專利名稱：生物膜的酶促防止和控制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于從表面除去生物膜的酶組合物和方法。具體地，用于除去生物膜 的方法包括向表面上的生物膜聯(lián)合施用過水解酶(perhydrolase)和其它酶。
背景技術(shù)：
生物膜由埋在粘性胞外聚合物(exopolymer)基質(zhì)中的附著性微生物群落組成， 盡管嘗試通過設(shè)計以殺死自由漂浮微生物的傳統(tǒng)方法控制該基質(zhì)，但其常常是頑固的。生 物膜對抗生素、防腐劑和氧化性殺生物劑的抗性已經(jīng)在文獻中充分報告。用于防止和/或減少生物膜的酶學方法已有描述，見例如PCT申請?zhí)?W006/031554, WO 01/98214、WO 98/26807、WO 04/041988、WO 99/14312、和 WO 01/53010。 然而，需要可以在工業(yè)、牙齒和健康護理應用中控制生物膜的改良方法和組合物。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供用于除去生物膜的方法、組合物和試劑盒。一方面，本發(fā)明提供從表 面除去生物膜的方法，所述方法包括以足以使所述生物膜減少至少25%的施用時間，向 所述生物膜施用過水解酶和清除酶混合物，其中所述酶混合物選自蛋白酶、葡聚糖酶和酯 酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種 蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；兩種蛋 白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白 酶、纖維素酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚 糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三種蛋白酶、纖 維素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纖維素酶、 葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少兩種淀粉酶和葡聚糖酶；至少三種淀粉酶；和至少兩種淀 粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。在一些實施方案中，生物膜包含銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、或金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)。在一些實施方案中，過水解酶包含SEQ ID NO :1中所示氨基酸 序列或其變體或同源物。在一個實施方案中，過水解酶是SEQ ID N0:1的S54V變體。在一個實施方案中，清除酶混合物由三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖 酶組成。在一個實施方案中，清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC 265、和 LYS0MAX 組成。在一個實施方案中，過水解酶和清除酶混合物同時施用于生物膜。在另一實施方 案中，過水解酶混合物和清除酶混合物相繼地施用于生物膜。在一個實施方案中，過水解酶在清除酶混合物施用前施用.在一個實施方案中，過水解酶和清除酶混合物協(xié)同作用從表 面除去生物膜。另一方面，本發(fā)明提供用于從表面除去生物膜的組合物，所述組合物包含過水解 酶和清除酶混合物，其中所述清除酶混合物選自蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚 糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖 酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；兩種蛋白酶、纖維素酶、 葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、磷 脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和 甘露聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、 和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂 酶、和酯酶；至少兩種淀粉酶和葡聚糖酶；至少三種淀粉酶；和至少兩種淀粉酶、葡聚糖酶、 和蛋白酶。在一個實施方案中，清除酶混合物由三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖 酶組成。在一個實施方案中，清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC 265、和 LYS0MAX 組成。在一些實施方案中，過水解酶包含SEQ ID NO 1中所示氨基酸序列或其變體或同 源物。在一個實施方案中，過水解酶是SEQ ID N0:1的S54V變體。另一方面，本發(fā)明提供用于從表面除去生物膜的試劑盒，所述試劑盒包含過水解 酶和清除酶混合物、以及任選地在本文所述的生物膜去除方法中使用的說明書，其中所述 酶混合物選自蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白 酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種 蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；兩種蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖 酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡 聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、纖維 素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡 聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少兩種淀粉酶和 葡聚糖酶；至少三種淀粉酶；和至少兩種淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。在一個實施方案中， 過水解酶和清除酶混合物在不同容器中。在一個實施方案中，過水解酶和清除酶混合物在 相同容器中。在一個實施方案中，清除酶混合物由三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖 酶組成。在一個實施方案中，清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC 265、和 LYSOMAX 組成。在一些實施方案中，過水解酶包含SEQ ID NO 1中所示氨基酸序列或其變體或同 源物。在一個實施方案中，過水解酶是SEQ ID N0:1的S54V變體。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于控制，即，清除或減少，表面上的生物膜或防止生物膜在表面上形 成或生長的方法、組合物和試劑盒。本發(fā)明的含酶組合物和方法適用于在例如工業(yè)水管理 如冷卻塔、飲用水、廢水、牙齒衛(wèi)生、醫(yī)學植入物和裝置、血液透析系統(tǒng)、石油回收、生物除污井、紙和紙漿加工、船體、食物加工設(shè)備、以及水遞送系統(tǒng)如導管、管道等中控制生物膜。除非本文中另有定義，否則本文中所用的所有科學和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員通常理解的含義。Singleton 等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular BioloRY,第 2 版，John Wiley and Sons, NewYork(1994),禾口 Hale&Markham, The Harper Collins Dictionary οfBiology,Harper Perennial，NY(1991)可以向本領(lǐng)域技術(shù)人員提 供本發(fā)明中所用許多術(shù)語的一般字典。與本文所述方法和材料相類似或等價的任何方法和 材料均可以用于實施或檢驗本發(fā)明。本文提供的數(shù)值范圍涵蓋定義該范圍的數(shù)。除非另行說明，否則核酸按5’至3’方向從左向右書寫；氨基酸序列按氨基至羧基 方向從左向右書寫。
