富含多不飽和脂肪酸的微生物油的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物油，在所述微生物油的成分中富含多不飽和脂肪酸、其酯、其酸鹽、由其形成的醇、和／或由其形成的醛。本發(fā)明還涉及包含富集的微生物油的組合物以及制備富集的微生物油的方法和使用富集的微生物油的方法。本發(fā)明還涉及分離的微生物以及菌株及其突變株、生物質(zhì)、微生物油、組合物和培養(yǎng)物；生產(chǎn)所述微生物油、生物質(zhì)和突變株的方法；以及使用所述分離的微生物、生物質(zhì)和微生物油的方法。
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[0003]發(fā)明背景
發(fā)明領域
[0004]本發(fā)明涉及富含多不飽和脂肪酸、其酯、其酸鹽、其醇和/或其醛的微生物油；包含富集的微生物油的組合物；以及制備富集的微生物油的方法和使用富集的微生物油的方法。
[0005]本發(fā)明涉及經(jīng)分離的微生物以及其菌株和突變株、生物質(zhì)、微生物油、組合物和培養(yǎng)物；生產(chǎn)微生物油、生物質(zhì)和突變株的方法；和使用經(jīng)分離微生物、生物質(zhì)、培養(yǎng)物和微生物油的方法。
【背景技術】
[0006]基于碳鏈的長度和飽和特征，將脂肪酸分類?；阪溨写嬖诘奶紨?shù)目，脂肪酸被稱為短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸；當碳原子之間不存在雙鍵時稱為飽和脂肪酸，當存在雙鍵時被稱為不飽和脂肪酸。當僅存在一個雙鍵時，不飽和長鏈脂肪酸是單不飽和的，當存在多于一個雙鍵時，是多不飽和的。
[0007]基于從脂肪酸的甲基端起第一個雙鍵的位置，將多不飽和脂肪酸(PUFAs)分類:ω-3(η-3)脂肪酸在第三個碳處含有第一個雙鍵，而ω_6(η_6)脂肪酸在第六個碳處含有第一個雙鍵。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是具有22個碳的鏈長度和6個雙鍵的ω-3長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，通常命名為“22:6η-3”。其他ω-3LC-PUFA包括命名為“20:5η-3”的二十碳五烯酸(“ΕΡΑ”)、命名為“22:5η_3”的ω-3 二十二碳五烯酸(“DPAη-3”)。DHA和EPA已被稱作“必需”脂肪酸。ω -6LC-PUFA包括命名為“20:4η_6”的花生四烯酸(“ARA”)和命名為“22:5η-6”的ω-6 二十二碳五烯酸(“DPAn-6”)。
[0008]由于位于細胞膜中，ω-3脂肪酸是影響細胞生理功能的重要的生物學分子，它能調(diào)節(jié)生物活性化合物的產(chǎn)生與基因表達，并起到生物合成底物的作用。Roche，H.Μ.，Proc.Nutr.Soc.58:397-401 (1999)。例如，DHA構(gòu)成人類大腦皮層中約15%至20%的脂質(zhì)，構(gòu)成視網(wǎng)膜中30%至60%的脂質(zhì)，在睪丸與精子中富集，并且是母乳中的一個重要組分。Berge, J.P.和 Barnathan, G..Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.96:49-125 (2005)。DHA 構(gòu)成腦中至多97%的ω-3脂肪酸，且構(gòu)成視網(wǎng)膜中至多93%的ω-3脂肪酸。此外，DHA是胎兒與嬰兒發(fā)育以及維持成人認知功能所必需的。(參考文獻同上)。因為在人體中無法從頭合成ω-3脂肪酸，因此這些脂肪酸必須從營養(yǎng)來源獲取。
[0009] 亞麻仁油與魚油被認為是良好的ω-3脂肪酸膳食來源。亞麻仁油不含有ΕΡΑ、DHA, DPA或AM’但卻含有亞麻酸(C18:3η_3)，其是使機體能夠制造EPA的一種構(gòu)建單元。然而有證據(jù)顯示代謝轉(zhuǎn)換的速率可以是緩慢且多變的，特別在健康不佳的那些個體中。根據(jù)具體的物種及其飲食，魚油在脂肪酸組成的類型與水平方面存在顯著的差異。例如，與野生魚類相比，水產(chǎn)養(yǎng)殖所飼養(yǎng)的魚的ω-3脂肪酸水平較低。此外，魚油具有含環(huán)境污染物的風險，并且可能與穩(wěn)定性問題和魚的腥臭或味道有關。
