專利名稱：反應(yīng)方法、反應(yīng)裝置和酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反應(yīng)方法、反應(yīng)裝置和酶，更詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及使用活性介質(zhì)對反應(yīng)底物進(jìn)行分解的反應(yīng)方法和在該反應(yīng)方法的特定實(shí)施方案中可以有效利用的反應(yīng)裝置，一定底物的酶分解方法、反應(yīng)促進(jìn)劑和利用該反應(yīng)促進(jìn)劑分解疏水性底物或難分解物質(zhì)的分解方法，新的錳過氧化物酶及其制造方法。
作為與上述反應(yīng)有關(guān)的眾所周知的技術(shù)有以下報(bào)道例如在“紙漿技術(shù)協(xié)會會志vol.150，59-68(原園等人)”中涉及到紙漿中含有的著色物質(zhì)木質(zhì)素通過過氧化物酶分解的報(bào)道，在該分解反應(yīng)中有作為介質(zhì)的錳離子參與。另外在特開平11-158790號公報(bào)中涉及到通過漆酶進(jìn)行的同樣的木質(zhì)素分解反應(yīng)，在該分解反應(yīng)中有作為介質(zhì)的HBT(1-羥基苯并三唑，1-hydroxybenzotriazole)參與。此外在特開平9-239396號公報(bào)中報(bào)道了利用氧化酶過氧化物酶對于難分解物質(zhì)的分解技術(shù)。但是在上述的以往技術(shù)中，無論哪種介質(zhì)都是以非活性狀態(tài)介質(zhì)投入到有底物存在的反應(yīng)體系中(例如含有紙漿的被處理液中)，在該反應(yīng)體系內(nèi)通過酶活化使其成為活性介質(zhì)。因此存在象以下那樣的問題。第1，如果將酶投入到被處理的液體中，不容易分離回收價(jià)格高的酶。即使使酶擔(dān)載到不溶性載體，回收時(shí)固液分離的對策，在上述被處理液體中混有各種各樣固體片段時(shí)實(shí)施固液分離也很困難。將酶擔(dān)載到固定床上的對策使得酶與低濃度特定物質(zhì)的接觸效率不好。而將酶掛在柱子上，使被處理液體通過柱子的對策也難于應(yīng)用于混有固體片段的被處理液體的處理中。第2，在工業(yè)處理過程中追求處理效率，按照底物要求變化的內(nèi)容，例如要求在高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿等嚴(yán)格條件下的高反應(yīng)效率時(shí)，在這些嚴(yán)格的條件下酶失活達(dá)不到處理的目的。第3，總而言之，在使活性介質(zhì)作用于底物可以達(dá)到目的的反應(yīng)中，實(shí)用的介質(zhì)活化手段除了酶以外是否還有別的手段這一重要的問題還沒有研究。另外在反應(yīng)體系中對介質(zhì)進(jìn)行活化是否必要的這一重要問題也沒有研究。第4，由于在反應(yīng)體系中通過酶活化介質(zhì)的這一形式受到限定，所以介質(zhì)的活化形式或活化程度(例如，為了使介質(zhì)活化的激發(fā)狀態(tài)程度)明顯受到制約。
本申請發(fā)明的第1個(gè)目的是在高濃度氧化劑存在下通過氧化酶過氧化物酶對底物、特別是難分解物質(zhì)的底物進(jìn)行高效地分解，而且要避免價(jià)格高的酶的失活，可有效地回收和再利用。另外要研究除了酶以外的其它實(shí)用的介質(zhì)活化手段，研究其有效的利用方法。
以提高上述酶的穩(wěn)定性為目的的眾所周知的技術(shù)有以下一些報(bào)道，有Gravski，A.C.等人(Appl.Biochem.Biotechnol.60，1-17(1996))有關(guān)固定于有機(jī)聚合物粒子的錳過氧化物酶的報(bào)道；Fawer，M.S.等人(Biochem.Biophys.Acta.1076，15-22(1991))和Ather，M.等人(Appl.Biochem.Biotechnol.38，57-67(1993))有關(guān)固定于玻璃珠、有機(jī)聚合物、瓊脂各種粒子的木質(zhì)素過氧化物酶的報(bào)道。在將氧化酶固定于上述的有機(jī)聚合物粒子、玻璃珠、瓊脂時(shí)，在該固定化酶的使用形式(填充柱子等)以及依次進(jìn)行的后處理(過濾等)中都能對酶有效回收和再利用。另外作為固定化酶的一般的優(yōu)點(diǎn)人們認(rèn)為對溫度和pH的容許范圍也相對地變寬了。然而根據(jù)本發(fā)明人的研究可知在用以往方式進(jìn)行固定化的氧化酶中，與固定化前相比對于氧化劑濃度的容許范圍幾乎沒有擴(kuò)展。想要利用氧化劑分解底物、特別是分解難分解物質(zhì)的底物時(shí)，試圖將氧化劑濃度盡可能提高以提高分解效率是一個(gè)重要的技術(shù)課題，可以說不能適應(yīng)這一點(diǎn)的固定化酶具有實(shí)用上的致命的缺陷。
因此，本發(fā)明的第2個(gè)目的是提供能夠識別而且選擇性地分解諸如木質(zhì)素和纖維素那樣的類似的物質(zhì)的反應(yīng)促進(jìn)劑以及利用該促進(jìn)劑的酶分解方法。本發(fā)明人注意到以往技術(shù)涉及到的反應(yīng)促進(jìn)劑丙二酸是親水性的二羧酸，因此生成的自由基也是親水的。與木質(zhì)素相比，親水的自由基優(yōu)先分解親水的纖維素，或者至少是同時(shí)分解木質(zhì)素和纖維素。
涉及到上述反應(yīng)促進(jìn)劑的眾所周知的技術(shù)在“紙漿技術(shù)協(xié)會雜志50卷4號1996”文獻(xiàn)的報(bào)道中指出丙二酸作為使錳離子穩(wěn)定在3價(jià)狀態(tài)的螯合劑是有效的。按照本發(fā)明人的理解，丙二酸是通過錳離子被自由基化，對木質(zhì)素等物質(zhì)進(jìn)行分解的反應(yīng)促進(jìn)劑。然而通過本發(fā)明人的研究可知丙二酸的自由基不僅對木質(zhì)素有一定的分解能力，而且對纖維素也有作用。因此，紙漿漂白即木質(zhì)素分解很容易不充分，而且由于纖維素也受到損傷，結(jié)果會制造出強(qiáng)度低的紙。一般來說，識別非常類似的高分子物質(zhì)木質(zhì)素和纖維素，有選擇地分解其中的一種物質(zhì)是相當(dāng)困難的。
因此，本發(fā)明的第3個(gè)目的是提供能夠識別、而且有選擇地分解諸如木質(zhì)素和纖維素那樣的類似的物質(zhì)的反應(yīng)促進(jìn)劑以及利用該促進(jìn)劑的酶分解方法。本發(fā)明人注意到以往技術(shù)涉及到的反應(yīng)促進(jìn)劑丙二酸是親水性的二羧酸，因此生成的自由基也是親水的。與木質(zhì)素相比，親水的自由基優(yōu)先分解親水的纖維素，或者至少是同時(shí)分解木質(zhì)素和纖維素。
涉及到錳過氧化物酶的眾所周知的技術(shù)有以下一些報(bào)道據(jù)J.Biotechnol.vol 30，79-90(1990)刊載的Cai D.等人的論文報(bào)道，白色腐朽菌(Phanerochaete crysosporium)中存在著4種MnP，其中只有3種MnP的等電點(diǎn)和分子量等理化特性已經(jīng)被解析。另外EnzymeMicrobiol.Technol.vol 18，27-32(1986)刊載的T.K.Kirk等人的論文報(bào)道了對白色腐朽菌實(shí)施UV變異，使MnP產(chǎn)量提高的變異株。但有關(guān)該變異株產(chǎn)生的MnP的耐熱性和耐過氧化氫等特性還沒有分析。可是，在酶反應(yīng)中一般來說酶的耐熱性是個(gè)問題，特別是在MnP參與的反應(yīng)中，大多希望根據(jù)3價(jià)錳離子以及通過它生成的自由基的反應(yīng)性等理由，將反應(yīng)溫度設(shè)定較高來提高反應(yīng)效率。另外，由于MnP參與的反應(yīng)的效率也受到過氧化氫濃度控制，所以通常都要求盡可能將過氧化氫濃度設(shè)定較高。為了適應(yīng)這些要求，MnP必須同時(shí)具備很好的耐熱性和耐過氧化氫性能。然而，以前報(bào)道有具有于50℃下耐熱10分鐘左右的耐熱性的MnP，但該MnP耐過氧化氫性能很差(特開平7-274958號公報(bào))。相反，報(bào)道有具有在10mM以下濃度的過氧化氫中1分鐘后殘余活性在35％以上的耐過氧化氫性的MnP(特開2000-83658號公報(bào))而且由于該MnP常時(shí)間與過氧化氫接觸，1分鐘短時(shí)間的耐性沒有實(shí)用價(jià)值，另外在上述文獻(xiàn)中就有關(guān)MnP的耐熱性也沒有給出明確的實(shí)驗(yàn)條件。所以，由于沒有提供同時(shí)具有實(shí)際使用水平的良好的耐熱性和良好的耐過氧化氫性能的MnP，所以其現(xiàn)狀是盡管MnP很有用，但還不能被產(chǎn)業(yè)上充分利用。
因此，本發(fā)明的第4個(gè)目的是提供具備可適應(yīng)實(shí)用要求的耐熱性和耐過氧化氫性能的MnP及其制造方法。
本申請的第2發(fā)明是一種反應(yīng)方法，其特征是在上述第1發(fā)明涉及到的反應(yīng)方法中設(shè)置一個(gè)通過介質(zhì)活化手段-酶使介質(zhì)活化的活化步驟，然后將通過該活化步驟得到的活性介質(zhì)投入到上述反應(yīng)體系中。如果介質(zhì)被活化的步驟和使活性介質(zhì)作用于底物的步驟是在同一反應(yīng)池中進(jìn)行的話，酶分離回收的困難或酶與底物的接觸效率的問題都是無法擺脫的。而在第2發(fā)明中，無底物存在環(huán)境下的活化步驟和底物存在環(huán)境下的底物反應(yīng)步驟在工序上是被隔離開的。因此，由于介質(zhì)活化手段本來就與底物(如各種各樣的固體片段和水溶性物質(zhì)等混在一起的被處理液體)分開的，所以該介質(zhì)活化手段是酶時(shí)，酶的回收是很容易的。更具體來說，使作為介質(zhì)活化手段的酶擔(dān)載在粉粒狀的不溶性載體上時(shí)，只是通過過濾等適當(dāng)?shù)墓桃悍蛛x方法(使固體和液體分離的方法)將酶與活性介質(zhì)水溶液分離，就可容易地回收酶。另外，如將酶搭載到固定床上時(shí)，由于固定床的作用是在不存在底物的環(huán)境下活化介質(zhì)，所以不必?fù)?dān)心酶與低濃度特定物質(zhì)的接觸效率。還有，由于在介質(zhì)溶液中沒混有多余的固體片段，所以將它通過搭載酶的柱子時(shí)，使介質(zhì)活化效率提高也容易。在第2發(fā)明中，一個(gè)條件是將通常為水溶性的活性介質(zhì)水溶液與介質(zhì)活化手段分離后轉(zhuǎn)移，但只要使用諸如電極等固定結(jié)構(gòu)物或固定于不溶性載體的酶(只要介質(zhì)活化手段不是水溶性物質(zhì))作為介質(zhì)活化手段，通過單純使溶液移動或簡單的固液分離操作，就可以容易地進(jìn)行分離。
在上述第2發(fā)明中，更為理想的是第2發(fā)明的活性介質(zhì)是穩(wěn)定的物質(zhì)(特別穩(wěn)定的低分子物質(zhì))時(shí)，在溫和的條件下使酶和介質(zhì)接觸進(jìn)行上述的活化步驟，在能獲得高反應(yīng)效率的嚴(yán)格條件下進(jìn)行上述活性介質(zhì)和底物的反應(yīng)。在該反應(yīng)方法中，前提是介質(zhì)活化手段是酶，活化介質(zhì)是穩(wěn)定物質(zhì)。在此前提下，由于是在溫和條件下進(jìn)行活化步驟，所以酶不易失活，而且由于在高反應(yīng)效率的嚴(yán)格條件下進(jìn)行底物反應(yīng)步驟，所以有望獲得適合工業(yè)化處理過程的高的底物處理效率。而且作為穩(wěn)定物質(zhì)(特別是穩(wěn)定的低分子物質(zhì))的活性介質(zhì)即使在高反應(yīng)效率的嚴(yán)格條件下也不易失活。即理所當(dāng)然地避開象上述以往技術(shù)那樣的在工業(yè)處理過程中的高處理效率要求和維持反應(yīng)活性要求之間的矛盾。
本申請的第3發(fā)明是一種反應(yīng)方法，其特征是將上述第1發(fā)明涉及到的介質(zhì)以高活化狀態(tài)的高活性介質(zhì)投入到上述反應(yīng)體系中，它們的活性和/或穩(wěn)定性比上述處于活性狀態(tài)的活性介質(zhì)的更高。由于該高活性介質(zhì)在活性和/或穩(wěn)定性比通常的活性介質(zhì)的更高，所以第1發(fā)明的反應(yīng)方法可以更高的效率實(shí)施，另外容許在更高溫度下的反應(yīng)、在酸性更強(qiáng)區(qū)域的反應(yīng)、在堿性更強(qiáng)區(qū)域的反應(yīng)等設(shè)定效率更高的嚴(yán)格反應(yīng)條件。
在上述第3發(fā)明中，更為理想的是高活性介質(zhì)與上述活性介質(zhì)相比處于更高活性的激發(fā)狀態(tài)，或者至少是包括配位化合物的情況下的介質(zhì)的高級次的化合物。這些是高活性介質(zhì)的代表性例子。在上述第1發(fā)明～第3發(fā)明中，更理想的是活性介質(zhì)或高活性介質(zhì)可以通過對上述介質(zhì)進(jìn)行酶作用、催化作用、光照射、電磁波照射、加電壓或等離子體化來制備。活性介質(zhì)或高活性介質(zhì)的制備手段由于不需要在底物存在的反應(yīng)體系中對介質(zhì)進(jìn)行活化，所以可使用包括酶在內(nèi)的任意手段，作為其代表性的手段諸如通過酶作用、通過酶以外的催化作用、通過光照射(包括為了激發(fā)光催化而進(jìn)行的光照射)、通過電磁波照射、通過加電壓、或通過等離子體化等手段。在上述第1發(fā)明～第3發(fā)明中，更理想的是酶是過氧化物酶或漆酶等氧化酶，底物是為使紙漿漂白而要分解的木質(zhì)素。在這樣的情況下，可以提供反應(yīng)方法特別實(shí)用的要求高的實(shí)施方案。
本申請的第4發(fā)明是為實(shí)施上述第2個(gè)發(fā)明的反應(yīng)方法的反應(yīng)裝置，其中包括(1)“具備與活性介質(zhì)為可分離形態(tài)的介質(zhì)活化手段，通過該手段可實(shí)施上述活化步驟的活化反應(yīng)場所”和(2)“通過活性介質(zhì)的輸送手段與上述活化反應(yīng)場所連接，可實(shí)施上述活性介質(zhì)和底物反應(yīng)的底物反應(yīng)場所”。該反應(yīng)裝置提供上述第2發(fā)明的有效的實(shí)施手段。