定義“生物膜”是指埋在附著于表面的細胞外聚合物基質(zhì)中的微生物群落。生物膜還包 括水，并可以包括其它陷入的顆粒。生物膜可以包括一種或多種微生物，包括革蘭氏陽性或 革蘭氏陰性細菌(需氧的或厭氧的)、藻類、原生動物、和/或酵母或絲狀真菌。在一些實施 方案中，生物膜包括細菌屬葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)Jg 單胞菌屬(Pseudomonas)、李斯特氏菌屬(Listeria)、鏈球菌屬(Sti^ptococcus)和埃希氏 桿菌屬(Escherichia)的活細胞。“表面”是指具有允許生物膜附著的足夠大小的任何結(jié)構(gòu)。硬表面包括，但不限 于，金屬、玻璃、陶瓷、木材、礦物(例如，巖石、石頭、大理石、花崗巖)、聚集物如混制的 (concrete)、塑料的、復合的材料、硬橡膠材料和石膏。硬材料可以用琺瑯和/或油漆涂飾 (finish)。硬表面可以見于例如水處理和貯存設(shè)備及罐、乳品和食品加工儀器及設(shè)備、醫(yī)療 儀器和設(shè)備，例如手術(shù)裝置、持久和暫時性植入物、和工業(yè)制藥機器和設(shè)備中。軟表面包括， 但不限于，毛發(fā)和織物。多孔表面可以是生物學表面，包括但不限于，皮膚、角質(zhì)(keratin) 和內(nèi)部器官。多孔表面還可以見于過濾用膜以及某些陶瓷中。其它表面包括但不限于船體 和泳池?！懊竸┝俊笔侵赣糜谔幚砩锬さ?、酶混合物的量、酶混合物中單個酶的量、或單獨 使用的單個酶的量。影響酶劑量的因素包括但不限于酶的類型、待處理的表面、和預期結(jié) 果。在一些實施方案中，酶劑量是使生物膜減少至少約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95、98、或99 %所需的、酶混合物的量。一般地，酶混合物中酶含量總共為 大約或以下、2%或以下、3%或以下、或5%或以下(w/w)。 “處理”或“控制”或“除去”生物膜是指，從表面減少或清除生物膜，包括殺死和/ 或抑制生物膜中的微生物的生長、和/或預防性防止生物膜在表面上形成或生長?！懊富旌衔铩笔侵钢辽賰煞N酶。本發(fā)明酶混合物中所用的酶可以來源于植物或動物 來源、細菌、真菌、或酵母，并且可以是野生型或變體酶?！八嵝詶l件”、“中性條件”和“堿性條件”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。典型地，“酸性 條件”是指PH為大約4至大約6?！爸行詶l件”是指pH為大約6至大約8。“堿性條件”是 指PH為大約8至大約10.“過水解酶”是指能夠催化過水解反應的酶，該反應導致產(chǎn)生適用于諸如物體的清
6潔、漂白、消毒或滅菌等應用(例如，本文所述生物膜的處理)的、足夠高量的過酸。一般地， 本發(fā)明方法中使用的過水解酶表現(xiàn)出高的過水解對水解比率。在一些實施方案中，過水解 酶包含SEQ ID NO :1所示的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)過水解酶氨基酸序 列、或其變體或同源物，或由所述序列或其變體或同源物組成，或基本上由所述序列或其變 體或同源物組成。在一些實施方案中，過水解酶包含?；D(zhuǎn)移酶活性，催化水性酰基轉(zhuǎn)移反 應。“過酸”是具有式RC ( = 0) OOH的有機酸。“過水解”是指產(chǎn)生過酸的酶促反應。在一些實施方案中，過酸通過在過氧化氫 (H2O2)存在下式R1C^ = 0)0R2的酯底物的過水解產(chǎn)生，其中R1和R2是相同或不同的有機部 分。短語“過氧化氫源”包括過氧化氫以及能夠自發(fā)地或酶促地產(chǎn)生過氧化氫作為反 應產(chǎn)物的系統(tǒng)的組分。短語“過水解對水解比率”是指在規(guī)定的條件下以及在規(guī)定的一段時間內(nèi)通過過 水解酶自酯底物酶促產(chǎn)生的過酸的量與酶促產(chǎn)生的酸的量的比。本文中，術(shù)語“?；笔侵赣袡C酸基團，其是羧酸除去羥基(-0H)基團后的殘基(例 如，乙酰氯CH3CO-Cl是從乙酸CH3CO-OH形成的?；?。各?；鶊F的名稱一般通過將相 應酸的“酸”改為“?；倍纬伞１疚闹?，術(shù)語“酰化”是指將?；?RC0-)基團替代入分子中(一般替代-OH基團 的活性氫)的化學轉(zhuǎn)化。本文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)移酶”是指催化官能團從一個底物轉(zhuǎn)移至另一個底物的酶。本文中，“蛋白質(zhì)”是指由氨基酸組成的、被本領(lǐng)域技術(shù)人員公認為蛋白質(zhì)的任何 組合物。術(shù)語“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)，，在本文中可互換，用于指任何長度的氨基 酸聚合物。該聚合物可以是線性的或分支的，其可以包含修飾的氨基酸，并且可以被非氨基 酸中斷。這些術(shù)語還涵蓋已經(jīng)天然地或通過干預被修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵形 成、糖基化、脂化(Iipidation)、乙?；⒘姿峄?、或任何其它操作或修飾，例如綴合標記性 成分。該定義還包括例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及 本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽。本文中，“多聚體”是指共價地或非共價地結(jié)合的、在溶液中以復合物形式存在的 兩個或多個蛋白質(zhì)或肽。“二聚體”是含有兩個蛋白質(zhì)或肽的多聚體；“三聚體”包含三個蛋 白質(zhì)或肽，等等。本文中，“八聚體”是指具有8個蛋白質(zhì)或肽的多聚體。多聚體的蛋白質(zhì)或 肽可以相同或不同。本文中，“酶的有效量”是指達到在特定應用(例如生物膜的去除)中需要的酶活 性所必需的酶量。本文中，功能上和/或結(jié)構(gòu)上相似的蛋白質(zhì)被認為是“相關(guān)蛋白質(zhì)”。在一些實施 方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)來源于不同屬和/或種，包括綱或生物體之間的差別(例如，細菌蛋白 質(zhì)和真菌蛋白質(zhì))。在一些實施方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)來源于相同物種。此外，術(shù)語“相關(guān)蛋 白質(zhì)”包括三級結(jié)構(gòu)同源物和一級序列同源物。該術(shù)語還包括具有免疫學交叉反應性的蛋 白質(zhì)。在一些實施方案中，相關(guān)過水解酶表現(xiàn)出高的過水解對水解比率。本文中，術(shù)語“衍生物”是指，通過在C和N末端之一或兩者處添加一個或多個氨基酸、在氨基酸序列內(nèi)的一個或幾個不同位置替代一個或多個氨基酸、和/或在C和N末端之 一或兩者處和/或在氨基酸序列內(nèi)一個或多個位置缺失一個或多個氨基酸、和/或在氨基 酸序列內(nèi)一個或多個位置插入一個或多個氨基酸，而從親本蛋白質(zhì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì) 衍生物的制備常常可以通過如下方式實現(xiàn)修飾編碼天生蛋白質(zhì)的DNA序列、將修飾的DNA 序列轉(zhuǎn)化至適宜宿主內(nèi)、和表達該修飾的DNA序列以產(chǎn)生該衍生蛋白質(zhì)。相關(guān)(和衍生)蛋白質(zhì)包括“變體”蛋白。變體蛋白與親本蛋白之間和/或彼此 之間相差少數(shù)個氨基酸殘基。在一些實施方案中，不同氨基酸殘基的數(shù)目是大約1、2、3、4、 5、10、20、25、30、35、40、45或50中之任一。在一些實施方案中，變體相差大約1至大約10 個氨基酸。在一些實施方案中，相關(guān)蛋白，例如變體蛋白，包括以下任何氨基酸序列同一性 至少大約 35 %、40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、 97%、98%、99%、或99. 5%氨基酸序列同一性。本文中，術(shù)語“類似序列”是指相對于參照蛋白質(zhì)提供相似功能、三級結(jié)構(gòu)和/或 保守殘基的蛋白質(zhì)內(nèi)的多肽序列。例如，在含有α螺旋或β折疊結(jié)構(gòu)的表位區(qū)域中，置換 類似序列中的氨基酸將維持相同的結(jié)構(gòu)元件。在一些實施方案中，提供類似序列，導致變體 酶，該變體酶相對于變體來源自的親本蛋白表現(xiàn)出相似或改良的功能。本文中，“同源蛋白”是指該蛋白質(zhì)(例如過水解酶)與參照蛋白質(zhì)(例如，來自不 同來源的過水解酶)具有相似功能(例如酶活性)和/或結(jié)構(gòu)。同源物可以來自進化相關(guān) 或無關(guān)物種。在一些實施方案中，同源物與參照蛋白質(zhì)具有相似的四級、三級和/或一級結(jié) 構(gòu)，由此可能允許將參照蛋白中的區(qū)段或片段置換為同源物中的類似區(qū)段或片段，且與用 非同源蛋白的序列置換該區(qū)段或片助相比，對參照蛋白的結(jié)構(gòu)和/或功能的破壞性降低。本文中，“相應于”是指一個蛋白質(zhì)或肽中的一個氨基酸殘基與另一蛋白質(zhì)或肽中 的編號氨基酸殘基類似、同源或等價。本文中，“相應區(qū)域”是指兩個蛋白質(zhì)或肽(包括兩個衍生或變體蛋白或一個衍生 或變體蛋白與親本蛋白)的多肽序列中類似的、同源的或等價的位置或區(qū)域。本文中，“野生型的”、“天生的”、和“天然的”蛋白質(zhì)是在自然界中存在的蛋白質(zhì)。 術(shù)語“野生型序列”是指存在于自然界中或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些實施方 案中，野生型序列是蛋白質(zhì)工程，例如產(chǎn)生變體蛋白，的起點。短語“基本上相似”和“基本上相同”用于至少兩個核酸或多肽時一般是指，一個多 核苷酸或多肽包含與參照(例如野生型)多核苷酸或多肽具有至少大約40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或 99. 5%序列同一 性的序列。序列同一性可以使用已知程序例如BLAST、ALIGN和CLUSTAL以及標準參數(shù)確定。 (參見例如，Altshul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 403-410 ；Henikoff 等(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. 89 10915 ；Karin 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90 5873 ；和 Higgins 等(1988) Gene 73:237)。實施BLAST分析的軟件可從美國國家生物技術(shù)信息中心公開獲得。此外， 可以使用 FASTA(Person 等(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 -.2444-2448.)檢索數(shù)據(jù)庫。在 一些實施方案中，基本上相同的多肽僅相差一個或多個保守氨基酸替代。在一些實施方案 中，基本上相同的多肽是免疫學交叉反應的。在一些實施方案中，基本上相同的核酸分子在 嚴緊條件(例如，中至高嚴緊性的范圍中)彼此雜交。