[0010]破囊壺菌(Thraustochytrids)是破囊壺菌目(Thraustochytriales)的微生物。破囊壺菌包括裂殖壺菌屬(Schizochytrium)與破囊壺菌屬(Thraustochytrium)的成員，并且已經(jīng)確認為包括DHA與EPA在內(nèi)的ω-3脂肪酸的一種替代來源。參見第5130242號美國專利。與相應的魚油或微藻油相比，由這些海生異養(yǎng)型微生物所生產(chǎn)的油通常具有更簡單的多元不飽和脂肪酸分布。Lewis，Τ.Ε.，Mar.Biotechnol.1:580-587 (1999)。已報導破囊壺菌種的菌株所生產(chǎn)的ω-3脂肪酸，在該生物體所生產(chǎn)的總脂肪酸中占很高的百分比。第 5130242 號美國專利；Huang，J.等的 J.Am.0il.Chem.Soc.78:605-610 (2001) ；Huang,J.等的Mar.Biotechnol.5 =450-457(2003)。然而，分離的破囊壺菌在所生產(chǎn)的LC-PUFAs的種類和量方面不同，這使得一些先前所述的菌株在培養(yǎng)中可能具有不期望的ω-6脂肪酸水平和/或會表現(xiàn)低的生產(chǎn)力。因此，一直存在對展現(xiàn)出高生產(chǎn)力和所期望的LC-PUFA譜的微生物的分離的需求。
[0011]此外，對與前述微生物油中存在的相比包含較高濃度下列物質(zhì)的富集的微生物油的需求得不到滿足，所述物質(zhì)為多不飽和脂肪酸、其酯、其醛、其酸鹽、和/或其醇。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明涉及富集的微生物油，其包含至少70重量％的DHA與EPA的組合，其中此油包含至少10重量％的ΕΡΑ。在一些實施方式中，本發(fā)明的油包含至少50重量％的DHA和至少20重量％的ΕΡΑ。在一些實施方式中，本發(fā)明的油包含甘油三酯組分，其中在甘油三酯組分中至少50重量％的脂肪酸為DHA，并且在甘油三酯組分中至少20重量％的脂肪酸為ΕΡΑ。在一些實施方式中，DHA和EPA是以酯形式存在的。例如，DHA和EPA的酯可以是乙基酷。
[0014]本發(fā)明涉及包含至少30重量％ EPA的富集的微生物油。在一些實施方式中，本發(fā)明的油包含甘油三酯組分，其中在甘油三酯組分中至少30重量％的脂肪酸是ΕΡΑ。在一些實施方式中，EPA是以酯形式存在的。例如，EPA的酯可以是乙基酯。
[0015]本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的富集的微生物油的食物、補充劑、藥物組合物。藥物組合物可以包含藥學上可接受的載劑。
[0016]在一些實施方式中，富集的微生物油是從裂殖壺菌屬物種的經(jīng)分離的微生物中可以獲得的。
[0017]在一些實施方式中，本發(fā)明的油是從以ATCC登錄號ΡΤΑ-10208所保藏物種的經(jīng)分離的微生物中可以獲得的，其中微生物所產(chǎn)生的總脂肪酸包含大于10重量％的ΕΡΑ。
[0018]在一些實施方式中，本發(fā)明的油是從具有以ATCC登錄號ΡΤΑ-10208所保藏的物種的特征的經(jīng)分離的微生物中可以獲得的，其中微生物所產(chǎn)生的總脂肪酸包含大于約10重量％的EPA。
[0019]在一些實施方式中，本發(fā)明的油是從產(chǎn)生甘油三酯組分的經(jīng)分離的微生物中可以獲得的，其中甘油三酯組分的EPA含量為至少約12重量％。
[0020]在一些實施方式中，本發(fā)明的油是從以ATCC登錄號ΡΤΑ-10208所保藏的經(jīng)分離的微生物中可以獲得的。[0021]在一些實施方式中，本發(fā)明的油是從以ATCC登錄號PTA-10209所保藏的經(jīng)分離的微生物中可以獲得的。
[0022]在一些實施方式中，本發(fā)明的油是從以ATCC登錄號PTA-10210所保藏的經(jīng)分離的微生物中可以獲得的。
[0023]在一些實施方式中，本發(fā)明的油是從以ATCC登錄號PTA-10211所保藏的經(jīng)分離的微生物中可以獲得的。
[0024]本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的富集的微生物油的口服劑型。在一些實施方式中，口服劑型包含IOOmg至3000mg的ω-3多不飽和脂肪酸。在一些實施方式中，口服劑型包含500mg至1000mg的DHA與EPA的組合。在一些實施方式中，口服劑型是膠囊。在一些實施方式中，口服劑型是素食膠囊(vegetarian capsule)。
[0025]本發(fā)明涉及用于在有需要的個體中治療心臟病或與其相關的狀況的方法，其包括給個體施用本發(fā)明的油或本發(fā)明的油的混合物以及藥學上可接受的載劑。
[0026]本發(fā)明涉及本發(fā)明的油或本發(fā)明的油的混合物用于制造治療心臟病或與其相關的狀況的藥物的用途。
[0027]本發(fā)明涉及本發(fā)明的油或本發(fā)明的油的混合物用于制造改善心臟狀況或與其相關的狀況、或維持健康心臟狀 況或與其相關的狀況的補充劑的用途。
[0028]本發(fā)明涉及由微生物的生物質(zhì)生產(chǎn)本發(fā)明的富集的微生物油的方法，其包括以下步驟:a)在醇和堿存在下加熱并使生物質(zhì)反應，從而由生物質(zhì)產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的酯；b)將生物質(zhì)分離到富含多不飽和脂肪酸的基本上為液體的相中和基本上為固體的相中；并且c)通過回收含有多不飽和脂肪酸的酯的組分來純化基本上為液體的相。