本申請的第5發(fā)明是底物的酶分解方法，其特征是在使用氧化劑通過氧化酶-過氧化物酶分解酶底物的方法中，使用將上述氧化酶固定于具有與酶大小大致相符的空間(即容積)而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)單元中形成的固定化酶，在酶固定化所容許的濃度范圍的氧化劑存在下分解上述底物。第5發(fā)明中用的固定化酶與以前的固定化酶相比，相對來說對溫度和pH的穩(wěn)定性都比較高，尤其是對過氧化氫等氧化劑的濃度的容許范圍顯著擴(kuò)大了。雖然其理由不一定很明確，但我們認(rèn)為可能是由于在結(jié)構(gòu)單元中被固定的氧化酶的立體結(jié)構(gòu)沒有全部暴露于外部環(huán)境，結(jié)構(gòu)單元具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，所以對氧化酶的保護(hù)作用強(qiáng)，以及由于結(jié)構(gòu)單元與酶的大小大體一致，表現(xiàn)出對氧化酶有適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用的緣故。在第5發(fā)明中由于容許的氧化劑的濃度范圍顯著擴(kuò)大，第1、相對于底物投入高濃度的氧化劑可以提高分解效率，第2、即使氧化劑濃度的正確調(diào)控在技術(shù)上是困難的，但隨著氧化劑濃度的上升也不會使酶失活。另外作為固定化酶的一般特征不用說在下列場合下對氧化酶的回收和再利用都是可能，即通過向柱子填充的固定化、向被處理液流動的固定床的固定化等使用形式的場合以及在反應(yīng)結(jié)束后對將投入到不含固體成分的被處理液中的固定化酶進(jìn)行過濾的場合。
在上述第5發(fā)明中，底物是難分解的物質(zhì)。這樣情況下，由于非常需要在酶反應(yīng)中盡可能地投入高濃度的氧化劑以便提高分解效率，所以能極大地發(fā)揮第5發(fā)明的實(shí)用價(jià)值。在上述第5發(fā)明中，難分解物質(zhì)為木質(zhì)素更理想。分解著色物質(zhì)木質(zhì)素以漂白紙漿在產(chǎn)業(yè)界特別需要。在上述第5發(fā)明中結(jié)構(gòu)單元是中孔(性)的二氧化硅多孔體中的各個(gè)細(xì)孔更理想。在這樣的情況下，由于提供了將氧化酶固定于多孔體的多數(shù)細(xì)孔中這一效率好的實(shí)施形式的結(jié)構(gòu)單元，所以反應(yīng)效率特別高，而且作為二氧化硅多孔體的結(jié)構(gòu)單元有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性極高的優(yōu)點(diǎn)。
本申請的第6發(fā)明是在通過氧化酶分解底物的反應(yīng)體系中所使用的反應(yīng)促進(jìn)劑，是具有基于上述酶的作用可自由基化的二酮結(jié)構(gòu)、而且可溶于水的反應(yīng)促進(jìn)劑。作為可溶于水的該反應(yīng)促進(jìn)劑溶于含有氧化酶的水溶液，通過氧化酶的作用容易自由基化。因此，如投入到用氧化酶進(jìn)行紙漿漂白的體系中，可有效地溶解于紙漿中，而且在自由基化后進(jìn)行木質(zhì)素的分解，結(jié)果使紙漿漂白。而且具有二酮結(jié)構(gòu)的反應(yīng)促進(jìn)劑作為可溶于水的反應(yīng)促進(jìn)劑具有疏水性特別強(qiáng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，容易接觸紙漿中疏水性的木質(zhì)素并分解它，而由于難于接觸親水性的纖維素，所以幾乎不分解纖維素。其結(jié)果由于木質(zhì)素分解使得紙漿漂白進(jìn)行得非常充分，而且由于纖維素沒有受到損傷，可以制造強(qiáng)度高的紙。不只是紙漿漂白，一般來說對于水中混有親水性底物和相對疏水性底物的底物溶液，將第6發(fā)明的反應(yīng)促進(jìn)劑與氧化酶共同使用的話，可以預(yù)料具有有選擇地分解疏水性底物的能力。在上述第6發(fā)明中，反應(yīng)促進(jìn)劑是乙酰丙酮更理想。
本申請的第7發(fā)明是促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其特征是在混有親水性底物和與它相比相對疏水性的底物的水溶液中使氧化酶以及反應(yīng)介質(zhì)和第6發(fā)明提到的反應(yīng)促進(jìn)劑共存，自由基化了的反應(yīng)促進(jìn)劑優(yōu)先地使疏水性底物分解。如第7發(fā)明所述，對于水中混有親水性底物和與它相比相對疏水性底物的底物溶液，如果在使用氧化酶以及反應(yīng)介質(zhì)的同時(shí)使用第6發(fā)明的反應(yīng)促進(jìn)劑，被自由基化的疏水性反應(yīng)促進(jìn)劑可有選擇地分解疏水性底物。因此對使用主要分解親水性底物的反應(yīng)促進(jìn)劑的情形與使用同等分解親水性和疏水性底物的反應(yīng)促進(jìn)劑的情形進(jìn)行比較時(shí)，結(jié)果表明第1、對疏水性底物的分解能力相對高些；第2、可以抑制親水性底物的分解。即在上述那樣的底物溶液中，希望使疏水性底物充分分解時(shí)，尤其是希望避免親水性底物分解時(shí)，第7發(fā)明提到的促進(jìn)疏水性底物分解的方法最有效。作為第7發(fā)明的一般的反應(yīng)機(jī)制可能是首先通過氧化酶使反應(yīng)介質(zhì)活化(例如錳變成3價(jià)錳離子)，通過被活化的反應(yīng)介質(zhì)使反應(yīng)促進(jìn)劑自由基化，該反應(yīng)促進(jìn)劑自由基使底物分解。
在上述第7發(fā)明中，更理想的促進(jìn)疏水性底物分解的方法是包括以下工序的方法，即包括通過氧化酶使反應(yīng)介質(zhì)活化的工序、將被活化的反應(yīng)介質(zhì)和第6發(fā)明中提到的反應(yīng)促進(jìn)劑添加到混有親水性底物和與它相比相對疏水性底物的水溶液中，通過自由基化的上述反應(yīng)促進(jìn)劑優(yōu)先分解上述疏水性底物的工序。這樣的情況下，由于氧化酶在沒有反應(yīng)促進(jìn)劑存在時(shí)可以對反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行活化，所以即使使用高濃度的反應(yīng)促進(jìn)劑也不會使氧化酶失活。而且通過高濃度反應(yīng)促進(jìn)劑的使用可進(jìn)一步促進(jìn)疏水性底物的分解。在上述第7發(fā)明中反應(yīng)的水溶液是紙漿，親水性底物是纖維素，相對疏水性底物是木質(zhì)素最理想。第7發(fā)明在這樣的場合特別有效。這樣場合下著色物質(zhì)疏水性木質(zhì)素可充分被分解，達(dá)到良好的漂白效果的同時(shí)，又抑制造紙?jiān)侠w維素的分解，可以制造出強(qiáng)度高的紙。在上述第7發(fā)明中，促進(jìn)上述疏水性底物分解的方法中間插入紙漿的堿萃取處理工序后多級反復(fù)操作最理想。這樣情況下，在紙漿固體成分中的木質(zhì)素之中，埋沒于纖維素中的難分解的木質(zhì)素通過紙漿的堿萃取處理暴露出來，使其更好地被分解。因此通過上述的多級反復(fù)操作方法可進(jìn)一步提高紙漿的白度。在上述第7發(fā)明中最理想的是氧化酶至少是從包括錳過氧化物酶、辣根過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶中選擇的過氧化物酶，反應(yīng)介質(zhì)是錳離子。這些氧化酶和反應(yīng)介質(zhì)特別理想。
本申請的第8發(fā)明是難分解物質(zhì)的分解方法，其特征是在含有難分解物質(zhì)的水溶液中使氧化酶和反應(yīng)介質(zhì)以及第6發(fā)明中提到的反應(yīng)促進(jìn)劑共存，通過自由基化的反應(yīng)促進(jìn)劑分解難分解物質(zhì)。難分解物質(zhì)呈現(xiàn)親水性結(jié)構(gòu)是很少見的，這成了難分解的一個(gè)原因，對此使用疏水性反應(yīng)促進(jìn)劑對縮短分解時(shí)間會起到很好的作用。
在上述第8發(fā)明中，難分解物質(zhì)為二噁英、多氯聯(lián)苯(PCB)，或擾亂內(nèi)分泌物質(zhì)更理想。這些難分解物質(zhì)特別重要。
本申請的第9發(fā)明是錳過氧化物酶液，可以是白色腐朽菌(Phanerochaete crysosporium)經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生的變異株SC26菌株(以ATCC-64314的保藏號保藏)的培養(yǎng)液、或從該培養(yǎng)液獲得的表現(xiàn)出以下的(1)耐熱性以及(2)耐過氧化氫性能的錳過氧化物酶。(1)于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的錳過氧化物酶的殘余活性在50％以上。(2)在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的錳過氧化物酶的殘余活性在15％以上。本申請發(fā)明人正當(dāng)獲得以ATCC-64314保藏的白色腐朽菌SC26菌株后進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)能獲得耐熱性和耐過氧化氫性能方面都非常好的錳過氧化物酶液(以下也稱之為“MnP酶液”)。另外到現(xiàn)在為止，又發(fā)現(xiàn)了在該MnP酶液中含有稱為S1～S5的5種MnP同功酶。第9發(fā)明的MnP酶液由于表現(xiàn)出上述(1)和(2)的特性，所以非常有用。應(yīng)予說明，在獲得和進(jìn)口上述SC26菌株時(shí)受到防疫上的一定必要條件的限制，即必須是配備對付規(guī)定水平以上生物污染的設(shè)備者。配備這樣設(shè)備者有可能接受轉(zhuǎn)讓和進(jìn)口。本申請發(fā)明人也準(zhǔn)備在正當(dāng)?shù)睦碛上聦⒌?發(fā)明涉及到的MnP酶液或該酶液中含有的MnP轉(zhuǎn)讓給任何人。
本申請的第10發(fā)明是符合以下(3)～(5)條件的錳過氧化物酶。(3)白色腐朽菌通過紫外線照射產(chǎn)生的變異株SC26菌株(以ATCC-63414保藏)產(chǎn)生的錳過氧化物酶；(4)等電點(diǎn)處于4.3～4.7范圍內(nèi)；(5)于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的錳過氧化物酶的殘余活性在50％以上，在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的錳過氧化物酶的殘余活性在15％以上。上述稱為S1～S5的5種MnP中，S1、S2和S3三種的等電點(diǎn)都處于4.3～4.7范圍內(nèi)，無論哪種都表現(xiàn)出于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的錳過氧化物酶的殘余活性在50％以上的很好的耐熱性，以及在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的錳過氧化物酶的殘余活性在15％以上的很好的耐過氧化氫特性。有可能從第9發(fā)明的MnP酶液中發(fā)現(xiàn)符合第10發(fā)明的新的MnP同功酶。第10發(fā)明的MnP在表現(xiàn)出優(yōu)良的耐熱性以及耐過氧化氫特性方面是很有用的，而且與第9發(fā)明的MnP酶液比較，由于是分別以單一的酶分離出來的，所以實(shí)用上很方便。
在上述第10發(fā)明中，更優(yōu)選的錳過氧化物酶是其等電點(diǎn)為4.3，50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的錳過氧化物酶的殘余活性在90％以上，在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的錳過氧化物酶的殘余活性在30％以上的錳過氧化物酶。在上述第10發(fā)明中，更理想的錳過氧化物酶是其等電點(diǎn)為4.5，50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的錳過氧化物酶的殘余活性在90％以上，在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的錳過氧化物酶的殘余活性在45％以上的錳過氧化物酶。在上述第10發(fā)明中，更理想錳過氧化物酶是其等電點(diǎn)為4.7，50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的錳過氧化物酶的殘余活性在50％以上，在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的錳過氧化物酶的殘余活性在15％以上的錳過氧化物酶。以上的MnP同功酶尤其更有用。
發(fā)明的實(shí)施方案[第1發(fā)明～第4發(fā)明的實(shí)施方案]反應(yīng)方法第1發(fā)明涉及到的反應(yīng)方法是將在活化狀態(tài)下作用于底物進(jìn)行規(guī)定反應(yīng)的介質(zhì)以活化狀態(tài)的活性介質(zhì)投入到存在底物的反應(yīng)體系的反應(yīng)方法。這里所謂“投入”包括將預(yù)先通過任意手段制備的活性介質(zhì)在制備后立刻投入，或通過任意手段或方法貯藏后投入的所有形式。活性介質(zhì)的投入量和投入方法可以根據(jù)需要任意決定，但最好是將與底物的反應(yīng)效率、底物量、反應(yīng)時(shí)間等作為基準(zhǔn)來決定投入量，可以按照底物的變換一面隨時(shí)調(diào)整投入量，一面連續(xù)地或間歇地投入。反應(yīng)方法中每1步驟中預(yù)定量的活性介質(zhì)可以一次性地投入。
第2發(fā)明涉及到的反應(yīng)方法是包括以下步驟的反應(yīng)方法即包括在沒有底物存在的環(huán)境下，通過介質(zhì)活化手段的作用使介質(zhì)活化的活化步驟以及將活性介質(zhì)從上述介質(zhì)活化手段中分離出來后，轉(zhuǎn)移到存在底物的環(huán)境下，使其作用于該底物的底物反應(yīng)步驟。優(yōu)選的反應(yīng)方法是當(dāng)上述第2發(fā)明涉及到的活性介質(zhì)是穩(wěn)定的低分子物質(zhì)時(shí)，在溫和條件下使酶和介質(zhì)接觸來進(jìn)行上述活化步驟，在高反應(yīng)效率的嚴(yán)格的條件下進(jìn)行上述活性介質(zhì)和底物之間反應(yīng)的反應(yīng)方法。
第3發(fā)明涉及到的反應(yīng)方法是將上述第1發(fā)明涉及到的介質(zhì)以高活化狀態(tài)的高活性介質(zhì)投入到上述反應(yīng)體系的反應(yīng)方法，其中高活性介質(zhì)的活性和/或穩(wěn)定性比上述活化狀態(tài)的活性介質(zhì)的更高。
介質(zhì)所謂介質(zhì)就是反應(yīng)介體，是通過酶以及其它任意的介質(zhì)活化手段活化使之成為活性介質(zhì)，作用于反應(yīng)的底物完成既定反應(yīng)的物質(zhì)。例如，已知有以錳過氧化物酶作為介質(zhì)活化手段的錳離子、以漆酶作為介質(zhì)活化手段的HBT(1-羥基苯并三唑)或NHA(N-羥基乙酰苯胺，N-hydroxyacetanilide)等，無論哪一種都可用于本發(fā)明中。作為介質(zhì)還有諸如ABTS(2，2’-偶氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，2，2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)和以木質(zhì)素過氧化物酶為活化手段的3，4-二甲氧基芐醇等。另外從更廣泛的意義上來說NAD和NADP等輔酶類也可以成為本發(fā)明的介質(zhì)。
