專利名稱：含順－9,反－11亞油酸的護膚組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及施用于人類皮膚的局部用組合物以及其改善皮膚狀況和外觀的用途。
背景和現(xiàn)有技術(shù)皮膚易于受皮膚病、環(huán)境影響(風(fēng)、空調(diào)、集中供熱)而變壞或由于可因暴露于陽光下(光老化)而加速的正常的老化而變壞(慢性老化)。近年來，對用于改善皮膚外觀和狀況的化妝品和化妝方法的需求已有巨大的增長。
消費者越來越尋求能治療或延遲慢性老化和光老化皮膚的表現(xiàn)癥狀如皺紋、條紋、松垂、色素沉著過多和老年斑的“抗老化”化妝品。
消費者也常常希望從化妝品得到除抗老化外的其它益處?！懊舾衅つw”的概念也使得消費者對改善敏感、干燥、粗糙和/或脫皮皮膚的外觀和狀況和減輕發(fā)紅、發(fā)炎和/或發(fā)癢皮膚的化妝品提出需求。消費者也需要治療斑點、丘疹、瑕疵等的化妝品。
包括多不飽和必需脂肪酸的長鏈甘油三酯、游離酸和其堿或銨鹽的用于改善皮膚狀況和外觀的護膚化妝品和皮膚病組合物為本領(lǐng)域所熟悉。例如，GB2181349A特別描述了用于改善皮膚光滑性和彈性的由亞油酸的甘油三酯組成的組合物。一種來自Dr.August WolffGmbh的商品“Linola Fettn”可用于治療干燥皮膚病和皮膚病，其特別包含共軛亞油酸的9，11異構(gòu)體的混合物。
無論如何，人們?nèi)匀徊粩嘈枨笥杏糜诰植渴┯糜谄つw來治療/延遲老化和光損傷皮膚的表現(xiàn)癥狀如皺紋、條紋、松垂、色素沉著過多和老年斑的可替代的有效化妝品組合物。特別需要除了提供抗老化外還提供其它護膚益處如改善干燥、粗糙和脫皮皮膚的外觀和狀況和減輕發(fā)炎和發(fā)癢皮膚的組合物和化妝方法。
我們已經(jīng)驚異地發(fā)現(xiàn)可通過將化妝品組合物施用于皮膚來獲得對常規(guī)的由于慢性老化或光老化造成的皮膚病如皺紋、條紋、松垂、色素沉著過多和老年斑，和/或敏感、干燥、粗糙、脫皮、發(fā)紅、發(fā)癢、發(fā)炎皮膚的有效治療和預(yù)防，所述化妝品具體富含一種特殊的共軛亞油酸的異構(gòu)體或其衍生物。
本發(fā)明簡述本發(fā)明的第一方面提供了一種局部用組合物，包括(a)共軛亞油酸和/或其包括共軛亞油酸部分的衍生物，其中至少50％(重量)的共軛亞油酸和/或部分以順9反11異構(gòu)體的形式存在；和(b)一種皮膚病學(xué)上可接受的載體。
這種組合物具體可用于局部施用于人類皮膚，用于化妝治療/預(yù)防選自皺紋、松垂、光損傷皮膚、敏感皮膚、干燥皮膚、粗糙皮膚、脫皮皮膚、發(fā)紅皮膚、發(fā)炎皮膚、發(fā)瘁皮膚和老年斑等皮膚病。所述組合物也可用作化妝品施用于皮膚上治療斑點、丘疹和瑕疵或者作為化妝護膚品促進皮膚修復(fù)和/或促進皮膚的膠原沉積。
本發(fā)明第二方面提供了治療/預(yù)防選自皺紋、松垂、光損傷皮膚、敏感皮膚、干燥皮膚、粗糙皮膚、脫皮皮膚、發(fā)紅皮膚、發(fā)炎皮膚、發(fā)癢皮膚和老年斑的皮膚病的化妝方法，所述方法包括將如上所述的局部用組合物施用到皮膚上。
在本發(fā)明的另一方面也提供了在用于治療/預(yù)防選自皺紋、松垂、光損傷皮膚、干燥皮膚、粗糙皮膚、脫皮皮膚、敏感皮膚、發(fā)炎皮膚、發(fā)瘁皮膚和老年斑的皮膚病的局部用組合物中共軛亞油酸和/或其含共軛亞油酸部分的衍生物的用途，其中至少50％(重量)的共軛亞油酸和/或部分以順9反11異構(gòu)體的形式存在。
本發(fā)明的組合物和方法因此提供了抗老化的益處，其在改善皮膚彈性下提高了皮膚光滑性和柔軟性并在改善膚色下減少或延遲皮膚出現(xiàn)起皺和老化。獲得了在外觀、質(zhì)地和狀況方面總的改善，特別是光度、潔度方面的改善，使皮膚總體呈現(xiàn)出更年輕的外表。本發(fā)明的組合物和方法也有益于減輕和舒緩敏感、干燥、粗糙、發(fā)炎、發(fā)紅、脫皮和發(fā)癢的皮膚。因此本發(fā)明方法和組合物有利地提供了寬范圍的護膚益處。