“分離的”多肽或多核苷酸是指該多肽或多核苷酸基本上不含天然與其相伴的物 質(zhì)?；旧喜缓侵笩o至少50%、常常至少70%、更常常是至少80%、甚至更常見是至少 90%的天然與其相伴的物質(zhì)。
酶混合物多種不同的酶可以用于本發(fā)明酶混合物和方法中用于減少生物膜。本文所述的 酶混合物包括至少兩種酶，例如糖酶，例如纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、和 β "葡糖苷酶；淀粉酶，例如α "淀粉酶；蛋白酶，例如絲氨酸蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶； 酯酶和角質(zhì)酶；顆粒淀粉水解酶；脂肪酶，例如磷脂酶；和半纖維素酶，例如甘露聚糖酶，的 組合。該酶混合物在本文中也稱為“清除酶混合物”，包括此處所述酶的組合。清除酶混合 物不包括過水解酶，但在本文所述的生物膜去除方法中與一種或多種過水解酶并行地或相 繼地聯(lián)合使用?？梢允褂玫乃饷?Ε. C. 3)包括例如蛋白酶、葡聚糖酶(糖基水解酶家族16)、纖 維素酶、酯酶、甘露聚糖酶、和阿拉伯聚糖酶(arabinases)。中性和絲氨酸蛋白酶，例如枯 草桿菌蛋白酶，可以用于本發(fā)明。中性蛋白酶是在大約6至8的中性pH范圍內(nèi)具有最佳蛋 白水解活性的蛋白酶。適宜的中性蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。適宜的商業(yè) 金屬蛋白酶是來自黑曲霉(Aspergillus niger)的 GC106、MULTIFECT、PURAFECT L、FNA、 PROPERASE L、和 PURADAX EG7000L (所有均可獲自 GenencorDivision, Danisco US, Inc.， Palo Alto (‘‘Genencor”), California)、禾口 Alcalase、Savinase、Esperase禾口Neutrase (Novo Nordisk A/S，Denmark)。中性蛋白酶可以來自細菌、真菌或酵母來源、或植物或動物來源， 可以是野生型或變體酶。變體酶可以在表達突變自親本基因的基因的來源中產(chǎn)生?？捎糜诒景l(fā)明的纖維素酶的實例包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β _葡糖 苷酶，包括在酸性至中性PH范圍內(nèi)具有最佳活性的纖維素酶，例如，Genencor的均來自真 菌來源的LAMINEX和INDIAGE、或來自細菌來源的PURADAX。纖維素酶可以來自例如曲霉屬 (Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鍵抱屬(Fusarium)禾口青霉 屬(Penicillium)真菌。有用的顆粒淀粉水解酶的實例包括來自腐質(zhì)霉屬、曲霉屬和根霉屬(Phizopus) 菌株的葡糖淀粉酶。顆粒淀粉水解(GSH)酶是指水解顆粒形式的淀粉的酶。葡糖淀粉酶 是指淀粉葡糖苷酶類型的酶(例如，EC. 3. 2. 1.3葡糖淀粉酶，l，4-a-D-葡聚糖葡糖水解 酶)。這些是從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原性末端釋放葡糖基殘基的外切酶。該酶 還水解α_1，6和α_1，3連接。葡糖淀粉酶活性可以使用基于葡糖淀粉酶催化對硝基苯 基-a-D-吡喃葡糖苷(PNPG)水解為葡萄糖和對硝基酚的能力的熟知測定法進行測量。在 堿性ΡΗ，硝基酚形成黃色，該顏色與葡糖淀粉酶活性成比例，可以在400nm監(jiān)測，之后與酶 標準品進行比較，度量為GAU。一個GAU (葡糖淀粉酶活性單位)定義為在PH4.2及60°C從 可溶性淀粉底物(4% ds)每小時產(chǎn)生1克還原糖(計算為葡萄糖)的酶量。從Genencor 商業(yè)可得的適宜葡糖淀粉酶包括0PTIDEX、DISTILLASE和G-ZYME?？捎糜诒景l(fā)明的脂肪酶的實例包括酸性、中性和堿性脂肪酶和磷脂酶。從 Genencor商業(yè)可得的脂肪酶和磷脂酶包括LYS0MAX和⑶TINASE。可用于本發(fā)明的半纖維素酶甘露聚糖酶的實例包括Genencor的均來自遲緩芽
9孢桿菌(Bacillus lentus)的HEMICELL和PURABRITE、來自遲緩芽孢桿菌的GC265、以及 Stahlbrand 等(1993) J. Biotechnol. 29 229~242 描述的葡聚糖酶?？捎糜诒景l(fā)明的酯酶和角質(zhì)酶的實例可以來自任何來源，包括例如細菌來源， 如門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、或真菌來源如腐質(zhì)霉屬或鐮孢屬?？蓮?Genencor獲得幾種此類酶?？捎糜诒景l(fā)明的淀粉酶的實例包括可從細菌或真菌來源獲得的α或β淀粉 酶，例如芽孢桿菌淀粉酶(淀粉液化芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌 (B. Iicheniformis)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearormophilus))、和真菌淀粉酶，例如，來 自曲霉，如黑曲霉、A. kawachi或米曲霉(A. oryze)、腐質(zhì)霉屬和木霉屬?？蓮腉enencor獲 得的淀粉酶包括SPEZYME FRED、SPEZYME AA、CLARASE、AMYLEX和淀粉酶的混合物SPEZYME ETHYL?？蓮?Novozymes A/S (Denmark)獲得的淀粉酶包括 BAN、AQUAZYM、AQUAZYM Ultra 和 TERMAMYLo其它淀粉酶包括淀粉酶混合物，例如Biocon的Ml和Sumizyme的CuConc、Aris Sumizyme L (內(nèi)切1，5 α-L阿拉伯聚糖酶)、ACH Sumizyme (β甘露聚糖酶)，腐質(zhì)霉葡糖淀 粉酶、葡聚糖酶(dextranase)、dextramase、殼多糖酶、ENDOH和OPTIMAX LlOOO (葡糖淀粉 酶)。如在共同待決PCT申請PCT/US2007/016461中所描述的，375種以上的不同酶混 合物被檢測了去除生物膜的性質(zhì)。該篩選導致鑒定到引起生物膜實質(zhì)性減少的33種令人 驚奇的酶混合物。這33種酶混合 物包括如下混合物α淀粉酶和和甘露聚糖酶；淀粉酶和 蛋白酶；淀粉酶和阿拉伯聚糖酶；至少一種α淀粉酶和至少兩種另外的淀粉酶；蛋白酶、纖 維素酶和葡聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、和三種葡聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶和甘露聚糖酶； 蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶；蛋白酶、淀粉酶、和葡聚糖酶；蛋白酶、甘露聚糖酶、和淀粉酶； 纖維素酶、阿拉伯聚糖酶和淀粉酶；蛋白酶、纖維素酶、甘露聚糖酶和磷脂酶；蛋白酶、葡聚 糖酶、淀粉酶、和阿拉伯聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、和兩種葡聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、和 三種葡聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、和磷脂酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷 脂酶和酯酶；三種蛋白酶、甘露聚糖酶、磷脂酶和酯酶；三種蛋白酶、纖維素酶、和甘露聚糖 酶；兩種蛋白酶、纖維素酶、和葡聚糖酶；兩種蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶； 兩種蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；至少三種淀粉酶和纖維素酶；淀 粉酶、阿拉伯聚糖酶、和纖維素酶；淀粉酶、阿拉伯聚糖酶和蛋白酶；至少三種淀粉酶和蛋 白酶；至少三種淀粉酶、蛋白酶、和纖維素酶；葡聚糖酶和淀粉酶混合物；纖維素酶和淀粉 酶混合物。在一些實施方案中，使用一種以下混合物蛋白酶、葡聚糖酶和酯酶；蛋白酶、葡 聚糖酶、酯酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖 酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶 和甘露聚糖酶；兩種蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶 和甘露聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶； 兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶和葡聚糖酶； 三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白 酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；兩種或以上淀粉酶和葡聚糖酶；至少三種淀粉酶； 至少兩種淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶.