活性介質(zhì)所謂活性介質(zhì)是指作用于底物能夠進(jìn)行既定反應(yīng)的那樣的處于活性狀態(tài)的介質(zhì)?；钚越橘|(zhì)是通過使后面講到的介質(zhì)活化手段作用于介質(zhì)生成的。活性介質(zhì)中包括通常的活性介質(zhì)和高活性介質(zhì)。所謂通常活性介質(zhì)是指象諸如3價(jià)錳離子那樣的通常的活化狀態(tài)而且處于游離狀態(tài)的活性介質(zhì)。所謂高活性介質(zhì)是指與通常活性介質(zhì)相比，其活性和/或穩(wěn)定性更高的高活化狀態(tài)的介質(zhì)，例如與通?；钚越橘|(zhì)相比處于高活性的激發(fā)狀態(tài)的活性介質(zhì)，或者是通常的活性介質(zhì)呈現(xiàn)至少含有配位化合物的高級次化合物形態(tài)，變成高穩(wěn)定性的介質(zhì)。作為處于特別高活性的激發(fā)狀態(tài)的活性介質(zhì)的例子如具有高的氧化還原電位的金屬配位化合物、氧化劑(金屬離子等)和二酮和/或其衍生物的混合體、金屬和二酮和/或其衍生物的配位化合物、酮類(二酮或其衍生物)的自由基等。穩(wěn)定性特別高的高活性介質(zhì)如活性介質(zhì)通過與穩(wěn)定劑結(jié)合而使其穩(wěn)定的活性介質(zhì)(例如3價(jià)錳離子與丙二酸或二酮結(jié)構(gòu)體等形成配位化合物的活性介質(zhì))等。
介質(zhì)活化手段在第1發(fā)明或第3發(fā)明的反應(yīng)方法中，介質(zhì)活化手段包括酶，但不限定于酶。關(guān)于酶下面將講到，而就酶以外的介質(zhì)活化手段來說，可以根據(jù)活性介質(zhì)的種類或其使用目的等任意選擇。例如可以通過酶以外的催化劑、光照射、電磁波照射、外加電壓或介質(zhì)的等離子體化活化介質(zhì)。作為催化劑可以利用具有通常催化作用的各種化學(xué)物質(zhì)、光催化劑等。上述化學(xué)物質(zhì)并不限定于電子受體類物質(zhì)，例如是金屬離子、金屬配位化合物、有機(jī)酸、芳香族羧酸等。關(guān)于光催化劑可以有效利用上述光照射，具體來說如二氧化鈦。作為通過電磁波照射、外加電壓和等離子體化的例子如傳荷配位化合物等電荷不平衡的物質(zhì)或價(jià)電子處于激發(fā)狀態(tài)的物質(zhì)等。
在第2發(fā)明的反應(yīng)方法中介質(zhì)活化手段是該介質(zhì)參與酶反應(yīng)的酶。只要是酶反應(yīng)機(jī)制中有介質(zhì)參與的酶，并不限定于哪一種類。例如理想的有代表性的酶是錳過氧化物酶和漆酶等氧化酶。
在活化反應(yīng)場所和底物反應(yīng)場所被不使酶通透的半透膜隔離開的那樣情況下，也可以將酶以單一的水溶液形式投入到活化反應(yīng)場所。不過一般來說，最好是通過不溶性載體對酶進(jìn)行固定化。作為酶的固定化及其使用的形式可以是將酶固定于粉粒狀的不溶性載體上之后，分散投入到介質(zhì)溶液中，或者是將固定化酶填充到使介質(zhì)溶液通過的柱子中，或者是將酶固定于介質(zhì)溶液通過的作為固定床組成材料的載體上。一個(gè)理想的不溶性載體例子是多孔載體，而多孔形不溶性載體中更理想的例子是具有很多與通常大小的酶相當(dāng)?shù)闹锌祝ㄟ^這些中孔容納酶，使其不溶解和穩(wěn)定的中孔(性)多孔體。特別是例如以水硅鈉石等硅酸鹽為原料，利用形成細(xì)孔用模板物質(zhì)等構(gòu)成的中孔性的硅多孔體(以下也稱為“FSM”)。
在活化反應(yīng)場所中當(dāng)通過酶以外的手段可以使介質(zhì)活化時(shí)也可以使用該手段。所述的手段如在錳過氧化物酶存在下將作為介質(zhì)的錳離子活化為3價(jià)離子時(shí)，可以通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)手段將氧化錳氧化，或使二氧化錳還原，另外也可以通過電象上述那樣進(jìn)行氧化或還原。在這種情況下，使介質(zhì)溶液中預(yù)先含有螯合劑，使3價(jià)錳離子穩(wěn)定也優(yōu)選。
底物在確定介質(zhì)和酶(或者酶以外的介質(zhì)活化手段)后底物的種類或者類型也就自動地確定了。而如以錳過氧化物酶或漆酶等氧化酶為例，作為反應(yīng)對象的種類或含有該底物的工業(yè)上被處理的材料的種類范圍非常廣泛。最優(yōu)選的底物以及工業(yè)的被處理材料例子如被處理材料是紙漿，底物是為使紙漿漂白紙漿中應(yīng)當(dāng)分解的木質(zhì)素。
反應(yīng)裝置上述第2發(fā)明涉及到的反應(yīng)方法最好利用第4發(fā)明涉及到的反應(yīng)裝置進(jìn)行，上述活化步驟在第4發(fā)明的上述活化反應(yīng)場所進(jìn)行，而上述底物反應(yīng)場所在第4發(fā)明的上述底物反應(yīng)場所進(jìn)行。所謂活化場所和底物反應(yīng)場所至少要保持能防止底物從后者轉(zhuǎn)移到前者的隔離狀態(tài)，而且需要通過可使化學(xué)介質(zhì)從前者轉(zhuǎn)移到后者的輸送手段將兩者聯(lián)系起來。只要具備這些條件，上述兩個(gè)反應(yīng)場所也可以由適當(dāng)形式的分別獨(dú)立的反應(yīng)容器或反應(yīng)槽等構(gòu)成，或者是通過將同一反應(yīng)容器內(nèi)或反應(yīng)槽內(nèi)用隔膜或隔板等分開來構(gòu)成上述兩個(gè)反應(yīng)場所。雖然上述輸送手段的內(nèi)容沒有限定，但由于介質(zhì)通常處于水溶液狀態(tài)，活性介質(zhì)也以水溶液轉(zhuǎn)移，所以最好使用諸如輸送液體用的(最好是具備通過泵進(jìn)行強(qiáng)制性輸送能力)泵等。在必要的時(shí)候，在該輸送手段中也可以設(shè)置使介質(zhì)活化手段和活性介質(zhì)分離的分離手段(例如濾器等固液分離手段)?；罨磻?yīng)場所只要至少具備與活性介質(zhì)可分離的形態(tài)的介質(zhì)活化手段就夠了?！翱煞蛛x形態(tài)”的具體內(nèi)容沒有限定，在活性介質(zhì)為水溶液時(shí)，可分離形態(tài)最好是諸如固定的結(jié)構(gòu)物或不溶性的固體。作為固定的結(jié)構(gòu)物如在介質(zhì)是通過價(jià)數(shù)變化被活化的金屬時(shí)的電極。不溶性的固體如固定于不溶性載體的酶。
在活化反應(yīng)場所以水溶液等形態(tài)提供介質(zhì)，通過介質(zhì)活化手段被活化，然后將該活性介質(zhì)輸送到底物反應(yīng)場所，這一連串工序連續(xù)進(jìn)行，所以可做成連續(xù)式的。在活化反應(yīng)場所不提供底物。考慮到反應(yīng)條件的穩(wěn)定性可以將成為介質(zhì)以及活性介質(zhì)的介體水配成緩沖液，另外根據(jù)需要可以含有使活性介質(zhì)穩(wěn)定的穩(wěn)定劑。例如在錳過氧化物酶的酶反應(yīng)中如果成為活性介質(zhì)的3價(jià)錳離子變成2價(jià)就失去活性了，但如果存在丙二酸等特定的螯合劑，可以通過與3價(jià)錳離子結(jié)合使其穩(wěn)定在3價(jià)狀態(tài)。在底物反應(yīng)場所提供底物，而且通過上述輸送手段由活化反應(yīng)場所提供活性介質(zhì)。也可以使底物和活性介質(zhì)連續(xù)不斷地供給，在底物反應(yīng)場所經(jīng)過預(yù)定的處理的底物可連續(xù)輸送到后面的任意工序那樣構(gòu)成各個(gè)工序。
活化反應(yīng)場所以及底物反應(yīng)場所中的pH、溫度等反應(yīng)條件可以通過任意手段設(shè)定，例如可以調(diào)整提供給活化反應(yīng)場所的上述介質(zhì)溶液的pH，在底物反應(yīng)場所中追加pH調(diào)節(jié)劑，調(diào)整兩個(gè)反應(yīng)場所的溫度等。具體的反應(yīng)條件根據(jù)需要可以任意設(shè)定，但象上述第2發(fā)明那樣介質(zhì)活化手段是酶，活性介質(zhì)是穩(wěn)定的低分子物質(zhì)時(shí)，活化步驟應(yīng)在溫和條件下進(jìn)行以避免酶失活，而在高反應(yīng)效率的嚴(yán)格條件下進(jìn)行底物反應(yīng)步驟，有望提高底物處理效率。在這種情況下，作為穩(wěn)定的低分子物質(zhì)的活性介質(zhì)不會失活。即使在擔(dān)心活性介質(zhì)的穩(wěn)定性的場合因?yàn)椴淮嬖谟捎诿改菢拥牧Ⅲw結(jié)構(gòu)變化引起的失活機(jī)制，所以象通過上述螯合劑使3價(jià)錳離子穩(wěn)定那樣，用各種方法通過一定的穩(wěn)定化處理使其穩(wěn)定是有可能。[第5發(fā)明的實(shí)施方案]氧化酶和氧化劑氧化酶是利用氧化劑分解底物的一種類型的氧化酶。這種類型的酶通常稱為過氧化物酶，只要是利用氧化劑類型的氧化酶，盡管其稱呼和氧化劑的種類不同，都包括在第5發(fā)明的氧化酶中。這樣的代表性的酶如錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶等，另外代表性的氧化劑如過氧化氫，另外還有氧、過氧乙酸等有機(jī)過氧化物等。
使用的氧化劑濃度是在固定化酶容許的濃度范圍內(nèi)，其濃度范圍因氧化酶、氧化劑、難分解物質(zhì)的種類以及溫度、pH等反應(yīng)條件的不同而各異，所以沒有統(tǒng)一的規(guī)定，例如，通過上述以前通常模式固定化的錳過氧化物酶在過氧化氫濃度為0.5～1mM左右時(shí)迅速失活，而使用同樣的錳過氧化物酶的固定化酶一般情況下過氧化氫濃度為上述濃度的6倍～12倍的6mM濃度下，相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)都不失活。從這點(diǎn)來看，例如在以往使用錳過氧化物酶對紙漿等進(jìn)行漂白時(shí)，由于過氧化氫傳感器的靈敏度在0.1mM以上，有必要用葡萄糖氧化酶等酶對過氧化氫的產(chǎn)生進(jìn)行控制。如果使用固定化酶，由于可以將過氧化氫控制在高濃度下，所以具有用便宜的雙氧水就可控制的很大優(yōu)點(diǎn)。
固定化酶氧化酶在被固定于與該酶大小大致相當(dāng)、具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)單元中后使用。此時(shí)可以將整個(gè)酶蛋白質(zhì)分子固定于結(jié)構(gòu)單元中，也可以固定酶的活性單元(含有活性部位的酶的片段)。就象圖26和圖27表示的那樣，結(jié)構(gòu)單元9是對pH、熱、流體的流動等環(huán)境條件具有穩(wěn)定性的中空的結(jié)構(gòu)體，其內(nèi)部固定有酶10(也可以是酶的活性單元)。結(jié)構(gòu)單元9的內(nèi)徑大致為酶10大小的尺寸為宜。
錨定單元11在固定化酶中并不是必需構(gòu)成要素，但是是連接結(jié)構(gòu)單元9和酶10的要素，在將結(jié)構(gòu)單元9的上述結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性傳遞給酶10后在抑制由于酶10立體結(jié)構(gòu)大的變化引起的失活的同時(shí)，賦予了容許活性部位比較小的結(jié)構(gòu)變化的自由度，該結(jié)構(gòu)變化是酶與底物12相互作用所必需的。構(gòu)成錨定單元的分子的結(jié)構(gòu)基本上與結(jié)構(gòu)單元的結(jié)構(gòu)相同最好，為了與酶結(jié)合，需要結(jié)合諸如羥基、氨基、吡啶基、脲基、羧基、羥基等官能團(tuán)。固定于結(jié)構(gòu)單元的氧化酶不通過上述那樣的錨定單元，而通過范德華力等與結(jié)構(gòu)單元結(jié)合也可以。在每個(gè)結(jié)構(gòu)單元可容納一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)酶。
上述結(jié)構(gòu)單元可以用無機(jī)材料或聚合物等有機(jī)材料構(gòu)成，該材料種類只要不妨礙本發(fā)明的目的并沒有特別限定。由無機(jī)材料構(gòu)成的結(jié)構(gòu)單元可以由諸如硅酸或氧化鋁等各種金屬氧化物、與Si和Al等金屬形成的復(fù)合氧化物等構(gòu)成。例如作為由硅酸構(gòu)成的結(jié)構(gòu)單元的形成方法最好使用水硅鈉石等層狀硅酸鹽、硅膠、水玻璃、硅酸鈉。最理想的結(jié)構(gòu)單元是形成由硅酸構(gòu)成的有很多結(jié)構(gòu)單元的集合體的中空(性)硅多孔體。中空(性)硅多孔體的制作方法沒有限定，但理想的方法是使無機(jī)材料，例如水硅鈉石等層狀硅酸鹽與作為模板物質(zhì)的表面活性劑(可以使用烷基三甲基銨等陽離子表面活性劑、烷基磺酸鹽等陰離子表面活性劑、聚乙二醇等非離子表面活性劑)混合反應(yīng)，使可形成無機(jī)骨架的表面活性劑/無機(jī)復(fù)合體在表面活性劑的膠團(tuán)周圍形成后，通過諸如在400～600℃下燒結(jié)或通過有機(jī)溶劑萃取除去表面活性劑，使與表面活性劑的膠團(tuán)具有相同形狀的中空細(xì)孔在無機(jī)骨架中形成的方法。
使用水硅鈉石等層狀硅酸鹽形成結(jié)構(gòu)單元時(shí)，其細(xì)孔表面為疏水性，而且具有陰離子特性。疏水性表面對于沒有水合作用的酶的穩(wěn)定固定化最理想，陰離子性表面對于表面有氨基等陽離子的酶的固定化最理想。
如上所述，結(jié)構(gòu)單元的大小最好與酶大小大致相當(dāng)。中空硅多孔體中這樣的結(jié)構(gòu)單元的尺寸(即細(xì)孔的直徑)的調(diào)整可以通過改變表面活性劑的烷基鏈的長度來調(diào)整膠團(tuán)的直徑來實(shí)現(xiàn)。通過將三甲基苯、三丙基苯等比較疏水性的分子與表面活性劑一起添加，使膠團(tuán)溶脹，結(jié)果也可以形成大的結(jié)構(gòu)單元。細(xì)孔徑通常為1～30nm，理想的是2～10nm。象以上那樣構(gòu)成的固定化酶的形態(tài)有粉末狀、顆粒狀、片狀、塊狀、膜狀等形狀，可以通過將它們分散投入到被處理材料中，填充到使被處理溶液通過的柱子中，構(gòu)成使被處理液通過的固定床、膜、多層集聚等形態(tài)使用。