此中所用的術(shù)語“治療”包括減少、延遲和/或防止上述的皮膚病諸如起皺、老化、光損傷、干燥和/或發(fā)炎皮膚并通常通過防止或減少皺褶和提高柔韌性、結(jié)實性、光滑性、柔軟性和彈性來提高皮膚的質(zhì)量和改善了皮膚的外觀和質(zhì)地。按照本發(fā)明的化妝品組合物、化妝方法和共軛亞油酸的用途可用于治療已經(jīng)起皺、老化、光損傷、干燥和發(fā)炎狀況下的皮膚或用于處理幼嫩的皮膚以防止或減少前述的那些由于正常老化/光老化過程導(dǎo)致的破壞性變化。本發(fā)明的詳細說明富含順9.反11異構(gòu)體的共軛亞油酸共軛亞油酸(后文稱為CLA)包括一類亞油酸的位置和幾何異構(gòu)體，其中可以是順和反雙鍵在(6，8)，(7，9)，(8，10)，(9，11)，(10，12)或(11，13)位置上的各種構(gòu)型。因此存在CLA的二十四種不同異構(gòu)體。
本發(fā)明組合物的主要活性物是順9，反11(后文稱為c9，t11)異構(gòu)體。所述游離酸的這種具體異構(gòu)體具有下面所示的結(jié)構(gòu)(I) 本發(fā)明也包括所述游離酸的衍生物，由此包含了共軛亞油酸部分。優(yōu)選的衍生物包括源于所述酸的羧基的取代的物質(zhì)，諸如酯(如視黃酯(retinyl esters)、甘油三酯、一甘油酯、甘油二酯、磷酸酯)、酰胺(如神經(jīng)酰胺衍生物)、鹽(如堿金屬和堿土金屬鹽、銨鹽)；和/或那些源于C18碳鏈的取代的衍生物，諸如α羥基和/或β羥基衍生物。
對于甘油三酯衍生物來說，包括所有在甘油主鏈上CLA取代基的位置異構(gòu)體。所述甘油三酯必須包含至少一個CLA部分。例如，在甘油主鏈的三個可酯化位置上，1和2號位可被CLA酯化而3號位被另一種類脂酯化，或者甘油主鏈上的1和3號位被CLA酯化，而2號位被另一種類脂酯化。
在本說明書中所用的術(shù)語“共軛亞油酸”或“CLA”均應(yīng)理解為也包括其含CLA部分的衍生物。“CLA部分”是指CLA衍生物的CLA脂肪?；糠帧?br> “富含c9，t11異構(gòu)體的CLA”是指在組合物中存在的CLA和/或CLA部分的總量的至少50％(重量)為順9，反11異構(gòu)體的形式。優(yōu)選組合物中存在的CLA和/或CLA部分的至少70％(重量)、最優(yōu)選至少90％(重量)為c9，t11異構(gòu)體的形式。
本發(fā)明的CLA和/或其包括CLA部分的衍生物(其中在組合物中存在的CLA和/或CLA部分的總量的至少50％(重量)為順9，反11異構(gòu)體的形式)可按照在WO 97/18320中公開的方法制備。優(yōu)選的制備方法公開于下面的實施例1中。
本發(fā)明使用的活性物，即富含c9，t11異構(gòu)體的CLA以有效量存在于所述局部用組合物中。通常所述活性物的總量為所述組合物的0.00001-50％(重量)。為了以最低的成本獲得最大的效益，更優(yōu)選活性物的量為0.01-10％，最優(yōu)選為0.1-5％。皮膚病學(xué)上可接受的媒介物本發(fā)明的組合物也包括皮膚病學(xué)上/化妝品上可接受的媒介物，用作活性物(即富含c9t11異構(gòu)體的CLA)的稀釋劑、分散劑或載體。所述媒介物可包括常用于護膚品的物質(zhì)諸如水、液體或固體潤膚劑、硅油、乳化劑、溶劑、潤濕劑、增稠劑、粉末、噴射劑等。
所述媒介物通常構(gòu)成所述組合物的5-99.9％(重量)，優(yōu)選25-80％(重量)，并且可在沒有其它化妝品助劑的情況下構(gòu)成組合物的剩余部分。任選的對皮膚有益物質(zhì)和化妝品助劑除了所述活性物(富含c9 t11異構(gòu)體的CLA)外，也可包括其它特殊的對皮膚有益的活性物諸如防曬劑、亮膚劑、皮膚鞣劑(tanningagents)。
