置和單不飽和脂肪酸的甘油三酯的sn-2位置的傾向，但不是絕對(duì)的。因此，改變酰基來源的脂肪酸組成，會(huì)導(dǎo)致相關(guān)油類的脂肪酸組成的相應(yīng)改變。另外，有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，正是因?yàn)檫@種專一性，使得植物能夠產(chǎn)生可可脂替代物或其他特殊脂肪，如果在?；D(zhuǎn)移酶的底物庫中有正確的脂肪酸組成存在的話[Bafor等(1990)JAOCS67217-225]。
根據(jù)以上說明，改變植物油中棕櫚酸、硬脂酸和油酸含量的一種方法是改變其在細(xì)胞質(zhì)脂酰輔酶A庫中用于油類生物合成的含量。
業(yè)已披露了對(duì)硬脂酸含量的控制(Knutzon,D.S.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(7)2624-2628)。通過用種子專一性啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行編碼蕓苔硬脂酰-ACP脫飽和酶(這種酶負(fù)責(zé)將第一個(gè)雙鍵導(dǎo)入植物中的18C的脂肪酸中)的cDNA的反義表達(dá)，生產(chǎn)蕓苔和歐洲油菜植物的種子。與來自相同物種的未改良的植物的種子相比，上述種子能產(chǎn)生硬脂酸含量高的油類，同時(shí)，還含有較高含量的亞麻酸(18∶3)。在大豆中通過硬脂酰-ACP脫飽和酶的類似的低水平表達(dá)(US5443674)，以及在canola中進(jìn)行酰基-ACP硫脂酶的超量表達(dá)(US5530186)獲得了較高含量的硬脂酸。突變育種業(yè)已產(chǎn)生了在其種子油中具有較高含量硬脂酸的大豆品系(Graef,G.L.等(1985),JAOCS62773-775；Hammond,E.G.和W.R.Fehr(1983)作物科學(xué)23192-193)。
多不飽和脂肪酸形成了液體植物油的低熔點(diǎn)。在高飽和油類中其存在是有害的，因?yàn)樗芙档腿埸c(diǎn)，并因此需要更大量的不理想的飽和脂肪酸來獲得在室溫下的塑性脂肪。另外，在用于烘烤和糖果業(yè)時(shí)，大量的多不飽和脂肪酸會(huì)導(dǎo)致上文所述的液體油的氧化不穩(wěn)定性。因此，為了具有最大的利用價(jià)值，在大豆中產(chǎn)生的高不飽和脂肪應(yīng)當(dāng)含有飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和盡量少的多不飽和脂肪酸。本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的基因組合，使大豆具有符合上述標(biāo)準(zhǔn)的新型脂肪酸特征。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量大于21％，C18∶1的含量大于60％，而C18∶2和C18∶3的組合含量低于7％。
在第二種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0的含量大于10％，C16∶0和18∶0的組合含量大于30％，C18∶1的含量大于55％，而C18∶2和C18∶3的組合含量低于7％。
在第三種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量大于42％，其中，所述植物是通過以下步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，其中，所述第一親本的C18∶0的含量占總的種子脂肪酸的至少10％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼油酰-ACP硫酯酶的核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本含有決定較高的種子硬脂酸含量的fasa等位基因；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
在第四種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量低于7％，C18∶1的含量大于87％，而C18∶2和C18∶3的組合含量低于6％。
在第五種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量低于12％，C18∶1的含量大于84％，而C18∶2和C18∶3的組合含量低于5％。
在第六種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用由本發(fā)明的上述大豆植物生產(chǎn)的高硬脂酸、或高硬脂酸和高油酸油生產(chǎn)人造奶油和/或糊狀制品。另外，通過對(duì)所述油類進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解所生產(chǎn)的制品可用于以混合或非混合形式生產(chǎn)人造奶油和/或糊狀制品。
在第七種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用由本發(fā)明所披露的大豆植物生產(chǎn)的高硬脂酸、或高硬脂酸和高油酸油與其他油類混合生產(chǎn)人造奶油和/或糊狀制品。另外，通過對(duì)所述油類進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解所生產(chǎn)的制品，可用于以混合或非混合形式生產(chǎn)人造奶油和/或糊狀制品。
生物學(xué)保藏物以下大豆種子業(yè)已交由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801Boulevard大學(xué)，Manassas,VA20110-2209)保藏，并擁有以下名稱、保藏號(hào)和保藏日期。大豆 保藏號(hào) 保藏日期大豆T1S ATCC203033 1998年5月14日大豆L9216116-109ATCCXXXXXX 1999年4月？？附圖簡(jiǎn)述和序列說明通過下面的詳細(xì)說明可以更全面地理解本發(fā)明，對(duì)四幅附圖的說明以及序列說明構(gòu)成了本申請(qǐng)的一部分。


圖1表示高硬脂酸和四種不同的高硬脂酸和高油酸大豆油與軟管植物油糊狀制品的固體脂肪含量(SFC)曲線。只有22％的高硬脂酸和高油酸(HS/HO A)的特性與糊狀制品一樣。其余的油的SFC曲線表明這些油的特性與糊狀制品不一樣。
圖2表示若干種非混合的和混合的油類的相對(duì)氧化穩(wěn)定性(OSI)。為了獲得高的氧化穩(wěn)定性，高的油酸含量和低的多不飽和脂肪酸含量是必需的。諸如大豆油(SO)與棕櫚酸(PO)，或高硬脂酸(HS)油與棕櫚油混合油或全氫化油的性能與人造奶油或糊狀制品的SFC特征一樣好。
圖3表示將高硬脂酸和高油酸油(HS/HO C和HS/HO D)與諸如棕櫚油或全氫化大豆油的硬漿混合，改善其SFC特征，以便與植物油糊狀制品的特征一致。
圖4表示極高含量硬脂酸油的SFC特征與黃油和硬漿油的特征一致。
序列說明歸納了后面所附的序列表。序列表包括核苷酸序列符號(hào)的單字母密碼和氨基酸序列的三字母密碼，如在披露于核酸研究133021-3030(1985)和生物化學(xué)雜志219(No.2)345-373(1984)中所披露的IUPAC-IUB標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的，而用于所有核苷酸和氨基酸序列資料的符號(hào)和格式進(jìn)一步與在37C.SR.§1.821-1.825和WIPO標(biāo)準(zhǔn)St.25中所規(guī)定的專利申請(qǐng)的有關(guān)核苷酸和/或氨基酸序列公布的規(guī)定一致。核苷酸序列從5’到3’閱讀。
序列1表示源于歐洲油菜的?；?ACP硫脂酶的1412bp的cDNA。
序列2表示歐洲油菜種子酰基-ACP硫脂酶的前體蛋白的氨基酸序列(序列1的編碼序列)。
序列3表示源于歐洲油菜的第二種?；?ACP硫脂酶cDNA的核苷酸序列，相當(dāng)于GenBank保藏號(hào)U17098。
序列4表示第二種歐洲油菜種子?；?ACP硫脂酶的前體蛋白的氨基酸序列(序列3的編碼序列)。
發(fā)明詳述通過篩選天然變異、突變育種和遺傳工程，發(fā)現(xiàn)了能改變油的品質(zhì)的多種新的大豆基因。含有上述新型基因的某些大豆品系或組合被用于本文中，并在表2中的“基因組合或品系名稱”一欄中涉及。
表2具有不同的脂肪酸修飾基因的大豆的典型的脂肪酸特征基因組合或品系各種脂肪酸含量(總的種子脂肪酸含量的參考文獻(xiàn)名稱1％)16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3野生型12 4 25 51 7T1S 16 10 19 47 7 本申請(qǐng)的例11D2T 73 85 1 3 WO94/11516D3A 10 5 32 49 3 WO93/11245fan 11 3 45 36 4 US5,534,425fap1 84 28 52 8 US5,585,535fap2 16 4 19 53 8 US5,850,029fap3 73 26 53 11US5,585,535fap1xfap3 43 22 63 8 US5,585,535fasa 823 26 35 7 US5,557,037L9216116-109 922 15 48 5 本申請(qǐng)的例3N85-2176 11 3 42 40 4 Kuhr等，1987年3月26日，USDA農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)HST1 928 15 43 5 本申請(qǐng)的例3HO2 11 3 45 37 4 本申請(qǐng)的例3HO4 11 3 45 37 4 本申請(qǐng)的例3T2T 32 17 65 12WO9606936，本申請(qǐng)的例13用于該表中的基因代碼的含義如下T1S是指油酰AP硫脂酶表達(dá)結(jié)構(gòu)，它呈有義取向，并且能表達(dá)一種有功能的酶。D2T是指Δ-12脫飽和酶結(jié)構(gòu)，它呈有義取向，該結(jié)構(gòu)的整合會(huì)導(dǎo)致活性的降低。D3A是指Δ-15脫飽和酶結(jié)構(gòu)，它呈反義取向，該結(jié)構(gòu)的整合會(huì)導(dǎo)致活性的降低。fan是指能決定較低的種子亞麻酸含量的基因。fap1是指決定較低的種子棕櫚酸含量的基因。fap2是指決定較高的種子棕櫚酸含量的基因。fap3是指決定較低的種子棕櫚酸含量的基因。fasa是指決定較高的種子硬脂酸含量的基因。L9216116-109是指源于系譜(HST1*(HO2*HO4))*野生型的、具有高的硬脂酸含量的品系。HST1是指源于N85-2176的高硬脂酸突變型品系。HO2是指源于N85-2176的高油酸突變型品系。HO4是指源于A5的高油酸突變型品系。T2T是指棕櫚酰-ACP硫脂酶結(jié)構(gòu)，它呈有義取向，該結(jié)構(gòu)的整合會(huì)導(dǎo)致活性的降低。
在本說明書中，將使用到多種術(shù)語?！盎颉笔侵改鼙磉_(dá)一種特定蛋白的核酸片段，包括位于編碼序列前面(5’非編碼序列)和后面(3’非編碼序列)的調(diào)控序列?！疤烊换颉笔侵柑烊淮嬖诘木哂衅渥陨淼恼{(diào)控序列的基因?！扒逗匣颉笔侵杆械姆翘烊换?，包括在天然狀態(tài)下不同時(shí)存在的調(diào)控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者調(diào)控序列和編碼序列源于相同來源，但其排列方式不同于天然狀態(tài)?！稗D(zhuǎn)基因”是通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組的基因。
本文所使用的“遺傳學(xué)基因座”是指基因在染色體或染色體組上的位置。本文所使用的術(shù)語“等位基因”是指一種遺傳學(xué)基因座的所有替代形式。本文所使用的術(shù)語“表達(dá)”是指產(chǎn)生有功能的最終產(chǎn)物。基因的表達(dá)或超量表達(dá)涉及基因的轉(zhuǎn)錄以及將mRNA翻譯成前體蛋白或成熟蛋白。“反義抑制”是指產(chǎn)生能夠抑制所述靶蛋白表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物。超量表達(dá)是指在轉(zhuǎn)基因生物中基因產(chǎn)物的產(chǎn)量超過了在正?；蚍寝D(zhuǎn)化生物中的產(chǎn)量?！肮惨种啤笔侵概c內(nèi)源基因具有明顯同源性的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)導(dǎo)致了異位基因和內(nèi)源基因表達(dá)的抑制。
“改變了的表達(dá)”是指在轉(zhuǎn)基因生物中，基因產(chǎn)物的產(chǎn)生量或比例明顯不同于在野生型生物的相應(yīng)組織(器官和發(fā)育類型)中的活性。