在一些實施方案中，使用一種以下混合物蛋白酶、葡聚糖酶和角質(zhì)酶，其可以使 用商業(yè)可得酶MULTIFECT NEUTRAL ；LAMINEX BG和角質(zhì)酶制備；蛋白酶、葡聚糖酶、甘露聚 糖酶和角質(zhì)酶，其可以使用商業(yè)可得酶MULTIFECT NEUTRAL ；LAMINEX BG ；甘露聚糖酶和 角質(zhì)酶制備；蛋白酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶和磷脂酶，其可以使用商業(yè)可得酶MULTIFECT NEUTRAL ；LAMINEX BG ；甘露聚糖酶和LYS0MAX制備；三種蛋白酶加纖維素酶的混合物、甘露 聚糖酶和角質(zhì)酶，其可以使用商業(yè)可得酶PROPERASE L ；PURAFECT L ;FNA ；和LAMINEX BG、 甘露聚糖酶和角質(zhì)酶制備。本發(fā)明一些實施方案包括可從Gnencor商業(yè)獲得的如下酶制品MULTIFECT NEUTRAL ；LAMINEX ；LYS0MAX ；PROPERASE ；PURADAX, PURAFECT ；和 SPEZYME，所有均注冊了 Genencor 商標。MULTIFECT NEUTRAL 包含淀粉液化芽孢桿菌蛋白酶(EC3. 4. 24. 28) ；LAMINEX BG, 具有大約3200IU/g的活性水平，包含木霉屬B-葡聚糖酶(纖維素酶EC3. 3. 1. 6) ；LYS0MAX, 具有大約400U/g的活性水平，包含紫紅鏈霉菌(Sti^ptomyces violceoruber)磷脂酶； PROPERASE，具有大約1600PU/g的活性水平，包含嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus) 蛋白酶(EC3. 4. 21. 62) ；PURAFECT，具有大約42，000GSU/g的活性水平，包含枯草桿菌蛋 白酶(EC3. 4. 21. 62)，描述于 U. S. Pat. No. 5，624，829 ；FNA 包含枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)蛋白酶(EC3. 4. 21. 62)，描述于 US 專利號 RE34, 606 和 5，310, 675 ；PURADAX，具 有大約32U/g的活性水平，包含里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維素酶(EC3. 2. 1. 4)， 描述于U. S.專利號5，753，484 ；SPEZYME FRED，具有大約15，100LU/g的活性水平，包含來 自地衣芽孢桿菌的α淀粉酶(EC3. 2. 1. 1)，描述于U. S.專利號5，736，499 ；5, 958，739 ；和 5，824，532。在一些實施方案中，使用商業(yè)可得酶的酶混合物包括如下混合物1. MULTIFECT NEUTRAL ；LAMINEX BG 和角質(zhì)酶。2. MULTIFECT NEUTRAL ；LAMINEX BG ；甘露聚糖酶和角 質(zhì)酶。3. MULTIFECT NEUTRAL ；LAMINEX BG ；甘露聚糖酶和 LYS0MAX。4. PROPERASE L ； PURAFECT L ；FNA ；LAMINEX BG、甘露聚糖酶和角質(zhì)酶。5. PROPERASE L ；PURAFECT L ；FNA ； 甘露聚糖酶、角質(zhì)酶和 LYS0MAX。6. PR0PERATEL ；PURAFECTL、FNA、甘露聚糖酶、LAMINEXBG。 7. MULTIFECT NEUTRAL ；LAMINEX BG ；和甘露聚糖酶。8. FNA ；PURADAX EG 7000L ；LAMINEX BG、和角質(zhì)酶。9. PURAFECT L ；FNA ；LAMINEX BG ；和LYS0MAX。10. PROPERASE L ；FNA ；LAMINEX BG ；和 LYS0MAX。11.PROPERASE L ；PURAFECT L；FNA ；LAMINEX BG ；PURADAX EG 7000L ；和 LYS0MAX012. PROPERASE L ；PURAFECT L ；FNA ；LAMINEX BG ；角質(zhì)酶和 LYS0MAX。13. MULTIFECT NEUTRAL ；PURADAX EG 7000L ；LAMINEXBG ；LYS0MAX ；和角質(zhì)酶。14. PROPERASE L ；LAMINEX BG ；LYS0MAX和角質(zhì)酶。在一些實施方案中，酶混合物是上列組合1、2、3和4。其它酶組合包括SPEZYME， 其包含來自地衣芽孢桿菌的α淀粉酶；CuCONC，其是雪白根霉(Rhizopus niveus)Koji 菌株葡糖淀粉酶的商品名，具有顆粒淀粉水解活性(Shin Nihon Chemical Co. Ltd.日 本)；AFP GC 106，其是酸性真菌蛋白酶(Shin Hihon Chemical Co. Ltd.日本)；Ml，其可 獲自 Biocon India, Ltd.，Bangalore，印度；ARIS SUMIZYME (1，5-α 阿拉伯聚糖酶)；禾口 ACH SUMIZYME。15.SPEZYME FRED L ；CuCON 禾Π LAMINEX BG。16.SPEZYME FLRED L ；Aris SUMIZYME 和 LAMINEX BG。17. SPEZYME FRED L 禾口 CuCONC。18. SPEZYME FRED L ;CuCONC 禾口GC106。19. SPEZYME FRED L和GC106。20. SPEZYME FRED L和Ml。21. SPEZYME FRED L ；Aris SUMIZYME 禾Π GC106。22. SPEZYME FRED L ；CuCONC ；LAMINEX BG 禾PGC106。23. SPEZYME FRED L；ACH SUMIZYME 和 GC106。24.SPEZYME FRED L ；Aris SUMIZYME ；LAMINEX BG 禾口 GC106。 25. CuCONC和 LAMINEX BG。26. SPEZYME FRED L 禾口 Aris SUMIZYME0 27. Ml 禾口 LAMINEX BG。 28.SPEZYME FRED L ；LAMINEX BG 禾口 GC106。29. CuCONC ；LAMINEX BG 禾口 GC106。
過水解酶一種或多種過水解酶可以與上述酶混合物聯(lián)合用于本發(fā)明的生物膜去除方法中。在一些實施方案中，過水解酶是天然的(即，由細胞基因組編碼的過水解酶)。 一些實施方案中，過水解酶包含與天然過水解酶的氨基酸序列具有至少大約80%、85%、 90 %、95 %、97 %、98 %、99 %或99. 5 %同一性的氨基酸序列，或由該序列組成、或基本上由 該序列組成。一些實施方案中，過水解酶是天然恥垢分枝桿菌過水解酶。一些實施方案中，過水 解酶包含SEQ ID NO :1所示氨基酸序列或其變體或同源物，或由所述序列或其變體或同源 物組成，或基本上由所述序列或其變體或同源物組成。一些實施方案中，過水解酶包含與 SEQ ID NO :1 所示氨基酸序列至少大約 80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或 99. 5% 同一的氨基酸序列，或由該序列組成，或基本上由該序列組成。恥垢分枝桿菌過水解酶的氨基酸序列顯示如下MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERF APDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGLSARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVIIMLGTNDTKAYFRRTPL DIALGMSVLVTQVLTSAGGVGTTYPAPKVLVVSPPPLAPMPHPWFQLIFEGGEQKTTELARVYSALASFMKVPFFDA GSVISTDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL(SEQ ID NO 1)編碼恥垢分枝桿菌過水解酶的相應多核苷酸序列為5’ -ATGGCCAAGCGAATTCTGTGT TTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGCTGGGTCCCCGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCG CTGGACCGGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGCACCACCA ACATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCAACGGCGCGAGCTACCTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTC GACCTGGTGATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACCCCGCTCGACATCGCGCTGGG CATGTCGGTGCTCGTCACGCAGGTGCTCACCAGCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTGG TGGTCTCGCCGCCACCGCTGGCGCCCATGCCGCACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAGGGCGGCGAGCAGAAGACC ACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCGTCGTTCATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAG CACCGACGGCGTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGGCCCTCGCGGAACAGGTGC GGAGCCTGCTGTAA-3，(SEQ ID NO 2)一些實施方案中，過水解酶在一個或多個與SEQ ID NO 1所示恥垢分枝桿菌過水 解酶氨基酸序列中的位置等價的氨基酸位置包含一個或多個替代。