[0029]在一些實施方式中，微生物是裂殖壺菌屬物種的分離的微生物。
[0030]在一些實施方式中，微生物是以ATCC登錄號PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211 所保藏的種及其突變菌株或其混合物的分離的微生物中的任意一種。
[0031]在一些實施方式中，加熱步驟a)是在從約80°C至100°C下進行的。
[0032]在一些實施方式中，加熱步驟a)是在90°C下進行的。
[0033]在一些實施方式中，堿是氫氧化鉀。
[0034]在一些實施方式中，醇是乙醇。
[0035]在一些實施方式中，酯是多不飽和脂肪酸的乙基酯。
[0036]在一些實施方式中，多不飽和脂肪酸是DHA與EPA的組合。
[0037]在一些實施方式中，分離步驟b)是通過離心或過濾來進行的。
[0038]在一些實施方式中，純化步驟c)是通過在乙醇中尿素包合結(jié)晶法來進行的。
[0039]在一些實施方式中，純化步驟c)是通過真空分子分餾來進行的。
[0040]本發(fā)明涉及以ATCC登錄號PTA-10212所保藏物種的經(jīng)分離的微生物。
[0041]本發(fā)明涉及具有以ATCC登錄號PTA-10212所保藏物種的特征的經(jīng)分離的微生物。
[0042]本發(fā)明涉及包含下述18s rRNA的經(jīng)分離的微生物，所述18s rRNA包含SEQ ID NO:I多核苷酸序列或與SEQ ID NO:1具有至少94%同一性的多核苷酸序列。
[0043]本發(fā)明涉及包含下述18s rRNA多核苷酸序列的經(jīng)分離的微生物，所述18s rRNA多核苷酸序列與以ATCC登錄號PTA-10212所保藏的微生物的18s rRNA多核苷酸序列具有至少94%同一性。
[0044]本發(fā)明涉及以ATCC登錄號ΡΤΑ-10208所保藏物種的經(jīng)分離的微生物，其中由微生物生產(chǎn)的總脂肪酸包含超過約10重量％的二十碳五烯酸。
[0045]本發(fā)明涉及具有以ATCC登錄號ΡΤΑ-10208所保藏物種的特征的經(jīng)分離的微生物，其中由微生物生產(chǎn)的總脂肪酸包含超過約10重量％ 二十碳五烯酸。
[0046]本發(fā)明涉及生產(chǎn)甘油三酯組分的經(jīng)分離的微生物，其中甘油三酯組分的二十碳五烯酸含量為至少約12重量％。
[0047]在一些實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物是突變菌株。
[0048]本發(fā)明涉及以ATCC 登錄號 PTA-10212、ΡΤΑ-10213、ΡΤΑ-10214、ΡΤΑ-10215、ΡΤΑ-10208、ΡΤΑ-10209、ΡΤΑ-10210 或 ΡΤΑ-10211 所保藏的經(jīng)分離的微生物。
[0049]本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的微生物的任一種或其混合物的生物質(zhì)。
[0050]本發(fā)明涉及分離的生物質(zhì)，其中至少約20重量％生物質(zhì)細胞干重是脂肪酸，其中超過約10重量％的脂肪酸是二十碳五烯酸，且其中脂肪酸包含各低于約5重量％的花生四烯酸和二十二碳五烯酸η-6。在一些實施方式中，至少約25重量％的脂肪酸是二十二碳六烯酸。
[0051]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及包含甘油三酯的分離的生物質(zhì)，其中至少約12重量％的甘油三酯是二十 碳五烯酸。
[0052]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的分離的生物質(zhì)的任何一種，其中脂肪酸還包含各低于約5重量％的油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳烯酸和芥酸。
[0053]本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的微生物的任一種或其混合物的分離的培養(yǎng)物。
[0054]本發(fā)明涉及用于非人類動物或人類的包含本發(fā)明的微生物或生物質(zhì)的任一種或其混合物的食用產(chǎn)品、化妝品或藥物組合物。
[0055]本發(fā)明涉及下述微生物油，所述微生物油包含至少約20重量％的二十碳五烯酸和各低于約5重量％的花生四烯酸、二十二碳五烯酸η-6、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳烯酸、芥酸和十八碳四烯酸。在一些實施方式中，微生物油還包含至少約25重量％的二十二碳六烯酸。