本文所使用的術(shù)語“環(huán)境穩(wěn)定的”或“環(huán)境穩(wěn)定性”被用于描述一種表現(xiàn)型，該表現(xiàn)型無論植物生長的環(huán)境條件如何都比較穩(wěn)定。
“轉(zhuǎn)化”是指將一種核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物的基因組中，產(chǎn)生遺傳學(xué)上穩(wěn)定的遺傳。含有所述轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物被稱作“轉(zhuǎn)基因”生物。植物轉(zhuǎn)化方法的例子包括農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(De Blaere等(1987)酶學(xué)方法153277)和粒子加速或“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein等(1987)自然(倫敦)32770-73；US49450505)。
本文所使用的“大豆”是指大豆(Glycine max)、野大豆(Glycinesoja)，或任何能與大豆(Glycine max)進(jìn)行有性雜交的品種?！捌废怠笔侵妇哂邢嗨朴H本的一類植物，這些植物在不同的個(gè)體之間至少在一種性狀上具有很小的遺傳變異或沒有遺傳變異。所述品系可以通過一代或幾代自花授粉和選擇形成，或者由單一親本無性繁殖，包括組織或細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)?！稗r(nóng)藝上的優(yōu)良品系”或“優(yōu)良品系”是指具有理想的可以或不可以進(jìn)行商業(yè)應(yīng)用的農(nóng)藝特性的品系。“品種”、“栽培品種”、“優(yōu)良品種“、或”優(yōu)良栽培品種“是指農(nóng)藝上突出的優(yōu)良品系，業(yè)已對(duì)該品系做過充分的實(shí)驗(yàn)，并且正被用于或已經(jīng)被用于商業(yè)大豆生產(chǎn)?！巴蛔儭笔侵覆皇怯煞蛛x或遺傳重組導(dǎo)致的可檢測(cè)的、并且可遺傳的遺傳學(xué)改變(自主型或誘導(dǎo)型)。“突變體”是指具有突變的個(gè)體或個(gè)體譜系。在本文中，“F1群體”是指由一個(gè)品系與另一個(gè)品系異花授粉所產(chǎn)生的后代。本文用于說明所述異花授粉的格式是“母本*父本”?！癋2群體”是指F1植物的自花授粉后代?！癋2衍生的品系”或“F2品系”是由單個(gè)的F2植株自花授粉所得到的品系。F2衍生的品系可以通過重復(fù)的自花授粉并積累來自所述F2衍生品系的種子由后續(xù)世代(F3、F4、F5等)繁殖?！胺蛛x群體”是指由雜交所得到的植物群體，該群體處于F2自交階段或更后一些的階段。
本文所使用的術(shù)語“成熟種子”是指已經(jīng)不再是綠色的大豆，其水分含量低于20％，優(yōu)選低于12％。
本文所使用的的術(shù)語“脂肪產(chǎn)物”是指植物油，它呈天然(非氫化和非化學(xué)改性)形式，或氫化和/或化學(xué)改性形式，或由它所產(chǎn)生的天然(非氫化和非化學(xué)改性的)形式或氫化和/或化學(xué)改性形式的級(jí)份。
用于本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且更詳細(xì)地披露于Sambrook,J.Fritsch,E.F.和Maniatis,T.分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社冷泉港，1989(以下被稱為“Maniatis”)中。
本發(fā)明涉及具有新型氨基酸組成的大豆品系。
在第一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量大于21％，C18∶1的含量大于60％，C18∶2和C18∶3的組合含量低于7％。
具有上述氨基酸特征的大豆植物是通過以下步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，所述第一親本的C18∶1的含量至少占總的種子脂肪酸的80％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼Δ-12脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本含有能產(chǎn)生較高的種子硬脂酸含量的合適的轉(zhuǎn)基因，或諸如fasa等位基因的突變；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
同樣感興趣的是由所述植物獲得的種子，由所述種子獲得的油，通過對(duì)所述油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解所制備的產(chǎn)品以及在生產(chǎn)這種油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。另外，本發(fā)明還涉及用所述油和用由所述油的氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解所制成的產(chǎn)品以混合的或非混合的形式制成人造奶油或糊狀制品。
在第二種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0的含量大于10％，C16∶0和C18∶0的組合含量大于30％，C18∶1的含量大于55％，而C18∶2和C18∶3的組合含量低于7％。
具有上述氨基酸特征的大豆植物是通過以下步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，所述第一親本的C18∶1的含量至少占總的種子脂肪酸的80％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼Δ-12脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本含有能增加種子中棕櫚酸和硬脂酸含量的嵌合轉(zhuǎn)基因，或者第二親本含有決定較高種子硬脂酸含量的諸如fasa的突變和決定較高種子棕櫚酸含量的fap2突變；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
同樣感興趣的是由所述植物獲得的種子，由所述種子獲得的油，通過對(duì)所述油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解所制備的產(chǎn)品以及在生產(chǎn)這種油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。另外，本發(fā)明還涉及用所述油和用由所述油的氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解所制成的產(chǎn)品以混合的或非混合的形式制成人造奶油或糊狀制品。
在第三種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量大于42％，其中，所述植物是由以下步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，其中，所述第一親本的C18∶0的含量占總的種子脂肪酸的至少10％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼油酰-ACP硫酯酶的核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本含有合適的轉(zhuǎn)基因或能產(chǎn)生較高種子硬脂酸含量的諸如fasa等位基因的突變；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
同樣感興趣的是由所述植物獲得的種子，由所述種子獲得的油，通過對(duì)所述油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解所制備的產(chǎn)品以及在生產(chǎn)這種油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。另外，本發(fā)明還涉及所述油，由所述油制成的制品，或由所述油制成的混合制品的用途，可將其用于生產(chǎn)人造奶油或糊狀制品。
在第四種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量低于7％，C18∶1的含量大于87％，而C18∶2和C18∶3的組合含量低于6％。
具有這種脂肪酸特征的大豆植物是通過以下步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，所述第一親本的C18∶1的含量至少占總的種子脂肪酸的80％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼Δ-12脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本(ⅰ)含有決定較低的種子棕櫚酸含量的fap1等位基因和決定較低的種子棕櫚酸含量的fap3等位基因，(ⅱ)含有編碼至少一個(gè)決定較低種子棕櫚酸含量的植物?；?ACP硫脂酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，其中，所述硫脂酶對(duì)棕櫚酰-ACP的優(yōu)勢(shì)至少超過硬脂酰-ACP或油酰-ACP的兩倍；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
同樣感興趣的是由所述植物獲得的種子，由所述種子獲得的油，通過對(duì)所述油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解所制備的產(chǎn)品以及在生產(chǎn)這種油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。
在第五種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量低于12％，C18∶1的含量大于84％，而C18∶2和C18∶3的組合含量低于5％。
具有這種脂肪酸特征的大豆植物是通過以下步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，其中，所述第一親本的C18∶1的含量至少占總的種子脂肪酸的80％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼Δ-12脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本包括決定較低的種子亞麻酸含量的諸如fan等位基因的突變，或者至少一個(gè)編碼Δ-15脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，另外，其中C18∶3的含量不足總的種子脂肪酸含量的4％；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
同樣感興趣的是由所述植物獲得的種子，由所述種子獲得的油，通過對(duì)所述油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解所制備的產(chǎn)品以及在生產(chǎn)這種油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。
用于組建決定本發(fā)明所述新型種子脂肪酸特征的特定基因型的一般方法如下1)通過人工方法將來自一種親本植物的花上的花粉，轉(zhuǎn)移到第二種親本植物的、去過雄的花上，對(duì)根據(jù)其種子脂肪酸特征選擇的親本系進(jìn)行異花授粉。
2)種植來自異花授粉的花的成熟種子，產(chǎn)生F1植株，讓該植株自花授粉產(chǎn)生含有不同劑量的參與產(chǎn)生以上兩種親本的種子脂肪酸表型的基因的種子的F2群體。
3)從不和胚軸直接接觸的子葉部分取出成熟種子的一個(gè)小的切片。通過披露于WO93/11245中的氣相液體層析法測(cè)定構(gòu)成種子脂類的5種主要脂肪酸的相對(duì)含量，種植根據(jù)分析過的切片的脂肪酸特征選擇的種子的其余部分。讓選擇的F2植株自交，并產(chǎn)生F3種子。用來自該世代的單一種子重復(fù)上述分析過程，并用來自該世代的混合種子集團(tuán)重復(fù)上述分析過程。
另外，可以在沒有預(yù)先選擇的情況下種植F2種子群體，并進(jìn)行自花授粉，對(duì)來自所產(chǎn)生的F2植株的單一植株的混合的種子進(jìn)行分析，以便根據(jù)單植株混合種子脂肪酸分析選擇F2∶3家族。
一旦鑒定到具有理想的脂肪酸特征的品系，就可以進(jìn)一步作為自花授粉的群體，以便保持并檢驗(yàn)所述種子脂肪酸特征。