一些實施方案中，過水 解酶包含選自如下的任何一個氨基酸替代或選自如下的氨基酸替代的任何組合M1，K3， R4, 15，L6, C7, D10, Sll, L12, T13, W14, W16, G15, V17, P18, V19, D21, G22, A23, P24, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, V32, R33, W34, T35, G36, L38, Q40, Q41, D45, L42, G43, A44, F46, E47, V48,149，E50, E51, G52, L53, S54, A55, R56, T57, T58, N59,160，D61, D62, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, G70, A71, S72, Y73, S76, C77, L78, A79, T80, L82, P83, L84, D85, L86, V87, N94, D95, T96, K97, Y99F100, R101，R102，P104, L105, D106,1107，A108, L109,
12G110，M111，S112, V113, L114, V115, T116, Q117, V118, L119, T120, S121, A122, G124, V125, G126, T127, T128, Y129, P146, P148, W149, F150, 1153，F(xiàn)154, 1194 和 F196。一些實施方案中，過水解酶在一個或多個與SEQ ID NO 1所示恥垢分枝桿菌過 水解酶氨基酸序列中的位置等價的氨基酸位置包含一個或多個以下替代L12C，Q，或G; T25S, G，或 P ；L53H, Q，G，或 S ；S54V, LA, P，T，或 R ；A55G 或 T ；R67T, Q, N, G, E，L，或 F ；K97R ； V125S, G, R，A，或 P ；F154Y ；F196G。一些實施方案中，過水解酶在一個或多個與SEQ ID NO 1所示恥垢分枝桿菌過水 解酶氨基酸序列中的氨基酸位置等價的氨基酸位置包含氨基酸替代組合L12I S54V ；L12M S54T ；L12T S54V ；L12Q T25S S54V ；L53H S54V ；S54P V125R ；S54V V125G ；S54V F196G ； S54V K97R V125G ；或 A55G R67T K97R V125G。一些實施方案中，過水解酶具有至少1的過水解水解比率。 評價生物膜的去除可以使用結(jié)晶紫測定法測量生物膜的去除。將樣品浸沒在結(jié)晶紫溶液(0. 31% w/ ν)中10分鐘，之后在磷酸緩沖鹽水(PBS)中漂洗3次去除未結(jié)合的染料。用95%乙醇提 取被生物膜保持的結(jié)合染料，在540nm讀取該結(jié)晶紫/乙醇溶液的吸光度。生物膜的去除 百分數(shù)計算為[(1-剩余生物膜百分數(shù))xl00]。剩余生物膜百分數(shù)按如下方式計算從酶 處理后的生物膜提取溶液的吸光度中扣除培養(yǎng)基+酶溶液的吸光度，除以未處理的對照生 物膜的吸光度與僅生長培養(yǎng)基的吸光度之間的吸光度差。也可以通過如下方式評價生物膜的去除將來自處理后的生物膜的細胞懸浮在緩 沖液例如磷酸緩沖鹽水(PBS)中、將細胞接種在含有適宜營養(yǎng)的生長培養(yǎng)基上、計算生長 在培養(yǎng)基上的細胞的數(shù)目?；罴毎嫈?shù)的降低可以通過與自從對照未處理生物膜制備的懸 浮液生長的細胞的數(shù)目比較而確定。
方法本發(fā)明提供從表面去除生物膜的方法。去除生物膜是指從表面上減少或清除生 物膜。本發(fā)明方法包括向表面上的生物膜施用一種或多種過水解酶以及上述的清除酶混 合物，其中所施用的酶劑量水平和時間量足以使生物膜減少至少大約20，25，30，35，40，45， 50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98，或99%。生物膜減少百分數(shù)是指與處理前生
物膜中的活細胞和/或總細胞的數(shù)目相比，生物膜中活細胞數(shù)目的減少。一些實施方案中， 待處理的生物膜包含銅綠假單胞菌、單核細胞增生李斯特氏菌、或金黃色葡萄球菌，或由其 組成、或基本上由其組成。本發(fā)明方法還包括預防性防止生物膜在表面上的形成或生長。一些實施方案中，清除酶混合物選自蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖 酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖 酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖 酶、和甘露聚糖酶；兩種蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚 糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、 和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和 葡聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；兩種或以上淀粉酶和葡聚糖酶；至 少三種淀粉酶；至少兩種淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。在一些實施方案中，一種或多種選自 PROPERASE、PURAFECT、MULTIFECT NEUTRAL、FNAjP GC106 的商業(yè)可得蛋白酶包括在清除酶 混合物中。在一些實施方案中，商業(yè)可得的纖維素酶PURADAX包括在清除酶混合物中。在 一些實施方案中，商業(yè)可得的酯酶⑶TINASE包括在清除酶混合物中。在一些實施方案中， 選自GC265和HEMICELL的商業(yè)可得甘露聚糖酶包括在清除酶混合物中。在一些實施方案 中，商業(yè)可得的葡聚糖酶LAMIINEX BG包括在清除酶混合物中。在一些實施方案中，內(nèi)切阿 拉伯聚糖酶也包括在清除酶混合物中。一些實施方案中，清除酶混合物包含3種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖 酶。一個實施方案中，蛋白酶來自枯草芽孢桿菌EC3. 3. 2. 6和嗜堿芽孢桿菌EC 3. 4. 2. 6，葡 聚糖酶來自木霉屬物種EC3. 3. 1.6，磷脂酶來自鏈霉菌屬物種EC 3. 1. 1.4，甘露聚糖酶來 自遲緩芽孢桿菌。一個實施方案中，清除酶混合物包含PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC265和LYS0MAX，或由其組成。一個實施方案中，過水解酶嗜來自恥垢分枝桿菌的過水解酶(SEQ ID N0:1)或其 變體或同源物。過水解酶(一種或多種)和清除酶混合物可以同時地(同時接觸生物膜)或相繼 地(在不同時間接觸生物膜)向生物膜施用。當同時施用時，過水解酶(一種或多種)和 清除酶混合物可以自包含所有這些酶的單個組合物添加，或者自分開的包含過水解酶的組 合物和包含清除酶混合物的組合物添加。一些實施方案中，過水解酶的施用是相繼的，其中首先添加過水解酶之后添加清 除酶混合物。一個實施方案中，向生物膜施用過水解酶，從生物膜除去該酶，然后向生物膜 施用清除酶混合物。一些實施方案中，在除去過水解酶后大約15分鐘至大約60分鐘，例如 大約15、30、45或60分鐘，添加清除酶混合物。一個實施方案中，清除酶混合物包含PROPERASE，PURAFECT，F(xiàn)NA，LAMINEX BG, GC265和LYS0MAX，或由其組成，過水解酶是來自恥垢分枝桿菌的過水解酶(SEQ ID NO :1)， 相繼地添加該過水解酶和清除酶混合物，并且過水解酶在清除酶混合物之前添加。一些實施方案中，過水解酶的底物包括在施用于生物膜的含過水解酶組合物中。 例如，當向生物膜施用過水解酶時，可以包括丙二醇二乙酸酯(PGD)和過碳酸鹽。過水解酶和清除酶混合物在生物膜上的效應可以是加性的(即，生物膜的去除程 度大約為單獨用過水解酶得到的去除與單獨用酶混合物得到的去除的和)或協(xié)同的(即， 生物膜去除程度大于單獨用過水解酶得到的去除與單獨用酶混合物得到的去除的和)。一些實施方案中，清除酶混合物含有按重量計大約至大約6%總酶。一些實施 方案中，過水解酶以按重量計大約0. 01%至大約0. 0001%的濃度使用。
試劑盒本發(fā)明還提供試劑盒。試劑盒包含足以用于本文所述生物膜處理方法中的量的過 水解酶和清除酶混合物。一個實施方案中，過水解酶和清除酶混合物在分開的容器中。另 一實施方案中，過水解酶和清除酶混合物在相同的容器中。清除酶混合物可以含有上述任 何酶組合。過水解酶可以包含SEQ ID NO :1所示氨基酸序列或如上所述其變體或同源物，或由SEQ ID NO :1所示氨基酸序列或其變體或同源物組成，或基本上由SEQID N0:1所示氨 基酸序列或其變體或同源物組成。試劑盒中提供的酶可以以固態(tài)形式或液體形式供給。試 劑盒還可以包括緩沖劑、底物、或?qū)τ诿富钚院?或穩(wěn)定性適宜的其它成分。例如，試劑盒 可以包含過水解酶活性的底物，例如丙二醇二乙酸酯(PGD)和過碳酸鹽。試劑盒可以包括 用于本文所述生物膜處理方法的說明書。提供適宜的包裝。本文中，“包裝”是指通常用于一個系統(tǒng)的、能夠在固定邊界內(nèi)容 納本文所述試劑盒的一個或多個組分(例如酶、緩沖劑、底物)的固體基質(zhì)或材料。此類材 料包括玻璃和塑料(例如，聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、紙的、塑料的和塑料-箔 層壓的袋子等等。如果使用電子束輻射(e-beam)滅菌技術(shù)，該包裝應具有足夠低的密度以 允許內(nèi)容物滅菌。說明書可以以印刷物的形式或以電子介質(zhì)如軟盤、CD或DVD的形式、或以可獲得 該說明書的網(wǎng)址的形式提供。以下實施例旨在舉例說明而非限制本發(fā)明。實施例實施例1.篩選用于去除銅綠 假單胞菌生物膜的酶混合物