[0056]發(fā)明涉及下述微生物油，所述微生物油包含至少約10重量％的甘油三酯組分，其中甘油三酯組分中至少約12重量％的脂肪酸是二十碳五烯酸，其中甘油三酯組分中至少約25重量％的脂肪酸是二十二碳六烯酸，和其中甘油三酯組分中低于約5重量％的脂肪酸是花生四烯酸。
[0057]本發(fā)明涉及用于非人類動物或人類的包含本發(fā)明的微生物油的任一種的食用產(chǎn)品、化妝品或藥物組合物。在一些實施方式中，食用產(chǎn)品是嬰幼兒配方奶粉。在一些實施方式中，嬰幼兒配方奶粉適于早產(chǎn)兒。在一些實施方式中，食用產(chǎn)品是牛奶、飲料、治療性飲品、營養(yǎng)飲品或其組合。在一些實施方式中，食用產(chǎn)品是非人類動物或人類產(chǎn)品的添加劑。在一些實施方式中，食用產(chǎn)品是營養(yǎng)補充劑。在一些實施方式中，食用產(chǎn)品是動物飼料。在一些實施方式中，動物飼料是水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。在一些實施方式中，動物飼料是家養(yǎng)動物飼料、動物園動物飼料、耕畜飼料、家畜飼料或其組合。
[0058]本發(fā)明涉及生產(chǎn)包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括:在培養(yǎng)物中培養(yǎng)本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物的任一種或其混合物，以生產(chǎn)包含ω-3脂肪酸的油。在一些實施方式中，所述方法還包括提取(extracting,萃取)油。
[0059]本發(fā)明涉及生產(chǎn)包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括從本發(fā)明的生物質(zhì)的任一種中提取包含ω-3脂肪酸的油。在一些實施方式中，使用有機溶劑提取方法(例如己烷提取)來提取微生物油。在一些實施方式中，使用無溶劑提取方法來提取微生物油。
[0060]本發(fā)明涉及由本發(fā)明的方法生產(chǎn)的微生物油。
[0061]本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)本發(fā)明的生物質(zhì)的方法，其包括:在培養(yǎng)物中培養(yǎng)本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物的任一種或其混合物，以生產(chǎn)生物質(zhì)。
[0062]本發(fā)明涉及由本發(fā)明的方法生產(chǎn)的生物質(zhì)。
[0063]本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)本發(fā)明的突變菌株的方法，其包括:對本發(fā)明的微生物的任一種進行誘變處理，并分離突變菌株。
[0064]本發(fā)明涉及本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物、生物質(zhì)或微生物油的任一種或其混合物用于制造治療炎癥或其相關狀況的藥物的用途。
[0065]本發(fā)明涉及本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物、生物質(zhì)或微生物油的任一種或其混合物用于治療炎癥或其相關狀況的用途。
[0066]本發(fā)明涉及用于治療炎癥或其相關狀況的本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物、生物質(zhì)或微生物油的任一種或其混合物。
[0067]本發(fā)明涉及用于治療有需要的個體的炎癥或其相關狀況的方法，其包括給個體施用本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物、生物質(zhì)或微生物油的任一種或其混合物和藥學上可接受的載劑。
[0068]附圖簡要說明
[0069]圖1是根據(jù)本發(fā)明的生物質(zhì)分離方法和微生物油富集方法的示例性實施方式的示意圖。
[0070]發(fā)明詳述
[0071]本發(fā)明涉及經(jīng)分離的微生物以及其菌株和突變株，以及其生物質(zhì)、微生物油、組合物和培養(yǎng)物。本發(fā)明涉及從本發(fā)明的微生物生產(chǎn)微生物油、生物質(zhì)和突變株的方法和使用微生物、生物質(zhì)和微生物油的方法。本文描述的微生物是高生產(chǎn)力的并產(chǎn)生獨特的脂肪酸分布，所述脂肪酸分布的部分特征為高水平的ω-3脂肪酸、尤其是高水平的ΕΡΑ。
[0072]微生物