為了生產(chǎn)同時(shí)具有高含量的油酸和低含量的多不飽和脂肪酸的品系，選擇WO97/40698中所披露的Δ-12脫飽和酶下調(diào)轉(zhuǎn)基因品系作為一個(gè)親本。為了生產(chǎn)多不飽和脂肪酸含量低，但飽和脂肪酸含量高的大豆品系，選擇含有會(huì)產(chǎn)生高含量硬脂酸的突變的大豆品系作為第二個(gè)親本。所述品系的一種例子披露于US5557037中，該專利的內(nèi)容被收作本文參考。上述專利披露的大豆品系A(chǔ)6攜帶位于被命名為fasa基因座的基因座上的突變。
為了生產(chǎn)同時(shí)具有高含量的油酸和極低含量飽和脂肪酸的品系，選擇Δ-12脫飽和酶下調(diào)轉(zhuǎn)基因品系作為一個(gè)親本，并選擇具有極低含量的棕櫚酸的品系作為第二個(gè)親本。一種方法是使用含有基因組合的第二親本，所述品系披露于US5585535中，該專利的內(nèi)容被收作本文參考。另一種方法是使用披露于WO96/06936中的品系作為第二親本，其中，所披露的棕櫚酰-ACP硫脂酶結(jié)構(gòu)呈有義取向，該結(jié)構(gòu)的整合會(huì)導(dǎo)致活性降低。
為了進(jìn)一步降低多不飽和脂肪酸--亞麻酸的含量并提高低的多不飽和脂肪酸表型的環(huán)境穩(wěn)定性，選擇Δ-12脫飽和酶下調(diào)轉(zhuǎn)基因品系作為一個(gè)親本，并選擇具有下調(diào)的Δ-15脫飽和酶表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系或具有類似的亞麻酸表型的突變品系作為第二親本。具有類似由Δ-15脫飽和酶下調(diào)所產(chǎn)生的亞麻酸表型的突變品系的例子披露于US5534425中，該專利的內(nèi)容被收作本文參考。
通過能產(chǎn)生高含量硬脂酸的種子的突變品系與攜帶編碼種子專一性超量表達(dá)的植物的?；?ACP硫脂酶的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因品系的組合生產(chǎn)了極高含量飽和脂肪酸的大豆種子。
用于提取并加工大豆種子以便生產(chǎn)大豆油和大豆粉的方法在大豆加工行業(yè)中是眾所周知的。一般，大豆油是用一系列步驟生產(chǎn)的，該方法實(shí)現(xiàn)了從含有油的種子中提取并純化可食用油類制品的目的。大豆油和大豆副產(chǎn)品是用下面的示意圖中所示的一般化步驟生產(chǎn)的。
工藝去除的雜質(zhì)/獲得的副產(chǎn)品 對(duì)大豆種子進(jìn)行清洗、加熱、去皮并壓碎，這能提高油提取的效率。油提取通常是用溶劑(己烷)提取完成的，但也可以通過機(jī)械加壓和/或溶劑提取組合完成。所得到的油被稱為粗油?？梢酝ㄟ^水合磷脂和其他極性和中性脂類復(fù)合物對(duì)所述粗油進(jìn)行脫膠，這有利于它們與非水合甘油三酯部分(大豆油)分離。所得到的卵磷脂膠可以做進(jìn)一步加工，以便制成具有重要商業(yè)價(jià)值的卵磷脂制品，該制品可用于多種食品和工業(yè)制品中，如乳化劑和分離(抗粘著)劑?？梢詫?duì)脫過膠的油做進(jìn)一步的精煉，以便除去雜質(zhì)；主要是除去游離脂肪酸、色素、和殘余膠質(zhì)。精煉是通過添加苛性劑實(shí)現(xiàn)的，所述苛性劑與游離脂肪酸反應(yīng)生成皂，并且水合所述粗油中的磷脂和蛋白。用水洗去在精煉期間形成的皂。所述皂類副產(chǎn)品可直接用于動(dòng)物飼料或者酸化以便回收游離脂肪酸。通過用漂白土吸附除去色素，這種土能除去大部分葉綠素和類胡蘿卜素化合物。精煉過的油可以進(jìn)行氫化，以便得到具有各種熔化特征和質(zhì)地的脂肪。防凍處理(分離)可用于從氫化的油中除去硬脂酸甘油酯，這一目的是通過在仔細(xì)控制的冷卻條件下結(jié)晶而實(shí)現(xiàn)的。脫臭處理主要是在真空條件下進(jìn)行蒸汽蒸餾完成的，它是最后一個(gè)步驟，并且被設(shè)計(jì)用于除去產(chǎn)生油的臭味或香味的化合物。其他有價(jià)值的副產(chǎn)品，如生育酚和固醇也可以在脫臭加工期間除去。含有上述副產(chǎn)品的脫臭餾出物可以出售，用于生產(chǎn)天然維生素E和其他高價(jià)值的藥用制品。精煉、漂白(氫化、分離)和脫臭的油和脂肪可以包裝并直接銷售或者進(jìn)一步加工成更特殊的制品。有關(guān)大豆種子加工，大豆油生產(chǎn)和副產(chǎn)品利用的更詳細(xì)的資料可以參見Erickson,1995，大豆加工和利用實(shí)踐手冊(cè)，美國油類化學(xué)家協(xié)會(huì)和聯(lián)合大豆董事會(huì)。
氫化是一種化學(xué)反應(yīng)，其中，在諸如鎳的催化劑的幫助下將氫添加到不飽和脂肪酸的雙鍵上。高油酸大豆油含有不飽和油酸、亞油酸、和亞麻酸脂肪酸，它們中的每一種都可以被氫化。氫化具有兩種主要作用。首先，由于降低了不飽和脂肪酸的含量而提高了油的氧化穩(wěn)定性，其次，由于脂肪酸的改性而改變了這種油的物理特性，提高其熔點(diǎn)，得到在室溫下呈半液體或固體狀態(tài)的脂肪。
存在多種影響氫化反應(yīng)的因素，該反應(yīng)反過來又會(huì)改變最終產(chǎn)品的組成。操作條件包括壓力、溫度、催化劑類型和濃度，攪拌和反應(yīng)器設(shè)計(jì)，這些是可以控制的比較重要的參數(shù)。相對(duì)較低不飽和脂肪酸而言，選擇性氫化條件用于氫化更高不飽和的脂肪酸更為有利。通常采用極輕度或輕度的氫化作用以便提高液態(tài)油的穩(wěn)定性。進(jìn)一步的氫化能將液態(tài)油轉(zhuǎn)化成物理上的固體脂肪。氫化的程度取決于所需要的性能和為特定最終產(chǎn)品設(shè)計(jì)的熔點(diǎn)特征。通過氫化獲得的多種可能的油和脂肪制品包括用于生產(chǎn)烘烤食品、固體脂肪的液體起酥劑和用于商業(yè)煎炸和烘烤作業(yè)的起酥劑，以及用于人造奶油生產(chǎn)的基礎(chǔ)原料。有關(guān)氫化和氫化產(chǎn)品的更詳細(xì)的說明可以參見Patterson,H.B.W.,1994，脂肪和油的氫化理論和實(shí)踐，美國油類化學(xué)家協(xié)會(huì)。
由于氫化過程所產(chǎn)生的反式脂肪酸異構(gòu)體的存在，使得氫化油也成問題。大量攝入反式異構(gòu)體會(huì)產(chǎn)生損害健康的作用，其中包括提高血漿中低密度脂蛋白與高密度脂蛋白的比例，并增加發(fā)生冠狀心臟病的危險(xiǎn)。用不含反式脂肪酸的形式的氫化油生產(chǎn)食品是有利的。本文所說的“基本上不含游離的反式脂肪酸”是指對(duì)健康沒有危害量的反式脂肪酸。例如，所述數(shù)量可以為0.1％(即，用現(xiàn)有的測(cè)定反式脂肪酸含量的方法不能可靠地檢測(cè))至不會(huì)造成健康危害的上限。在不久的將來，聯(lián)邦政府預(yù)計(jì)會(huì)制訂出食品中可以存在的反式脂肪酸異構(gòu)體含量的上限，并稱之為“不含反式脂肪酸”。我們相信，本發(fā)明的所有油、人造奶油和糊狀制品預(yù)計(jì)都能符合由政府機(jī)構(gòu)提出的規(guī)定。
油類中可以檢測(cè)出的脂肪酸的反式異構(gòu)體的極限大約為0.1％。(用于檢測(cè)油中反式脂肪酸的氣相層析方法披露于AOCS CelC-89中)。通過改進(jìn)氫化方法產(chǎn)生的“低反式異構(gòu)體油”的報(bào)導(dǎo)可以達(dá)到5-20％(w/w)的水平，但通常會(huì)犧牲高飽和脂肪酸的含量(Allen,D.A.(1998)脂類技術(shù)，10(2),29-33)。我們相信，本發(fā)明的完全或部分非氫化的和非化學(xué)改性的脂肪制品、混合的脂肪制品基本上不含反式脂肪酸，即，反式脂肪酸的濃度會(huì)低于油的20％(w/w)，優(yōu)選低于10％，更優(yōu)選低于5％，更優(yōu)選低于3％，更優(yōu)選低于1％，最優(yōu)選低于0.5％。
酯交換反應(yīng)是指酯和酸之間(酸解)，酯和醇之間(醇解)或酯和酯之間(轉(zhuǎn)酯)脂肪?；糠值慕粨Q。酯交換反應(yīng)是用化學(xué)或酶促方法實(shí)現(xiàn)的。隨機(jī)或定向轉(zhuǎn)酯過程會(huì)改變脂肪酸在甘油三酯分子上的位置，而不改變脂肪酸的組成。修飾過的甘油三酯結(jié)構(gòu)有可能產(chǎn)生具有改變了的物理特性的脂肪。由脂肪酶進(jìn)行的定向酯交換反應(yīng)正日益得到更多的關(guān)注，因?yàn)樵摲磻?yīng)可用于生產(chǎn)諸如可可黃油替代品的高價(jià)值特殊制品。用酯交換反應(yīng)商業(yè)化生產(chǎn)的制品，包括但不限于含有中等鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸的起酥劑、人造奶油、可可黃油替代品和結(jié)構(gòu)性脂類。酯交換反應(yīng)進(jìn)一步披露于Hui,Y.H.,1996,Bailey’s工業(yè)油類和脂肪制品，4卷，John Wiley&Sons。
脂肪酸和脂肪酸甲酯是源于植物油的兩種比較重要的油類化合物。脂肪酸被用于生產(chǎn)多種制品，如皂、中等鏈甘油三酯，多羥基酯，鏈烷醇酰胺等。植物油可以水解或裂解成相應(yīng)的脂肪酸和甘油。由各種脂肪裂解工藝產(chǎn)生的脂肪酸可以作為粗制品使用，或者更常見的是通過蒸餾和分離純化成級(jí)份或單一的脂肪酸。純化的脂肪酸及其級(jí)份可以轉(zhuǎn)化成多種油類化合物，如二聚和三聚酸，二酸，醇，胺，酰胺和酯。脂肪酸甲酯正越來越多的代替脂肪酸作為多種油類化合物的原始材料，如脂肪醇、鏈烷醇酰胺，a-磺酸甲酯，柴油成分等。使用裂解或水解植物油的方法，通過裂解甘油三酯也可以獲得甘油。有關(guān)脂肪酸和油類化合物的商業(yè)用途的更詳細(xì)的資料可以參考Erickson,D.R.,1995，大豆加工和利用實(shí)踐手冊(cè)，美國油類化學(xué)家協(xié)會(huì)，聯(lián)合大豆董事會(huì)；Pryde,E.H.,1979，脂肪酸，美國油類化學(xué)家協(xié)會(huì)；和Hui,Y.H.,1996,Bailey’s工業(yè)硫類和脂肪制品，4卷，JohnWiley&Sons。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明通過對(duì)油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解獲得的制品可用于生產(chǎn)人造奶油或糊狀制品。另外，可以按下文所述方法，用分離的或未分離的本發(fā)明的油，以其天然狀態(tài)或通過氫化、分離、酯交換反應(yīng)和/或水解進(jìn)行改性的形式制成混合制品，與其他成分組合生產(chǎn)人造奶油或糊狀制品。
人造奶油是一種有香味的食品，通常被用作餐桌上的奶油替代品或者用于烹飪目的，如煎炸、烘烤等。人造奶油的組成中通常含有80％的脂肪，是通過混合選擇的脂肪和油類及其他成分而制成的，并用維生素A強(qiáng)化。用于生產(chǎn)混合脂肪的成分的例子包括但不限于選自下列一組的至少一種成分全氫化大豆油，全氫化棉籽油，全氫化棕櫚油，部分氫化大豆油，部分氫化棉籽油，部分氫化棕櫚油，大豆油，玉米油，棕櫚油，canola油，向日葵油，花生油、紅花油或其混合物。
混合方法以及最終產(chǎn)品可以根據(jù)不同用途而改變。脂肪含量低于80％的所有制品都要標(biāo)明為“糊狀制品”。在本文中，術(shù)語“糊狀制品”或“涂抹制品”可以交換使用。人造奶油或糊狀制品可以含有一種或幾種水相成分，以及具有特殊功能的其他選擇性成分。目前有超過10種的不同人造奶油和糊狀制品，包括常規(guī)、攪打、軟管、液體、飲食、糊狀制品、無脂肪、餐館、面包師、和特殊類型，均作為不同的制品包裝。
在1950年代初期，幾乎所有的消費(fèi)人造奶油都是棒狀類型的。在1957年，人造奶油的銷售和總的消費(fèi)量上升并超過了黃油的消費(fèi)量，銷售的上升刺激了新技術(shù)的發(fā)展和新產(chǎn)品的開發(fā)。為了滿足消費(fèi)者的方便需要和營養(yǎng)觀念，以及對(duì)體重的關(guān)心，開發(fā)出了可涂抹的人造奶油，多不飽和人造奶油，和低脂肪食品。
過去的第一次大的變革是引入包裝在管中，并可以從冰箱中涂抹的軟的人造奶油。到1973年這種軟的全脂制品占人造奶油市場(chǎng)的1/4。近些年來，棒狀餐桌用糊狀制品幾乎占到了總的餐桌用糊狀制品市場(chǎng)的1/2。最突出的新趨勢(shì)是從人造奶油(80％)脂肪向含有較低脂肪含量的糊狀制品轉(zhuǎn)化。最初引入了60％的脂肪，從1980年開始，在市場(chǎng)上出現(xiàn)了含有75％到低于5％的脂肪的糊狀制品。所述食品以棒狀、液體和軟的攪打形式出售。含有40-75％脂肪的低卡路里、軟的和棒狀的糊狀制品，通常是用與分別用來生產(chǎn)軟的和棒狀人造奶油的相同的油類混合物制成的。有關(guān)人造奶油和糊狀制品生產(chǎn)實(shí)踐以及產(chǎn)品特征的詳細(xì)說明，可以參考Bailey’s工業(yè)油和脂肪制品，第5版，3卷，Y.H.Hui著，John Wiley&Sons公司，紐約，1996,65-114頁；和Bailey’s工業(yè)油和脂肪制品，第5版，4卷，Y.H.Hui著，John Wiley&Sons公司，紐約，1996,491-568頁。