一般實驗設(shè)置基于設(shè)計的酶研究矩陣，使用高通量方法篩選了大量酶混合物。使用PBS和乙酸 緩沖液制備該溶液(Tris緩沖液:pH 7. 0或8. 5以及乙酸緩沖液:pH 5. 0)。根據(jù)酶的pH和 溫度規(guī)格，制備了各種酶混合物組合。含有所有375種不同組合的表包括在附表A中。使 用96孔方法篩選該375種不同酶組合，每一組合進行4次重復。該分析允許在96孔微量 滴定板的孔中形成生物膜，所述板可以用于提供多達96個不同測試樣品。細菌接種物培養(yǎng)物(銅綠假單胞菌，P01，形成生物膜)生長在胰胨豆胨培養(yǎng)液 (TSB)中于搖瓶中21°C過夜。然后將20ml該培養(yǎng)液加入另一搖瓶中的大約180ml新鮮胰 胨豆胨培養(yǎng)液中。然后使用96針復制器，向96孔板的每孔加入200 μ 1該稀釋的接種物。 每8-10小時，吸出營養(yǎng)物、浮游生物細胞和培養(yǎng)基，替換為新鮮TSB培養(yǎng)基。生物膜在21°C 在孔中生長24小時。生物膜形成后，從96孔板孔中除去培養(yǎng)基，將各種酶和對照處理溶液轉(zhuǎn)移至該板 的孔中。允許生物膜浸泡給定時間(90分鐘用于本研究)。然后用去離子水清洗孔兩次，以 從該系統(tǒng)中去除任何剩余的處理溶液和懸浮的細胞。然后用結(jié)晶紫染色生物膜10分鐘。每 孔各清洗4次以從該系統(tǒng)中去除任何多余的染料，然后用300 μ 1乙醇進行洗脫。該洗脫步 驟提高分析過程中對染料的檢測。然后立即用微量滴定板讀數(shù)器讀板(J. Microbiological Methods (2003) 54 :269_276)。所有處理均至少一式四份地運行。在篩選條件下，漂白劑對 照(bleach control)在pH 7. 0具有75%降低、在pH 5. 0具有75%降低，且在pH 8具有 93%降低。
酸性PH條件下的生物膜去除篩選在酸性條件(pH 5)下有效催化水解反應的特定酶，例如蛋白酶、脂肪酶、纖 維素酶和其它糖酶，去除生物膜的效力。例如，本研究使用GC106酸性蛋白酶組合在酸性條 件下具有催化效力的脂肪酶、纖維素酶和其它糖酶。從本研究篩選出的17種酶組合達到了69% -88%的生物膜去除。 中性PH條件下的生物膜去除選擇在中性條件(pH 7)下有效催化水解反應的特定酶，例如蛋白酶、脂肪酶、纖 維素酶和糖酶，篩選它們?nèi)コ锬さ男ЯΑ＠?，本研究使用中性蛋白酶組合在中性條 件下具有催化效力的脂肪酶、纖維素酶和其它糖酶。從本研究篩選出的5種酶組合達到了 71% -84%的生物膜去除。
堿性PH條件下的生物膜去除選擇在堿性條件(pH 8.4)下有效催化水解反應的特定酶，例如堿性蛋白酶、脂肪 酶、纖維素酶和其它糖酶，篩選它們?nèi)コ锬さ男Я?。例如，本研究使用絲氨酸蛋白酶，例 如，F(xiàn)NA、PURAFECT和PR0PERASE，組合在堿性條件下具有催化效力的脂肪酶、纖維素酶和其 它糖酶。從本研究篩選出的11種酶組合達到了 70% -80%的生物膜去除。
數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學顯著性。方差分析確定了下表1所示酶混合物與對照顯著不 同。族誤差率(family-wise error rate)設(shè)在0· 05 ；即，95%置信區(qū)間為在一組143個檢 測結(jié)果中無假陽件結(jié)果。用于統(tǒng)計學分析的該方法的細節(jié)可以見于httD: //core, ecu, edu/ psyc/wuenschk/docs30/multcomp. doc,該概念充分舉例說明于 http //www, brettscaife. net/statistics/introstat/08multiple/lecture. html。
結(jié)果有效去除至少40%生物膜的酶混合物列在表1中，其中按降序排列各不同酶組。 表1各種酶組合的生物膜去除
表2對表1所示混合物中的酶的解釋 由該高通量方法提供的數(shù)據(jù)用于篩選大數(shù)量的混合物。接著進行候選混合物的進 一步研究，以驗證其對生物膜(包括銅綠假單胞菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄 球菌的生物膜，以及飲用水聚生體生物膜(drinking water consortium biofilms))的效 力，見以下實施例的描述。實施例2 在CDC生物膜反應器中評價表1的酶混合物
實驗方法使用實驗室模型系統(tǒng)CDC生物膜反應器(CBR 90模型，Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT)，評價表1的酶混合物的生物膜去除。該系統(tǒng)由Centers for Disease Control開發(fā)，已經(jīng)用于研究過由多種細菌物種形成的生物膜。⑶C生物膜反應器 由一個1升的罐子組成，蓋上懸8個聚丙烯取樣管支架(coupon holder)。每個取樣管支架 可以容納3根0. 5英寸直徑的樣品取樣管。對于此處報告的實驗，樣品取樣管由聚苯乙烯 制成，以便與使用聚苯乙烯微量滴定板進行的高通量篩選試驗相一致。兩個CDC生物膜反 應器平行地運行，提供每實驗總共48根樣品取樣管。液體生長培養(yǎng)基通過罐頂進入，并通 過側(cè)臂排放口排出。混合槳葉加上磁力攪拌棒提供流體混合和表面剪切。
銅綠假單胞菌生物膜⑶C生物膜反應器罐具有大約400ml工作體積，包含10%濃度的胰胨豆胨液體培 養(yǎng)基，接種銅綠假單胞菌，以分批模式(無注入的培養(yǎng)基)37°C運行6小時。建立該分批培 養(yǎng)物后，以600ml/hr速率提供再42小時的培養(yǎng)基流，以在聚苯乙烯樣品取樣管上建立銅綠 假單胞菌生物膜。在生物膜生長期結(jié)束時，從兩個反應器之每一個取出6根對照取樣管，用 無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗以去除未附著的細菌。然后使用下述結(jié)晶紫染色法，分析 來自各反應器的三根取樣管的生物膜。來自每個反應器的剩余3根對照取樣管在PBS中超 聲，系列稀釋，接種在胰胨豆胨瓊脂上以計算生物膜中可培養(yǎng)的細菌的數(shù)目。將剩余30根測試取樣管和6根對照取樣管轉(zhuǎn)移至12孔組織培養(yǎng)板，用選擇的高 效酶混合物(以wt總酶的酶劑量使用)在緩沖液中45°C處理90分鐘。以用于制備酶 混合物的相同緩沖液處理6根對照取樣管。在處理之后，用PBS清洗取樣管3次，并使用 結(jié)晶紫染色法分析生物膜。該方法包括將取樣管浸沒在結(jié)晶紫溶液(0.31%w/v)中10 分鐘，在PBS中清洗取樣管3次以去除未結(jié)合的染料。然后使用95%乙醇從生物膜提取結(jié) 合的染料，并在540nm讀取該結(jié)晶紫/乙醇溶液的吸光度。根據(jù)[(1_剩余生物膜百分數(shù)) xlOO]計算假單胞菌生物膜的去除百分數(shù)。剩余生物膜百分數(shù)按如下方式計算從酶處理 后的生物膜提取溶液的吸光度中扣除培養(yǎng)基+酶溶液的吸光度，除以未處理的對照生物膜 的吸光度與僅生長培養(yǎng)基的吸光度之間的吸光度差。生物膜平均厚度為0. 2mm。
使用在⑶C-BR中生長的生物膜評價的生物膜去除百分數(shù)稍低于之前使用高通量 篩選方法(HTA)確定的生物膜去除百分數(shù)，見下表3。這可能是因為CDC-BR中生長的生物 膜性質(zhì)上更頑固。與用于HTA的96孔微量滴定板法相比，CDC-BR產(chǎn)生更高的剪切環(huán)境，這 可能導致更難于去除的生物膜。然而，使用一些酶組合觀察到多達77%的生物膜去除。在 HTA試驗中組合“P印1,2,4,Cel 2,Car l,Pal 1”排名第9，實現(xiàn)80%去除，但對CDC-BR生 物膜具有比任何其它組合都好的表現(xiàn)，實現(xiàn)77%去除。針對在堿性緩沖液(50mM Bis-Tris, PH 8. 5)中制備的酶混合物，觀察到最高的生物膜去除百分數(shù)。表3使用在CDC生物膜反應 器中生長的銅綠假單胞菌生物膜進行的生物膜去除試驗的結(jié)果 使用具有銅綠假單胞菌的CDC生物膜反應器系統(tǒng)測試30種酶混合物，結(jié)果顯示， 20種酶混合物具有大于40%的生物膜去除，19種混合物具有大于50%的生物膜去除百分 數(shù)，10種混合物具有大于60%的生物膜去除百分數(shù)，4種混合物具有70%以上的生物膜去 除。根據(jù)基于HTP和CDC反應器的銅綠假單胞菌生物膜的生物膜去除分析，發(fā)現(xiàn)對于假單 胞菌生物膜去除最有效的大多數(shù)酶混合物在堿性至中性條件中。在酸性條件下，發(fā)現(xiàn)的性 能最佳混合物是Car2+Car7+Ce12。Cel2出現(xiàn)在所測試的大多數(shù)有效去除假單胞菌生物膜 的酶混合物中。
實施例3基于在假單胞菌上的CDC生物膜反應器數(shù)據(jù)以及在牙齒生物膜上的單獨HTP研 究(4個物種模型)，測試了下列酶混合物，評價對三種其它主要的商業(yè)相關(guān)生物膜的效力。 鑒于對可用于清除的時間和節(jié)約劑量的實際考慮，清除酶混合物與生物膜取樣器的接觸 時間減少至40分鐘，酶混合物中所有酶組分的最終組合酶濃度被限制在總共1%。例如， PEP5+CAR2+CEL3酶混合物含有0. 33+0. 33+0. 34%的各酶，形成的用于測試的最終酶混 合物劑量。