所述媒介物還可包括助劑，諸如香料、抗氧化劑、遮光劑、防腐劑、著色劑和緩沖劑。產(chǎn)品制備、形式、使用和包裝為了制備本發(fā)明的局部使用組合物，可使用常規(guī)的制備護膚品的方式?；钚越M分通常以常規(guī)方式摻入到皮膚病學(xué)上可接受的載體中?？墒紫葘⒒钚越M分適當(dāng)?shù)厝芙饣蚍稚⒂谝徊糠謱⒒烊氲浇M合物中的水或另一種溶劑或液體中。優(yōu)選的組合物是水包油或油包水乳液。
所述組合物可以是常規(guī)的護膚品的形式諸如膏、凝膠或露等。所述組合物也可以是所謂的“洗凈(wash off)”產(chǎn)品的形式如沐浴膠或淋浴膠，可能含有促進活性物在洗滌時與皮膚粘附的釋放體系。最優(yōu)選所述產(chǎn)品為“保留(cleave on)”產(chǎn)品，即在將其施用于皮膚后無需立即特意的洗滌步驟的施加到皮膚上的產(chǎn)品。
所述組合物可以適合的方式包裝，諸如以常規(guī)方式包裝于罐、瓶、管、滾珠(roll-ball)等中。
可每天實施一次或多次本發(fā)明的方法以施用于需要治療的皮膚上。根據(jù)皮膚狀況、本發(fā)明方法所用活性組分的濃度、所用的組合物的量和施用頻率，可在3到6個月后觀察到皮膚外觀的改善。通常使用手或手指或適合的裝置將少量的組合物(如0.1-5ml)從適合的容器或涂敷器施用到皮膚上和涂覆和/或擦到皮膚上。根據(jù)組合物配制成的是“保留”型或“洗凈(rinse-off)”型產(chǎn)品，可任選接著進行洗滌步驟。
為了使本發(fā)明更容易地理解，提供了下面的實施例，但是這些實施例只用于說明。
通過將紅花油高溫堿處理產(chǎn)生具等量c9，t11和t10，c12 CLA異構(gòu)體的CLA來制備混合的CLA異構(gòu)體。通過使用白地霉作為催化劑用月桂醇選擇性酯化從混合物分離出富含c9，t11 CLA的CLA。將富含c9t11的CLA水解轉(zhuǎn)化成甘油三酯。經(jīng)過酯化步驟并進行分離后，剩余的CLA游離酸富含有t10，c12 CLA。1、混合CLA異構(gòu)體的制備通過混合并加熱到80-85℃將分析純(AR)氫氧化鈉(0.6kg)溶解于6kg藥物級的丙二醇中。將樣品冷卻并加入2kg紅花油。使用標準中試設(shè)備在170℃快速攪拌下將混合物回流3小時。將反應(yīng)混合物冷卻到約95℃，將攪拌器調(diào)整到中速，使用1.280升溶解于軟化水(8升)中的35.5％鹽酸中和所述混合物，保持溫度約90℃。使反應(yīng)混合物沉降并排去水相。在90℃下，將油相用2×1升5％分析純鹽溶液和2×1升軟化水洗滌，棄去任何含皂物質(zhì)。將富含CLA油在真空100℃干燥，然后在約50℃排出并過濾通過含Whatman濾器和C鹽-hvflo-助濾劑的薄層的布氏系統(tǒng)。將混合異構(gòu)體CLA油貯存在-25℃的氮氣下待用。通過該方法制備的油的組成列于下表1中
表1
2、富含c9 t11異構(gòu)體的CLA的制備(I)月桂酯的制備將由紅花油制備的CLA(2.0kg)與5.96kg軟化水一起加入到2×摩爾當(dāng)量的月桂醇(1-十二烷醇；98％，購自Aldrich Chemicals)中。將溫度調(diào)節(jié)到25℃并加入與少量水預(yù)混的1％(重量)白地霉(購自日本的Amano Pharmaceuticals)，并劇烈攪拌。在44小時停止反應(yīng)。將容器加熱到80-90℃，排去水層并將油層用軟化水洗滌并在真空100℃下干燥30分鐘。將油冷卻到50℃并通過含Whatman濾器和C鹽-hyflo-助濾劑的薄層的布氏系統(tǒng)過濾。
