Rimbp3基因的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了RIMBP3基因在制備診斷結(jié)腸癌的試劑盒中的用途。本發(fā)明利用NCBI?GEO數(shù)據(jù)檢索將符合要求的5套大腸癌病例和正常人群基因組mRNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)納入研究范圍，通過對上述芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析，篩選出RIMBP3基因是差異顯著基因，相比正常組織，RIMBP3基因在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，并使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法驗(yàn)證了上述結(jié)論。據(jù)此，本發(fā)明還公開了一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒以及利用該試劑盒診斷結(jié)腸癌的方法。本發(fā)明一方面為研究結(jié)腸癌的分子機(jī)理提供新的思路，另一方面為早期診斷結(jié)腸癌提供了更為靈敏的診斷試劑盒。
【專利說明】RIMBP3基因的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種結(jié)腸癌診斷試劑盒及RMBP3基因在制備結(jié)腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]大腸癌(colorectal cancer, CRC)包括結(jié)腸癌和直腸癌，是國內(nèi)外常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命，其發(fā)生發(fā)展受眾多因素影響。但無論如何，歸根結(jié)底大腸癌是一種基因病，是體內(nèi)外環(huán)境相互作用的結(jié)果，它的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因的改變，表現(xiàn)為多基因多步驟的協(xié)同累積以及相互作用。隨著分子生物學(xué)研究的深入，愈來愈多的學(xué)者認(rèn)識到，孤立地檢測某些基因的表達(dá)狀態(tài)來分析基因的功能，難以對癌癥相關(guān)基因及其作用機(jī)制做全面、準(zhǔn)確地理解和把握。只有系統(tǒng)、平行地展現(xiàn)癌細(xì)胞生長、發(fā)展某個(gè)時(shí)段的基因表達(dá)譜(gene express1n profile),利用生物信息學(xué)方法對表達(dá)譜檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，才能從整體空間上把握與癌癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因及其表達(dá)、調(diào)控模式，推測和分析其生物學(xué)功能，篩選出癌癥診斷、預(yù)后的分子標(biāo)志物及治療的靶基因。近些年，國內(nèi)外已應(yīng)用基因芯片及高通量篩選等技術(shù)對大腸癌基因表達(dá)譜進(jìn)行了較多研究。但是不同的實(shí)驗(yàn)平臺及樣本的差異導(dǎo)致分析結(jié)果存在很多不一致性。
[0003]Meta分析可對同一個(gè)問題所發(fā)表相關(guān)研究報(bào)告的結(jié)果進(jìn)行收集、統(tǒng)計(jì)上的整合，以期獲得更準(zhǔn)確或更多的結(jié)果。這個(gè)分析能產(chǎn)生很多顯著的差異表達(dá)基因，能避免單個(gè)研究帶來的不正確性。Meta分析是在多個(gè)芯片實(shí)驗(yàn)研究中識別差異表達(dá)基因的強(qiáng)有力工具。此外，用Meta分析能識別出單個(gè)研究不能識別的差異基因，并且能有效地降低單個(gè)芯片數(shù)據(jù)的假陽性。
[0004]本發(fā)明通過對已發(fā)表的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析，篩選出影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，并使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)檢測驗(yàn)證臨床樣本中的表達(dá)，本發(fā)明通過生物信息學(xué)手段發(fā)掘這些基因在結(jié)腸癌中的作用，從而對結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行探究，為其診斷和治療提供一定的研究基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明通過對已發(fā)表的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析和QPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)RIMBP3基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與在正常組織中的表達(dá)存在差異。與正常組織相比，RIMBP3基因在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，通過檢測RMBP3基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，可以判斷受試者是否患有結(jié)腸癌。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供RMBP3基因在制備結(jié)腸癌診斷試劑盒中的用途。所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增RMBP3基因和管家基因的引物對。SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0007]上述技術(shù)方案中，PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩沖液包含:25mM KCl, 2.5mM MgCl2, 200mM(NH4)2SO40
[0008]引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物設(shè)計(jì)的常規(guī)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增RMBP3基因的正向引物序列為5 ’ -TGAAGGAGGAGCAGGAGGCACT-3 ’，反向引物序列為5’ -TTGATGACTTTGGCGGATGGAG-3’ ；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴(kuò)增該基因的正向引物序列為5’ -1TTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為 5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
[0009]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系，該逆轉(zhuǎn)錄體系包含:τ重復(fù)寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