試驗在以下所列3種pH進行，使用了下列6種酶混合物。試驗在李斯特氏菌、葡 萄球菌和飲用水生物膜上進行。結(jié)果提供在實施例4-6。pH 5.51. PEP5+CAR2+CEL32. PEP5+CAR2+CEL2pH 7. 03. PEP6+PAL2+CEL34. PEP3+PAL2+CEL2pH 8. 55. PEP1+PEP2 +PEP4+CEL2+CAR1+PAL16. PEP4+CEL1+PAL1+PAL2在輕度堿性條件下，對于所有類型的生物膜去除最有效的酶混合物是FAN、 PurafectL> Properase L、Laminex BG、GC265 禾口 Lysomax 的組合。對于中性至酸性 pH 條 件，最有效的酶混合物包括MultifectNeutral、Laminex BG和Cutinase酶。
實施例4.單核細胞增生李斯特氏菌生物膜帶不銹鋼取樣管的⑶C生物膜反應器罐具有大約400ml工作體積，含有10%濃度 的腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基，接種4ml在10% BHI中37°C過夜培養(yǎng)的單核細胞增生李斯特氏 菌(ATCC 19112)。反應器以分批模式運行24小時，之后接著24小時以7ml/min連續(xù)補料 BHI培養(yǎng)基流。48小時(24分批+24連續(xù))后，終止和拆卸反應器。使用無菌鉗子從把手(wand)上取下所有不銹鋼取樣管，盡可能少地接觸取樣管 的前面和背面，將取樣管放在無菌12孔板中用于處理。每反應器總共24根取樣管可用，每 種酶混合物組合分別處理3根取樣管(6個組合，組合的所有酶組分的總酶混合濃度為1 %， 40分鐘，45°C)。三根取樣管未處理，用作未處理對照。自處理中取出所有處理后的取樣 管，在PBS中清洗3次，放在12孔板的75%結(jié)晶紫溶液中10分鐘。染色后，PBS中清洗取 樣管3次，放在5. Oml 95%乙醇中置于搖床上室溫5分鐘以洗脫結(jié)晶紫。然后將洗脫的溶 液吸入比色杯，在分光光度計上在540nm讀數(shù)。根據(jù)[(1_剩余生物膜百分數(shù))xlOO]計算 李斯特氏菌生物膜的去除百分數(shù)。剩余生物膜百分數(shù)按如下方式計算從酶處理后的生物 膜提取溶液的吸光度中扣除培養(yǎng)基+酶溶液的吸光度，除以未處理的對照生物膜的吸光度 與僅生長培養(yǎng)基的吸光度之間的吸光度差。表4在CDC反應器中酶混合物對李斯特氏菌生 物膜的去除
實施例5 金黃色葡萄球菌生物膜帶聚氨基甲酸酯取樣管的CDC生物膜反應器罐具有大約400ml工作體積，含有 10%胰胨豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)，接種4ml在10% TBS培養(yǎng)基中37°C過夜培養(yǎng)的金黃色葡 萄球菌(SRWC-10943)。⑶C反應器以分批模式運行24小時，之后接著24小時以7ml/min 連續(xù)補料TBS培養(yǎng)基流。48小時(24分批+24連續(xù))后，終止和拆卸反應器。使用無菌鉗子從把手(wand)上取下所有聚氨基甲酸酯取樣管，盡可能少地接觸 取樣管的前面和背面，將取樣管放在無菌12孔板中用于處理。每反應器總共24根取樣管可用，每種酶混合物組合分別處理3根取樣管(6個組 合，組合的所有酶組分的總酶混合濃度為1%，40分鐘，45°C )。三根取樣管未處理，用作未 處理對照。自處理中取出所有處理后的取樣管，在PBS中清洗3次，放在12孔板的75%結(jié) 晶紫溶液中10分鐘。染色后，PBS中清洗取樣管3次，放在5. Oml 95%乙醇中置于搖床上 室溫5分鐘以洗脫結(jié)晶紫。然后將洗脫的溶液吸入比色杯，在分光光度計上在540nm讀數(shù)。 根據(jù)[(1-剩余生物膜百分數(shù))xlOO]計算葡萄球菌生物膜的去除百分數(shù)。剩余生物膜百分 數(shù)按如下方式計算從酶處理后的生物膜提取溶液的吸光度中扣除培養(yǎng)基+酶溶液的吸光 度，除以未處理的對照生物膜的吸光度與僅生長培養(yǎng)基的吸光度之間的吸光度差。表5在 CDC反應器中酶混合物對金黃色葡萄球菌生物膜的去除
實施例6.飲用水聚生體生物膜使用以下成分預備具有19L BAC/GAC飲用水(含低CFU的混合飲用水聚生 體)和IL碳修飾溶液的20L無菌大玻璃瓶(carboy)以獲得額外的碳濃度L_谷氨
酸.......0. 0047g/LL-天冬氨酸.....0. 0053g/LL-絲氨酸...........0. 0055g/LL-丙
氨酸..........0. 0047g/LD+ 葡萄糖.........0. 0048g/LD+ 半乳糖.......0. 0048g/
LD-阿拉伯糖.......0. 0048g/L將無菌⑶C反應器放在層流凈化罩中，裝入BAC/GAC水到出口。37°C溫箱中，進行 所有到進口和出口的管道連接，將⑶C反應器放在攪拌板上。分批模式運行反應器24小 時，之后接著24小時為7ml/min的連續(xù)的碳增補BAC/GAC水流。在48小時(24分批+24 連續(xù))結(jié)束時，關(guān)閉流入流，將培養(yǎng)基從反應器倒出至廢料容器，并將反應器放在層流凈化罩中。使用無菌鉗子從把手(wand)上取下所有取樣管。然后將含有飲用水聚生體生物 膜的PVC取樣管放在無菌12孔板中用于處理。每反應器總共24根取樣管可用，每種酶混合物組合分別處理3根取樣管(6個組 合，總濃度，40分鐘，45°C)。三根取樣管未處理，用作未處理對照。自處理中取出所有 處理后的取樣管，在PBS中清洗3次，放在12孔板的75%結(jié)晶紫溶液中10分鐘。染色后， PBS中清洗取樣管3次，放在5. Oml 95%乙醇中置于搖床上室溫5分鐘以洗脫結(jié)晶紫。然后 將洗脫的溶液吸入比色杯，在分光光度計上在540nm讀數(shù)。根據(jù)[(1_剩余生物膜百分數(shù)) xlOO]計算生物膜的去除百分數(shù)。剩余生物膜百分數(shù)按如下方式計算從酶處理后的生物 膜提取溶液的吸光度中扣除培養(yǎng)基+酶溶液的吸光度，除以未處理的對照生物膜的吸光度 與僅生長培養(yǎng)基的吸光度之間的吸光度差。表6在⑶C反應器中酶混合物對飲用水聚生體 生物膜的去除
實施例7.用酶化合物和過水解酶去除生物膜
方法無菌條件下將加有4. Oml 一種以下接種物的適宜培養(yǎng)基裝入⑶C生物膜反應器 (http //www, imt. net/ mitbst/CDCreactor. html).在 10%胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)中 的銅綠假單胞菌過夜培養(yǎng)物。用于該系列的取樣管是聚苯乙烯的。.在10%腦心浸液(BHT) 中的單核細胞增生李斯特氏菌(ATCC 19112)過夜培養(yǎng)物。用于該系列的取樣管是不銹鋼 的。.在具有碳修飾的水中的飲用水聚生體。用于該系列的取樣管是聚乙烯氯(PVC)的。對于假單胞菌和李斯特氏菌培養(yǎng)物，反應器在37°C以分批模式培養(yǎng)24小時。在T =24hr，接下來的24小時開始以7ml/min的連續(xù)流。在T = 48hr (24hr分批+24hr連續(xù))， 檢測取樣管。以分批模式在實驗臺上室溫生長飲用水生物膜48小時，之后為24小時的連續(xù)流。 在T = 72hr (48hr分批+24hr連續(xù))，檢測飲用水取樣管。
酶處理將取樣管放在無菌12孔板中進行酶處理。實施如下處理.過水解酶，之后PEP1、 PEP2、PEP4、CEL2、CAR1和PALl的混合物(“清除酶混合物”).清除酶化合物，之后過水解 酶.單獨過水解酶用以上每種酶處理方式或用無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)(用作對照)分別處理6根 取樣管。處理時間為45°C 90分鐘(45分鐘清除酶化合物和45分鐘過水解酶)，或者當單 獨使用過水解酶時45°C 45分鐘。在處理時間結(jié)束時，從處理溶液中取出取樣管，在PBS中 清洗3次。清除酶溶液50mMTris, pH 8.5 中 PEP1、PEP2、PEP4、CEL2、CARl 禾口 PALI，各酶的
終酶濃度為1%。過水解酶溶液，終濃度100mM丙二醇二乙酸酯(PGD)、IOOmM過碳酸、4ppm SEQ ID NO :1 的 S54V 變體、400mM KH2PO4, ρΗ7· 1。過水解酶的C存溶液；125mMPGD_2ml/100ml 400mMKH2P04 (800 μ 1 每 Iml 反應混 合物)；10. 5mg/ml過碳酸(10. 5mg每Iml反應混合物)；20ppm過水解酶(200 μ 1每Iml反
應混合物)。過水解酶處理程序稱重過碳酸鹽并與P⑶/KH2PO4緩沖液混合以溶解。(備選地， 可以使用PH 6-12的另外適宜緩沖劑，或不加入緩沖劑，以過碳酸鹽充當緩沖劑。)加入過 水解酶并再次混合溶液。室溫放置溶液20分鐘，然后立即使用。過乙酸測試溶液50ml 125mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5. 0，500 μ IlOOmM在水中的2， 2，-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽，CAS#30931-67-0(ABTS)，100y 1 25mM 在水中的ΚΙ。過乙酸測定程序25μ 1過水解酶溶液與225μ 1水混合。該溶液再次稀釋 (25 μ 1+25 μ 1水)。25 μ 1終溶液與75 μ 1水混合，隨后加入比色杯中的900 μ 1過乙酸測定溶液中。室溫孵育溶液3分鐘。讀取420nm吸光度。過乙酸濃度計算為:A420x 0. 242 = [過乙酸]mM。 對于第一銅綠假單胞菌PAOl輪，測試方案如下 隨后的試驗包括用單獨清除酶化合物進行的處理，根據(jù)如下測試方案進行
結(jié)晶紫試驗確定去除效力將來自每個處理的取樣管放入12孔板的75%結(jié)晶紫溶液中10分鐘。染色后，PBS 中清洗取樣管3次，然后放入5. Oml 95%乙醇中，置于搖床上室溫5分鐘以洗脫結(jié)晶紫。然 后將洗脫的溶液吸入比色杯，在分光光度計中540nm讀取吸光度。