(II)富含c9，t11 CLA酯的分離在130℃通過分子蒸餾以25-35毫升/分鐘的速率去除殘留的月桂醇。通過在158℃蒸發(fā)以25-35毫升/分鐘的流量將殘留物粗分成月桂酯(富含c9，t11 CLA)和游離酸(富含t10，c12 CLA)。在月桂酯殘留物中殘余的游離酸通過在170℃以30-40毫升/分鐘的流量的進一步蒸餾來降低。在90℃使用330ml 4M分析純的氫氧化鈉將2790g月桂酯殘留物中和，接著從水相分離出油，將油用軟化熱水洗滌3次、再用0.1M堿洗滌并用熱水洗滌兩次。將富含月桂酯油樣品如前那樣干燥。
(III)富含c9，t11 CLA月桂酯的皂化將富含c9，t11 CLA的月桂酯用分析純氫氧化鈉/96％食品級乙醇皂化并用分析純濃鹽酸再酸化。將含富含CLA游離脂肪酸的反應(yīng)混合物在100℃下干燥并如前面那樣在約50℃下過濾。在132℃下以25-30毫升/分鐘的速率蒸發(fā)去月桂醇。為了除去任何殘留的月桂醇，使用SP392 Mucor miehei脂酶(5％，購自Novo Nordisk的batch lux0110)，將游離醇用反應(yīng)混合物中存在的脂肪酸酯化。在真空155℃下使用分子蒸餾以15-20ml/min的速率從月桂酯中分離出含有富含c9t11 CLA的脂肪酸。通過上述方法制備的富含c9 t11 CLA的制劑的組成列于下表2中表2
3、富含t10，c12異構(gòu)體的CLA的分離將由上面步驟(II)獲得的CLA游離酸在160-165℃下以20-30ml/min的速率再次蒸餾以降低酯含量。通過在131℃以25-30ml/min的速率進一步蒸餾減少殘留的月桂醇。通過如上面步驟(III)所述的使用SP392 Mucor miehei脂酶對c9，t11異構(gòu)體進行的的再酯化來減少任何殘留的月桂醇。通過所述的對c9，t11異構(gòu)體的蒸餾去除形成的月桂酯，產(chǎn)生富含t10，c12的CLA，其組成列于下表3中表3
實施例2c9，t11 CLA甘油三酯的制備將按照實施例1制備的富含c9，t11的CLA(55g)與5.55g(10.1％)甘油(購自Ellis and Everards的Pricerine 9083甘油，化學(xué)純)和3g(約5％)SP392 Mucor Meihie非特異性脂酶(購自Novo Nordisk Batch Lux0110的Mucor Meihie)混合。伴隨著細微的氮氣流在60℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中真空下攪拌混合的材料。
24小時后，游離脂肪酸水平降低到12.7％，再加入0.15g甘油。48小時后，游離脂肪酸水平降低到3.4％，通過將混合物過濾通過在布氏濾器上的C鹽硅藻土助濾劑的薄層停止反應(yīng)并收集CLA甘油三酯油相，其組成列在下表4中表4
實施例3該實施例證實富含c9 t11異構(gòu)體的CLA的抗老化益處。
為了進行比較，對在局部視黃酸處理后的活體皮膚上的前膠原-I和核心蛋白聚糖的正調(diào)節(jié)的鑒定已知作為主要基質(zhì)皮膚蛋白的膠原賦予皮膚拉伸強度。已知核心蛋白聚糖是對在皮膚的胞外基質(zhì)上膠原的受控和正確沉積重要的蛋白聚糖。本領(lǐng)域已知皮膚膠原和核心蛋白聚糖的水平隨皮膚老化和/或光損傷而顯著降低。許多研究表明皮膚中膠原I型的水平隨年齡和/或隨光損傷增加而降低(例如Lavker，R.J.Inv.Derm.，(1979)，73，79-66；Griffiths等.N.Eng.J.med.(1993)329，530-535中描述)。在核心蛋白聚糖的情況下，已經(jīng)表明在活體外光損傷的皮膚上mRNA表達和蛋白聚糖的表達極大地降低(Bernstein et al.Lab.Invest.(1995)72，662-669)。因此這些皮膚蛋白質(zhì)水平的降低是與導(dǎo)致皺紋和松弛的皮膚拉伸強度的降低相聯(lián)系的。