[0010]優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含:250mMPH8.3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2,50mM 的 DTT。
[0011]RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)的非競爭性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑，RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0013]本發(fā)明的診斷試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0014]本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種診斷結(jié)腸癌的試劑盒。所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增RMBP3基因和管家基因的引物對。所述SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0015]上述技術(shù)方案中，PCR緩沖液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)選地，PCR緩沖液包含:25mM KCl, 2.5mM MgCl2, 200mM(NH4)2SO40
[0016]引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)引物設(shè)計(jì)的常規(guī)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)；優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增RMBP3基因的正向引物序列為5 ’ -TGAAGGAGGAGCAGGAGGCACT-3 ’，反向引物序列為5’ -TTGATGACTTTGGCGGATGGAG-3’ ；管家基因優(yōu)選GAPDH，擴(kuò)增該基因的正向引物序列為5’ -1TTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為 5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
[0017]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系，該逆轉(zhuǎn)錄體系包含:τ重復(fù)寡核苷酸Oligo (dT)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs。
[0018]優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含:250mMPH8.3 的 Tris-HCL，375mM 的 KCL，15mM 的 MgCl2,50mM 的 DTT。
[0019]RNA酶抑制劑可選用本領(lǐng)域常用的RNA酶抑制劑，優(yōu)選為大腸桿菌表達(dá)的非競爭性抑制RNA酶的重組蛋白酶。
[0020]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒還包含RNA提取試劑，RNA酶提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
[0021]本發(fā)明還提供了診斷結(jié)腸癌的方法，所述方法包括:
[0022](I)利用RNA提取試劑提取樣本總RNA ；
[0023](2)將步驟(1)獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0024](3)在熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上將RMBP3基因和管家基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測；
[0025](4)通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Δ ACT法進(jìn)行相對定量；
[0026](5)RIMBP3基因表達(dá)下調(diào)，表明研究對象為結(jié)腸癌患者。
[0027]步驟(1)的具體實(shí)施方法為:收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后:
[0028]①加入Trizol，室溫保存5min ；
[0029]②加氯仿0.2ml,用力振蕩離心管,充分混勻，室溫下放置5min_10min ；
[0030]③12000rpm高速離心15min后吸取上層水相(吸70%)到另一新離心管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上1min ；
[0031]④12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液,按lml/ml Trizol的比例加入75%DEPC乙醇洗滌沉淀(4°C保存)，洗滌沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5min ；
[0032]⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；
[0033]⑥用NanOdrOp2000紫外分光光度計(jì)測量RNA純度及濃度，凍存于_70°C。
[0034]步驟(2)的具體實(shí)施方法為:用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對IygS RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用25 μ I反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取IygS RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分:DEPC水，5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/L dNTP，0.lmmol/1 DTT, 30 μ mmol/1 OligodT, 200U/ μ I M-MLV RT，模板 RNA。42°C孵育 lh，72°C lOmin，短暫離心。
[0035]步驟(3)的具體實(shí)施方法為:采用25μ I反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。配制以下反應(yīng)體系=SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5 μ 1，正向引物(5 μ M/μ I) I μ 1，反向引物(5 μ M/μ I) I μ 1，模板cDNA 2.0 μ 1，無酶水8.5 μ I ;擴(kuò)增RMBP3基因的正向引物序列為5’ -TGAAGGAGGAGCAGGAGGCACT-3’，反向引物序列為 5’ -TTGATGACTTTGGCGGATGGAG-3’ ；擴(kuò)增GAPDH基因的正向引物序列為5 ’ -TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3 ’，反向引物序列為5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?95 °C 1min,(95°〇158，601:608)*45個(gè)循環(huán)。以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Λ Λ CT法進(jìn)行相對定量。
