專利名稱：織物的高溫生物制備的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及使用熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶高溫下生物制備纖維素纖維，優(yōu)選織物，最優(yōu)選棉織物的方法。
背景技術(shù)：
除去在天然纖維中發(fā)現(xiàn)的非纖維素成分，以及除去雜質(zhì)，諸如加入到纖維中的化合物，如加工機械中使用的漿料和潤滑劑，是由纖維素纖維制備織物的重要方面。除去非纖維素雜質(zhì)，稱為“精練(scouring)”，最理想的是產(chǎn)生具有均勻高可濕性的織物，從而可以均勻地漂白和/或染色。
傳統(tǒng)的精練工藝通常采用高堿性化學處理，不僅能夠除去雜質(zhì)，還會削弱纖維或織物中潛在的纖維素成分。此外，由于采用的化學藥品和由纖維提取的材料，化學精練存在廢水處理的環(huán)境問題。因此，本領域需要特異靶向除去雜質(zhì)、且對環(huán)境無害的精練方法。
使用包含于pH大約4-5有活性的果膠酶和纖維素酶的多組分真菌酶系統(tǒng)進行了織物的酶法精練(Bach等人，Textilveredlung 272，1992；Bach等人，Textilpraxis International，1993年3月，第220-225頁；Rssner，Melliand Textilberichte 2144，1993；Rssner，Textilveredlung 3082，1995；Hardin等人，1997年Beltwide棉會議進展(1997 Proceedings Beltwide Cotton Conferences)，第745-747頁；Li等人，織物化學家和色彩學家(Textile Chemist andColorist)2971，1997；Li等人，AATCC 1997年國際會議及展覽(1997International Conference & Exhibition)，第444-454頁)。在這些研究中，制劑中的總酶活性只有小部分可以用于精練。這些方法由此需要使用大量酶制劑，使得它們在經(jīng)濟上難以實行。還使用了細菌果膠酶，有時與半纖維素酶(諸如阿拉伯聚糖酶)聯(lián)合使用；這些酶通常在較高pH有活性(國際專利申請W09802531；Sakai等人，織物工程(Textile Engineering)(日文)45301，1992；日本專利6220772；Sakai，染色工業(yè)(Dyeing Industry)(日文)43162，1995)。然而，所有報導的細菌果膠酶其活性需要二價陽離子，而且通常在超過60℃的溫度沒有活性。由于(i)織物必須預先煮沸使覆蓋在果膠層上的蠟質(zhì)表皮變薄，和(ii)鈣離子易形成不溶鹽沉淀在纖維表面，所以這些特性限制了它們應用于織物的生物精練。
由此，本領域需要能夠一步進行的生物精練方法，該方法在近乎或超過棉的蠟質(zhì)表皮熔化溫度的溫度下(70℃)，且無需加入二價陽離子時，使用有效除去果膠的酶進行，由此有助于除去果膠和其它非纖維素雜質(zhì)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了處理纖維素纖維以除去非纖維素化合物的方法。該方法通過于高溫在能夠除去果膠的條件下將纖維與具有果膠降解活性，優(yōu)選果膠酸裂解酶活性的酶接觸而進行。優(yōu)選除去纖維中果膠的至少大約30％(質(zhì)量百分比)；更優(yōu)選除去至少大約50％，最優(yōu)選除去至少大約70％。接觸優(yōu)選于超過大約70℃的溫度進行；最優(yōu)選超過大約80℃。在優(yōu)選的實施方案中，接觸(i)于至少大約7的pH；更優(yōu)選至少大約8；最優(yōu)選至少大約9的pH下；和(ii)不加入二價陽離子時進行。
可以用于本發(fā)明實踐的果膠降解酶包括(但不限于)(i)于超過大約70℃，優(yōu)選超過大約80℃的溫度展示最大果膠酸裂解酶活性；(ii)于超過大約8，優(yōu)選超過大約9的pH展示最大活性；和(iii)展示不依賴二價陽離子存在的酶活性的酶?？梢岳斫?，可以使用于超過大約70℃溫度下有足夠活性除去纖維中果膠至少大約30％(質(zhì)量百分比)的任何果膠酸裂解酶。
在一系列實施方案中，此方法使用熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶，其包括與SEQ ID NO1的氨基酸序列具有至少70％同源性的多肽。在優(yōu)選的實施方案中，熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶包括SEQ ID NO1的氨基酸序列。參閱如下文的實施例2。已經(jīng)將包含編碼SEQ ID NO1的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli菌株中，并于1998年9月8日根據(jù)布達佩斯條約將包含該質(zhì)粒的細菌克隆保存于Deutsche Sammlung von Midroorganismenund Zelkulturen GmbH，保藏號DSM 12404。