本領(lǐng)域熟知視黃酸是有效的抗老化活性物并且誘發(fā)光損傷皮膚的皮膚修復(fù)。已經(jīng)表明用視黃酸進行局部處理后通過在皮膚上新的膠原淀積和合成達到了皺紋消除和皮膚修復(fù)(例如，Griffiths等人，N.Eng.J.med.(1993)329，530-535)。通過使用視黃酸增加皮膚膠原水平增強皮膚基質(zhì)提供了抗老化/皮膚修復(fù)益處。前膠原I是膠原的前體。隨受試混合物施用產(chǎn)生的前膠原I的增加是膠原水平提高的一個信號。
對兩組其中每個人的外側(cè)前臂受到相同或幾乎相同的輕度到中度光損傷的婦女進行康復(fù)。向她們提供在潤濕基底中的0.05％視黃酸(Retinova)并且也提供具類似感覺特征的顏色匹配但是沒有活性成分的潤濕膏(Dermacare露)作為空白對照物。兩組的每個參試者在一外側(cè)前臂施用Retinova，另一外側(cè)前臂施用空白劑(Dermacare)。第一組每日在其外側(cè)前臂施用所述產(chǎn)品14周，第二組在其外側(cè)前臂施用所述產(chǎn)品28周。研究的最后從每只前臂的處理區(qū)域鉆取兩個完整的厚度為4mm的活檢組織。進行從受試者提取的活組織的免疫組織化學(xué)分析以驗證與空白劑處理的前臂相比視黃酸處理對皮膚胞外基質(zhì)成分核心蛋白聚糖和前膠原-I的表達的影響。采用下面的方法材料蠟部分的抗體稀緩沖液由Tris緩沖的鹽水(TBS)、3％牛血清白蛋白(BSA)、0.05％Triton X-100和0.05％疊氮化鈉組成。前膠原-I(氨基端基)的第一抗體從Chemicon International Inc.獲得(目錄號MAB1912，大鼠IgG1)并以1∶800的稀釋度用于經(jīng)用胰蛋白酶預(yù)處理(0.5mg/ml，25分鐘，37℃)的蠟切片上，在4℃過夜。核心蛋白聚糖的第一抗體從Biogenesis獲得(兔多克隆的)并以1∶800的稀釋度用于蠟切片上，在4℃下過夜?？勾笫笊锼鼗牡诙贵w從DAKO獲得(目錄號E0468，兔多克隆的)并以1∶400的稀釋度施用于蠟切片上。抗兔生物素化的第二抗體從Amersham獲得(目錄號RPN1004，驢多克隆的)并以1∶400的稀釋度施用于蠟切片上。鏈霉抗生物素結(jié)合的堿性磷酸酶從Zymed獲得(目錄號43-4322)并以1∶2500的濃度使用。固紅色原從DAKO獲得(目錄號K597)。Gills#3 Haemotoxylin核復(fù)染劑從Sigma獲得(目錄號GHS-3)、過濾并不稀釋直接使用。胰蛋白酶從Sigma獲得(目錄號T-7186)并且載玻片采用來自DAKO的Glycergel(目錄號C563)封固。方法將活檢組織的蠟切片封固在涂覆硅烷的載玻片上并在55℃下烘烤18小時。通過二甲苯和乙醇將載玻片脫蠟并進入水中，然后轉(zhuǎn)移到TBS。使用DAKO筆圈起所述切片。正如對每個抗體指明的那樣，需要時使用胰蛋白酶將所述切片處理以恢復(fù)抗原(antigen retrieval)。當(dāng)需要恢復(fù)抗原時，將載玻片在35℃下用0.5mg/ml胰蛋白酶(Sigma目錄號T-7186)溫育25分鐘。隨后用TBS洗去(2×2分鐘)蛋白酶。在恢復(fù)抗原(如果需要)后或者在直接圈起所述切片后，在濕潤室中在室溫下使用作為封閉溶液的5％第二抗體宿主血清的TBS/0.5％BSA/0.1％疊氮化鈉溶液封閉非特異性抗體接合至少20分鐘。排出過量封閉溶液，但保持所述切片濕潤。然后將所述切片在濕潤室中用第一抗體(按上面的描述作適當(dāng)稀釋)在4℃下溫育過夜。然后從所述切片排出抗體，但不讓其干燥。然后用TBS洗滌所述載玻片以去除未接合的第一抗體---漂洗1分鐘后進行3次五分鐘洗滌---然后在濕潤室中用適合的第二抗體(按上面所述適當(dāng)稀釋)在室溫下溫育1小時。隨后將抗體溶液從載玻片排出而不讓切片干燥。將載玻片用TBS洗滌，漂洗一分鐘后洗滌4×5分鐘以便除去未接合的第二抗體。對于生物素化的第二抗體來說，所述切片用鏈霉抗生物素綴合物在37℃溫育45分鐘，然后在TBS中洗滌除去未接合的鏈霉抗生物素綴合物。加入色原并監(jiān)視其顯色過程以免過度著色。然后將所述切片進行復(fù)染色和封固。