底物作為處理對象的種類只要是使用氧化劑通過氧化酶-過氧化物酶可以分解的底物，就沒有限定，例如可以將鄰甲氧基苯酚、1，2，3-苯三酚等酚類作為底物。不過以社會上希望分解處理的難分解物質(zhì)作為底物特別合適。有關(guān)的難分解物質(zhì)舉2，3個(gè)例子，如紙漿漂白處理中應(yīng)當(dāng)分解的著色物質(zhì)木質(zhì)素、作為環(huán)境激素被看作問題的二噁英、雙酚A、多氯聯(lián)苯類(PCB)等。[第6發(fā)明～第8發(fā)明的實(shí)施方案]反應(yīng)促進(jìn)劑反應(yīng)促進(jìn)劑是用于氧化酶分解底物的反應(yīng)體系中的物質(zhì)，需要具備兩個(gè)條件具有以下“化1”表示的二酮結(jié)構(gòu)和可溶于水。由于具有二酮結(jié)構(gòu)，所以確保使反應(yīng)促進(jìn)劑有一定的疏水性?；? 在上述的“化1”中，R1、R2、R3只要至少不是羥基和烷氧基，就沒有限定。具體來說，例如可以從氫、甲基、乙基、異丙基等分子量小的烷基、這些烷基的衍生物基(例如二溴甲基和三氟甲基)、苯基等的碳5員環(huán)或6員環(huán)基、噻吩基等5員雜環(huán)或6員雜環(huán)等選擇合適的。無論R1、R2、R3是同一基團(tuán)，還是不同的基團(tuán)都可以。但是，必須避免由于上述R1、R2、R3基的選擇，結(jié)果使化1分子量過高、使反應(yīng)促進(jìn)劑變成不可溶于水的。特別理想的反應(yīng)促進(jìn)劑當(dāng)R2是氫、R1和R3中的任一個(gè)是氫，而另外一個(gè)是甲基時(shí)即為乙酰乙醛，兩者都是甲基時(shí)即乙酰丙酮，尤其反應(yīng)促進(jìn)劑是乙酰丙酮最理想。
氧化酶氧化酶只要是通過使反應(yīng)介質(zhì)活化而能夠使反應(yīng)促進(jìn)劑自由基化的酶都可以使用，并沒有限定。理想的酶是氧化還原酶、特別是過氧化物酶。過氧化物酶的種類雖然沒有限定，但最好使用錳過氧化物酶、辣根過氧化物酶或木質(zhì)素過氧化物酶。氧化酶通過不溶性載體進(jìn)行固定最理想。其固定化以及使用形式最好是將酶固定于粉粒狀載體后再使用。理想的不溶性載體之一如多孔的載體，多孔的不溶性載體中更理想的是有很多大小與通常酶大小相對應(yīng)的中孔，通過將酶收容在這些中孔使其不溶和穩(wěn)定的中孔多孔體，尤其是諸如以水硅鈉石等層狀硅酸鹽為原料，利用形成細(xì)孔用的模板物質(zhì)等構(gòu)成的多孔體的中孔硅多孔體。
反應(yīng)介質(zhì)所謂反應(yīng)介質(zhì)是指通過特定的酶活化后成為活性介質(zhì)，使反應(yīng)促進(jìn)劑自由基化的物質(zhì)。反應(yīng)介質(zhì)有時(shí)由氧化酶的種類決定，例如在錳過氧化物酶中可以利用錳離子、在木質(zhì)素過氧化物酶中可以利用3，4-二甲氧基芐醇等。介質(zhì)是其活化狀態(tài)在高反應(yīng)效率的嚴(yán)格條件下能夠維持活性的穩(wěn)定的低分子物質(zhì)特別理想。在上述條件下活性態(tài)即便不一定穩(wěn)定，但通過諸如與穩(wěn)定劑結(jié)合那樣的一定處置可以穩(wěn)定的物質(zhì)也很理想。
促進(jìn)疏水性底物分解的方法第1個(gè)促進(jìn)疏水性底物分解的方法是在混有親水性底物和與之相比相對疏水性的底物的水溶液中，使氧化酶和反應(yīng)介質(zhì)以及反應(yīng)促進(jìn)劑共存，通過自由基化的反應(yīng)促進(jìn)劑使疏水性底物優(yōu)先分解的方法。第2個(gè)促進(jìn)疏水性底物分解的方法是包括以下工序的方法通過氧化酶使反應(yīng)介質(zhì)活化的工序，將被活化的反應(yīng)介質(zhì)和反應(yīng)促進(jìn)劑添加到混有親水性底物和相對疏水性底物的水溶液中，通過自由基化的上述反應(yīng)促進(jìn)劑使上述疏水性底物優(yōu)先分解的工序。
在這些方法中，氧化酶以及反應(yīng)介質(zhì)的種類如前面所說的那樣。在這些方法中作為處理對象的底物溶液是混有親水性底物和與之相比相對疏水性底物的以水為媒介的底物溶液。親水性底物和疏水性底物的種類沒有限定。特別理想的底物溶液是應(yīng)當(dāng)進(jìn)行漂白處理的紙漿液。即親水性底物是應(yīng)當(dāng)避免被氧化酶分解的纖維素，而相對疏水性底物是要分解的著色物質(zhì)木質(zhì)素。底物溶液是要進(jìn)行漂白處理的紙漿液時(shí)，中間可以引入紙漿的堿萃取處理，使促進(jìn)疏水性底物分解的方法多級反復(fù)操作在使紙漿的漂白程度進(jìn)一步提高上最理想。
難分解物質(zhì)的分解方法難分解物質(zhì)的分解方法是在含有難分解物質(zhì)的水溶液中使氧化酶和反應(yīng)介質(zhì)以及上述反應(yīng)促進(jìn)劑共存，通過自由基化的反應(yīng)促進(jìn)劑分解上述難分解物質(zhì)的方法。雖然難分解物質(zhì)的種類沒有限定，但二噁英、PCB或擾亂內(nèi)分泌的物質(zhì)特別重要。擾亂內(nèi)分泌物質(zhì)如雙酚、壬基苯酚等。
MnP酶液第9發(fā)明涉及到的MnP酶液可以是通過白色腐朽菌(Phanerochaetecrysosporium)的紫外線照射產(chǎn)生的變異株SC21菌株的培養(yǎng)液；或者是該培養(yǎng)液通過過濾或離心分離除去固體成分，得到的更高純度的MnP酶液；也可以是通過鹽析或柱層析等操作得到的更高純度的MnP酶液。第9發(fā)明涉及到的更高純度的MnP酶液于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的MnP的殘余活性在50％以上，在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的MnP的殘余活性在15％以上。具備這樣高度耐熱性和耐過氧化氫特性的MnP酶液至今還屬未知。該酶液由于至少包括本申請發(fā)明人稱為S1～S5的5種MnP的同功酶，所以可以認(rèn)為酶液的上述特性反映了所有這些MnP同功酶的特性。第9發(fā)明涉及到的MnP酶液可以以上述各種純度的酶液原封不動地作為商品流通或被利用，也可以通過酶制劑上的任意的各種加工手段做成各種劑型、例如冷凍劑型或冷凍干燥劑型形式作為商品流通或被利用。
MnP第10發(fā)明涉及到的MnP是白色腐朽菌的上述變異株SC21菌株產(chǎn)生的，等電點(diǎn)處于4.3～4.7范圍，而且于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的MnP的殘余活性在50％以上，在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的MnP的殘余活性在15％以上。上述MnP中，特別理想的是稱之為S1的MnP同功酶，稱為S2的MnP同功酶以及稱為S3的MnP同功酶。這些MnP同功酶無論哪一個(gè)以前都沒有報(bào)道過或獲得過。
S1等電點(diǎn)為4.3，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的MnP的殘余活性在90％以上，在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的MnP的殘余活性在30％以上。S1的分子量是40.5kDa。
S2等電點(diǎn)為4.5，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的MnP的殘余活性在90％以上，在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的MnP的殘余活性在45％以上。S2的分子量是40.5kDa。
S3等電點(diǎn)為4.7，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的MnP的殘余活性在50％以上，在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的MnP的殘余活性在15％以上。S3的分子量是40.5kDa。
MnP的制造方法按照MnP的制造方法可以制造第9發(fā)明涉及到的MnP酶液，或第10發(fā)明涉及到的任一種MnP或一種以上的MnP。具體來說，培養(yǎng)上述SC21菌株，可以提取上述任一種MnP酶液或MnP。SC21菌株的培養(yǎng)條件沒有限定。有關(guān)培養(yǎng)基的種類和添加劑等也沒有特別限定。有關(guān)的培養(yǎng)方法也沒有特別限定，但理想的作法是例如將1L合適的培養(yǎng)基加入2L的三角燒瓶中，然后添加菌體懸濁液80mL(該菌體懸濁液是通過將預(yù)先培養(yǎng)2天的前培養(yǎng)菌體攪勻后得到的)，于30℃、120rpm條件下進(jìn)行適當(dāng)?shù)臅r(shí)間的振蕩培養(yǎng)。有關(guān)上述以外的培養(yǎng)條件，最好是例如在培養(yǎng)至第3天時(shí)添加3，4-二甲氧基芐醇等酶誘導(dǎo)劑，或者向培養(yǎng)燒瓶內(nèi)酶滿后密封等。該酶的置換最好是在培養(yǎng)第3天以后直至培養(yǎng)結(jié)束每天換一次。
利用該制造方法在提取MnP酶液時(shí)，為了使酶液的純度提高，可以象上述那樣對培養(yǎng)液進(jìn)行過濾或離心分離、為了獲得更高純度可以進(jìn)行鹽析或柱層析等各種操作?？梢詮腟C21的培養(yǎng)物，或者從上述MnP酶液中對各個(gè)MnP分別提取和純化。該提取和純化工作的內(nèi)容沒有限定，但可以任意進(jìn)行陰離子交換層析或陽離子交換層析等操作。
MnP的固定化當(dāng)使用第10發(fā)明涉及到的各種MnP時(shí)，為了進(jìn)一步提高耐熱性和耐過氧化氫特性，通過不溶性載體將MnP進(jìn)行固定化更理想。酶的固定化以及使用形式可以是將酶固定于粉粒狀的不溶性載體上之后，分散投入到介質(zhì)溶液中，或者是將固定化酶填充到使介質(zhì)溶液通過的柱子中，或者是將酶固定于介質(zhì)溶液通過的固定床的構(gòu)成材料載體上使用。一種理想的不溶性載體如多孔載體，而多孔形不溶性載體中更理想的例子如具有很多大小與通常酶大小相當(dāng)?shù)闹锌祝ㄟ^將酶收納在這些中孔中使其不溶化和穩(wěn)定的中孔(性)多孔體，尤其是例如以水硅鈉石等層狀硅酸鹽為原料，利用細(xì)孔形成用的模板物質(zhì)等構(gòu)成多孔體的中孔(性)硅多孔體(FSM)。
MnP的利用MnP酶液以及各種MnP用途廣泛。例如，用于紙漿中木質(zhì)素的分解(目的是使紙漿漂白)，以及人體中有害的難分解物質(zhì)的分解等都很理想。作為有害的難分解物質(zhì)如二噁英、PCB、雙酚、壬基苯酚等擾亂內(nèi)分泌的物質(zhì)等。除此之外，尼龍等化學(xué)纖維或其它的塑料的高效分解等都是MnP酶液或各種MnP的理想用途。在MnP酶液或MnP引起的酶反應(yīng)中，都同時(shí)存在著作為介質(zhì)的錳離子和過氧化氫。
所謂介質(zhì)是指來自于酶反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物，通過酶MnP的作用使其成為活性介質(zhì)(2價(jià)錳變成3價(jià)錳)，然后作用于底物完成既定反應(yīng)的物質(zhì)。作為活性介質(zhì)的3價(jià)錳離子通過與丙二酸等指定的螯合劑共存，通過與螯合劑結(jié)合可以使3價(jià)錳離子穩(wěn)定?？紤]到反應(yīng)條件的穩(wěn)定性，可以將作為介質(zhì)以及活性介質(zhì)的介體水配成緩沖液。
過氧化氫濃度對MnP酶液或MnP引起的酶反應(yīng)的速度有重要的影響。在以往利用錳過氧化物酶的酶反應(yīng)中，為了避免酶失活，過氧化氫濃度為0.1mM左右是實(shí)質(zhì)上的上限。在本發(fā)明涉及到的MnP酶液或MnP過氧化氫濃度可以提高到0.3mM(1小時(shí))左右。在將第10發(fā)明涉及到的MnP作為上述FSM-MnP用時(shí)，還可以將過氧化氫濃度提高到0.6mM(1小時(shí))左右。
在酶反應(yīng)中一般都提到，本發(fā)明涉及到的MnP酶液或MnP參與的酶反應(yīng)中也提到反應(yīng)溫度對酶反應(yīng)速度有重要的影響。在以往利用錳過氧化物酶的酶反應(yīng)中，為了避免酶失活，反應(yīng)溫度為30℃左右是實(shí)質(zhì)上的上限。在本發(fā)明涉及到的MnP酶液或MnP經(jīng)過1小時(shí)以上可以使反應(yīng)溫度提高直至50℃左右。在將本發(fā)明涉及到的MnP作為上述FSM-MnP用時(shí)，經(jīng)過1小時(shí)以上可以使反應(yīng)溫度提高直至60℃左右。
通過以上構(gòu)成，裝在容器1內(nèi)水溶液中的介質(zhì)通過玻璃管2轉(zhuǎn)移到作為活化反應(yīng)場所的反應(yīng)柱3中，被酶活化，然后活性介質(zhì)被輸送到作為底物反應(yīng)場所的容器5中，對底物進(jìn)行所期望的反應(yīng)，通過該反應(yīng)變成無活性介質(zhì)的水溶液廢棄到容器8中。在上述實(shí)施例中，底物是水溶性物質(zhì)時(shí)，將容器8作為用于進(jìn)行指定的后續(xù)工序的反應(yīng)容器，可以將在容器5中的進(jìn)行所期望的反應(yīng)后的底物連同用過的介質(zhì)一起運(yùn)輸?shù)饺萜?中。
(實(shí)施例2-活化步驟和底物反應(yīng)步驟的分離)將所定活性單位的錳過氧化物酶(以下錳過氧化物酶也稱之為“MnP”)固定化的FSM(以下固定了MnP的FSM也稱之為“FSM-MnP”)粉末5mg懸浮于含有介質(zhì)2價(jià)錳和活性介質(zhì)(3價(jià)錳)的穩(wěn)定劑丙二酸鹽的緩沖液[25mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)、1mM丙二酸鈉、0.5mM硫酸錳、0.1mM過氧化氫]中，于37℃反應(yīng)5分鐘后，通過離心分離除去固定化酶，得到反應(yīng)上清。該反應(yīng)上清含有3價(jià)錳，而且通過另外的酶活力檢測可以確認(rèn)沒有混入MnP。將上述反應(yīng)上清與一定量的含有過量濃度底物2，6-二甲氧基苯酚的水溶液混合，通過對生成的有色溶液測定470nm的吸光度，對反應(yīng)上清氧化DMP的氧化能力進(jìn)行定量。圖2的曲線給出了測定的結(jié)果。圖2中橫坐標(biāo)的“反應(yīng)液量(ml)”表示混合在上述一定量底物水溶液中的反應(yīng)上清的量。另外作為與上述不同的比較實(shí)驗(yàn)，用沒有固定MnP的FSM進(jìn)行同樣的操作，可以確認(rèn)在使用該反應(yīng)上清時(shí)沒有看到DMP發(fā)色。
就象圖2表明的那樣，不含有MnP的本實(shí)施例的反應(yīng)上清可以使DMP發(fā)色，發(fā)色量隨反應(yīng)上清的量的增大而增大。由此可以確認(rèn)在有介質(zhì)參與的酶反應(yīng)中，可以象第1發(fā)明那樣將活化步驟與底物反應(yīng)步驟分開。
(實(shí)施例3-活性介質(zhì)的穩(wěn)定性)將實(shí)施例2得到的反應(yīng)上清裝入容器后置于冰中，以對DMP的氧化活性作為指標(biāo)定量一定時(shí)間后的該反應(yīng)上清中的3價(jià)錳的殘存量。圖3曲線給出了以實(shí)施例2中獲得的反應(yīng)上清直接測得的DMP氧化活性設(shè)為100％的相對活性的測定結(jié)果。圖3中橫坐標(biāo)的“處理時(shí)間(時(shí)間)”表示上述在冰中放置的時(shí)間。根據(jù)測得結(jié)果可知，反應(yīng)上清中活性介質(zhì)中的3價(jià)錳6小時(shí)后殘存有60％，即使24小時(shí)后還殘存約40％，可見至少在3價(jià)錳被螯合劑(丙二酸)穩(wěn)定的情況下，在從活化反應(yīng)場所向底物反應(yīng)場所轉(zhuǎn)移過程所需要的時(shí)間內(nèi)是十分穩(wěn)定的。