[0036]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于:(I)本發(fā)明首次公開了 RMBP3基因與結(jié)腸癌相關(guān)，RIMBP3基因有望成為診斷結(jié)腸癌的分子標(biāo)志物，并為研究結(jié)腸癌的分子機(jī)理提供新的思路。(2)利用檢測基因表達(dá)的方式診斷結(jié)腸癌的存在與否的方法更加靈敏，有利于疾病早期的診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0037]圖1表示熒光實(shí)時(shí)定量PCR測定在正常組織和結(jié)腸癌組織中RMBP3基因mRNA的相對表達(dá)量。
[0038]具體的實(shí)施方式:
[0039]下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不意味著限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0040]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0041]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042]實(shí)施例1篩選與結(jié)腸癌相關(guān)的基因
[0043]1.1NCBI GEO (Gene Express1n Omnibus)數(shù)據(jù)檢索
[0044]GEO(Gene Express1n Omnibus)數(shù)據(jù)庫是由NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心)開發(fā)維護(hù)，GEO數(shù)據(jù)庫作為最大的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫以芯片數(shù)據(jù)為主，此外亦包含一些非芯片類型的數(shù)據(jù)如SAGE (基因表達(dá)系列分析)數(shù)據(jù)、SARST (核糖體序列標(biāo)簽連續(xù)分析)數(shù)據(jù)、MS (質(zhì)譜)數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和新一代高通量測序數(shù)據(jù)(MPSS，大規(guī)模平行測序技術(shù))等。
[0045]a.檢索關(guān)鍵詞:("colorectal cancer" [MeSH Terms] OR^colorectal cancer"
[0046][All Fields])AND^Homo sapiens"[porgn]
[0047]b.研究中的樣本篩選策略:
[0048]限制研究類型為“express1n profiling by array”符合以下標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)集將納入我們的研究中:①所選數(shù)據(jù)集必須是全基因組的表達(dá)mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，且都為RNA-seq數(shù)據(jù)集；②這些數(shù)據(jù)來自于大腸癌病例組和對照組的活檢組織或培養(yǎng)的細(xì)胞；③本研究均考慮經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化或者原始數(shù)據(jù)集；最后，有5套RNA-seq數(shù)據(jù)集納入我們的研究中(表1)。
[0049]表1 8套結(jié)腸癌全基因組數(shù)據(jù)集的基本情況
[0050]

【權(quán)利要求】
1.RIMBP3基因在制備結(jié)腸癌診斷試劑盒中的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增RMBP3基因和管家基因的引物對；所述SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含:PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述擴(kuò)增RMBP3基因的引物對的序列如下:正向引物序列為5’ -TGAAGGAGGAGCAGGAGGCACT-3’，反向引物序列為5’ -TTGATGACTTTGGCGGATGGAG-3’;所述管家基因是GAPDH，擴(kuò)增GAPDH基因的正向引物序列為 5’ -1TTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為 5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR緩沖液包含:25mMKCL、2.5mMMgCL2,200mM (NH4)2SO40
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系或RNA提取試劑；所述逆轉(zhuǎn)錄體系包含T重復(fù)寡核苷酸Oligo dT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述RNA提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含:250mMPH8.3的Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
6.—種結(jié)腸癌的診斷試劑盒,其特征在于,所述診斷試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增RMBP3基因和管家基因的引物對；所述SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含=PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述擴(kuò)增RIMBP3基因的引物對的序列如 下:正向引物序列為5 ’ -TGAAGGAGGAGCAGGAGGCACT-3 ’，反向引物序列為5’ -TTGATGACTTTGGCGGATGGAG-3’;所述管家基因是GAPDH，擴(kuò)增GAPDH基因的正向引物序列為 5’ -1TTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列為 5’ -GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液包含:25mMKCL、2.5mM MgCL2,200mM(NH4)2SO40
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系或RNA提取試劑；所述逆轉(zhuǎn)錄體系包含T重復(fù)寡核苷酸Oligo dT、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs ;所述RNA提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含:250mMPH8.3 的 Tris-HCL、375mM 的 KCL、15mM 的 MgCL2、50mM 的 DTT。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131104SQ201410389732
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】肖文華, 屈雪玲, 王碩, 李小梅, 董偉偉, 趙慧霞 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院