消費(fèi)用人造奶油，是通過混合兩種或兩種以上具有不同硬度的油類原料制成的。這使得人造奶油可以直接從冰箱中涂抹出來，并在室溫下保持固體稠度。性能良好的人造奶油的特性，可以通過測(cè)定該脂肪混合物的固體脂肪含量(SFC，見下文)而確定。這一特征隨后可用于預(yù)測(cè)其他油類混合物作為人造奶油食品的性能。有關(guān)人造奶油制備的詳細(xì)說明可以參考脂肪和油，應(yīng)用制備和加工，R.D.O’Brien著，技術(shù)出版公司，Lancaster,PA,1998,437-457頁。
脂肪的熔點(diǎn)特征和塑性可以通過工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定。最常用的方法是固體脂肪指數(shù)(SFI,AOCS Cd10-57-93)和固體脂肪含量(SFC,AOCSCd16B-93(97))。SFI測(cè)定是根據(jù)膨脹計(jì)量進(jìn)行的，該方法根據(jù)當(dāng)脂肪熔化成液體狀態(tài)時(shí)體積的變化測(cè)定脂肪中固體或液體的量。這種技術(shù)正逐漸被SFC所取代。該方法基于脈沖、低解析核磁共振(NMR)，根據(jù)在樣品受到脈沖之后在固相和液相中質(zhì)子速度的差別測(cè)定該樣品中固體和液體的相對(duì)量。將SFI轉(zhuǎn)化成SFC數(shù)值并不總是可靠的。對(duì)于特定樣品來說，通常在10-40℃溫度范圍內(nèi)測(cè)定固體的百分比。為了了解有關(guān)脂肪在不同溫度下的特性，需要完整的SFC曲線。脂肪的功能取決于固體含量和位于臨界溫度處的SFC曲線的斜率，例如，在室溫和體溫之間的溫度合適。這樣，所述脂肪的塑性可以預(yù)測(cè)對(duì)性能重要的溫度。
對(duì)于人造奶油或常規(guī)油和脂肪來說，SFC是用直接的、系列的、非穩(wěn)定方法測(cè)定的。SFC NMR直接方法測(cè)定并比較來自固相和液相的信號(hào)。SFC被定義為由固相中氫核獲得的NMR反應(yīng)與由樣品的固相和液相中的核獲得的反應(yīng)的百分比。所述系列非穩(wěn)定方法使用單一一組樣品，通過熔化將該樣品加熱，并在100℃下保存15分鐘，在60℃下保持5分鐘，并在0℃下保持1小時(shí)。然后將該樣品在每一個(gè)記錄溫度下保持30分鐘，并在測(cè)定SFC之后馬上轉(zhuǎn)移到相鄰的較高溫度下。據(jù)信，這里所出現(xiàn)的高硬脂酸和高油酸以及具有類似組成的油類能夠生產(chǎn)SFC特征為25℃下低于20的脂肪制品，優(yōu)選25℃下低于15，更優(yōu)選在25℃下低于10，最優(yōu)選在25℃下低于5，并且在10℃下高于20，優(yōu)選在10℃下為20-50，更優(yōu)選10℃下為20-35。
脂肪的熔點(diǎn)也是一個(gè)重要指標(biāo)。由于脂肪是由具有不同熔點(diǎn)的甘油三酯的混合物組成，通常不可能進(jìn)行精確測(cè)定。本行業(yè)有若干種測(cè)定熔點(diǎn)的常用方法，包括毛細(xì)熔點(diǎn)(AOCS Cc1-25-93)，Wiley熔點(diǎn)(AOCS Cc2-38-91)，滑動(dòng)點(diǎn)(AOCS Cc3-25-93)，和滴落點(diǎn)(AOCSCc13-80-95)。
在表3中給出了美國人造奶油的典型固體脂肪指數(shù)值。數(shù)字代表商業(yè)制品。不過，對(duì)于特定類型的人造奶油來說，生產(chǎn)商的說明有明顯的不同，這要取決于1)希望的感官特征，2)滿足營養(yǎng)成分要求的組成要求或營養(yǎng)方面的其他信息，3)該制品是否使用非制冷形式陳列銷售，和4)現(xiàn)有的包裝設(shè)備類型。固體值是成品在冰箱溫度下(10℃)的可分散性，在室溫下(21.1℃)對(duì)油分離的抗性，和在口腔質(zhì)量(33.3℃)中的熔化的指標(biāo)。
表3美國餐桌用糊狀制品的典型固體脂肪指數(shù)固體脂肪指數(shù)10°21.1°26.7°33.3°37.7°棒 28 16 10 2 0軟棒20 13 92.50軟管11 7 52 0.5液體3 2.52.5 2 1.5黃油32 7 72 0一種人造奶油制品的物理和功能特征主要取決于其油相特征。在成品人造奶油的脂肪固體含量和結(jié)構(gòu)、稠度、和塑性方面存在直接關(guān)系。人造奶油稠度、香味和乳化穩(wěn)定性取決于結(jié)晶的脂肪。在美國，氫化是用于改變?nèi)嗽炷逃驮系墓腆w/液體關(guān)系的優(yōu)選方法。不過，由于在氫化過程中產(chǎn)生的反式脂肪酸異構(gòu)體的存在使得氫化油也有問題。大量攝入反式異構(gòu)體對(duì)健康有損害作用，包括提高血漿中低密度脂蛋白與高密度脂蛋白的比例，并增加冠狀心臟病的危險(xiǎn)。從環(huán)保角度考慮，在氫化過程中使用金屬催化劑產(chǎn)生了有關(guān)有毒金屬廢品的回收和處理問題。公眾對(duì)氫化作用的不利影響的日益關(guān)注，有可能導(dǎo)致人造奶油配方的明顯改變，以便減少或消除工業(yè)改性油的存在。
有多種用于測(cè)定氧化穩(wěn)定性的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。現(xiàn)在被常用于評(píng)估商用烹飪油的穩(wěn)定性的一種標(biāo)準(zhǔn)方法是氧化穩(wěn)定性指數(shù)(OSI)，該指數(shù)是用由Ominion公司(Rockland,MA，美國)生產(chǎn)的機(jī)器自動(dòng)測(cè)定的。
OSI機(jī)器通過在加熱到110℃的油中吹氣泡進(jìn)行工作。隨著油被氧化，形成揮發(fā)性有機(jī)酸，主要是甲酸，可以在容器中以蒸餾水形式收集這種酸。該機(jī)器穩(wěn)定測(cè)定蒸餾水的導(dǎo)電性，并測(cè)定感應(yīng)周期，即該導(dǎo)電性開始迅速升高所需要的時(shí)間。據(jù)信，本發(fā)明以非混合形式和混合形式提供的高硬脂酸和高油酸油以及具有相似組成的油所生產(chǎn)的脂肪酸制品的OSI(110)可以大于15，優(yōu)選大于25，最優(yōu)選大于35。
實(shí)施例下面的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明的，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。所給出的所有溫度是攝氏度，除非另有說明。在這些實(shí)施例中所提供的固體脂肪含量(SFC)特征，表示在指定溫度下，在固相中測(cè)定的總脂肪組分的百分比。
例1用大豆制備油，并分析脂肪酸組成用于這些實(shí)施例中的所有的油都是按照下面的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的方法制備的。在微波爐中將收獲的大豆加熱到180°F，冷卻到室溫，并用Roskamp TRC650-6粉碎輥粉碎。用Kice吸氣機(jī)除去大豆皮，并將剩余的實(shí)質(zhì)部分加熱到180℃，并在Roskamp TRC912壓片輥中壓片。粗制油在玻璃水夾套提取容器中加熱到60℃保持45分鐘進(jìn)行提取，溶劑與固體的比例大約為4∶1。收集己烷/油的混合物，并重復(fù)提取。用旋轉(zhuǎn)真空儀對(duì)該混合物進(jìn)行脫溶劑化，留下粗制油。
將體積相當(dāng)于粗制油的0.1％(v/v)的85％的磷酸溶液加入，并將該溶液加熱到65-70℃，保持10分鐘，同時(shí)攪拌。將熱的(60℃)氫氧化鈉(8％水溶液)滴加到所述油中，中和游離脂肪酸和磷酸，另外添加0.2％wt/wt的富裕量。在樣品被加熱到90℃時(shí)，通過加入熱水到20％(v/v)，同時(shí)快速攪拌對(duì)所述油進(jìn)行水洗。讓所述油和水在室溫下冷卻10分鐘，然后通過離心分離。通過在85-95℃、在真空條件下快速攪拌對(duì)所述油進(jìn)行脫水30分鐘或者直到所述的水份(氣泡、冷凝物)被除去。然后用氮?dú)饨獬稣婵?。通過添加2％(wt/wt)活化漂白土(AOCS#Z1077)對(duì)所述油進(jìn)行漂白，并將該溶液在真空條件下在85-95℃下混合30分鐘，然后冷卻到80℃。用氮?dú)饨獬稣婵?，并添?％(wt/wt)的硅藻土，并通過制備的硅藻土床過濾該混合物。
以大約50ppm的濃度添加檸檬酸，并在玻璃脫臭儀中在240℃下用蒸汽(4毫升水/100克油)對(duì)所述油進(jìn)行脫臭大約1小時(shí)。將精煉過的、漂白過的、并且脫臭過的油在氮?dú)庵欣鋬霰２亍?br> 這些實(shí)施例中所披露的所有脂肪酸組成的分析基本上是通過披露于AOCS Celc-89中的方法測(cè)定的。按以上方法制備脂肪酸甲酯。將10微升油或液化脂肪與1毫升己烷和0.25毫升3％的甲醇鈉溶液混合30分鐘。添加乙酸(0.1毫升10％的溶液)，混合該樣品，并通過離心分層。在己烷層中提取的所產(chǎn)生的脂肪酸甲酯通過氣相層析(GC)分析。使用配有SP2340柱(60米，0.25毫米ID,0.20微米薄膜厚度)(Supelco,Bellefonte,PA)的Hewlett,Packard5890EC(Wilmington,DE)。在加樣時(shí)柱的溫度為150℃，并且用40分鐘時(shí)間，以2℃/分鐘的速度將溫度從150℃提高到200℃。注射器和檢測(cè)器的溫度分別為215℃和230℃。所提供的所有組成數(shù)值是由通過GC檢測(cè)儀測(cè)定的整體面積計(jì)算的相對(duì)值。
所有SFC測(cè)定大體上是按照披露于AOCS Cd16b-93中的方法進(jìn)行的。
所有氧化穩(wěn)定性測(cè)定是通過披露于AOCS Cd12b-92(93)中的方法通過OSI確定的。
例2商業(yè)人造奶油的固體脂肪含量分析具有不同固態(tài)程度的商業(yè)人造奶油樣品的SFC。通過在100℃下熔化所述制品并去掉含水層制備樣品。作為溫度的函數(shù)分析所得到脂肪級(jí)份的SFC，其結(jié)果在表4中給出。該表表示可用于根據(jù)脂肪塑性和所需要的產(chǎn)品形式(例如，軟管，棒條，低脂肪糊狀制品)生產(chǎn)不同類型的人造奶油和糊狀制品。
表4商業(yè)人造奶油在不同溫度下的固體脂肪含量功能 產(chǎn)品形式 10 15 20 25 30 354068％的植物油糊狀制品棒 24.2 23.5 16.28.54.10.9 0.540％的植物油糊狀制品棒 22.2 21.7 15 8 3.61.1 0.070％的玉米油糊狀制品棒 31.0 25.8 17.610.9 5 0.7 0.140％的植物油糊狀制品軟管 16.4 11.9 7.2 4.11.70.6 0.324％的植物油糊狀制品軟管 18.5 13.9 9.4 5.83.31.3 0.670％的植物油糊狀制品棒 40.3 32.1 22.712.6 5.11.3 0.1玉米油人造奶油 棒 35.7 nd 22.113.8 6.71 nd大豆油人造奶油 棒 36.5 nd 23 15.4 8.93 nd軟人造奶油 軟管 19.1 nd 9 4.41.5-0.1 nd黃油棒 47.3 34.9 20 11.8 5.11.2 0.0
例3高硬脂酸大豆油的固體脂肪含量來自被稱為L9216116-109的高硬脂酸大豆，是由杜邦公司用譜系(HST1*(HO2*HO4))*A2506育成的(它表示來自HO2和HO4雜交的后代與HST1雜交，并將所得到的后代與野生型品系A(chǔ)2506雜交產(chǎn)生L9216116-109)。所產(chǎn)生的種子與常規(guī)大豆相比，具有較高的硬脂酸含量和較低的亞麻酸含量。親本HST1,HO2和HO4(見表2)是通過披露于US5710365中的誘變方法篩選的，所不同的是，將不同的大豆品系用作原始材料進(jìn)行誘變，并且篩選是基于脂肪酸含量的變化，而不是碳水化合物含量。HST1是N85-2176的突變體，該品系是高油酸低亞麻酸品系，由J.W.Burton在美國北卡羅來那州育成(Kuhr等，1987年3月26日N85-2124,N85-2131和N85-2176的銷售公告。USDA農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu))。HST1與其親本N85-2176的差別在于，它具有異常的高硬脂酸含量(HST1=高硬脂酸)，同時(shí)又保留了N85-2176的較低的亞麻酸含量。HST1中的高硬脂酸突變抑制了存在于來自N85-2176的遺傳背景中的高油酸基因(是后者的上位基因)。HST1與N85-2176不同，它不是高油酸的。HST1中的硬脂酸突變與品系A(chǔ)6(來自依阿華州的W.Fehr)的fasa(見表2)等位，并且在雜交到與fasa相似的背景中之后產(chǎn)生相似的表型。N85-2176和A5(來自依阿華州的W.Fehr)之間的雜交，證實(shí)了N85-2176含有存在于A5中的fan基因(見表2)的等位基因，它能產(chǎn)生類似的低亞麻酸表型。因此，HST1同時(shí)含有高硬脂酸突變(與fasa等位)和低亞麻酸突變(與fan等位)。