在另一系列實施方案中，此方法使用果膠酸裂解酶，其包括與1998年5月6日提交的共同待審美國專利申請序列號09/073，684中SEQ IDNO2的氨基酸序列具有至少70％同源性的多肽。參閱如下文的實施例2。
用于本發(fā)明的果膠酸裂解酶優(yōu)選來源于芽孢桿菌屬(Bacillus)的種，更優(yōu)選來自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、B.agaradhaerens、嗜堿芽孢桿菌(B.alcalophilus)、類嗜堿芽孢桿菌(B.pseudoalcalophilus)、B.clarkii、耐鹽芽孢桿菌(B.halodurans)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、B.clausii、B.gibsonii，或相關(guān)芽孢桿菌屬物種。只要展示熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶活性，優(yōu)選堿性和/或不依賴二價陽離子的酶活性，則由任何果膠酸裂解酶多肽衍生的變異果膠酸裂解酶也可以用于本發(fā)明實踐。
本發(fā)明的方法可以用于處理粗制纖維、紗、或者針織或機織織物。纖維可以是棉、麻、亞麻、苧麻、人造絲、或者這些纖維彼此或與其它天然或合成纖維的混和物。使用本發(fā)明的方法除去的非纖維素化合物可以是由纖維衍生的化合物或由制造過程衍生的化合物，諸如紡紗、絡筒或漿紗潤滑劑。
在一些實施方案中，本發(fā)明進一步包括將纖維與一種或多種其它酶接觸，所述酶包括(但不限于)蛋白酶、果膠降解酶、和脂肪酶。
在另一方面，本發(fā)明提供了制備織物的方法，包括將織物同時或依次(i)精練和(ii)漂白，其中精練包括在能夠除去至少大約30％(質(zhì)量百分比)織物中果膠的條件下將織物與具有熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶活性的酶接觸。在一些實施方案中，精練和漂白步驟優(yōu)選同時進行。還可以使用其它酶對織物進行脫漿、染色、和/或生物拋光。
本發(fā)明提供了相對于傳統(tǒng)精練方法的優(yōu)勢，包括(i)更短的加工時間；(ii)更有效的乳化和去蠟；和(iii)與本領域現(xiàn)有織物加工技術(shù)(包括如連續(xù)軋蒸系統(tǒng))具有完全兼容性。
圖的簡述

圖1是pH和溫度對使用熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶由棉織物除去果膠的影響的例示圖。果膠的除去用％殘余果膠表述。果膠酸裂解酶應用于織物的劑量是100μmol/min/kg織物。
圖2是熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶劑量對由棉織物除去果膠的影響的例示圖。果膠的除去用％殘余果膠表述，劑量用μmol/min/kg織物表述。果膠酸裂解酶應用于織物的條件是pH9和80℃。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了處理纖維素纖維以除去非纖維素化合物的方法。該方法通過在能夠由纖維除去果膠的條件下將纖維與果膠降解酶，優(yōu)選具有熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶活性的酶接觸而進行。本發(fā)明的方法可以用于織物的生物制備，特別是精練，以產(chǎn)生具有期望特性(諸如均一高可濕性)的織物。使用本發(fā)明的方法除去的非纖維素化合物可以是由天然纖維自身衍生的化合物，包括(但不限于)果膠和蠟質(zhì)表皮，以及由制造工藝衍生的非纖維素化合物，包括(但不限于)紡紗、絡筒或漿紗潤滑劑。熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶本發(fā)明基于的是在與織物制備技術(shù)相容的溫度、pH、和離子組成條件下有酶活性的熱穩(wěn)定果膠酸裂解酶的發(fā)現(xiàn)。此處所用的果膠酸裂解酶活性指通過反式消除作用催化果膠酸(也稱為聚半乳糖醛酸)中α-1，4-糖苷鍵的隨機切割。果膠酸裂解酶通常屬于酶類EC 4.2.2.2，也稱為聚半乳糖醛酸裂解酶和聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸酐)裂解酶。為了本發(fā)明的目的，果膠酸裂解酶活性是指通過測量0.1％(w/v)聚半乳糖醛酸鈉溶液(用pHl0的0.1M甘氨酸緩沖液配制)于235nm處的吸光值的增加而測定的活性。酶活性通常表述為xμmol/min，即每分鐘催化xμmol產(chǎn)物形成的酶量。另一種實驗是測量5％(w/v)聚半乳糖醛酸鈉溶液(用pH10的0.1M甘氨酸緩沖液配制)粘度的降低(使用振動粘度法測量，APSU單位)。下文更詳細的描述了測量果膠酸裂解酶活性的這兩種實驗。