通過使用光學(xué)顯微術(shù)目視評價免疫組織化學(xué)染色切片來測定視黃酸(Retinova)和空白對照劑(Dermacare)處理部位間前膠原-I和核心蛋白聚糖表達的差異。
正如下表5所示，該分析驗證了在局部施用視黃酸(Retinova)后在光損傷皮膚上前膠原-I和核心蛋白聚糖兩者明顯的正調(diào)節(jié)作用。表5視黃酸處理對活體皮膚前膠原I和核心蛋白聚糖表達的影響
因此胞外基質(zhì)組分前膠原I和核心蛋白聚糖是視黃酸誘導(dǎo)皮膚修復(fù)的可清楚辨明的指示劑。測量人皮膚成纖維細胞中核心蛋白聚糖合成的方法皮膚成纖維細胞條件培養(yǎng)基的制備將第二次傳代(P2)的原代人包皮成纖維細胞以10,000細胞/平方厘米的密度接種到12孔板中并在補充有10％胎牛血清的Dulbeccos改進的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中在5％二氧化碳和4％氧氣的氣氛下保持24小時。之后將細胞用無DMEM的血清洗滌并隨后在新鮮的無DMEM血清中再溫育60小時。然后將成纖維細胞單層用無DMEM血清再次洗滌。將測試試劑和對照載體加入到細胞中使體積增加三倍而最終達到每孔0.4毫升新鮮無DMEM血清的體積并再溫育24小時。將這種成纖維細胞條件培養(yǎng)基立即分析或在液氮中快速冷凍并貯存在-70℃待進一步分析。然后對細胞計數(shù)并隨后將斑點印跡分析得到的數(shù)據(jù)標準化成細胞數(shù)目。
在皮膚成纖維細胞條件培養(yǎng)基中核心蛋白聚糖蛋白質(zhì)的斑點印跡測定往用媒介物(作為對照)或測試試劑處理的皮膚成纖維細胞條件培養(yǎng)基樣品中補充20mM二硫蘇糖醇(200mM貯備液的1∶10稀釋液)和0.1％十二烷基硫酸鈉(10％貯備液的1∶100稀釋液)，良好混合后在75℃溫育2分鐘。通過將在175cm2燒瓶中以10000細胞/cm2的密度接種的成纖維細胞的純成纖維細胞條件培養(yǎng)基的系列稀釋得到供分析的標準物并如上所述保持在無DMEM的血清中。分析樣品按廠商指南中的所述使用Bio-Rad的96孔Bio-Dot裝置一式三份地施加到預(yù)潤濕的Immobilon-P轉(zhuǎn)移膜片上。每孔施加約200μl培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基在重力下通過所述膜過濾(30分鐘)，之后將膜用PBS(200μl)洗滌兩次。將這些PBS洗滌液在重力下過濾通過所述膜(2×15分鐘)。然后將Bio-Dot裝置與真空歧管連接并在抽吸下進行第三次和最后一次的PBS洗滌。拆卸所述裝置，移出所述膜，按需要快速切割后置于4℃下的封閉緩沖液中并過夜。將制備用于核心蛋白聚糖分析的膜用3％(w/v)BSA/0.1％(v/v)吐溫20的PBS溶液封閉。第二天，將所述膜用人核心蛋白聚糖第一抗體(兔多克隆的；Biogenesis)的1∶10000稀釋液在室溫下探測2小時。隨后將所述膜用TBS/0.05％吐溫20洗滌(3×5分鐘)并然后在室溫下用抗兔F(ab’)2片斷(Amersham)的1∶1000稀釋液溫育1小時。接著將Immobilon板再用TBS/吐溫20洗滌(3×5分鐘)后在室溫空氣下干燥。將干燥膜用噻璐玢包裹并暴露于分子動力學(xué)貯存磷光體屏(Molecular Dynamics storage phosphorscreen)16-18小時。在最后，使用ImageQuantTM軟件通過磷光成像儀(phosphorimager，分子動力學(xué)磷光成像儀SF)掃描曝光的屏。通過使用在ImageQuantTM中的定量工具進行計算機輔助圖象分析來評價點密度，標準化成細胞數(shù)并相對于100任意單位媒介物處理的對照值測定各種受試試劑對核心蛋白聚糖合成的影響。測試下表6列出了被評價其對人皮膚成纖維細胞中核心蛋白聚糖合成影響的試劑及其施用的量。為了將結(jié)果標準化，相對于100任意單位的媒介物處理對照值測定受試物質(zhì)的影響。