HO2是選自品系N85-2176的誘變的杜邦公司擁有專利權(quán)的突變品系。誘變方法基本上與US5710365中披露的方法相同，所不同的是將N85-2176用作誘變的原始材料，并且選擇是基于脂肪酸含量的變化而不是基于碳水化合物的含量。HO2與N85-2176(fan)的不同在于它具有略微較高的油酸含量(HO=高油酸)，但保留了N85-2176的低亞麻酸含量。因此，HO2含有一種尚未命名的突變，該突變除了fan基因之外還能產(chǎn)生高于N85-2176的較高的油酸含量。
HO4是選自品系A(chǔ)5的誘變的杜邦公司擁有專利權(quán)的突變品系。誘變方法基本上與US5710365中披露的方法相同，所不同的是將A5用作誘變的原始材料，并且選擇是基于脂肪酸含量的變化而不是基于碳水化合物的含量。HO4與A5(fan)的不同在于，它具有略微較高的油酸含量(HO=高油酸)，但保留了A5的低亞麻酸含量。因此，HO4含有一種尚未命名的突變，該突變除了fan基因之外，還能產(chǎn)生高于A5的較高的油酸含量。
我們相信，A6(fasa)的衍生物或能產(chǎn)生具有包括類似于本發(fā)明所披露的高硬脂酸和低亞麻酸表型的油的組成的種子的類似植物，可用于本文所披露的方法。
按例5所披露的方法育成了高硬脂酸和高油酸大豆。
所有的大豆油都是按照披露于例1中的方法制備的，并在多種溫度下分析脂肪酸組成和固體脂肪含量。
表5和6表示硬脂酸含量為15-22％的高硬脂酸大豆油的組成和功能特征。另外，所述油類中的四種具有較高含量的油酸。含有22％硬脂酸和正常油酸含量的油，不具有足夠的硬度以便滿足軟管人造奶油的要求(參見圖1)。不過，22％硬脂酸，高油酸組合的SFC特征適合公開的商業(yè)軟管人造奶油的范圍。據(jù)信，高硬脂酸與本發(fā)明所提供的高油酸油的組合以及具有類似組成的油能夠產(chǎn)生這樣一種脂肪制品，其SFC特征在25℃下低于20，優(yōu)選在25℃下低于15，更優(yōu)選在25℃下低于10，最優(yōu)選在25℃下低于5，并且在10℃下高于20，優(yōu)選在10℃下為20-50，更優(yōu)選10℃下為20-35。
硬脂酸含量低于22％的油不具備與人造奶油和糊狀制品一致的SFC特征。因此，可以從具有高油酸濃度和硬脂酸濃度至少為22％的非混合油獲得與人造奶油和糊狀制品一致的SFC特征。
表5脂肪酸組成鏈長不飽和 16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 20∶0高硬脂酸 8.8 22.2 14.6 48.1 4.9 1.5高硬脂酸/高油酸油A 5.9 21.9 62.8 2.6 3.6 1.8高硬脂酸/高油酸油B 6.0 18.6 66.8 2.3 3.6 1.5高硬脂酸/高油酸油C 5.5 17.6 67.6 3.4 3.7 1.4高硬脂酸/高油酸油D 5.9 15.1 69.2 2.6 3.6 1.2
表6作為溫度的函數(shù)的SFC百分?jǐn)?shù)溫度10° 15°20°25°30°35°40°高硬脂酸13.9 6.8 4.6 0.1 0.4 0 0高硬脂酸/高油酸油A 21.2 16.47.1 4.5 0 0 0高硬脂酸/高油酸油B 29.9 19.84.3 3.1 0.3 0.6 0.5高硬脂酸/高油酸油C 28.4 17.62.9 1.4 0.5 0 0.3高硬脂酸/高油酸油D 23.6 11.51.0 0.7 0.2 0.4 0.3例4用于生產(chǎn)缺少反式脂肪酸異構(gòu)體的基礎(chǔ)油混合物將高硬脂酸油與棕櫚油或全氫化大豆餅(Dlitex PST氫化大豆餅，AC SUMKO,525W.1st Avenue,Corumbus,OH)混合，以便生產(chǎn)能滿足人造奶油對(duì)SFC的要求并且不含反式脂肪酸異構(gòu)體的脂質(zhì)。分析所得到的混合物的脂肪酸組成，在各種溫度下的固體脂肪含量，以及氧化穩(wěn)定性。表7表示上述混合物中每一種的脂肪酸組成和OSI值。圖2表示曲線示意圖。由高硬脂酸/高油酸制成的混合物和表現(xiàn)出的氧化穩(wěn)定性值比由高硬脂酸油與正常油酸含量的制成的混合物高4-7倍。據(jù)信，本發(fā)明所提供的非混合和混合形式的高硬脂酸和高油酸油以及具有類似組成的油能夠生產(chǎn)這樣的脂肪制品，其OSI(110)大于15，優(yōu)選大于25，更優(yōu)選大于35。表8表示上述混合物中每一種的固體脂肪含量。如圖3所示，混合形式的高硬脂酸/高油酸表現(xiàn)出高的氧化穩(wěn)定性(HSHO C+棕櫚油，和HSHO D+氫化大豆油)，還改善了其SFC特征，現(xiàn)在與人造奶油的曲線吻合。根信，本發(fā)明本發(fā)明所提供的非混合和混合形式的高硬脂酸和高油酸油以及具有類似組成的油能夠生產(chǎn)這樣的脂肪制品，其OSI特征為在25℃下低于20，優(yōu)選在25℃下低于15，更優(yōu)選在25℃下低于10，最優(yōu)選在25℃下低于5，在10℃下大于20，優(yōu)選在10℃下為20-50，最優(yōu)選在10℃下為20-35。
表7混合油的脂肪酸組成(％)14∶0 16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 20∶0 OSI(110)高硬脂酸/高油酸油C Nd5.5 17.667.63.4 3.7 1.4 41.2高硬脂酸/高油酸油D 5.9 15.169.22.6 3.6 1.2 nd棕櫚油 1.2 44.74.5 39.08.6 0.1 0.4 25.5全氫化大豆油(FHS ) 1.3 55.241.20.3 0.1 0 0.5 nd普通大豆油 0.1 10.94.0 24.651.46.7 0.3 6.1HSHO油C+棕櫚油(50％)的混合物 0.6 24.011.053.86.5 1.9 0.9 35.7高硬脂酸+棕櫚油(40％)的混合物 0.4 22.215.124.632.42.6 1.0 8.5HSHO油D+FHS(3％)的混合物 nd7.3 15.868.22.8 3.4 1.1 43.3高硬脂酸+FHS(3％)的混合物 0.1 10.322.414.245.64.0 1.4 5.8普通大豆油+棕櫚油(35％)0.4 22.14.1 30.136.74.5 0.3 7.4表8作為溫度函數(shù)的SFC溫度 10°20°25°30°35°高硬脂酸/高油酸油C 28.42.9 1.4 0.5 0高硬脂酸/高油酸油D 24.21.8 0.6 0 0棕櫚油 57.231.619.710.95.0HSHO油C+棕櫚油(50％)的混合物25.810.46.1 3.7 1.7高硬脂酸+棕櫚油(40％)的混合物 22.77.4 4.8 2.5 0.7HSHO油D+FHS(3％)的混合物24.44.6 3.5 2.0 0.9高硬脂酸+FHS(3％)的混合物 17.38.2 3.6 2.3 1.2普通大豆油+棕櫚油(35％) 12.86.3 4.2 3.3 1.5例5具有高硬脂酸和高油酸含量的大豆在其種子脂肪酸中具有較高油酸含量的大豆品系與其種子脂肪酸中具有較高硬脂酸含量的大豆之間進(jìn)行雜交。所述高油酸品系含有一個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的大豆脂肪酸脫飽和酶基因gmFAD2-1(Heppard,E.P.等(1996)植物生理學(xué)110311-319)，它會(huì)導(dǎo)致共抑制，并因此下調(diào)gmFAD2-1信號(hào)水平，有關(guān)內(nèi)容披露于WO97/40698中。FAD2-1表達(dá)的減弱，導(dǎo)致Δ-12脫飽和酶活性的降低，以及多不飽和脂肪酸積累的減少。所述高油品系被命名為D2T，其種子脂類的典型脂肪酸特征在表2中示出。高硬脂酸親本是從誘變的大豆種子群體中分離的脂肪酸合成突變體(US5557037)，被命名為A6，并且含有脂肪酸突變型fasa等位基因。其典型的種子脂類脂肪酸特征在表2中示出。
種植由上述雜交獲得的F1種子，以便獲得F1植物。然后讓F1植物自花授粉，以便獲得F2種子，該種子會(huì)發(fā)生影響種子脂肪酸特征的基因座的分離。種植F2種子，并且讓其植物按上一世代的方式自花授粉，通過披露于WO94/11516中的氣相液體層析法，測(cè)定從單個(gè)F2植株獲得的混合種子樣品中的五種主要脂肪酸的相對(duì)含量。選擇來自F2植物的含有最大硬脂酸和油酸含量的其余種子，播種并進(jìn)行自花授粉，以便獲得F3∶4種子。然后對(duì)來自每一個(gè)F3植物的F4種子的樣品(F3∶4種子)進(jìn)行GC分析，以便確定單株的F3∶4表型。然后對(duì)追溯至共同的F2植物祖先的F3∶4植物表型加以平均，以便獲得F2衍生的家族的平均表型(F2∶4家族平均值)，在表9中示出了油酸和硬脂酸含量最高的單株和家族平均值。以種子脂肪酸中硬脂酸的下降順序提供單株品系以及家族平均值。
表9來自由高油酸親本D2T和高硬脂酸親本fasa雜交產(chǎn)生的單株和F2∶4家族平均的種子脂肪酸特征品系ID各種脂肪酸含量(總種子脂肪酸的％)世代和類型16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶37SO-2334-1 7 26 61 1 3 F3∶4單株7SO-2293-2 6 26 61 2 3 F3∶4單株7SO-2293-1 6 25 62 2 3 F3∶4單株7SO-2303-5 6 24 66 0 2 F3∶4單株7SO-2339-1 6 24 64 1 3 F3∶4單株7SO-2295-1 6 24 64 1 3 F3∶4單株7SO-2331-3 7 24 63 1 3 F3∶4單株7SO-5097-3 6 20 67 2 3 F3∶4單株7SO-5097-1 6 20 66 2 3 F3∶4單株7SO-2356-1 6 18 72 0 3 F3∶4單株7SO-2306-2 6 18 71 2 3 F3∶4單株7SO-2305-3 6 18 70 2 2 F3∶4單株7SO-2310-3 6 18 70 2 3 F3∶4單株7SO-2293 6 24 63 2 3 9個(gè)植株的F2∶4家族平均值7SO-2334 6 23 65 1 3 8個(gè)植株的F2∶4家族平均值7SO-2339 6 23 65 1 3 7個(gè)植株的F2∶4家族平均值7SO-2379 6 19 70 1 2 3個(gè)植株的F2∶4家族平均值7SO-2305 6 18 71 2 3 10個(gè)植株的F2∶4家族平均值在由上述雜交選擇的后代中，保留了來自D2T親本的極低的多不飽和脂肪酸表型和來自含有fasa親本的極高的硬脂酸含量。在來自所述雜交的選擇的后代中，硬脂酸含量相對(duì)D2T親本的提高導(dǎo)致了油酸含量的降低。
例6具有高油酸和高棕櫚酸和高硬脂酸含量的大豆在含有D2T基因(編碼高油酸含量)的大豆品系和含有fap2等位基因(編碼高棕櫚酸含量)和fasa等位基因(編碼高硬脂酸含量)的大豆品系之間進(jìn)行雜交，獲得F1后代。然后在下一個(gè)世代中讓F1后代自花授粉，以便獲得F2種子和F2∶3家族。選擇含有最大棕櫚酸+硬脂酸+油酸含量的F2∶3家族，并種植進(jìn)行自花授粉，以便獲得F3∶4種子。然后對(duì)來自每一個(gè)植株的F4種子的樣品(F3∶4種子)進(jìn)行GC分析，以便可以測(cè)定單一的F3∶4表型。將追溯至共同F(xiàn)2植物祖先的F3∶4植物表型加以平均，以便獲得F2衍生的家族的平均表型(F2∶4家族平均值)。在表10中示出了棕櫚酸+硬脂酸+油酸含量最高的單株和家族平均值，以總的種子飽和脂肪酸降低的順序排列。
表10具有高油酸和高棕櫚酸和高硬脂酸含量組合的單株和家族平均表型(D2T+fap2+fasa基因)品系ID 各種脂肪酸含量(總種子脂肪酸的％) 世代和類型16∶018∶0 18∶118∶218∶37HSO-5076-5 12 215833F3∶4單株7HSO-2201-2 12 196223F3∶4單株7HSO-2229-1 12 186513F3∶4單株7HSO-2201-1 11 196223F3∶4單株7HSO-2227-5 11 186613F3∶4單株7HSO-2207-5 11 186513F3∶4單株7HSO-5074-3 11 176313F3∶4單株7HSO-2201-0 11 1863233個(gè)植株的F2∶4家族平均值7HSO-2208-0 11 1668133個(gè)植株的F2∶4家族平均值7HSO-2208-0 11 1668134個(gè)植株的F2∶4家族平均值7HSO-2207-0 11 1568136個(gè)植株的F2∶4家族平均值例7具有高油酸和低棕櫚酸含量的大豆在含有D2T基因(編碼高油酸含量)的大豆品系和含有fap1等位基因和fap3等位基因(編碼低棕櫚酸含量)的大豆品系之間進(jìn)行雜交，獲得F1后代。然后在下一個(gè)世代中讓F1后代自花授粉，以便獲得F2種子和F2∶3家族。選擇含有最低棕櫚酸和最高油酸含量的F2∶3家族，并種植進(jìn)行自花授粉，以便獲得F3∶4種子。然后對(duì)來自每一個(gè)F3植株的F4種子的樣品進(jìn)行GC分析，以便可以測(cè)定單一的F3∶4表型。將追溯至共同F(xiàn)2植物祖先的F3∶4植物表型加以平均，以便獲得F2衍生的家族的平均表型(F2∶4家族平均值)。在表11中示出了具有最低的棕櫚酸含量和最高的油酸含量的單株和家族平均值，以總種子脂肪酸中棕櫚酸增加的順序排列。由于低棕櫚酸含量的選擇要求精確到一個(gè)百分點(diǎn)的1/10，表11中所示的棕櫚酸值是所述精確水平，而其他脂肪酸的值被四舍五入成最接近的整數(shù)百分比。