如此處所用，“熱穩(wěn)定的”果膠酸裂解酶是于超過大約70℃的溫度展示最大果膠酸裂解酶活性的酶。“堿性的”果膠酸裂解酶是于超過大約7的pH展示最大果膠酸裂解酶活性的酶?！安灰蕾嚩r陽離子的”果膠酸裂解酶是其果膠酸裂解酶活性基本上不受二價陽離子(諸如鈣離子)影響的酶。
本發(fā)明的方法涵蓋使用于超過大約70℃，優(yōu)選超過大約80℃，最優(yōu)選超過大約85℃的溫度展示足夠降解至少大約30％纖維素纖維中果膠的酶活性的任何果膠酸裂解酶。此方法優(yōu)選采用于這些高溫展示最大活性的酶。另外，可以用于本發(fā)明實踐的熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶還可能(i)于超過大約8，優(yōu)選超過大約9，最優(yōu)選超過大約10的pH展示最大活性，和(ii)缺乏加入二價陽離子(諸如鈣離子)時展示酶活性。這些特性使得果膠酸裂解酶特別適用于本發(fā)明的生物精練方法。
其用途涵蓋于本發(fā)明的熱穩(wěn)定果膠酸裂解酶的非限制性范例包括，包含SEQ ID NO1的序列的多肽和包含與SEQ ID NO1具有至少大約60％，優(yōu)選至少大約70％，更優(yōu)選至少大約80％，最優(yōu)選至少大約90％同源性的氨基酸序列的多肽。同源性可以使用本領域已知的算法測定，包括(但不限于)GAP程序(GCG，Madison，WI)，其中GAP產(chǎn)生罰分3.0，GAP延伸罰分0.1。
在優(yōu)選的實施方案中，熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶包括SEQ ID NO1的氨基酸序列。參閱如下文的實施例2。已經(jīng)將包含編碼SEQ ID NO1的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli菌株中，并于1998年9月8日根據(jù)布達佩斯條約將包含該質(zhì)粒的細菌克隆保存于Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏號DSM 12404。
在另一系列實施方案中，此方法使用的果膠酸裂解酶包含與1998年5月6日提交的共同待審美國專利申請序列號09/073，684中SEQ IDNO2的氨基酸序列具有至少70％，優(yōu)選至少大約80％，最優(yōu)選至少大約90％同源性的多肽。參閱如下文的實施例2。
可以理解，展示上述特性的任何多肽可以用于本發(fā)明的實踐。換言之，只要產(chǎn)生的多肽展示上述高溫活性(且優(yōu)選地，活性的最佳pH和二價陽離子不依賴性)，即可以使用由其它有機體衍生的果膠酸裂解酶，或由上述酶通過加入、刪除、或取代一個或多個氨基酸而衍生的果膠酸裂解酶，包括雜合多肽。可以用于本發(fā)明實踐的這些果膠酸裂解酶變體，可以使用傳統(tǒng)誘變步驟產(chǎn)生，并使用如高通量篩選技術(shù)(諸如下文實施例1描述的瓊脂平板篩選步驟)鑒定。
分離果膠酸裂解酶的溫度、pH、和二價陽離子依賴性可以使用傳統(tǒng)方法確定。例如，于一定溫度和pH范圍、當不同Ca2+濃度存在或不存在時，進行酶活性實驗(諸如下文實施例1描述的分光法實驗)，并確定最佳溫度和pH，將二價陽離子的影響(如果存在)定量。然后確定pH、溫度、和陽離子依賴性，以確定用于本發(fā)明的特定果膠酸裂解酶的適用性。
用于本發(fā)明的果膠酸裂解酶可以由起源的細胞衍生，或重組產(chǎn)生，而且可以進行純化或分離。如此處所用，“純化的”或“分離的”果膠酸裂解酶指經(jīng)處理除去了由合成該酶的細胞衍生的、可能干擾其酶活性的非果膠酸裂解酶物質(zhì)的果膠酸裂解酶。通常，果膠酸裂解酶由產(chǎn)生該酶作為內(nèi)源成分或重組產(chǎn)物的細菌或真菌微生物分離。如果果膠酸裂解酶分泌到培養(yǎng)基中，則純化可以包括使用傳統(tǒng)方法通過離心、過濾、或沉淀將生物質(zhì)與培養(yǎng)基分離。或者，果膠酸裂解酶可以由宿主細胞通過細胞的裂解和生物質(zhì)的分離而釋放。在某些情況中，可以通過傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法實現(xiàn)進一步的純化，包括(但不限于)硫酸銨沉淀；酸或離液劑提?。浑x子交換、分子篩、和疏水層析，包括FPLC和HPLC；制備性等電聚焦；和制備性聚丙烯酰胺凝膠電泳?；蛘撸梢允褂糜H和層析法實現(xiàn)純化，包括免疫親和層析法。例如，可以使用具有額外氨基酸序列作為親和“標簽”有助于使用恰當固相基質(zhì)純化的雜合重組果膠酸裂解酶。