在表中“CLA c9，t11”是指總CLA的93％(重量)是c9，t11異構(gòu)體，即屬于本發(fā)明范圍的活性劑。這種活性劑按上面實施例1的描述制備。
在表中“CLA t10，c12”是指總CLA的80.5％(重量)是具有下面結(jié)構(gòu)2的t10，c12異構(gòu)體
因此該試劑不屬于本發(fā)明的范圍。其按實施例1的描述制備。
在表中的“CLA混合物”是指1∶1比率的c9，t11異構(gòu)體和t10，c12異構(gòu)體的混合物，其中各異構(gòu)體占總CLA的47％(重量)。因此這種試劑不屬于本發(fā)明的范圍。其按實施例1的描述制備。
用“CLA t10，c12”和“CLA混合物”進行的試驗用于對照。
同樣為了進行比較，用視黃酸進行了試驗以評價其對人皮膚成纖維細胞中核心蛋白聚糖合成的影響。在該試驗中所用的試劑的濃度對細胞生存力沒有影響。表6各種試驗化合物處理對通過成纖維細胞的核心蛋白聚糖合成的影響
表6的結(jié)果表明富含c9，t11異構(gòu)體的CLA與對照物和t10，c12CLA及CLA混合物相比顯著正調(diào)節(jié)了人皮膚成纖維細胞中核心蛋白聚糖的合成。
皮膚核心蛋白聚糖的水平與皮膚改善的狀況和外觀相聯(lián)系。增加皮膚核心蛋白聚糖的水平對于皮膚中膠原受控和正確的淀積是重要的，而膠原的受控和正確淀積與許多皮膚益處如皺紋消除和光損傷皮膚的修復(fù)相聯(lián)系。
用視黃酸(1μm)的對照試驗與100任意單位的媒介物處理的對照值相比，顯示出核心蛋白聚糖的正調(diào)節(jié)，138±14.0(p＝0.035，n＝4)。令人驚異的是，該數(shù)據(jù)還表明受共軛亞油酸的c9，t11異構(gòu)體影響的人的皮膚成纖維細胞中核心蛋白聚糖的合成的正調(diào)節(jié)的幅度超過了基準的抗老化皮膚修復(fù)活性物視黃酸的正調(diào)節(jié)的幅度。
表7
結(jié)果以5μg/ml SDS生存力值的百分比表示。
與通過使用Student-Neunan-Kuels多重比較(p＜0.05)的1wayANOVA測定的5μg/ml SDS值比較，c9 t11 CLA(本發(fā)明范圍內(nèi)的試劑)顯著提高了生存力。與SDS對照物相比，t10 c12 CLA(本發(fā)明范圍外的試劑)并沒有提高細胞生存力。
該方法表明刺激劑的角質(zhì)細胞毒性與活體內(nèi)試劑的刺激效果相關(guān)(Lawrence，JN，Starkey，S.，Dickson，F(xiàn)M & Benford，DJ.用于評價皮膚刺激力的人和大鼠角質(zhì)細胞培養(yǎng)物的用途，Toxicol.In Vitro.10，331-340(1996).)。這里我們證明用“c9 t11 CLA”處理顯著降低了SDS對角質(zhì)細胞的毒性作用，因此它具有抗刺激功能，而“t10 c12 CLA”不能顯著改變SDS對這些細胞的毒性，因此并沒有抗刺激效果。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性用熒光單位/ng DNA表示。角化膜的形成角化膜(CE)形成通過定量保留在24孔板的孔中的角質(zhì)細胞培養(yǎng)基中的SDS不溶性蛋白質(zhì)來評價。去除Triton提取緩沖液(如上述)后，將孔用pH9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(Sigma)洗滌。然后每個孔用偶合到生物素(以10mg/ml溶解于DMSO中的貯備液)的N-羥基琥珀酰胺，以0.1mg/ml的量在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液中溫育(200μl/孔)。