表11具有高油酸和低棕櫚酸含量的單株和F2∶4家族平均表型(D2T+fap1+fap3基因)品系ID各種脂肪酸含量(總種子脂肪酸的％) 世代和類型16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶37AO-2079-12 2.7 3 89 1 3 F3∶4單株7AO-2083-12.8 3 90 1 2 F3∶4單株7AO-2072-42.9 3 89 1 2 F3∶4單株7AO-2065-12.9 3 89 1 3 F3∶4單株7AO-2083-33.0 3 89 1 2 F3∶4單株7AO-2075-33.0 3 89 1 3 F3∶4單株7AO-2079-13.0 3 88 2 3 F3∶4單株7AO-2072-13.1 3 88 1 3 F3∶4單株7AO-2085-53.2 3 89 1 2 F3∶4單株7AO-2084-13.2 3 88 2 2 F3∶4單株7AO-2072-63.2 3 88 1 3 F3∶4單株7AO-2081-63.3 3 90 1 2 F3∶4單株7AO-2074-73.3 3 89 1 3 F3∶4單株7AO-2081-33.4 3 89 1 2 F3∶4單株7AO-2087-13.4 3 88 3 3 F3∶4單株7AO-2072-03.0 3 89 1 3 6個(gè)植株的F2∶4家族平均值7AO-2083-03.5 3 89 1 2 4個(gè)植株的F2∶4家族平均值7AO-2074-03.5 3 88 1 3 7個(gè)植株的F2∶4家族平均值7AO-2080-03.6 3 88 1 3 5個(gè)植株的F2∶4家族平均值7AO-2065-03.6 3 88 1 3 3個(gè)植株的F2∶4家族平均值7AO-2082-03.6 3 88 2 3 5個(gè)植株的F2∶4家族平均值7AO-2068-03.6 3 88 1 3 4個(gè)植株的F2∶4家族平均值7AO-2079-03.6 3 88 1 3 12個(gè)植株的F2∶4家族平均值例8具有高油酸和低亞麻酸含量的大豆在含有編碼高油酸含量的D2T基因的大豆品系和含有編碼低亞麻酸含量的fan等位基因或D3A基因的大豆品系之間進(jìn)行雜交，以便獲得F1后代。然后在下一個(gè)世代中讓F1后代自花授粉，以便獲得F2種子和F2∶3家族。然后選擇含有最低亞麻酸和最高油酸含量的F2∶3家族，并種植，讓其自花授粉以便獲得F3∶4種子。然后對(duì)來自每一個(gè)F3植株的F4種子的樣品(F3∶4種子)進(jìn)行GC分析，以便可以測(cè)定單一的F3∶4表型。將追溯至共同的F2植物祖先的F3∶4植物表型加以平均，以便獲得F2衍生的家族的平均表型(F2∶4家族平均值)。在表12中示出了亞麻酸含量最低和油酸含量最高的單株和家族平均值，以亞麻酸增加的順序排列。由于篩選低亞麻酸含量需要精確到一個(gè)百分點(diǎn)的1/10，表12中所示的亞麻酸值是所述精確水平，而其他脂肪酸的值被四舍五入成最接近的整數(shù)百分比。
表12具有高油酸和低亞麻酸含量組合的單株和F2∶4家族平均表型品系ID 各種脂肪酸含量(總種子脂肪酸的％) 世代和類型16∶018∶018∶118∶218∶37OL-2703-653872 1.7F3∶4單株7OL-2708-174851 1.7F3∶4單株7OL-2073-763871 1.8F3∶4單株7OL-2706-664861 1.8F3∶4單株7OL-2703-553881 1.9F3∶4單株7OL-2073-263871 1.9F3∶4單株7OL-5180-763872 1.9F3∶4單株7OL-5181-763862 1.9F3∶4單株7OL-2706-764861 1.9F3∶4單株7OL-2707-564861 1.9F3∶4單株7OL-2705-10 74851 1.9F3∶4單株7OL-2711-474852 1.9F3∶4單株7OL-2712-574842 1.9F3∶4單株7OL-2708-075841 1.84個(gè)植株的F2∶4家族平均值7OL-2703-063871 1.97個(gè)植株的F2∶4家族平均值7OL-2707-0 64861 2.15個(gè)植株的F2∶4家族平均7OL-2705-064851 2.112個(gè)植株的F2∶4家族平均值7OL-2710-074852 2.29個(gè)植株的F2∶4家族平均值7OL-2711-074842 2.25個(gè)植株的F2∶4家族平均值7OL-2712-075823 2.311個(gè)植株的F2∶4家族平均值7OL-2713-064852 2.411個(gè)植株的F2∶4家族平均值7OL-2709-074832 2.511個(gè)植株的F2∶4家族平均值例9從歐洲油菜中分離編碼?；?ACP硫酯酶的cDNA用從歐洲油菜的發(fā)育中的種子中分離的mRNA制備cDNA文庫，所述歐洲油菜是在授粉之后20-26天從花盆中收獲的。提取總的RNA，并通過寡聚dT層析純化mRNA。該文庫是用Ray和Ray披露的方法(1991，核酸研究194559)，用從Pharmacia購買的試劑進(jìn)行制備的，作了某些改進(jìn)。按照生產(chǎn)商的說明將所得到的cDNA克隆到λZAP載體(Stratagene,La Jolla,CA)上。一級(jí)文庫含有大約1×106個(gè)個(gè)體，并進(jìn)行一次擴(kuò)增。
使用Sambrook等披露的克隆技術(shù)[(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港試驗(yàn)室出版社]。通過感染鋪平板在總共六個(gè)平板上的大腸桿菌得到了擴(kuò)增文庫的約3×105個(gè)噬斑，從每一個(gè)培育過的平板上提取復(fù)制的硝酸纖維素膜。用32p標(biāo)記過的(隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，Life技術(shù)，Gaithersburg,MD)源于蕓苔屬基因組克隆的序列(WO92/11373中的序列20)探測(cè)復(fù)制的硝酸纖維素膜，并在63℃下在雜交緩沖液(6×SSC
，5×Denhardts’s溶液[0.5克Ficoll(400型，Pharmacia)，0.5克聚乙烯吡咯烷酮，0.5克牛血清白蛋白(級(jí)份V,Sigma)，1mMDETA,1％SDS和100微克變性鮭精DNA/毫升(Sigma))中退火。讓所述纖維素膜退火18小時(shí)，然后在63℃下用0.2×SSC洗滌，然后放在照相膠片上。統(tǒng)計(jì)到了與所述探針雜交的16個(gè)噬斑，對(duì)其中的7個(gè)進(jìn)行純化，并按照在λZAP克隆指導(dǎo)試劑盒手冊(cè)(Stratagene)中的說明進(jìn)行剪切，用所得到的噬菌粒感染大腸桿菌XL-1Blue細(xì)胞，所得到的雙鏈質(zhì)粒含有選擇的cDNA插入片段。通過對(duì)純化的質(zhì)粒進(jìn)行限制性分析發(fā)現(xiàn)了兩種類型的克隆。一種類型是被稱為p5C的克隆。通過雙脫氧測(cè)序測(cè)定p5C中的插入片段的序列，并證實(shí)它編碼歐洲油菜油酰-ACP硫酯酶。該cDNA的序列如序列1所示。其所編碼蛋白的序列如序列2所示。預(yù)測(cè)的翻譯產(chǎn)物與由Jones等(1995，植物細(xì)胞7359-371)報(bào)導(dǎo)的另一種cDNA編碼的蛋白具有98.6％的相同性，并交由GenBenk保藏，保藏號(hào)為U17098。所述第二種硫酯酶克隆的序列及其蛋白分別示于序列3和4中。
例10在大豆種子中表達(dá)源于歐洲油菜的油酰-ACP硫酯酶以XmnI片段形式將p5C上的完整的cDNA插入片段從pBluscript上切除，并克隆到大豆種子表達(dá)載體上，用于優(yōu)良大豆栽培品種A2396的biolistic轉(zhuǎn)化。
構(gòu)建一種質(zhì)粒，其中源于歐洲油菜cDNA序列的?；?ACP(油酰-ACP)硫酯酶受大豆β-conglycinin啟動(dòng)子的控制(Beachy R.N.等(1985)，EMBO雜志43047-3053)。該載體的構(gòu)建是用披露于WO94/11516中的質(zhì)粒pCW109實(shí)現(xiàn)的。載體pCW109含有830個(gè)堿基的DNA片段，它包括大豆種子儲(chǔ)存蛋白β-conglycinin的α亞基的啟動(dòng)子序列，一個(gè)具有多個(gè)限制位點(diǎn)的區(qū)域，和源于菜豆種子儲(chǔ)存蛋白--菜豆蛋白的1080個(gè)堿基的3’調(diào)控序列。對(duì)載體pCW109進(jìn)行修飾，以便在所述多克隆區(qū)含有SamⅠ位點(diǎn)。通過用XmnⅠ消化除去p5C上的cDNA插入片段，分離，并連接到用SamⅠ消化修飾過的pCW109上，選擇沿有義方向插入的來自p5C的cDNA插入片段的事件，并命名為pST14。
構(gòu)建被命名為pKS18HH的質(zhì)粒，賦予用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過的植物或細(xì)菌對(duì)潮霉素B的抗性。所述質(zhì)粒是用以下遺傳因子構(gòu)建的1)質(zhì)粒載體pSP72(Promega,Madison,WI)，通過除去β-內(nèi)酰胺編碼區(qū)對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行過修飾，2)一種植物選擇標(biāo)記框，包括源于花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(CaMV)，它連接于潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)和源于根癌農(nóng)桿菌的胭脂氨酸合酶3’調(diào)控序列上，和3)一種細(xì)菌選擇標(biāo)記框，它包括源于噬菌體T7的啟動(dòng)子，位于HPT編碼區(qū)上游的SD序列，以及T7轉(zhuǎn)錄終止序列。
潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因可以從含有克雷伯桿菌屬衍生的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株W677中獲得(pJR225,Gritz,L.和Davies,J.(1983)基因25179-188)。用于在諸如NovaBlue(Novagen,Madison,WI)的大腸桿菌的某些菌株中表達(dá)HPT酶的T7啟動(dòng)子HPTT7終止子框是從pEP載體的衍生物獲得的。用于在植物表達(dá)HPT的35SHPT胭脂氨酸合酶的3’末端框的起點(diǎn)，詳細(xì)披露于WO94/11516中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用分子克隆的常用方法將以上因子克隆到一個(gè)質(zhì)粒上。
為了能夠?qū)⒃撦d體用于Christou等披露的轉(zhuǎn)化方法中(1990，生物技術(shù)趨勢(shì)8145)，通過限制性內(nèi)切酶消化從35SHPT胭脂氨酸合酶框上去掉HPT編碼序列，并代之以正確取向的細(xì)菌3-葡糖醛酸苷酶基因的編碼區(qū)(Jefferson等(1987)EMBO雜志63901-3907)。所得到的質(zhì)粒被命名為pKS18。
通過HindⅢ的部分消化除去pST14上的β-conglycininp5C菜豆蛋白-3’表達(dá)框，分離，并連接到同樣用HindⅢ消化過的pKS18上，得到的最終轉(zhuǎn)化載體被命名為pRB19。
該轉(zhuǎn)化技術(shù)所產(chǎn)生的植物所結(jié)的種子會(huì)發(fā)生所述導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因的分離。由所述植物獲得的混合種子在所述轉(zhuǎn)基因上也可以是嵌合型的。
從上述轉(zhuǎn)化得到三個(gè)可育的植株，并通過部分種子分析技術(shù)分析其脂肪酸表型。用剃須刀片從所述種子上取得一小片遠(yuǎn)離胚軸的子葉。在含有1％乙醇鈉的甲醇中消化所述切片，并將所得到的脂肪酸甲酯提取到己烷中，然后分離并通過氣相液體層析進(jìn)行定量。由此鑒定具有改變了的脂肪酸特征的種子，隨后用于發(fā)芽和生長。
在用含有蕓苔屬酰基-ACP硫酯酶的種子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過的上述三個(gè)大豆植株中，有一個(gè)植株的種子脂肪酸表型沒有改變(分析了32粒種子，平均為3.9％的硬脂酸，觀察到的范圍為3.2％-4.6％)。其余的兩個(gè)植株在其種子中具有較高的硬脂酸含量。對(duì)第二個(gè)植株的29粒種子進(jìn)行了分析，測(cè)定其平均硬脂酸含量為5.4％，所觀察到的范圍為3.8％-7.5％，對(duì)來自第三個(gè)植株的40粒種子進(jìn)行了分析，并且測(cè)定其平均脂肪酸含量為4.85％，所觀察到的范圍為3.5％-6.7％。