用于本發(fā)明的果膠酸裂解酶可以經(jīng)化學修飾以增強一種或多種特性，使得它們更有利，諸如溶解度增加、不穩(wěn)定性或二價離子依賴性降低、等等。修飾包括(但不限于)磷酸化、乙?；⒘蛩峄?、酰化、或本領域技術(shù)人員知道的其它蛋白質(zhì)修飾。生物制備法根據(jù)本發(fā)明，通過在能夠有效精練的條件下，將纖維與一種或多種上述熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶接觸，從而由纖維素纖維除去非纖維素成分。如此處所用，“精練”指由纖維素纖維除去非纖維素成分。有效的精練通常導致使用滴水測試根據(jù)AATCC測試法39-1980測量時，其可濕性小于大約10秒，優(yōu)選小于大約5秒，最優(yōu)選小于大約2秒。
通常，根據(jù)本發(fā)明的有效精練需要消化纖維中顯著比例的果膠，優(yōu)選至少30％(質(zhì)量百分比)，更優(yōu)選至少50％(質(zhì)量百分比)，最優(yōu)選至少70％(質(zhì)量百分比)。果膠降解指切割果膠中的α-1，4-糖苷鍵，使得能夠通過如漂洗或任何其它傳統(tǒng)分離方法由纖維除去消化產(chǎn)物。測量纖維中的果膠消化程度的方法包括(但不限于)釕紅染色法(Luft，The Anatomical Record 171347，1971)。
如此處所用，“纖維素纖維”指(但不限于)棉、麻、亞麻、苧麻、人造絲、及其混和物。纖維可以包括(但不限于)粗制纖維、紗、針織或機織紡織品或織物、或者衣物或完成的產(chǎn)品。
在本發(fā)明的實踐中，將纖維素纖維與含上述熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶的水溶液或清洗液接觸。調(diào)節(jié)水溶液中的酶濃度，使得加到給定量纖維中的酶劑量(即μmol/min/kg纖維)在大約0.1和大約10,000之間，優(yōu)選在大約1和大約2,000之間，最優(yōu)選在大約10和大約500之間。
含酶的水溶液優(yōu)選具有大約9.0或更高的pH，最優(yōu)選pH大約10.0或更高，且含低濃度的添加鈣(即低于2mM Ca2+)或完全不加入Ca2+。
為了實現(xiàn)有效的精練，根據(jù)(i)纖維的本質(zhì)，即粗制纖維、紗、或織物；(ii)使用的特定果膠酸裂解酶，和酶的比活性；(iii)進行加工的溫度、pH、時間等等條件；(iv)清洗液中存在的其它成分；和(v)使用的加工方案的類型，即連續(xù)或不連續(xù)的浸軋-堆放回蘇法或間歇法，改變應用于給定量纖維(L/kg纖維)的酶劑量(μmol/min/kg纖維)、清洗液中的酶濃度(μmol/min/L清洗液)、和清洗液的總體積。
僅使用常規(guī)實驗通過建立條件矩陣并測試矩陣中的不同點，可以確定使用的合適酶劑量、酶濃度、和溶液體積。例如，可以改變酶量、進行接觸的溫度、和加工總時間，隨后評價產(chǎn)生的纖維或織物中(a)果膠的除去和/或(b)精練特性，諸如可濕性。
在優(yōu)選的實施方案中，將纖維與酶在下列條件下接觸(i)超過大約70℃，優(yōu)選超過大約80℃的溫度；(ii)超過大約7.0，優(yōu)選超過大約8.0，最優(yōu)選超過大約9.5的pH；(iii)不加入二價陽離子；(iv)清洗液織物的比例在大約0.5和大約50之間；和(v)酶劑量在大約10和大約500μmol/min/kg纖維之間。
將含酶水溶液與纖維素材料接觸的方式取決于加工方案是連續(xù)的、不連續(xù)的浸軋-堆放回蘇法或間歇法。對于連續(xù)或不連續(xù)的浸軋-堆放回蘇法加工，酶的水溶液裝在浸泡池中，并當織物移過池時連續(xù)應用于織物，在此過程中織物通常吸收其重量0.5-1.5倍量的加工液。在間歇法操作中，將織物暴露于酶溶液，時間范圍是大約5分鐘-大約24小時，液體∶織物的比例是5∶1-50∶1。其它生物制備方法在本發(fā)明的某些實施方案中，將纖維素材料進行化學處理，諸如包括例如使用過氧化氫或其它氧化劑的漂白工藝或聯(lián)合精練/漂白工藝。酶對纖維素物質(zhì)的作用使得纖維對隨后的漂白步驟更有反應，導致變白應答增強。由此，本發(fā)明的方法能夠使用相同水平的漂白化學藥品產(chǎn)生更白的材料，或使用降低水平的漂白化學藥品產(chǎn)生相當水平的白度。其它成分在本發(fā)明的某些實施方案中，含熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶的水溶液還含其它成分，包括(但不限于)增強精練過程和/或提供涉及如漂白度、強度、對起球的抵抗力、水吸收性、和染色力的出眾效果的其它酶，以及表面活性劑、漂白劑、消泡劑、助洗劑系統(tǒng)、等等。