(實(shí)施例4-酶的穩(wěn)定性)將固定有所定活性單位MnP的FSM的較粗粒狀體填充到柱子中，用39℃的緩沖液[50mM丙二酸緩沖液(pH4.5)、0.1mM硫酸錳、0.05％Tween80、0.1mM過氧化氫]洗脫柱子，流速為200mL/hr，使3價(jià)錳離子連續(xù)生成。以上操作完成后，上述粒狀多孔體用蒸餾水洗凈后，保存于4℃下。以上操作用同樣的粒狀多孔體以一日一次的程度反復(fù)進(jìn)行30天，以從柱子的流出液對DMP的氧化活性為指標(biāo)，評價(jià)固定于粒狀多孔體的MnP的酶活性的穩(wěn)定性。其結(jié)果以第一天操作時(shí)的流出液對DMP的氧化活性為100％的相對活性表示在圖4的曲線中。
如果從該結(jié)果來看，流出液的DMP氧化活性雖然隨著天數(shù)增加的同時(shí)漸漸降低，但即使在30天后仍然維持著大約70％的相對活性。其結(jié)果一方面表示固定于FSM的酶的穩(wěn)定性，同時(shí)也表明在介質(zhì)參與的酶反應(yīng)中，使酶只參與從空間上與底物反應(yīng)步驟分開的活化步驟，這對酶的穩(wěn)定性也有利。
(實(shí)施例5-紙漿的漂白)在用與實(shí)施例4相同的緩沖液在同樣的條件下洗脫與實(shí)施例4準(zhǔn)備的同樣柱子，通過連續(xù)地將流出液輸送到收容1％未漂白紙漿的反應(yīng)槽(底物反應(yīng)場所)，進(jìn)行紙漿的漂白。上述無論哪一操作都是在39℃下進(jìn)行的。另外作為比較例，對填充了沒有固定化酶的FSM的稍粗粒狀體的柱子也用上述那樣的緩沖液洗脫，用流出液進(jìn)行同樣的紙漿漂白實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果以紙漿白度(％)隨相應(yīng)漂白實(shí)驗(yàn)開始后反應(yīng)時(shí)間過程的變化表示在圖5的曲線中，從“●”曲線給出的本實(shí)施例可以看出紙漿白度有效提高，相對于用“X”給出的比較例表現(xiàn)出顯著差別。
(實(shí)施例6-在各個(gè)溫度下3價(jià)錳的反應(yīng)性)向50μl固定了所定活性單位MnP的FSM中加入底物溶液[30mM丙二酸緩沖液(pH4.5、10mM硫酸錳、0.1mM過氧化氫)]1mL，于37℃下反應(yīng)5分鐘。通過離心分離分離固定化酶，將反應(yīng)上清作為活性Mn溶液保存在冰中。將活性Mn溶液于各個(gè)溫度下保溫10分鐘，以270nm的吸光度變化作為指標(biāo)測定消失的Mn(III)、即3價(jià)錳量。圖6給出了在各個(gè)溫度下Mn(III)的消失量，即反應(yīng)速度。與丙二酸形成配位化合物的Mn(III)即使在約30℃以下的低溫區(qū)也幾乎不反應(yīng)(還原反應(yīng))，維持穩(wěn)定，而相反在約40℃以上的高溫區(qū)，隨著溫度的上升，其反應(yīng)速度急劇增加。這表明在高溫通過使Mn(III)與紙漿接觸，可以有效地與紙漿反應(yīng)。
(實(shí)施例7-酶柱以及反應(yīng)槽的反應(yīng)溫度與紙漿漂白效率的關(guān)系)將0.4mL所定活性單位的MnP的FSM填充到柱子中，用活化緩沖液[10mM硫酸錳、0.05％Tween80、0.1mM過氧化氫、30mM丙二酸緩沖液(pH4.5)]洗脫柱子，流速為360mL/hr，使Mn(III)連續(xù)生成。將含有Mn(III)的酶反應(yīng)液連續(xù)地輸送到收容1％未漂白紙漿的反應(yīng)槽中，進(jìn)行紙漿漂白。在此過程中，酶柱和反應(yīng)槽分別保溫在39℃或70℃下。酶柱和反應(yīng)槽都保溫在39℃時(shí)(圖7(A)表示的情況)，雖然酶活性大約能保持10小時(shí)，但紙漿漂白效率低。酶柱和反應(yīng)槽都保溫在70℃時(shí)(圖7(B)表示的情況)，酶活性從反應(yīng)剛開始就急速下降，雖然初期白度上升很快，但隨著酶的失活，白度的上升也達(dá)到頂點(diǎn)。另外將酶柱保溫在39℃下，而反應(yīng)槽保溫在70℃時(shí)(圖7(C)表示的情況)，在酶活性保持穩(wěn)定的同時(shí)，漂白速度也快了，能更有效地漂白紙漿。從圖7(A)～圖7(C)的結(jié)果可以確認(rèn)通過將酶柱和反應(yīng)槽分別設(shè)定在最適溫度，可以實(shí)現(xiàn)更有效的酶反應(yīng)。
(實(shí)施例8-酶處理和堿萃取配合的多級漂白)使利用固定了MnP的FSM的酶漂白與堿萃取交替反復(fù)操作，對未漂白紙漿進(jìn)行漂白。在上述實(shí)施例7給出的系統(tǒng)中，通過將酶柱保溫在39℃，反應(yīng)槽保溫在70℃進(jìn)行60分鐘酶漂白后，將紙漿懸浮于堿性溶液(2.5％氫氧化鈉)中，于70℃下保溫5分鐘。將紙漿洗凈后，反復(fù)進(jìn)行上述操作，直至獲得目的白度(白度85％)為止。結(jié)果表明通過進(jìn)行7次酶漂白和7次堿萃取，就象圖8“●”曲線表示的那樣，可以看到總共用大約450分鐘就可達(dá)到目的白度，實(shí)際的紙漿漂白可以達(dá)到產(chǎn)業(yè)上可實(shí)用的水平。另外就象圖8“○”曲線表示的那樣，漂白過程中通過FSM-MnP生成的Mn(III)的量(用吸光度270nm測定)穩(wěn)定，F(xiàn)SM-MnP具備可適用于實(shí)際紙漿漂白工序的充分穩(wěn)定性。
(實(shí)施例9-利用固定化漆酶漂白紙漿)將固定了所定活性單位漆酶的FSM填充到柱子中，保溫于40℃下，連續(xù)地用作為介質(zhì)含有1mM ABTS的50mM乙酸緩沖液(pH4.5)進(jìn)行洗脫。將反應(yīng)液連續(xù)地輸送到保溫在70℃的裝有1％未漂白紙漿的反應(yīng)槽中，進(jìn)行紙漿漂白。此時(shí)，以436nm的吸光度為指標(biāo)檢測來自反應(yīng)液中含有的ABTS的活性自由基的濃度，檢測結(jié)果如圖9(b)所示，與此同時(shí)每隔一定時(shí)間從反應(yīng)槽中取紙漿樣品進(jìn)行白度測定，結(jié)果如圖9(a)所示。
圖9(a)、(b)中，●曲線代表的上述實(shí)施例通過酶使介質(zhì)活化，生成了自由基，通過自由基與紙漿反應(yīng)，紙漿的白度上升，與此相反，■曲線代表的比較例(填充了沒有固定漆酶的FSM的柱子)沒有給反應(yīng)槽提供活化的自由基，所以紙漿的白度也沒有上升。在FSM固定化漆酶柱和反應(yīng)槽兩者都保溫在40℃的比較例(×曲線)中，可以確認(rèn)相對于實(shí)施例，漂白速度變慢。
從這些結(jié)果可以確認(rèn)本發(fā)明的方法可適用于使用漆酶的紙漿漂白中，通過使酶反應(yīng)階段和紙漿漂白階段的反應(yīng)條件分別最適化，與使用MnP時(shí)一樣可有效地漂白紙漿。
(實(shí)施例10-通過固定化木質(zhì)素過氧化物酶漂白紙漿)將固定了木質(zhì)素過氧化物酶的FSM填充到柱子中，保溫于40℃下，用含有10mM鄰甲氧基苯酚和0.4mM過氧化氫的琥珀酸緩沖液(pH4.5)連續(xù)洗脫，通過與實(shí)施例7同樣的系統(tǒng)對紙漿漂白2小時(shí)，結(jié)果表明與實(shí)施例中白度63.3％相比，填充了沒有固定化木質(zhì)素過氧化物酶的FSM的柱子的比較例白度是61.9％。通過顯著性差異檢測，可以確認(rèn)該實(shí)施例與比較例的差異存在統(tǒng)計(jì)上的顯著差異。[第5發(fā)明涉及到的實(shí)施例](實(shí)施例11中孔(性)多孔體的合成)向100mL的燒杯中分別加入5.0g(0.028mol)的δ-Na2Si2O5(水硅鈉石)、50mL的離子交換水，于約25℃下攪拌3小時(shí)，進(jìn)行陽離子交換。然后過濾掉水溶液，得到δ-Na1.6H0.4Si2O5沉淀。向該沉淀加入50mL的離子交換水?dāng)嚢柚敝脸蔀榫鶆虻姆稚⒁?，將這種溶液作為A液。另外，向100mL的三角燒瓶中加入3.0g(0.0082mol)的十六烷基三甲基溴銨(HDTMA-Br)和50mL的離子交換水，于60℃下攪拌變成完全透明，然后添加5.0g(0.025mol)的三異丙基苯(TIPB)，劇烈攪拌10分鐘，將該溶液作為B液。將上述A液移至250mL的三口燒瓶中，在劇烈攪拌下慢慢地添加B液，使溫度升至80℃后，連續(xù)進(jìn)行3小時(shí)恒溫反應(yīng)。然后一邊用2N鹽酸將該反應(yīng)液的pH調(diào)至8.5±0.1，一邊攪拌3小時(shí)后，立刻過濾，用200mL的離子交換水進(jìn)行5次洗滌過濾。將過濾的生成物(白色粉末)于45℃下，風(fēng)干24小時(shí)，然后于550℃的電爐中燒結(jié)，得到除去了模板物質(zhì)的中孔(性)硅多孔體約3.5g。用X射線衍射儀(理學(xué)RAD-B)測定該多孔體的結(jié)構(gòu)，用氮?dú)馕窖b置(Autosorb mp-1)測定多孔體的細(xì)孔直徑和表面積以及細(xì)孔總?cè)莘e。詳細(xì)測定過程省略，細(xì)孔直徑幾乎均一都是約50。該多孔體稱之為“FSM-50載體”。
一方面準(zhǔn)備與上述相同的A液，另一方面向100mL的三角燒瓶中加入4.0g(0.01mol)的二十二烷基三甲基氯銨(DTMA-C1)和50mL的離子交換水，于約60℃下攪拌直至完全透明，然后添加8.0g(0.04mol)的TIPB，劇烈攪拌10分鐘，將該溶液保持在60℃下，作為B2液。就A液和B2液進(jìn)行象上述實(shí)施例1-1中對A液和B1液那樣的操作，得到的生成物同樣進(jìn)行風(fēng)干和燒結(jié)，得到約4.5g的中孔(性)硅多孔體。就該多孔體進(jìn)行與實(shí)施例1-1同樣的結(jié)構(gòu)確認(rèn)和測定。詳細(xì)測定過程省略，細(xì)孔直徑幾乎均一都是約70，該多孔體稱之為“FSM-70載體”。
除了將上述的B液的制備過程中使用的TIPB量由8.0g(0.04mol)變更為16.0g(0.08mol)以外，其它操作完全與上述操作相同，得到約4.5g中孔(性)硅多孔體。就該多孔體進(jìn)行與實(shí)施例1-1同樣的結(jié)構(gòu)確認(rèn)和測定。詳細(xì)測定過程省略，但細(xì)孔直徑幾乎均一都是約90，該多孔體稱之為“FSM-90載體”。
(實(shí)施例12FSM-MnP等的制備)
將培養(yǎng)白色腐朽菌得到的錳過氧化物酶(MnP)用pH4.5的50mM琥珀酸緩沖液調(diào)整為0.2mg/mL。然后將3份約70mL的該酶液分別加到上述的各200mg的“FSM-50載體”、“FSM-70載體”和“FSM-90載體”粉末中，于4℃下緩慢地混合16小時(shí)以上，然后離心分離，再用去離子水洗3次，得到固定化酶(結(jié)合了MnP的各個(gè)FSM載體)。將固定化載體不同的上述3種固定化酶一并稱之為“FSM-MnP載體”，要將它們分別稱呼時(shí)，使用FSM-50載體的FSM-MnP簡單地稱為“FSM-50/MnP”，使用FSM-70載體的FSM-MnP簡單地稱為“FSM-70/MnP”，使用FSM-90載體的FSM-MnP簡單地稱為“FSM-90/MnP”。
另外一方面按照“Applied Biochemistry and Biotechnology，60卷、1-17頁，1996年”記載的方法，準(zhǔn)備將與上述FSM-MnP情況相同的錳過氧化物酶固定于聚合物的固定化酶，而固定的酶量平均重量與上述相同。該固定化酶以下稱之為“Emphaze”，用作比較例的固定化酶。另外，使用富士Silysia公司生產(chǎn)的硅膠5D(平均細(xì)孔直徑為190)，準(zhǔn)備將與上述FSM-MnP情況相同的錳過氧化物酶固定了的固定化酶，而固定的酶量平均重量與上述相同。該固定化酶以下稱之為“硅膠”(silica gel)，用作比較例的固定化酶。
(實(shí)施例13FSM-MnP的評價(jià))氧化劑存在下FSM-MnP的pH穩(wěn)定性向5mg的FSM-70/MnP中加入90μL的50mM各種不同pH的緩沖液，于37℃下處理1小時(shí)，離心分離固體成分后，用500μL的離子交換水洗凈。向該FSM-70/MnP中加入含有作為底物的0.5mM的MnSO4和2mM草酸鈉和0.1mM過氧化氫的950μL50mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)，于37℃下反應(yīng)5分鐘，然后離心5分鐘，測定上清的270nm的吸光度(作為酶反應(yīng)生成物的3價(jià)錳的配位化合物)。以該測定值評價(jià)FSM-70/MnP的酶活性，

圖10中的曲線是按照以最大活性值為100的相對數(shù)值畫的曲線。
另外向4單位非固定化的錳過氧化物酶中加入90μL的50mM各種不同pH的緩沖液，于37℃下處理1小時(shí)，用其中的5μL進(jìn)行同樣的反應(yīng)，同樣測定吸光度，如圖10所示。另外，對上述5mg“Emphaze”和FSM-70/MnP也進(jìn)行同樣處理，進(jìn)行反應(yīng)，同樣測定吸光度。如圖所示10。就象圖10表示的那樣，以標(biāo)記為“Native”的非固定化的錳過氧化物酶和“Emphaze”幾乎沒什么差別，與這兩者相比，可看出“FSM-70/MnP”在超過pH4范圍內(nèi)顯著的pH穩(wěn)定性。
氧化劑存在下FSM-MnP隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性向5mg的FSM-70/MnP中加入200μL的25mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)，于60℃下進(jìn)行不同時(shí)間的處理，離心分離固體成分后，用500μL的離子交換水洗凈。向該FSM-70/MnP中加入含有作為底物的0.5mM MnSO4和2mM的草酸鈉和0.1mM的過氧化氫的950μL的25mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)，于37℃下反應(yīng)5分鐘，然后離心5分鐘，測定上清的270nm的吸光度(作為酶反應(yīng)生成物的3價(jià)錳的配位化合物)。以該測定值評價(jià)FSM-70/MnP的酶活性，圖11中的曲線是按照以最大活性值為100的相對數(shù)值(圖11中用“相對活性”表示)畫的曲線。
另外向4單位非固定化的錳過氧化物酶中加入50μL的50mM pH4.5琥珀酸緩沖液，于60℃下進(jìn)行與上述同樣的各種時(shí)間處理，用其中的2.5μL進(jìn)行同樣的反應(yīng)，同樣測定吸光度，如圖11所示。另外，就上述的“Emphaze”和“silica gel”各5mg也象FSM-70/MnP那樣處理，使其反應(yīng)，同樣測定吸光度，如圖11所示。就象圖11表示的那樣，以“Native”表示的非固定化的錳過氧化物酶隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性非常低，而“Emphaze”和“silica gel”活性也迅速降低很多，而“FSM-70/MnP”在經(jīng)過2小時(shí)后仍然維持大約70％的相對活性。