在根據(jù)較高的16∶0和18∶0含量從最初的轉(zhuǎn)化體中篩選的種子中，在隨后的世代中篩選同樣具有較高含量飽和脂肪酸硬脂酸和棕櫚酸的后代。與典型的非轉(zhuǎn)化優(yōu)良品系相比，硬脂酸的含量提高大約2-3倍，而棕櫚酸含量提高大約25-40％。由該轉(zhuǎn)化獲得的穩(wěn)定品系被命名為T1S。該品系業(yè)已交給美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA)保藏。
例11具有由硬脂酰-ACP脫飽和酶和油酰-ACP硫酯酶的組合改變產(chǎn)生的較高的硬脂酸含量的大豆在含有fasa等位基因的大豆品系和含有T1S基因(增加油酰ACP硫酯酶)的大豆品系之間進(jìn)行雜交，以便獲得F1后代。其目的是積累硬脂酰-ACP，這種物質(zhì)隨后被硫酯酶裂解導(dǎo)致在組織中積累硬脂酸。在隨后的世代中讓F1后代自交，以便獲得F2種子和F2∶3家族。然后選擇含有較高含量棕櫚酸和硬脂酸的F2∶3家族，種植并進(jìn)行自花授粉，以便獲得F3∶4后代。然后對(duì)來自F3植株的F4種子的樣品(F3∶4種子)進(jìn)行GC分析，以便可以測(cè)定單一的F3∶4表型。在表13中示出單株的脂肪酸特征，以總的種子飽和脂肪酸增加的順序排列。
表13由于增加了油酰-ACP硫酯酶和減少了硬脂酰-ACP脫飽和酶而具有高的飽和脂肪酸含量的單株的脂肪酸特征品系ID 各種脂肪酸含量(總種子脂肪酸的％) 世代和類型16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶37S-2244-616 36 7 33 7F3∶4單株7S-2244-715 35 8 34 7F3∶4單株7S-2244-315 35 7 34 7F3∶4單株7S-2236-413 35 15 30 6F3∶4單株7S-2236-214 33 9 37 7F3∶4單株7S-2236-613 34 9 36 6F3∶4單株7S-2236-713 34 9 36 6F3∶4單株7S-2244-114 32 9 37 7F3∶4單株7S-2244-414 32 9 37 7F3∶4單株7S-2244-514 32 9 37 7F3∶4單株7S-2236-315 30 11 37 6F3∶4單株7S-2240-312 33 13 35 6F3∶4單株7S-2240-212 32 11 37 6F3∶4單株7S-2240-412 31 13 37 6F3∶4單株7S-2240-512 31 11 38 6F3∶4單株7S-2240-112 29 13 39 6F3∶4單株7S-2236-113 25 11 42 7F3∶4單株例12極高硬脂酸大豆油的固體脂肪含量極高硬脂酸大豆是從例11所述植物上獲得的。按例1所述方法用這些種子制備油，并在多種溫度下分析脂肪酸組成和固體脂肪含量。
表14和15表示極高硬脂酸大豆油的組成和功能特征，硬脂酸的含量范圍為33％-38％。所有這些油都滿足人造奶油的固態(tài)性要求(為了進(jìn)行比較參見圖1的曲線)。這種高硬脂酸油的SFC特征與棒狀人造奶油或黃油的特征一致(參見圖4)。據(jù)信，源于例11的油以及具有類似組成的油能夠生產(chǎn)出這樣的脂肪制品，其SFC特征在25℃下低于20，優(yōu)選在25℃下低于15，更優(yōu)選在25℃下低于10，最優(yōu)選在25℃下低于5，在10℃下大于20，優(yōu)選在10℃下為20-50，最優(yōu)選在10℃下為35-50。因此，這種油可用于生產(chǎn)基本上不含反式脂肪酸的棒狀人造奶油，或者作為硬脂肪添加劑用于混合物中生產(chǎn)人造奶油或油基糊狀制品。
表14脂肪酸組成16∶018∶018∶118∶2 18∶320∶0極高硬脂酸A14.4 35.4 8.8 33.25.0 1.7極高硬脂酸B14.0 33.6 9.1 34.85.4 1.6極高硬脂酸C13.5 38.2 8.3 30.95.5 1.9表15作為溫度函數(shù)的SFCSFC％溫度 10° 15° 20° 25° 30° 35° 40°極高硬脂酸A 44.7 31.5 20.4 8.9 0 0.30極高硬脂酸B 36.3 23.9 15.6 4.2 0 0.1 0極高硬脂酸C 48.2 36.8 26.6 13.8 0.5 0.2 0例13生產(chǎn)高油酸和低飽和脂肪酸大豆的其他方法用披露于WO9606936中的啟動(dòng)子棕櫚酰-ACP硫酯酶編碼區(qū)植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化能產(chǎn)生大豆體細(xì)胞胚胎的培養(yǎng)物，同樣用詳細(xì)披露于WO9606936中的方法獲得轉(zhuǎn)化的可育大豆植株。測(cè)定從長在轉(zhuǎn)基因植物上的成熟的種子子葉上取出的種子切片的脂肪酸特征。所述植株中的小部分具有在極低飽和脂肪酸性狀上似乎發(fā)生了分離的種子。鑒定了三個(gè)這樣的植株；所有三種轉(zhuǎn)基因現(xiàn)象的低飽和酸類型平均具有組合的16+18∶0含量為總的脂肪酸的5.6％，而正常飽和脂肪酸類型平均為14.9％。
在表16中給出了組合來自最佳過程的三個(gè)植株的低飽和脂肪酸類型種子的228個(gè)種子切片的平均總的脂肪酸特征。
表16在生產(chǎn)高油酸和低飽和脂肪酸大豆時(shí)被用作親本之一的三個(gè)棕櫚酰-ACP硫酯酶共抑制大豆植株的脂肪酸特征
為了用上述植物作為低飽和脂肪酸親本，產(chǎn)生高油酸、低飽和脂肪酸種子表型，播種來自所述種子切片分析的剩余的種子，并生長到開花。在棕櫚酰-ACP硫酯酶共抑制植株和脂肪酸Δ-12脫飽和酶共抑制植株之間進(jìn)行正反交。由于在種植時(shí)，所述低飽和脂肪酸種子可以來自在轉(zhuǎn)基因上純合的種子或者轉(zhuǎn)基因雜合的種子，所述親本植株上的其余的花自花授粉。確定所述自花授粉所產(chǎn)生的分離模式，以便鑒定在低飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因上純合的植物，其特征是缺少正常的飽和脂肪酸種子。播種來自雜交的能使植株在低飽和脂肪酸轉(zhuǎn)基因上純化的種子。讓花進(jìn)行自花授粉并結(jié)實(shí)，通過種子切片法分析高油酸和低飽和脂肪酸表型的分離。種植其種子切片表現(xiàn)出理想表型的剩余的種子，并讓植株自花授粉，并對(duì)來自單株的混合種子進(jìn)行分析，證實(shí)所述理想表型。
序列表<110>納幕爾杜邦公司<120>能改變大豆油的質(zhì)量和功能的新型基因組合<130>BB-1156-A<140>
<141>
<150>60/085,030<151>MAY 11,1998<160>4<170>MICROSOFT OFFICE 97<210>1<211>1412<212>DNA<213>歐洲油菜<220>
<221>CDS<222>(36)..(1124)<220>
<221>mat_peptide<222>(210)..(1124)<400>1cggcacgaga cattttcttc ttcgatcccg aaaag atg ttg aag ctc tcg tgt 53Met Leu Lys Leu Ser Cys-55aat gcg act gat aag tta cag acc ctc ttc tcg cat tct cat caa ccg 101Asn Ala Thr Asp Lys Leu Gln Thr Leu Phe Ser His Ser His Gln Pro-50-45 -40gat ccg gca cac cgg aga acc gtc tcc tcc gtg tcg tgc tct cat ctg 149Asp Pro Ala His Arg Arg Thr Val Ser Ser Val Ser Cys Ser His Leu-35 -30 -25agg aaa ccg gtt ctc gat cct ttg cga gcg atc gta tct gct gat caa 197Arg Lys Pro Val Leu Asp Pro Leu Arg Ala Ile Val Ser Ala Asp Gln-20 -15 -10 -5gga agt gtg att cga gca gaa caa ggt ttg ggc tca ctc gcg gat cag 245Gly Ser Val Ile Arg Ala Glu Gln Gly Leu Gly Ser Leu Ala Asp Gln-1 1 5 10ctc cga ttg ggt agc ttg acg gag gat ggt ttg tcg tat aag gag aag 293Leu Arg Leu Gly Ser Leu Thr Glu Asp Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Lys15 20 25ttc atc gtc aga tcc tac gag gtt ggg agt aac aag acc gcc act gtc 341Phe Ile Val Arg Ser Tyr Glu Val Gly Ser Asn Lys Thr Ala Thr Val30 35 40gaa acc gtc gct aat ctt ttg 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Thr Leu Asp Tyr Arg Arg Glu Cys Gln Gln Asp Asp290 295 300Val Val Asp Ser Leu Thr Thr Thr Thr Ser Glu Ile Gly Gly Thr Asn305 310 315 320Gly Ser Ala Thr Ser Ala Ala Gln Gly His Asn Asp Ser Gln Phe Leu325 330 335His Leu Leu Arg Leu Ser Gly Asp Gly Gln Glu Ile Asn Arg Gly Thr340 345 350Thr Leu Trp Arg Lys Lys Pro Ser Asn Leu355 360<210> 3<211> 1307<212> DNA<213> 歐洲油菜<220><221> CDS<222> (38)..(1126)<300> 植物細(xì)胞<304> 7<306> 359-371<308> U17098<309> 1995-06-01<400> 3gctcgcctcc cacattttct tcttcgatcc cgaaaag atg ttg aag ctc tcg tgt 55Met Leu Lys Leu Ser Cys1 5aat gcg act gat aag tta cag acc ctc ttc tcg cat tct cat caa ccg 103Asn Ala Thr Asp Lys Leu Gln Thr Leu Phe Ser His Ser His Gln Pro10 15 20gat ccg gca cac cgg aga acc gtc tcc tcc gtg tcg tgc tct cat ctg 151Asp Pro Ala His Arg Arg Thr Val Ser Ser Val Ser Cys Ser His Leu25 30 35agg aaa ccg gtt ctc gat cct ttg cga gcg atc gta tct gct gat caa 199Arg Lys Pro Val Leu Asp Pro Leu Arg Ala Ile Val Ser Ala Asp Gln40 45 50gga agt gtg att cga gca 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1．一種大豆植物，在它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量大于21％，C18∶1的含量大于60％，C18∶2和C18∶3的組合含量低于7％。
2．如權(quán)利要求1的大豆植物，其中，所述植物是通過下列步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，所述第一親本的C18∶1的含量至少占總的種子脂肪酸的80％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼Δ-12脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本含有決定較高種子硬脂酸含量的fasa等位基因；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
3．由權(quán)利要求1的植物所獲得的種子。
4．由權(quán)利要求1的植物的種子所獲得的油。
5．如權(quán)利要求4的油，其中，所述油的OSI(110)大于15。
6．如權(quán)利要求4的油，其中，所述油的SFC在10℃下大于20，而在25℃下低于20。
7．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求4、5或6的油。
8．如權(quán)利要求7的人造奶油或糊狀制品，其中，所述人造奶油基本上不含反式脂肪酸。
9．一種適用于生產(chǎn)含有權(quán)利要求4、5或6的油的人造奶油或糊狀制品的混合脂肪制品。