適用于本發(fā)明的酶包括(但不限于)(i)果膠消化酶合適的果膠消化酶(其中一些由它們根據(jù)國際生化和分子生物學學會(International Union of Biochemistry andMolecular Biology，IUBMB)1992年推薦的酶分類號鑒定)包括(但不限于)果膠降解酶，諸如果膠裂解酶(4.2.2.2)、果膠甲基酯酶、聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、和鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)(WO92/19728)；和半纖維素酶，諸如內(nèi)切阿拉伯聚糖酶(3.2.1.99，Rombouts等人，碳水化合物多聚體(Carb.Polymers)925，1988)、阿拉伯呋喃糖苷酶、內(nèi)切β-1，4-半乳聚糖酶、和內(nèi)切木聚糖酶(3.2.1.8)。
(ii)蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物、或微生物起源的蛋白酶，優(yōu)選微生物起源的酶。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。蛋白酶的范例包括氨肽酶脯氨酰氨肽酶(3.4.11.5)、X-pro氨肽酶(3.4.11.9)、細菌亮氨酰氨肽酶(3.4.11.10)、嗜熱氨肽酶(3.4.11.12)、賴氨酰氨肽酶(3.4.11.15)、色氨酰氨肽酶(3.4.11.17)、和甲硫氨酰氨肽酶(3.4.11.18)；絲氨酸內(nèi)肽酶糜蛋白酶(3.4.21.1)、胰蛋白酶(3.4.21.4)、cucumisin(3.4.21.25)、brachyurin(3.4.21.32)、cerevisin(3.4.21.48)、和枯草桿菌蛋白酶(3.4.21.62)；半胱氨酸內(nèi)肽酶木瓜蛋白酶(3.4.22.2)、ficain(3.4.22.3)、木瓜凝乳蛋白酶(3.4.22.6)、蘿藦蛋白酶(3.4.22.7)、actinidain(3.4.22.14)、caricain(3.4.22.30)、和ananain(3.4.22.31)；天冬氨酸內(nèi)肽酶胃蛋白酶A(3.4.23.1)、Aspergillopepsin(3.4.23.18)、Penicillopepsin(3.4.23.20)、和Saccharopepsin(3.4.23.25)；和金屬內(nèi)肽酶Bacillolysin(3.4.24.28)。
枯草桿菌蛋白酶的非限制性范例包括枯草桿菌蛋白酶BPN’、枯草桿菌蛋白酶amylosacchariticus、枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶mesentericopeptidase、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、thermitase、aqualysin、枯草桿菌PB92蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶TW7、和蛋白酶TW3。
可購買的蛋白酶包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(Novo Nordisk A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TM、和EN3TM(Genencor Internat ional Inc.)。
本發(fā)明的使用還涵蓋蛋白酶變體，諸如EP 130.756(Genentech)、EP 214.435(Henkel)、WO87/04461(Amgen)、WO87/05050(Genex)、EP 251.446(Genencor)、EP 260.105(Genencor)、Thomas等人(自然(Nature)318375-376，1985)、Thomas等人(分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)193803-813，1987)、Russel等人(自然(Nature)328496-500，1987)、WO88/08028(Genex)、WO88/08033(Amgen)、WO89/06279(Novo Nordisk A/S)、WO91/00345(Novo Nordisk A/S)、EP 525 610(Solvay)、和WO94/02618(Gist-Brocades N.V.)中公開的變體。
蛋白酶活性可以如《酶分析方法(Methods of EnzymaticAnalysis)》(第3版，1984，Verlag Chemie，Weinheim，第5卷)所述測定。