氧化劑存在下FSM-MnP的熱穩(wěn)定性向各5mg的FSM-50/MnP、FSM-70/MnP以及FSM-90/MnP中分別加入200μL的25mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)，于各種不同的溫度下處理1小時(shí)，離心分離后，再用500μL的離子交換水洗凈。向各個(gè)FSM-MnP中分別加入含有作為底物的0.5mM的MnSO4和2mM的草酸鈉和0.1mM的過氧化氫的950μL的25mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)，于37℃下反應(yīng)5分鐘，然后離心5分鐘，測定上清的270nm的吸光度(作為酶反應(yīng)生成物的3價(jià)錳的配位化合物)。用該測定值評價(jià)各個(gè)FSM-MnP的酶活性，圖12中的曲線是按照以最大活性值為100的相對數(shù)值畫的曲線。
另外向4單位非固定化的錳過氧化物酶中加入50μL的50Mm的pH4.5的琥珀酸緩沖液，于上述相同的各種溫度下處理1小時(shí)，用其中的2.5μL進(jìn)行同樣的反應(yīng)，同樣測定吸光度，如圖12所示。就象圖12表示的那樣，以“Native”表示的非固定化的錳過氧化物酶和各個(gè)FSM-MnP在比較高的溫度范圍內(nèi)可以看到顯著性差異。另外，就各個(gè)FSM-MnP之間來說，具有與錳過氧化物酶的酶直徑幾乎一致的細(xì)孔直徑的“FSM-70/MnP”特別好。
氧化劑存在下FSM-MnP隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性向各5mg的FSM-50/MnP、FSM-70/MnP以及FSM-90/MnP中分別加入200μL的200mM的50mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)，于60℃下進(jìn)行各種不同時(shí)間的處理，離心分離后，再用500μL的離子交換水洗凈。向各個(gè)FSM-MnP中分別加入含有作為底物的0.5mM的MnSO4和2mM的草酸鈉和0.1mM的過氧化氫的950μL的25mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)，于37℃下反應(yīng)5分鐘，然后離心5分鐘，測定上清的270nm的吸光度(作為酶反應(yīng)生成物的3價(jià)錳的配位化合物)。以該測定值評價(jià)各個(gè)FSM-MnP的酶活性，圖13中的曲線是按照以時(shí)間0點(diǎn)活性值為100的相對數(shù)值(圖13中用“相對活性”表示)畫的曲線。
另外向4單位非固定化的錳過氧化物酶中加入50μL的50Mm的pH4.5的琥珀酸緩沖液，于60℃下進(jìn)行上述那樣各種時(shí)間的處理，用其中的2.5μL進(jìn)行同樣的反應(yīng)，同樣測定吸光度，如圖13所示。就象圖13表示的那樣，可以看出以“Native”表示的非固定化的錳過氧化物酶和各個(gè)FSM-MnP隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性有顯著的差異。另外就各個(gè)FSM-MnP之間比較來說“FSM-70/MnP”特別好。
FSM-MnP對氧化劑濃度的穩(wěn)定性向2mg的FSM-70/MnP中加入含有作為底物的0.5mM的MnSO4和2mM的草酸鈉和各種不同濃度過氧化氫的950μL的25mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)，于37℃下反應(yīng)5分鐘，然后離心5分鐘，測定上清的270nm的吸光度(作為酶反應(yīng)生成物的3價(jià)錳的配位化合物)。以該測定值評價(jià)FSM-70/MnP的酶活性，圖14中的曲線是按照相對于過氧化氫濃度為0時(shí)的吸光度的比吸光度(圖14中用“相對活性’’表示)畫的曲線。
另外向3單位非固定化的錳過氧化物酶中加入含有上述那樣各種不同濃度過氧化氫的緩沖液，進(jìn)行同樣的反應(yīng)，測定吸光度，如圖14所示。就象圖14表示的那樣，以“Native”表示的非固定化的錳過氧化物酶和“Emphaze”在0.5mM過氧化氫濃度下已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的失活，與此相反，“FSM-70/MnP”即使在最大為6mM的過氧化氫濃度內(nèi)仍維持有效的活性。而各個(gè)例子在過氧化氫的極低濃度范圍內(nèi)沒有表現(xiàn)出充分的活性，但這是由于氧化劑絕對量不足引起的，并不意味著酶的活性低。
(實(shí)施例14紙漿的漂白)將FSM-70/MnP的稍粗的粒狀體填充到柱子中，用39℃的緩沖液[50mM丙二酸緩沖液(pH4.5)、0.1mM硫酸錳、0.05％Tween80、0.1mM過氧化氫]洗脫柱子1小時(shí)，流速為200mL/hr，使3價(jià)錳離子連續(xù)生成。然后連續(xù)地將該流出液輸送到收容1％未漂白紙漿的反應(yīng)槽，進(jìn)行紙漿的漂白。上述無論哪一操作都是在39℃下進(jìn)行的。
另外作為比較例，對填充了沒有固定化的FSM-70載體的稍粗的粒狀體的柱子也用上述那樣的緩沖液洗脫，用流出液進(jìn)行同樣的紙漿漂白實(shí)驗(yàn)。
這些結(jié)果作為紙漿白度(％)隨漂白實(shí)驗(yàn)開始后的反應(yīng)時(shí)間過程的變化表示在圖15的曲線中，在“●”曲線給出的本實(shí)施例中可以看出紙漿白度有效提高，相對于用“X”給出的比較例可以看出顯著性差異。[第6發(fā)明～第8發(fā)明涉及到的實(shí)施例](實(shí)施例15紙漿的漂白)Kraft法(磷酸鹽法(制漿))蒸煮后的紙漿1kg用5L蒸餾水洗3次，制備未漂白紙漿。另外利用陰離子交換層析從P.chrysosporiumBFC-1767菌株(ATCC 64314)的培養(yǎng)液中純化錳過氧化物酶。
然后相對于含有0.1mM硫酸錳、0.05％Tween80、0.5M的葡萄糖的50mM乙酸緩沖液(pH4.5)分別加入各50mM的乙酰丙酮、丙二酸、檸檬酸或酒石酸，制備各種測試溶液。
向上述各個(gè)實(shí)驗(yàn)溶液100mL添加上述未漂白紙漿使紙漿濃度為1％，然后加入錳過氧化物酶100單位和5單位葡萄糖氧化酶，于37℃、50rpm下一邊振蕩一邊使其反應(yīng)。
然后使用反應(yīng)剛開始后，反應(yīng)開始5小時(shí)后以及反應(yīng)開始24小時(shí)后的各個(gè)實(shí)驗(yàn)溶液，將紙漿過濾后，做成手制紙，按照J(rèn)IS P-8123測定這些手制紙白度。結(jié)果如圖16所示。在圖16的曲線圖中，橫坐標(biāo)表示反應(yīng)開始后經(jīng)歷的時(shí)間，縱坐標(biāo)表示白度(％)。
就象從圖16的結(jié)果所了解的那樣，與作為反應(yīng)促進(jìn)劑使用的丙二酸以及其它有機(jī)酸情況相比，使用本發(fā)明實(shí)施例使用的乙酰丙酮能迅速地提高紙漿的白度。在本發(fā)明實(shí)施例中從反應(yīng)開始5小時(shí)后直到反應(yīng)開始24小時(shí)后的紙漿白度的提高達(dá)到頂點(diǎn)，考慮這是由于木質(zhì)素分解效果(提高白度的效果)已經(jīng)飽和的緣故。
(實(shí)施例16-乙酰丙酮濃度的影響)進(jìn)行與實(shí)施例15中加有50mM的乙酰丙酮的試驗(yàn)例相關(guān)的試驗(yàn)例，其中乙酰丙酮的添加量變更為0mM、5mM、15mM、150mM以及500mM，其它方面與上述實(shí)施例15試驗(yàn)例相同。應(yīng)予說明白度測定的時(shí)間是反應(yīng)剛開始后、反應(yīng)開始2小時(shí)后以及4小時(shí)后。包括添加50mM的乙酰丙酮的例子在內(nèi)的結(jié)果都表示在圖17中。
就象從圖17的結(jié)果所了解的那樣，乙酰丙酮的濃度越高，紙漿的白度也迅速提高。但從添加了高濃度的乙酰丙酮的例子可看到紙漿白度迅速上升后有變平的傾向。其理由可能是效果飽和了，也可能是由于高濃度的乙酰丙酮使酶失活了。
(實(shí)施例17-多級分解法)將實(shí)施例15中制備的未漂白紙漿懸浮于2.5％氫氧化鈉溶液中，使紙漿濃度為1％，于60℃下加熱攪拌30分鐘(該堿提取處理稱之為E工序)。將經(jīng)E工序處理的未漂白紙漿完全象實(shí)施例1那樣按照本發(fā)明的促進(jìn)分解方法進(jìn)行處理(該工序稱為M工序)。
然后使E工序和M工序交替反復(fù)多級操作，共進(jìn)行9次，每當(dāng)在第3、第5、第7、第9工序的E工序結(jié)束時(shí)，過濾紙漿做成手制紙，按照J(rèn)IS P-8123標(biāo)準(zhǔn)測定紙白度。
另外也進(jìn)行在M工序不添加乙酰丙酮，其它都同樣進(jìn)行的比較例實(shí)驗(yàn)以及在M工序不添加乙酰丙酮和錳過氧化物酶，其它都同樣進(jìn)行的比較例實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖18所示。在圖18中，“MnP+，acac+”代表本發(fā)明的實(shí)施例，“MnP+，acac-”代表沒有添加乙酰丙酮的比較例，“MnP-，acac-”代表沒有添加乙酰丙酮和錳過氧化物酶的比較例。另外，圖中的橫坐標(biāo)不是工序次數(shù)，而表示在各次工序中分解反應(yīng)的累計(jì)時(shí)間。各個(gè)曲線由左邊開始依次代表第3、第5、第7、第9工序。
從圖18可以看出，與比較例相比實(shí)施例紙漿白度提高效果非常迅速，直至得到高的白度之前沒有出現(xiàn)效果飽和的傾向，最終能達(dá)到超過80％的非常高的白度。
(實(shí)施例18-酶的固定化)以層狀硅酸鹽水硅鈉石作為原料，利用形成細(xì)孔用的模板物質(zhì)，按照所定的方法構(gòu)成具有均一50細(xì)孔徑的中孔(性)硅多孔體(該多孔體稱之為“FSM-70”)。
另外用pH4.5的10mM乙酸琥珀酸緩沖液將實(shí)施例15制備的錳過氧化物酶配成5mg/mL溶液。然后將該溶液5mL加到200mg的上述FSM-70中，于4℃下緩慢地混合16小時(shí)以上，獲得固定于FSM-70上的錳過氧化物酶(該固定化酶稱之為“FSM-MnP”)。
(實(shí)施例19-酶反應(yīng)與紙漿漂白反應(yīng)的分離)使含有0.1mM硫酸錳、0.05％Tween80、1mM過氧化氫的200mL的50mM丙二酸緩沖液(pH4.5)通過填充了3mg FSM-MnP的小柱子，流速為8mL/分，回收穿過液，制備3價(jià)錳離子溶液。
相對于50mL上述回收的穿過液，作為比較例添加干重0.5g的紙漿，而作為實(shí)施例添加干重0.5g的紙漿和乙酰丙酮0.5M(最終濃度)，于70℃下振蕩1小時(shí)。然后根據(jù)270nm吸光度消失確認(rèn)3價(jià)錳離子的消失后，進(jìn)行與實(shí)施例15同樣的操作做成手制紙，測定白度。
測定結(jié)果是在實(shí)施例中白度為62.3％，與未處理的紙漿白度比較提高了3.3％。比較例中的白度為59.9％，白度提高了0.9％。以上結(jié)果表明在本發(fā)明的促進(jìn)疏水性底物分解的方法中氧化酶的作用在于提供了作為活化反應(yīng)介質(zhì)的3價(jià)錳離子，在進(jìn)行紙漿漂白反應(yīng)時(shí)，如果存在活化反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)促進(jìn)劑和底物最好。
因此，通過將利用氧化酶作用生成活性反應(yīng)介質(zhì)的反應(yīng)和利用該活性反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行紙漿漂白的反應(yīng)分別在不同場所進(jìn)行，既避免了由于反應(yīng)促進(jìn)劑引起的酶的失活，又可通過添加高濃度反應(yīng)促進(jìn)劑促進(jìn)疏水性底物的分解，該方法是個(gè)值得極力推薦的方法。
(實(shí)施例20-紙的質(zhì)量實(shí)驗(yàn))將實(shí)施例17中“MnP+，acac+”的第9工序后的紙漿和用乙酰丙酮代替丙二酸進(jìn)行同樣處理的第9工序后的紙漿分別用水調(diào)整到紙漿濃度約為0.3％，按照J(rèn)IS P 8222標(biāo)準(zhǔn)，用每邊為250mm的方形片紙機(jī)做成手制紙，標(biāo)準(zhǔn)為干透張重60g/m2。按照J(rèn)IS P 8111標(biāo)準(zhǔn)將手制紙于23℃、50％r.h的條件下進(jìn)行預(yù)處理后，根據(jù)JIS P 8112標(biāo)準(zhǔn)測定破裂強(qiáng)度。
測定結(jié)果表明比破裂強(qiáng)度為6.8kPa·m2/g，而添加了丙二酸的漂白紙漿的比破裂強(qiáng)度降低到6.5kPa·m2/g。而添加乙酰丙酮的漂白紙漿的比破裂強(qiáng)度為6.8kPa·m2/g，與漂白前一樣。以上結(jié)果表明通過使用作為反應(yīng)促進(jìn)劑的乙酰丙酮，只分解作為疏水性底物的木質(zhì)素進(jìn)行漂白，因不分解作為親水性底物的纖維素又可以避免紙的質(zhì)量下降。[第9發(fā)明～第11發(fā)明涉及到的實(shí)施例](實(shí)施例21-SC21菌株的培養(yǎng)和粗酶液的制備)使用T.K.Kirk等人(Arch.Microbiol.117，277-285(1978))和M.H.Gold等人(Arch.Biochem.Biophys.234，353-363(1984))的培養(yǎng)基培養(yǎng)從ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)獲得的白色腐朽菌(Phanerchaete crysosporium)SC21菌株(ATCC-64314)。
將孢子接種于斜面培養(yǎng)基上，于37℃下培養(yǎng)約2周，使孢子充分形成。將形成的孢子懸浮于5mL的蒸餾水，制備孢子懸浮液，將1mL的孢子懸浮液接種于100mL的前培養(yǎng)基，于37℃下靜置培養(yǎng)3天。
對前培養(yǎng)液進(jìn)行30秒均化，使菌絲充分分散后，將100mL前培養(yǎng)液接種于1L正式培養(yǎng)液。然后于37℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3天(50mm、150rpm)后，添加3，4-二甲氧基芐醇，再對燒瓶內(nèi)用氧進(jìn)行置換、加壓(0.25kgf/cm2)，繼續(xù)培養(yǎng)。以后每日一次象上述那樣繼續(xù)用氧置換、加壓直至培養(yǎng)結(jié)束。
在培養(yǎng)液的顏色呈紅褐色、上清中的酶活性非常高時(shí)終止培養(yǎng)。然后通過玻璃過濾器除去菌體獲得培養(yǎng)濾液。向該培養(yǎng)濾液加PEG4000(5％)，用氫氧化鈉將pH調(diào)至7.2，于冰中緩慢攪拌。生成的沉淀用玻璃過濾器除去，獲得粗酶液。