10．如權(quán)利要求9的混合脂肪制品，其中，所述混合脂肪制品的OSI(110)大于15。
11．如權(quán)利要求9的混合脂肪制品，它還含有選自下列一組的至少一種成分全氫化大豆油，全氫化棉籽油，全氫化棕櫚油，部分氫化大豆油，部分氫化棉籽油，部分氫化棕櫚油，大豆油，玉米油，棕櫚油，canola油，向日葵油，花生油、紅花油或其混合物。
12．如權(quán)利要求10的混合脂肪制品，它還含有選自下列一組的至少一種成分全氫化大豆油，全氫化棉籽油，全氫化棕櫚油，部分氫化大豆油，部分氫化棉籽油，部分氫化棕櫚油，大豆油，玉米油，棕櫚油，canola油，向日葵油，花生油、紅花油或其混合物。
13．如權(quán)利要求9的混合脂肪制品，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
14．如權(quán)利要求10的混合脂肪制品，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
15．如權(quán)利要求9的混合脂肪制品，它還含有選自下列一組的至少一種成分全氫化大豆油，全氫化棉籽油，全氫化棕櫚油，大豆油，玉米油，棕櫚油，canola油，向日葵油，花生油、紅花油或其混合物，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
16．如權(quán)利要求10的混合脂肪制品，它還含有選自下列一組的至少一種成分全氫化大豆油，全氫化棉籽油，全氫化棕櫚油，大豆油，玉米油，棕櫚油，canola油，向日葵油，花生油、紅花油或其混合物，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
17．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求9的混合脂肪制品。
18．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求10的混合脂肪制品。
19．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求11的混合脂肪制品。
20．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求12的混合脂肪制品。
21．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求13的混合脂肪制品。
22．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求14的混合脂肪制品。
23．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求15的混合脂肪制品。
24．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求16的混合脂肪制品。
25．通過對(duì)權(quán)利要求4、5或6的油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解生產(chǎn)的制品。
26．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求25的制品。
27．一種適于生產(chǎn)含有權(quán)利要求25的制品的人造奶油或糊狀制品的混合脂肪制品。
28．如權(quán)利要求27的混合脂肪制品，它還含有選自下列一組的至少一種成分全氫化大豆油，全氫化棉籽油，全氫化棕櫚油，部分氫化大豆油，部分氫化棉籽油，部分氫化棕櫚油，大豆油，玉米油，棕櫚油，canola油，向日葵油，花生油、紅花油或其混合物。
29．在生產(chǎn)權(quán)利要求4、5或6的油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。
30．一種大豆植物，在它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0的含量大于10％ ，C16∶0和C18∶0的組合含量大于30％，C18∶1的含量大于55％，C18∶2和C18∶3的組合含量低于7％。
31．如權(quán)利要求30的大豆植物，其中，所述植物是通過以下步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，所述第一親本的C18∶1的含量至少占總的種子脂肪酸的80％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼Δ-12脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本含有決定較高種子硬脂酸含量的fasa等位基因和決定較高種子棕櫚酸含量的fap2等位基因；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
32．由權(quán)利要求30的植物所獲得的種子。
33．由權(quán)利要求30的植物的種子所獲得的油。
34．通過對(duì)權(quán)利要求33的油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解生產(chǎn)的制品。
35．在生產(chǎn)權(quán)利要求33的油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。
36．一種大豆植物，它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量大于42％，其中，所述植物是通過以下步驟生產(chǎn)(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，其中，所述第一親本的C18∶0的含量占總的種子脂肪酸的至少10％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼油酰-ACP硫酯酶的核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本含有決定較高種子硬脂酸含量的fasa等位基因；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
37．由權(quán)利要求36的植物所獲得的種子。
38．由權(quán)利要求36的植物的種子所獲得的油。
39．如權(quán)利要求38的油，其中，所述油的SFC在10℃下大于20，而在25℃下低于20。
40．一種含有權(quán)利要求38的油的人造奶油或糊狀制品。
41．如權(quán)利要求40的人造奶油或糊狀制品，它基本上不含反式脂肪酸。
42．一種適用于生產(chǎn)含有權(quán)利要求38或39的油的人造奶油或糊狀制品的混合脂肪制品。
43．如權(quán)利要求42的混合脂肪制品，它還含有選自下列一組的至少一種成分全氫化大豆油，全氫化棉籽油，全氫化棕櫚油，部分氫化大豆油，部分氫化棉籽油，部分氫化棕櫚油，大豆油，玉米油，棕櫚油，canola油，向日葵油，花生油、紅花油或其混合物。
44．如權(quán)利要求42的混合脂肪制品，其中，所述脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
45．如權(quán)利要求44的混合脂肪制品，它還含有選自下列一組的至少一種成分全氫化大豆油，全氫化棉籽油，全氫化棕櫚油，大豆油，玉米油，棕櫚油，canola油，向日葵油，花生油、紅花油或其混合物，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
46．一種含有混入其中的權(quán)利要求42的混合脂肪制品的人造奶油或糊狀制品。
47．一種含有混入其中的權(quán)利要求43的混合脂肪制品的人造奶油或糊狀制品。
48．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求44的混合脂肪制品。
49．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求45的混合脂肪制品。
50．通過對(duì)權(quán)利要求38或39的油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解生產(chǎn)的制品。
51．一種人造奶油或糊狀制品，它含有權(quán)利要求50的制品。
52．一種適用于生產(chǎn)含有權(quán)利要求50的制品的人造奶油或糊狀制品的混合脂肪制品。
53．如權(quán)利要求52的混合脂肪制品，它還含有選自下列一組的至少一種成分全氫化大豆油，全氫化棉籽油，全氫化棕櫚油，部分氫化大豆油，部分氫化棉籽油，部分氫化棕櫚油，大豆油，玉米油，棕櫚油，canola油，向日葵油，花生油、紅花油或其混合物。
54．在生產(chǎn)權(quán)利要求38或39的油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。
55．一種大豆植物，在它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量低于7％，C18∶1的含量大于87％，C18∶2和C18∶3的組合含量低于6％。
56．如權(quán)利要求55的大豆植物，其中，所述植物是通過以下步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，所述第一親本的C18∶1的含量至少占總的種子脂肪酸的80％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼Δ-12脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本含有決定較低的種子棕櫚酸含量的fapl等位基因和決定較低的種子棕櫚酸含量的fap3等位基因，或者含有編碼至少一個(gè)決定較低種子棕櫚酸含量的植物酰基-ACP硫脂酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，其中，所述硫脂酶對(duì)棕櫚酰-ACP的優(yōu)勢(shì)至少超過硬脂酰-ACP或油酰-ACP的兩倍；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
57．由權(quán)利要求55的植物所獲得的種子。
58．由權(quán)利要求55的植物的種子所獲得的油。
59．通過對(duì)權(quán)利要求58的油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解生產(chǎn)的制品。
60．在生產(chǎn)權(quán)利要求58的油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。
61．一種大豆植物，在它所產(chǎn)生的成熟種子中總的種子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的組合含量低于12％，C18∶1的含量大于84％，C18∶2和C18∶3的組合含量低于5％，其中，所述植物是通過以下步驟生產(chǎn)的(a)讓第一親本大豆植物與第二親本雜交，其中，所述第一親本的18∶1的含量至少占總的種子脂肪酸的80％，并且第一親本還含有至少一個(gè)編碼Δ-12脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，所述第二親本包括決定較低的種子亞麻酸含量的fan等位基因，或者至少一個(gè)編碼Δ-15脫飽和酶的大豆核酸片段的轉(zhuǎn)基因拷貝，另外，其中C18∶3的含量不足總的種子脂肪酸含量的4％；(b)從所述雜交步驟(a)獲得雜交種子，讓所述種子萌發(fā)，生長，并通過一個(gè)或多個(gè)自花授粉周期產(chǎn)生分離的大豆植物群體；和(c)從步驟(b)的分離群體中篩選能產(chǎn)生具有所述脂肪酸特征的種子的植物。
62．由權(quán)利要求61的植物所獲得的種子。
63．由權(quán)利要求61的植物的種子所獲得的油。
64．通過對(duì)權(quán)利要求63的油進(jìn)行氫化、分離、酯交換反應(yīng)或水解生產(chǎn)的制品。
65．在生產(chǎn)權(quán)利要求63的油時(shí)所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。
全文摘要
披露了能在大豆種子中產(chǎn)生新型脂類特征的新型基因組合,以及從所述種子中提取的油類。還披露了用于生產(chǎn)所述組合的方法。另外,披露了本發(fā)明的油類可用于生產(chǎn)人造奶油和糊狀制品。
文檔編號(hào)C11B1/10GK1300322SQ99806008
公開日2001年6月20日 申請(qǐng)日期1999年5月6日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月11日
發(fā)明者小·J·R·波斯, R·M·布洛格利, W·D·希茨, A·J·金尼, S·諾爾頓, S·A·塞巴斯迪安 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司