(iii)脂肪酶合適的脂肪酶(也稱為羧基酯水解酶)包括細菌或真菌起源的脂肪酶三?；视椭久?3.1.1.3)和磷脂酶A2(3.1.1.4)。用于本發(fā)明的脂肪酶包括(但不限于)來自腐質(zhì)霉屬(與Thermomyces同物異名)的脂肪酶，諸如來自H.lanuginose(T.lanuginosus)的脂肪酶(如EP 258 068和EP 305 216所述)，或來自H.insolens的脂肪酶(如WO96/13580所述)；假單胞菌(Pseudomonas)脂肪酶，諸如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌菌株SD 705(WO95/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌(Bacillus)脂肪酶，諸如來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(Dartois等人，生物化學和生物物理學學報(Biochem.Biophys.Acta)1131253-360，1993)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)、或短小芽孢桿菌(B.pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。其它范例是諸如WO92/05249、WO94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079、和WO97/07202中描述的脂肪酶變體。優(yōu)選的商業(yè)性脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM、LipozymeTM、PalataseTM、NovozymTM435、和LecitaseTM(都可以由Novo Nordisk A/S購買)。脂肪酶活性可以如《酶分析方法(Methods of Enzymatic Analysis)》(第3版，1984，Verlag Chemie，Weinheim，第4卷)所述測定。
優(yōu)選酶來源于嗜堿性微生物和/或在升高溫度展示酶活性。酶可以由起源細胞分離或可以重組產(chǎn)生，而且可以進行化學或基因修飾。通常，向水溶液中以大約0.0001％-大約1％(組成物質(zhì)量百分比)酶蛋白的水平摻入酶，更優(yōu)選大約0.001％-大約0.5％，最優(yōu)選0.01％-0.2％?？梢岳斫猓褂脗鹘y(tǒng)實驗可以容易的測定在本發(fā)明的方法中與特定熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶聯(lián)合使用的每種其它酶的酶活性單位的量。
適用于本發(fā)明實踐的表面活性劑包括(但不限于)非離子(美國專利號4,565,647)、陰離子、陽離子、和兩性離子表面活性劑(美國專利號3,929,678)，其存在的濃度通常是大約0.2％-大約15％(質(zhì)量百分比)，優(yōu)選大約1％-大約10％(質(zhì)量百分比)。陰離子表面活性劑包括(但不限于)直鏈烷基苯磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇磷酸鹽)、醇乙氧基硫酸鹽、仲烷烴磺酸鹽、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或鏈烯基琥珀酸、和皂。非離子表面活性劑包括(但不限于)醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺、和葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡萄糖酰胺”)。
助洗劑系統(tǒng)包括(但不限于)鋁硅酸鹽、硅酸鹽、聚羧酸鹽和脂肪酸、諸如乙二胺四乙酸鹽等物質(zhì)、和諸如氨基多膦酸鹽等金屬離子螯合劑，特別是乙二胺四亞甲基膦酸和二亞乙三胺五亞甲基膦酸，濃度是大約5％-大約80％(質(zhì)量百分比)，優(yōu)選大約5％-大約30％(質(zhì)量百分比)。
漂白系統(tǒng)可以包含H2O2來源，諸如過硼酸鹽或過碳酸鹽，它們可以與形成過氧酸的漂白激活劑(諸如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ趸交撬猁})聯(lián)合使用。或者，漂白系統(tǒng)可以包含如酰胺、二酰亞胺、或砜型過氧酸。
消泡劑包括(但不限于)硅樹脂(美國專利號3,933,672；DC-544(Dow Corning))，濃度通常是大約0.01％-大約1％(質(zhì)量百分比)。
組合物中還可以包含已知在本領域是傳統(tǒng)的污垢懸浮劑、污垢釋放劑、熒光增白劑、磨料、和/或殺菌劑。
下文意欲作為本發(fā)明的非限制性例示。