將板在室溫攪拌下溫育60分鐘。加入50ul/孔的10％SDS、100mMDTT并將板在60℃下再溫育60分鐘。使用斑點印跡裝置將包膜過濾(在TBS-吐溫中洗滌)在PVDF膜(在TBS-0.5％吐溫中預(yù)封閉)上。將所述膜在室溫下用稀釋1/1000的鏈霉抗生物素-HRP(Zymed)小心探測60分鐘、洗滌(TBS-吐溫)并用ECL基質(zhì)(Pierce)溫育2分鐘。將所述膜包裹在“粘著-膠片(cling-film)”中并曝光在X-射線膠片上以目測蛋白質(zhì)。通過掃描和Phoretix分析定量點強度。其結(jié)果列于下面的表8。每個測量參數(shù)的結(jié)果均以對照值的百分比表示。
表8
*p＜0.01與所述對照物(只有DMSO處理)相比，所述“c9 t11 CLA”(本發(fā)明范圍內(nèi)的試劑)顯著(p＜0.01)提高了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性和CE的形成。與對照物相比，“t10 c12 CLA”(本發(fā)明范圍外的試劑)并沒有提高角質(zhì)細胞分化的這兩個參數(shù)。
因此我們證實了用“c9 t11 CLA”處理顯著提高了角質(zhì)細胞在活體內(nèi)的分化，因此說明其具有增強分化功能，而“t10 c12 CLA”并沒有顯著改變角質(zhì)細胞的分化狀態(tài)，因此沒有增強分化的作用。因此“c9 t11 CLA”可用于皮膚干燥和粗糙狀況的預(yù)防以及用于滑潤和濕潤已處于干燥和粗糙狀況的皮膚。實施例6下面的配方是混入了本發(fā)明組合物的水包油乳油，其適合于本發(fā)明的方法和用途。除非另加說明，這里的百分比均是以組合物的重量計。
*Brij56為鯨蠟醇POE(10)Alfol 16RD為鯨蠟醇
權(quán)利要求
1.一種局部用組合物，包括(a)共軛亞油酸和/或其包括共軛亞油酸部分的衍生物，其中至少50％重量的共軛亞油酸和/或部分以順9反11異構(gòu)體的形式存在；和(b)一種皮膚病學(xué)上可接受的載體。
2.按照權(quán)利要求1的組合物，所述組合物包括占其重量的0.00001-50％、優(yōu)選0.01-10％的所述共軛亞油酸和/或衍生物。
3.一種治療和/或預(yù)防選自起皺、松垂、光損傷皮膚、干燥皮膚、粗糙皮膚、脫皮皮膚、發(fā)炎皮膚、發(fā)瘁皮膚、敏感皮膚和/或老年斑等皮膚病的方法，所述方法包括將按照權(quán)利要求1或2的局部用組合物施用到皮膚上。
4.共軛亞油酸和/或其包括共軛亞油酸部分的衍生物在治療/預(yù)防選自起皺、松垂、光損傷皮膚、干燥皮膚、粗糙皮膚、脫皮皮膚、發(fā)炎皮膚、敏感皮膚、發(fā)瘁皮膚和老年斑等皮膚病的局部用組合物中的用途，其中至少50％重量的共軛亞油酸和/或部分以順9反11異構(gòu)體的形式存在。
全文摘要
一種用于治療選自起皺、松垂、光損傷皮膚、敏感皮膚、干燥皮膚、脫皮皮膚、發(fā)紅皮膚、發(fā)炎皮膚、發(fā)癢皮膚和老年斑等皮膚病的局部用組合物和化妝方法,所述組合物包括(a)共軛亞油酸和/或其包括共軛亞油酸部分的衍生物,其中至少50%(重量)的共軛亞油酸和/或部分以順9反11異構(gòu)體的形式存在;和(b)一種皮膚病學(xué)上可接受的載體。
文檔編號A61Q19/08GK1335763SQ99816269
公開日2002年2月13日 申請日期1999年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者S·阿拉盧夫, M·R·格林, C·R·哈丁, H·L·胡, G·P·麥內(nèi)爾, J·R·波維爾, A·V·勞林斯, J·S·羅格爾斯, A·瓦特金森 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司