板計數(shù)確定I og減少將來自每個處理的取樣管放入含有IOml無菌PBS的無菌錐形瓶。依照在Medical Biofilm Laboratory, Center for Biofilm Engineering atMontana State University, Bozeman, Montana(MBL)建立的標準化程序，渦旋瓶子1分鐘，超聲2分鐘，渦旋30秒。細菌懸浮液進行系列稀釋，之后鋪板以確定活細胞計數(shù)和由處理導致的log減少。對于活細 胞計數(shù)，將銅綠假單胞菌鋪在100%胰胨豆胨瓊脂(TSA)上，將單核細胞增生李斯特氏菌鋪 在1005BHI瓊脂上，以及將飲用水聚生體鋪在100% R2A瓊脂上。結(jié)果表7在⑶C反應器中 通過酶混合物和過水解酶對銅綠假單胞菌生物膜的去除
*對于表中所列頭三個處理為三輪的平均值，對于第4個處理為兩輪的平均值(清除酶單 獨)表8在CDC反應器中酶混合物和過水解酶對單核細胞增生李斯特氏菌生物膜的去除
*對于表中所列所有處理均為2輪的平均值表9在CDC反應器中通過酶混合物和過水解酶 對飲用水聚生體生物膜的去除
*基于一輪的數(shù)據(jù)實施例8 用酶混合物和有和無底物的過水解酶去除銅綠假單胞菌生物 膜
方法向安裝有24個聚苯乙烯取樣管的⑶C生物膜反應器中裝入大約450ml 10% TSB 加4ml銅綠假單胞菌24小時培養(yǎng)物。在連續(xù)攪拌下反應器以分批模式培養(yǎng)24小時。在T =24hr，開始7ml/min的連續(xù)流，持續(xù)接下來的24小時。在T = 48hr (24hr分批+24hr連 續(xù))，將取樣管放入無菌12孔板中進行酶處理。
酶處理分別用·無底物的過水解酶(SEQ ID NO=I的S54V變體；4ppm) +清除酶混合物 (每種酶各) ·無底物的過水解酶(4ppm) ·有底物的過水解酶(4ppm) · PBS，7. 2(對
昭)在45°C的處理溫度，處理時間總共90分鐘。處理結(jié)束時，在PBS中清洗取樣管3 次。
酶混合物和混合方案無底物的過水解酶+清除酶混合物PEP1，PEP2，CEL2，CARl和PALl在400mM KH2PO4緩沖液pH 7. 1中各酶的總最終酶溶度為1%，加上4ppm終濃度的過水解酶。無底物的過水解酶400mM KH2PO4緩沖液，4ppm過水解酶有底物的過水解酶IOOmM P⑶，IOOmM過碳酸鹽，4ppm過水解酶，400mM KH2POjl 沖液，pH 7.1。稱重過碳酸鹽，與P⑶/KH2PO4緩沖液混合以溶解。加入過水解酶，再次混合 溶液。在室溫放置溶液20分鐘，之后立即使用。PBS 混合 NaCl 8g/l, KCl 0. 2g/L, Na2HPO4L 15g/L 和 KH2PO4O. 2g/L。調(diào)整 pH 至 7. 2，溶液高壓滅菌。
測試方案測試方案如下
結(jié)晶紫試驗確定去除效力將來自每個處理的取樣管放入12孔板的75%結(jié)晶紫溶液中10分鐘。染色后，PBS 中清洗取樣管3次，然后放入5. Oml 95%乙醇中，置于搖床上室溫5分鐘以洗脫結(jié)晶紫。然 后將洗脫的溶液吸入比色杯，在分光光度計中540nm讀取吸光度。
板計數(shù)確定I og減少來自每個處理的3個取樣管放入含有IOml無菌PBS的無菌錐形瓶。依照在MBL 建立的標準化程序，渦旋瓶子1分鐘，超聲2分鐘，渦旋30秒。細菌懸浮液進行系列稀釋， 之后鋪在100% TSA板上以確定活細胞計數(shù)和由處理導致的log減少。結(jié)果表10用酶混合 物和有或無底物的過水解酶對銅綠假單胞菌生物膜的去除 盡管為了清楚理解的目的前述發(fā)明已經(jīng)以某種詳細程度通過舉例說明和實施例 進行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員明了可以實施某些變化和改變而不偏離本發(fā)明的精神和范 圍。因此，說明書不應理解為限制本發(fā)明的范圍。 本文引用的所有出版物、專利和專利申請均完整地為了所有目的而特此引入作為 參考，其程度等同于具體地單獨地指出每一出版物、專利或?qū)＠暾埐⑷胱鳛閰⒖肌?br> 權(quán)利要求
從表面去除生物膜的方法，所述方法包括向所述生物膜施用過水解酶和清除酶混合物，其中施用時間足以使所述生物膜減少至少25％，其中所述酶混合物選自蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；兩種蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少兩種淀粉酶和葡聚糖酶；至少三種淀粉酶；和至少兩種淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。
2.權(quán)利要求1的方法，其中過水解酶和清除酶混合物同時施用于生物膜。
3.權(quán)利要求1的方法，其中過水解酶混合物和清除酶混合物相繼地施用于生物膜。
4.權(quán)利要求3的方法，其中過水解酶在清除酶混合物施用前施用。
5.權(quán)利要求1的方法，其中過水解酶和清除酶混合物協(xié)同地起作用以從表面去除生物膜。
6.權(quán)利要求1的方法，其中生物膜包含銅綠假單胞菌、單核細胞增生李斯特氏菌、或金 黃色葡萄球菌。
7.權(quán)利要求1的方法，其中清除酶混合物由三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚 糖酶組成。
8.權(quán)利要求1的方法、其中清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEXBG、 GC265、和 LYS0MAX 組成。
9.權(quán)利要求1的方法，其中過水解酶包含SEQID NO 1所示氨基酸序列。
10.用于從表面去除生物膜的組合物，所述組合物包含過水解酶和清除酶混合物，其中所述清除酶混合物選自蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、 和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；兩種蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、 磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和酯 酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖 酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和甘露聚 糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯 酶；至少兩種淀粉酶和葡聚糖酶；至少三種淀粉酶；和至少兩種淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白 酶。
11.權(quán)利要求10的組合物、其中清除酶混合物由三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘 露聚糖酶組成。
12.權(quán)利要求10的組合物、其中清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC265、和 LYSOMAX 組成。
13.權(quán)利要求10的組合物、其中過水解酶包含SEQIDN01所示氨基酸序列。
14.用于從表面去除生物膜的試劑盒，所述試劑盒包含過水解酶和清除酶混合物，其中所述酶混合物選自蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露 聚糖酶；三種蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；兩種蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、 和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和酯酶；兩種 蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；兩種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種蛋 白酶、纖維素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三種蛋白酶、纖維素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三種 蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少兩種 淀粉酶和葡聚糖酶；至少三種淀粉酶；和至少兩種淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中過水解酶和清除酶混合物在分開的容器中。
16.權(quán)利要求14的試劑盒，其中過水解酶和清除酶混合物在相同容器中。
17.權(quán)利要求14的試劑盒，其中清除酶混合物由三種蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘 露聚糖酶組成。
18.權(quán)利要求14的試劑盒，其中清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC265、和 LYS0MAX 組成。
19.權(quán)利要求14的試劑盒，其中過水解酶包含SEQIDN01所示氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于從表面除去生物膜的方法、組合物和試劑盒。本文描述的方法包括向表面上的生物膜同時或相繼地施用過水解酶和其它酶如蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、甘露聚糖酶、磷脂酶、纖維素酶和/或淀粉酶的混合物，以去除生物膜。
文檔編號C11D3/386GK101903511SQ200880121578
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者C·巴內(nèi)特, G·M·懷特德, M·庫馬 申請人:丹尼斯科美國公司