實施例實施例1熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶特性的測定下列方法用于果膠酸裂解酶活性的定性分析。1.果膠酸裂解酶實驗對于此實驗，在0.1M甘氨酸緩沖液(pHl0)中配制0.1％聚半乳糖醛酸鈉(Sigma P-1879)溶液。取4ml此溶液于40℃預熱5分鐘。然后，加入250μl酶(或酶稀釋液)，將反應體系在混和器上以最高速度混和10秒鐘，并于40℃或其它溫度溫育20分鐘，隨后測量235nm的吸光值使用1cm光路的0.5ml比色杯，在HP二極管陣列分光光度計上，在溫度控制的比色杯支架中，連續(xù)測量235nm的吸光值。對于穩(wěn)定狀態(tài)，將至少200秒的線性增加用于計算速率。
對于催化速率的計算，5.2A235/min的增加對應于lμmol未飽和產(chǎn)物的形成(Nasuna等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2415298-5306，1966；和Bartling等人，微生物學(Microbiology)141873-881，1995)。2.堿性APSU實驗APSU實驗測量當不加入鈣離子時，聚半乳糖醛酸溶液的粘度變化。將5％(w/v)聚半乳糖醛酸鈉(Sigma P-1879)溶于0.1M甘氨酸緩沖液(pH10)。取4ml此溶液于40℃預熱5分鐘。然后，加入250μl酶(或酶稀釋液)，將反應體系在混和器上以最高速度混和10秒鐘，并于40℃或其它溫度溫育20分鐘。
使用MIVI 600粘度計(Sofraser，45700 Villemandeur，法國)測量粘度。10秒鐘后以mV測量濃度。對于APSU單位的計算，使用下列標準曲線APSU/ml mV0.003004.002769.0024914.00 22719.00 20624.00 18834.00 17749.00 16399.01683.瓊脂實驗可以如下測量果膠酸裂解酶活性在含0.7％(w/v)聚半乳糖醛酸鈉(Sigma P-1879)的瓊脂平板(諸如LB瓊脂)上打出4mm孔，加入待測溶液后，于特定溫度(諸如75℃)溫育6小時。然后將平板(i)在lM CaCl2中浸泡0.5小時，或(ii)在1％混和烷基三甲基溴化銨(MTAB，Sigma M-7635)中浸泡1小時。這些步驟都能引起瓊脂中聚半乳糖醛酸鹽的沉淀。果膠酸裂解酶活性可以通過沉淀的聚半乳糖醛酸鹽背景中清晰區(qū)的出現(xiàn)而檢測。使用果膠酸裂解酶標準制劑的稀釋液標定實驗的靈敏度。實施例2用熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶處理棉織物進行下列實驗以評價熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶精練織物的使用。A.材料1)織物使用機織軍用粗梳棉緞坯布，質(zhì)量428R(242g/m2)。
2)儀器使用Labomat(Mathis，瑞士)，液體比例12.5∶1(12g織物150ml緩沖液/酶溶液)。
3)果膠酸裂解酶在實驗1中，使用對應于SEQ ID NOl的果膠酸裂解酶，其配制在含0.02M磷酸鹽緩沖液和0.4g/L非離子表面活性劑(Tergitol 15-S-12，Union Carbide)的溶液中。在實驗2中，使用對應于共同待審美國專利申請序列號09/073,684的SEQ ID NO2的果膠酸裂解酶，其配制在含0.05M磷酸鹽/硼酸鹽緩沖液、2.0g/L非離子表面活性劑(Tergitol 15-S-12，Union Carbide)、和1.0g/L潤濕劑(琥珀酸二辛酯磺酸鹽)的溶液中。B.步驟和結(jié)果在實驗1中，將待測織物與含果膠酸裂解酶的水溶液于溫度范圍60-80℃和pH范圍7-11內(nèi)接觸15分鐘，然后對殘余果膠定量。
圖1顯示了％殘余果膠作為pH和溫度函數(shù)的輪廓圖(等高線)，圖2顯示了作為酶劑量函數(shù)的％殘余果膠。對除去果膠的最佳pH是9.2，最佳溫度超過80℃。
在實驗2中，將待測織物與含果膠酸裂解酶的水溶液接觸，果膠酸裂解酶劑量是600APSU/kg棉，在滾筒系統(tǒng)中擠壓，給出85％的溶液得率，并于40-70℃溫育60分鐘，隨后對殘余果膠定量。下表顯示作為溫度函數(shù)的％殘余果膠。
此處提及的所有專利、專利申請、和參考文獻都完整引用作為參考。
本發(fā)明技術(shù)人員根據(jù)上文詳述的精神可以提出本發(fā)明的許多變化。這些明顯的變化屬于所附權(quán)利要求書的范圍。
序列表<110>Lange，Niels E.K.
Kongsbak，LarsSchulein，MartinBjornvad，Mads E.
Husain，Philip A.
<120>織物的高溫生物制備<130>5729.204-WO<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>335<212>PRT<213>bacillus sp.