(實(shí)施例22-MnP的純化)使實(shí)施例21獲得的粗酶液1L吸附于陰離子交換樹脂DEAESepharose Fast Flow柱(Pharmacia公司生產(chǎn)，50mm×100mm)，用洗凈緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.2)洗，然后依次用洗脫緩沖液-1(20mM磷酸鈉，pH6.0)、洗脫緩沖液-2(20mM琥珀酸鈉，pH5.5)和洗脫緩沖液-3(50mM琥珀酸鈉，pH4.5)三種緩沖液進(jìn)行洗脫，將MnP洗脫下來。通過測定血紅素蛋白特有的405nm的吸光度檢測MnP。405nm處的吸峰與MnP活性一致性良好，由圖19可見MnP被洗脫緩沖液3洗脫。在圖19中，上述洗凈緩沖液用①表示，洗脫緩沖液-1用②表示，洗脫緩沖液-2用③表示，洗脫緩沖液-3用④表示。將洗脫出來的MnP活性級分用10mM琥珀酸鈉(pH3.5)緩沖液透析后，吸附于陽離子交換柱MonoS 5/5HR上。
通過氯化鈉的0～0.4M線性濃度梯度將吸附的MnP從柱子上洗脫下來，就象圖20給出的那樣，分離出5個(gè)具有405nm吸收的峰。這些峰級分都有MnP活性，它們是性質(zhì)不同的5種同功酶。將各個(gè)活性峰包含的同功酶從保留時(shí)間最短的開始依次命名為S1、S2、S3、S4和S5。
(實(shí)施例23-同功酶分子量和等電點(diǎn)的解析)通過SDS-PAGE解析各個(gè)活性峰包含的MnP的分子量。發(fā)現(xiàn)來自各個(gè)活性峰的MnP為分子量約46000的單一一條帶，是分子量幾乎相同的一組同功酶。另外，通過使用IEF PAGE mini(テフコ生產(chǎn))等電點(diǎn)電泳解析各個(gè)活性峰包含的MnP的等電點(diǎn)，可知上述5種同功酶的等電點(diǎn)pI分別為S1為4.3、S2為4.5、S3為4.7、S4為4.8、S5為4.9，它們是等電點(diǎn)都不同的一組同功酶。
(實(shí)施例24-酶的穩(wěn)定性)將上述各個(gè)同功酶于50mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)中在50℃下進(jìn)行一定時(shí)間的熱處理，然后通過測定隨時(shí)間變化的殘存活性，評價(jià)酶的耐熱性。結(jié)果如圖21所示。就象圖21所表明的那樣，S4和S5的耐熱性比較差，S1和S2表現(xiàn)出很好的耐熱性。S3的耐熱性處于中間。
另外、測定在0mM、0.03mM、0.3mM和3mM濃度的過氧化氫存在下于37℃下對各個(gè)同功酶處理1小時(shí)后的殘存活性。結(jié)果如圖22所示。就象圖22所表明的那樣，S4和S5在有0.03mM過氧化氫存在下幾乎完全失活了，而在同樣濃度的過氧化氫情況下，S1和S2的殘存活性在70％以上，S3的殘存活性在50％以上，而且即使在有3mM的高濃度的過氧化氫存在下，仍有一定的殘存活性。
這些結(jié)果表明在各個(gè)同功酶中有時(shí)即使其功能相同，但對環(huán)境耐性差異異很大，在產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用上對環(huán)境耐性好的酶或同功酶是很重要的。
(實(shí)施例25-FSM-MnP的制備)含有S1～S5各個(gè)同功酶的活性級分對10mM琥珀酸緩沖液充分透析，相對于含有約70埃細(xì)孔徑的上述FSM以50U/mg的比例添加透析后的酶液，通過4℃下攪拌過夜，制備MnP固定于FSM的FSM-MnP。
(實(shí)施例26-FSM-MnP的耐熱性)將象上述那樣固定S1～S5各個(gè)同功酶后構(gòu)成的FSM-MnP分別在50mM琥珀酸緩沖液(pH4.5)中于60℃下進(jìn)行一定時(shí)間熱處理，通過測定隨時(shí)間變化的殘存活性來評價(jià)酶的耐熱性。結(jié)果如圖23所示。通過對比圖23和圖21可知，F(xiàn)SM-MnP的耐熱性反映了固定化同功酶的耐熱程度。
(實(shí)施例27-用FSM-MnP漂白紙漿)將象上述那樣固定了S1～S5各個(gè)同功酶后構(gòu)成的FSM-MnP各20mg分別裝柱，通過使漂白緩沖液[30mM丙二酸緩沖液(pH4.5)、10mM硫酸錳、0.05％Tween80、0.1mM過氧化氫]連續(xù)地從柱子中流過，對錳進(jìn)行活化。將含有活化了的錳的酶反應(yīng)液輸送到含有1％濃度紙漿的反應(yīng)槽，進(jìn)行紙漿漂白。
在通過測定270nm的吸光度檢測酶活性隨時(shí)間變化的同時(shí)，從反應(yīng)槽中取出經(jīng)過一定時(shí)間的紙漿樣品制作紙漿紙，通過測定其白度(％)(依據(jù)JIS P 8123)，評價(jià)FSM-MnP的漂白紙漿活性。圖24給出了酶活性隨時(shí)間變化的測定結(jié)果，圖25給出了漂白紙漿活性的評價(jià)結(jié)果。
從圖24可知固定了S1或S2的FSM-MnP經(jīng)8小時(shí)實(shí)驗(yàn)后的活性約為90％，而經(jīng)過同樣時(shí)間實(shí)驗(yàn)的固定了S3的FSM-MnP的活性約50％，而在固定了S4或S5的FSM-MnP中，反應(yīng)開始后活性急劇下降，反應(yīng)1小時(shí)后的殘存活性在30％，而反應(yīng)2小時(shí)后酶幾乎完全失活了。
從圖25可知使用固定了S1或S2的FSM-MnP時(shí)，紙漿白度隨反應(yīng)時(shí)間延長而提高，雖然在反應(yīng)后期其上升程度變慢，但經(jīng)過8小時(shí)后白度分別提高了8點(diǎn)或10點(diǎn)。使用固定了S3的FSM-MnP時(shí)經(jīng)過8小時(shí)后白度上升了5點(diǎn)。使用固定了S4或S5的FSM-MnP時(shí)，經(jīng)過8小時(shí)后白度上升停止在2點(diǎn)左右。
這些結(jié)果表明為了使通過MnP漂白技術(shù)實(shí)用化，必須使用穩(wěn)定性高的MnP。
產(chǎn)業(yè)上的利用范圍如上所述，本發(fā)明可以被有效地用于有介質(zhì)參與的各種產(chǎn)業(yè)上有用的酶反應(yīng)、以及利用酶以外的介質(zhì)活化手段的反應(yīng)、尤其是用于紙漿的木質(zhì)素分解和各種難分解物質(zhì)的分解中。
按照條約第19條的修改1.一種反應(yīng)方法，是向有底物存在的反應(yīng)體系中投入在活性狀態(tài)下作用于上述底物完成既定反應(yīng)的介質(zhì)的反應(yīng)方法，該介質(zhì)是以處于上述活性狀態(tài)的活性介質(zhì)投入的。
2.權(quán)利要求1記載的反應(yīng)方法，特征是在上述反應(yīng)方法，將通過作為介質(zhì)活化手段的酶使介質(zhì)活化的活化步驟設(shè)置在前面，然后將通過該活化步驟得到的活性介質(zhì)投入到反應(yīng)體系中。
3.權(quán)利要求2記載的反應(yīng)方法，特征是當(dāng)上述活性介質(zhì)是穩(wěn)定物質(zhì)時(shí)，使酶和介質(zhì)在溫和條件下接觸來進(jìn)行活化步驟，在可獲得高反應(yīng)效率的嚴(yán)格條件下進(jìn)行活性介質(zhì)和底物的反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1記載的反應(yīng)方法，特征是將上述介質(zhì)以比處于活性狀態(tài)的活性介質(zhì)的活性和/或穩(wěn)定性更高的高活化狀態(tài)的高活性介質(zhì)投入到反應(yīng)體系中。
5.權(quán)利要求4記載的反應(yīng)方法，其中上述高活性介質(zhì)是處于比活性介質(zhì)更高活性的激發(fā)狀態(tài)，或者是至少含有配位化合物的高級次化合物。
6.權(quán)利要求1、4或5記載的反應(yīng)方法，其中上述活性介質(zhì)或高活性介質(zhì)是通過對介質(zhì)實(shí)施酶作用、催化作用、光照射、電磁波照射、加電壓或等離子體化而制備的。
7.權(quán)利要求2、3或6記載的反應(yīng)方法，其中上述酶是氧化酶，底物是為使紙漿漂白應(yīng)當(dāng)分解的木質(zhì)素。
8.為實(shí)施權(quán)利要求2或3記載的反應(yīng)方法的反應(yīng)裝置，具有活化反應(yīng)場所和底物反應(yīng)場所，活化反應(yīng)場所具備可與活性介質(zhì)相分離的介質(zhì)活化手段、完成上述活化步驟，底物反應(yīng)場所通過活性介質(zhì)輸送手段與上述活化反應(yīng)場所連接、可完成上述活性介質(zhì)和底物的反應(yīng)。
9.權(quán)利要求2、3或7記載的反應(yīng)方法，所述酶是在尺寸與酶大小大致相符、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)單元中固定了上述氧化酶過氧化物酶的固定化酶，在酶的固定化容許的濃度范圍內(nèi)的氧化劑存在下分解上述底物的底物。
10.權(quán)利要求9記載的反應(yīng)方法，其中上述的結(jié)構(gòu)單元是中孔(性)硅多孔體中的細(xì)孔。
11.權(quán)利要求1、2、3或7記載的反應(yīng)方法，所述存在底物的反應(yīng)體系中具有反應(yīng)促進(jìn)劑，該反應(yīng)促進(jìn)劑具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮結(jié)構(gòu)、而且可溶于水。
12.權(quán)利要求11記載的反應(yīng)方法，其中上述反應(yīng)促進(jìn)劑是乙酰丙酮。
13.權(quán)利要求1、2、3或7記載的反應(yīng)方法，是在混有親水性底物和相對于親水性底物來說相對疏水性底物的水溶液中，使氧化酶、反應(yīng)介質(zhì)與具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮結(jié)構(gòu)、而且可溶于水的反應(yīng)促進(jìn)劑共存，通過自由基化了的反應(yīng)促進(jìn)劑優(yōu)先分解疏水性底物。
14.權(quán)利要求13記載的反應(yīng)方法，其中上述反應(yīng)促進(jìn)劑是乙酰丙酮。
15.權(quán)利要求1、2、3或7記載的反應(yīng)方法，其中包括通過氧化酶活化反應(yīng)介質(zhì)的工序，以及將被活化的反應(yīng)介質(zhì)添加到混有親水性底物和相對于親水性底物來說相對疏水性底物的水溶液中，通過被自由基化的反應(yīng)介質(zhì)使疏水性底物優(yōu)先分解的工序。
16.權(quán)利要求15記載的反應(yīng)方法，其中上述反應(yīng)促進(jìn)劑是乙酰丙酮。
17.權(quán)利要求13、14、15或16記載的反應(yīng)方法，其中上述水溶液是紙漿、親水性底物是纖維素、相對疏水的底物是木質(zhì)素。
18.權(quán)利要求17記載的反應(yīng)方法，其特征是中間設(shè)置紙漿的堿萃取處理工序，并多級反復(fù)操作。
19.權(quán)利要求17或18記載的促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其中上述氧化酶至少是從錳過氧化物酶、辣根過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶中選出的過氧化物酶，反應(yīng)介質(zhì)是錳離子。
20.權(quán)利要求1、2、3或7記載的反應(yīng)方法，是使氧化酶和被活化的反應(yīng)介質(zhì)與具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮結(jié)構(gòu)、而且可溶于水的反應(yīng)促進(jìn)劑共存于含有難分解物質(zhì)的水溶液中，通過自由基化的上述反應(yīng)促進(jìn)劑使上述難分解物質(zhì)分解。
21.權(quán)利要求20記載的反應(yīng)方法，其中上述反應(yīng)促進(jìn)劑是乙酰丙酮。
22.權(quán)利要求20或21記載的難分解物質(zhì)的分解方法，上述難分解物質(zhì)是二噁英、多氯聯(lián)苯(PCB)，或擾亂內(nèi)分泌物質(zhì)。
23.權(quán)利要求2、3或7記載的反應(yīng)方法，其中所述酶是從白色腐朽菌Phanerochaete crysosporium經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生的變異株SC26菌株，ATCC-64314的培養(yǎng)液獲得的、或從該培養(yǎng)液獲得的表現(xiàn)出以下的(1)耐熱性以及(2)耐過氧化氫特性的錳過氧化物液(1)于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的錳過氧化物酶的殘余活性在50％以上；(2)在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的錳過氧化物酶的殘余活性在15％以上。
24.權(quán)利要求2、3或7記載的反應(yīng)方法，所述酶是符合以下(3)～(5)條件的錳過氧化物酶(3)白色腐朽菌經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生的變異株SC26菌株產(chǎn)生的錳過氧化物酶；(4)等電點(diǎn)處于4.3～4.7范圍內(nèi)；(5)于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在50％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在15％以上。
25.權(quán)利要求24記載的反應(yīng)方法，其中上述的錳過氧化物酶的等電點(diǎn)是4.3，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在90％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在30％以上。
26.權(quán)利要求24記載的反應(yīng)方法，其中上述的錳過氧化物酶的等電點(diǎn)是4.5，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在90％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在45％以上。
27.權(quán)利要求24記載的反應(yīng)方法，其中上述的錳過氧化物酶的等電點(diǎn)是4.7，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在50％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在15％以上。