<400> 1Met Arg Lys Leu Leu Ser Met Met Thr Ala Leu Val Leu Met Phe Gly1 5 10 15Ile Met Val Val Pro Ser Ile Ala Lys Gly Glu Ser Asp Ser Thr Met20 25 30Asn Ala Asp Phe Ser Met Gln Gly Phe Ala Thr Leu Asn Gly Gly Thr35 40 45Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gln Thr Val Thr Val Ser Thr Gly Asp Glu50 55 60Leu Leu Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ser Asn Thr Pro Leu Thr Ile65 70 75 80Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Pro Ser Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile85 90 95Asp Ile Lys Asp Val Asn Asp Val Ser Ile Leu Gly Val Gly Thr Gln100 105 110Gly Glu Phe Asn Gly Ile Gly Ile Lys Val Trp Arg Ala Asn Asn Ile115 120 125Ile Leu Arg Asn Leu Lys Ile His His Val Asn Thr Gly Asp Lys Asp130 135 140Ala Ile Ser Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn145 150 155 160Glu Leu Tyr Asn Ser Leu Asp Val His Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu165 170 175Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr180 185 190Val His Asp Ser Trp Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp195 200 205Ser Tyr Asn Arg Lys Ile Thr Phe His Asn Asn Tyr Phe Glu Asn Leu210 215 220Asn Ser Arg Val Pro Ser Ile Arg Phe Gly Glu Ala His Ile Phe Ser225 230 235 240Asn Tyr Tyr ASn Gly Ile Asn Glu Thr Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly245 250 255Ala Lys Val Arg Ile Glu Glu Asn Leu Phe Glu Arg Ala Asn Asn Pro260 265 270Ile Val Ser Arg Asp Ser Arg Gln Val Gly Tyr Trp His Leu Ile Asn275 280 285Asn His Phe Thr Gln Ser Thr Gly Glu Ile Pro Thr Thr Ser Thr Ile290 295 300Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Gln Ala Thr Pro Val Gly Gln Val305 310 315 320Lys Asp Val Val Arg Ala Asn Ala Gly Val Gly Lys Val Thr Pro325 330 33權(quán)利要求
1.處理纖維素纖維以除去非纖維素化合物的方法，該方法包括將所述纖維與具有熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶活性的酶在能夠除去纖維中果膠至少大約30％(質(zhì)量百分比)的條件下接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸是在超過大約70℃的溫度進行的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述接觸是在超過大約80℃的溫度進行的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸是在至少大約8的pH進行的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述接觸是在至少大約9的pH進行的。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶在超過大約70℃的溫度展示最大果膠酸裂解酶活性。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述酶在超過大約80℃的溫度展示最大果膠酸裂解酶活性。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶在超過大約8的pH展示最大果膠酸裂解酶活性。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述酶在超過大約9的pH展示最大果膠酸裂解酶活性。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶的果膠酸裂解酶活性不依賴二價陽離子的存在。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶的氨基酸序列包含與SEQ IDNO1的氨基酸序列具有至少70％同源性的序列。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO1的序列。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶由芽孢桿菌屬的種衍生。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述種選自地衣芽孢桿菌、B.agaradhaerens、嗜堿芽孢桿菌、類嗜堿芽孢桿菌、B.clarkii、耐鹽芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、B.clausii、和B.gibsonii。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述纖維包含織物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述織物是棉。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述非纖維素化合物選自由纖維衍生的化合物和由制造工藝衍生的化合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述由制造工藝衍生的化合物選自紡紗、絡筒和漿紗潤滑劑。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸能夠由纖維除去至少50％的果膠。
20.權(quán)利要求1的方法，其中進一步包括將所述纖維與一種或多種選自果膠降解酶、蛋白酶、和脂肪酶的酶接觸。
21.處理纖維素纖維以除去非纖維素化合物的方法，該方法包括在超過大約70℃的溫度，在能夠除去纖維中果膠至少大約30％(質(zhì)量百分比)的條件下，將所述纖維與具有果膠降解活性的酶接觸。
22.制備織物的方法，包括將所述織物同時或依次進行(i)精練和(ii)漂白，其中所述精練包括將所述織物與具有熱穩(wěn)定的果膠酸裂解酶活性的酶在能夠除去織物中果膠至少大約30％(質(zhì)量百分比)的條件下接觸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中進一步包括在所述精練和漂白步驟前將所述織物進行脫漿。
24.權(quán)利要求22的方法，其中進一步包括對所述織物進行染色。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述精練和漂白步驟同時進行。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過在與精煉和漂白技術(shù)兼容的條件下將纖維與果膠降解酶,優(yōu)選熱穩(wěn)定的、堿性的、不依賴二價陽離子的果膠酸裂解酶接觸而高溫生物制備纖維素纖維的方法。
文檔編號D06L3/11GK1342233SQ99813581
公開日2002年3月27日 申請日期1999年10月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月2日
發(fā)明者L·康斯巴克, M·舒萊恩, P·A·胡賽因, N·E·K·朗格, M·伯卓恩瓦德 申請人:諾沃奇梅茲北美公司, 諾沃奇梅茲有限公司