28.一種底物的酶分解方法，即在使用氧化劑通過氧化酶過氧化物酶分解酶底物的方法中，使用在尺寸與酶大小大致相符、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)單元中固定了上述氧化酶的固定化酶，在酶的固定化容許的濃度范圍內(nèi)的氧化劑存在下分解上述底物的底物。
29.權(quán)利要求28記載的底物的酶分解方法，其中上述底物是難分解物質(zhì)。
30.權(quán)利要求29記載的反應(yīng)方法，其中上述難分解物質(zhì)是木質(zhì)素。
31.權(quán)利要求28、29或30記載的反應(yīng)方法，其中上述的結(jié)構(gòu)單元是中孔(性)硅多孔體中的細(xì)孔。
32.一種用于通過氧化酶分解底物的反應(yīng)體系中的反應(yīng)促進(jìn)劑，具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮結(jié)構(gòu)、而且可溶于水。
33.權(quán)利要求32記載的反應(yīng)促進(jìn)劑，其中上述反應(yīng)促進(jìn)劑是乙酰丙酮。
34.一種促進(jìn)疏水性底物優(yōu)先分解的方法，是在混有親水性底物和相對于親水性底物來說相對疏水性底物的水溶液中，使氧化酶和被活化的反應(yīng)介質(zhì)與權(quán)利要求32或33記載的反應(yīng)促進(jìn)劑共存，通過自由基化了的反應(yīng)促進(jìn)劑優(yōu)先分解疏水性底物。
35.一種促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其中包括通過氧化酶活化反應(yīng)介質(zhì)的工序，以及將被活化的反應(yīng)介質(zhì)與權(quán)利要求32或33記載的反應(yīng)促進(jìn)劑添加到混有親水性底物和相對于親水性底物來說相對疏水性底物的水溶液中，通過被自由基化的反應(yīng)介質(zhì)使疏水性底物優(yōu)先分解的工序。
36.權(quán)利要求34或35記載的促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其中上述水溶液是紙漿、親水性底物是纖維素、相對疏水的底物是木質(zhì)素。
37.權(quán)利要求36記載的促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其特征是中間設(shè)置紙漿的堿萃取處理工序，并多級反復(fù)操作。
38.權(quán)利要求35、36或37記載的促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其中上述氧化酶至少是從錳過氧化物酶、辣根過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶中選出的過氧化物酶，反應(yīng)介質(zhì)是錳離子。
39.一種難分解物質(zhì)的分解方法，是使氧化酶和被活化的反應(yīng)介質(zhì)與權(quán)利要求32或33記載的反應(yīng)促進(jìn)劑共存于含有難分解物質(zhì)的水溶液中，通過自由基化的上述反應(yīng)促進(jìn)劑使上述難分解物質(zhì)分解。
40.權(quán)利要求39記載的難分解物質(zhì)的分解方法，上述難分解物質(zhì)是二噁英、多氯聯(lián)苯(PCB)，或擾亂內(nèi)分泌物質(zhì)。
41.一種錳過氧化物酶液，是從白色腐朽菌Phanerochaetecrysosporium經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生的變異株SC26菌株(以ATCC-64314保藏)的培養(yǎng)液獲得的、或從該培養(yǎng)液獲得的表現(xiàn)出以下的(1)耐熱性以及(2)耐過氧化氫特性的錳過氧化物液(1)于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的錳過氧化物酶的殘余活性在50％以上；(2)在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的錳過氧化物酶的殘余活性在15％以上。
42.一種符合以下(3)～(5)條件的錳過氧化物酶(3)白色腐朽菌經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生的變異株SC26菌株產(chǎn)生的錳過氧化物酶；(4)等電點(diǎn)處于4.3～4.7范圍內(nèi)；(5)于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在50％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在15％以上。
43.權(quán)利要求42記載的錳過氧化物酶，其中上述的錳過氧化物酶的等電點(diǎn)是4.3，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在90％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在30％以上。
44.權(quán)利要求42記載的錳過氧化物酶，其中上述的錳過氧化物酶的等電點(diǎn)是4.5，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在90％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在45％以上。
45.權(quán)利要求42記載的錳過氧化物酶，其中上述的錳過氧化物酶的等電點(diǎn)是4.7，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在50％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在15％以上。
權(quán)利要求
1.一種反應(yīng)方法，是向有底物存在的反應(yīng)體系中投入在活性狀態(tài)下作用于上述底物完成既定反應(yīng)的介質(zhì)的反應(yīng)方法，該介質(zhì)是以處于上述活性狀態(tài)的活性介質(zhì)投入的。
2.權(quán)利要求1記載的反應(yīng)方法，特征是在上述反應(yīng)方法，將通過作為介質(zhì)活化手段的酶使介質(zhì)活化的活化步驟設(shè)置在前面，然后將通過該活化步驟得到的活性介質(zhì)投入到反應(yīng)體系中。
3.權(quán)利要求2記載的反應(yīng)方法，特征是當(dāng)上述活性介質(zhì)是穩(wěn)定物質(zhì)時(shí)，使酶和介質(zhì)在溫和條件下接觸來進(jìn)行活化步驟，在可獲得高反應(yīng)效率的嚴(yán)格條件下進(jìn)行活性介質(zhì)和底物的反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1記載的反應(yīng)方法，特征是將上述介質(zhì)以比處于活性狀態(tài)的活性介質(zhì)的活性和/或穩(wěn)定性更高的高活化狀態(tài)的高活性介質(zhì)投入到反應(yīng)體系中。
5.權(quán)利要求4記載的反應(yīng)方法，其中上述高活性個(gè)質(zhì)是處于比活性介質(zhì)更高活性的激發(fā)狀態(tài)，或者是至少含有配位化合物的高級次化合物。
6.權(quán)利要求1、4或5記載的反應(yīng)方法，其中上述活性介質(zhì)或高活性介質(zhì)是通過對介質(zhì)實(shí)施酶作用、催化作用、光照射、電磁波照射、加電壓或等離子體化而制備的。
7.權(quán)利要求2、3或6記載的反應(yīng)方法，其中上述酶是氧化酶，底物是為使紙漿漂白應(yīng)當(dāng)分解的木質(zhì)素。
8.為實(shí)施權(quán)利要求2或3記載的反應(yīng)方法的反應(yīng)裝置，具有活化反應(yīng)場所和底物反應(yīng)場所，活化反應(yīng)場所具備可與活性介質(zhì)相分離的介質(zhì)活化手段、完成上述活化步驟，底物反應(yīng)場所通過活性介質(zhì)輸送手段與上述活化反應(yīng)場所連接、可完成上述活性介質(zhì)和底物的反應(yīng)。
9.一種底物的酶分解方法，即在使用氧化劑通過氧化酶過氧化物酶分解酶底物的方法中，使用在尺寸與酶大小大致相符、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)單元中固定了上述氧化酶的固定化酶，在酶的固定化容許的濃度范圍內(nèi)的氧化劑存在下分解上述底物的底物。
10.權(quán)利要求9記載的底物的酶分解方法，其中上述底物是難分解物質(zhì)。
11.權(quán)利要求10記載的反應(yīng)方法，其中上述難分解物質(zhì)是木質(zhì)素。
12.權(quán)利要求9、10或11記載的反應(yīng)方法，其中上述的結(jié)構(gòu)單元是中孔(性)硅多孔體中的細(xì)孔。
13.一種用于通過氧化酶分解底物的反應(yīng)體系中的反應(yīng)促進(jìn)劑，具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮結(jié)構(gòu)、而且可溶于水。
14.權(quán)利要求13記載的反應(yīng)促進(jìn)劑，其中上述反應(yīng)促進(jìn)劑是乙酰丙酮。
15.一種促進(jìn)疏水性底物優(yōu)先分解的方法，是在混有親水性底物和相對于親水性底物來說相對疏水性底物的水溶液中，使氧化酶和被活化的反應(yīng)介質(zhì)與權(quán)利要求13或14記載的反應(yīng)促進(jìn)劑共存，通過自由基化了的反應(yīng)促進(jìn)劑優(yōu)先分解疏水性底物。
16.一種促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其中包括通過氧化酶活化反應(yīng)介質(zhì)的工序，以及將被活化的反應(yīng)介質(zhì)與權(quán)利要求13或14記載的反應(yīng)促進(jìn)劑添加到混有親水性底物和相對于親水性底物來說相對疏水性底物的水溶液中，通過被自由基化的反應(yīng)介質(zhì)使疏水性底物優(yōu)先分解的工序。
17.權(quán)利要求15或16記載的促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其中上述水溶液是紙漿、親水性底物是纖維素、相對疏水的底物是木質(zhì)素。
18.權(quán)利要求17記載的促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其特征是中間設(shè)置紙漿的堿萃取處理工序，并多級反復(fù)操作。
19.權(quán)利要求17、18或19記載的促進(jìn)疏水性底物分解的方法，其中上述氧化酶至少是從錳過氧化物酶、辣根過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶中選出的過氧化物酶，反應(yīng)介質(zhì)是錳離子。
20.一種難分解物質(zhì)的分解方法，是使氧化酶和被活化的反應(yīng)介質(zhì)與權(quán)利要求13或14記載的反應(yīng)促進(jìn)劑共存于含有難分解物質(zhì)的水溶液中，通過自由基化的上述反應(yīng)促進(jìn)劑使上述難分解物質(zhì)分解。
21.權(quán)利要求20記載的難分解物質(zhì)的分解方法，上述難分解物質(zhì)是二噁英、多氯聯(lián)苯(PCB)，或擾亂內(nèi)分泌物質(zhì)。
22.一種錳過氧化物酶液，是從白色腐朽菌Phanerochaetecrysosporium經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生的變異株SC26菌株(以ATCC-64314保藏)的培養(yǎng)液獲得的、或從該培養(yǎng)液獲得的表現(xiàn)出以下的(1)耐熱性以及(2)耐過氧化氫特性的錳過氧化物液(1)于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的錳過氧化物酶的殘余活性在50％以上；(2)在有0.3mM的過氧化氫存在下于37℃1小時(shí)后的錳過氧化物酶的殘余活性在15％以上。
23.一種符合以下(3)～(5)條件的錳過氧化物酶(3)白色腐朽菌經(jīng)紫外線照射產(chǎn)生的變異株SC26菌株產(chǎn)生的錳過氧化物酶；(4)等電點(diǎn)處于4.3～4.7范圍內(nèi)；(5)于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在50％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在15％以上。
24.權(quán)利要求23記載的錳過氧化物酶，其中上述的錳過氧化物酶的等電點(diǎn)是4.3，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在90％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在30％以上。
25.權(quán)利要求23記載的錳過氧化物酶，其中上述的錳過氧化物酶的等電點(diǎn)是4.5，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在90％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在45％以上。
26.權(quán)利要求23記載的錳過氧化物酶，其中上述的錳過氧化物酶的等電點(diǎn)是4.7，于50℃下進(jìn)行45分鐘熱處理后的殘存活性在50％以上，在有0.3mM過氧化氫存在下于37℃下1小時(shí)后的殘存活性在15％以上。
全文摘要
一種向含有底物的反應(yīng)體系中投入處于活性狀態(tài)的介質(zhì)的反應(yīng)方法。最好是將該介質(zhì)活化作為前工序通過酶在溫和條件下進(jìn)行。另外最好是向上述反應(yīng)體系投入活性和/或穩(wěn)定性進(jìn)一步提高的高活性介質(zhì)。一種將氧化酶過氧化物酶固定于在尺寸與酶大小幾乎一致、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)單元中,在酶的固定化容許的濃度范圍內(nèi)的氧化劑存在下分解上述底物的底物的酶分解方法。一種用于通過氧化酶分解底物的反應(yīng)體系中,可與具有在氧化酶作用下自由基化的二酮結(jié)構(gòu)一起溶于水的反應(yīng)促進(jìn)劑。通過培養(yǎng)白色腐朽菌的變異株SC26菌株獲得的錳過氧化物酶液和錳過氧化物酶。
文檔編號D21C5/00GK1384889SQ00815117
公開日2002年12月11日 申請日期2000年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月28日
發(fā)明者梶野勉, 高橋治雄, 杉山英彥, 淺見修, 笹木俊哉, 李波 申請人:株式會社豐田中央研究所