[0073]本發(fā)明涉及經(jīng)分離的微生物及由其所衍生的菌株。由本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物所“衍生”的菌株可以是天然衍生的或人工衍生的，比如突變株、變異株或重組菌株。本文中使用時，術語“分離的”并不一定反映分離物已被純化的程度，而是指從天然形式或天然環(huán)境中分離或隔離。分離物可包括但不限于分離的微生物、分離的生物質(zhì)、分離的培養(yǎng)物、分離的微生物油及分離的序列(比如本文中所公開的分離的多核苷酸序列)。本文中使用時，術語“微生物”包括但不限于術語“微藻”、“破囊壺菌”及與本文中所述的任一種保藏微生物相關的分類學分類。與本發(fā)明的任一種微生物(包括本文中所述的保藏微生物)相關時所用的術語“破囊壺菌目” (“Thraustochytriales”)、“破囊壺菌” (“thraustochytrid”)、“裂殖壺菌屬”(“Schizochytrium”)及“破囊壺菌屬”(“Thraustochytrium”)基于囊括可獲得的系譜信息的當前分類學分類，并且在本申請的申請日后修訂分類學分類的情況下不意圖起限制作用。
[0074]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號PTA-10212所保藏物種的經(jīng)分離的微生物。與ATCC登錄號PTA-10212相關的分離的微生物在本文中也稱為破囊壺菌屬物種(Thraustochytrium sp.)ATCC PTA-10212。與 ATCC 登錄號 PTA-10212 相關的經(jīng)分離的微生物按照布達佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美國維吉尼亞州 20110-2209 馬納沙斯(Manassas)大學大道(University Boulevard) 10801 號的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(PatentDepository)。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號PTA-10212所保藏的經(jīng)分離的菌株。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號PTA-10212所保藏的經(jīng)分離的菌株。
[0075]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及具有以ATCC登錄號PTA-10212所保藏物種的特征的經(jīng)分離的微生物或由其所衍生的菌株。以ATCC登錄號PTA-10212所保藏物種的特征可以包括其生長性質(zhì)與表型性質(zhì)(表型性質(zhì)的例子包括形態(tài)學性質(zhì)和繁殖性質(zhì))、其物理性質(zhì)和化學性質(zhì)(比如干重和脂質(zhì)譜)、其基因序列及其組合，其中所述特征使這些種區(qū)別于先前鑒定過的種。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及具有以ATCC登錄號PTA-10212保藏物種的特征的經(jīng)分離的微生物，其中所述特征包括:包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或與SEQ IDNO:1的同一性為至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核苷酸序列的18s rRNA,以ATCC登錄號PTA-10212保藏物種的形態(tài)學性質(zhì)與繁殖性質(zhì)，以及以ATCC登錄號PTA-10212保藏物種的脂肪酸分布。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的微生物具有與以ATCC登錄號PTA-10212保藏的微生物基本相同的生長特征。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的微生物具有與以ATCC登錄號PTA-10212保藏的微生物基本相同的生長性質(zhì)。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的微生物，其包含具有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或與SEQ ID NO:1的同一性為至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核苷酸序列的18s rRNA。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的微生物，其包含與以ATCC登錄號PTA-10212保藏的微生物的18s rRNA多核苷酸序列的同一性為至少94%的18s rRNA多核苷酸序列。
[0076]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號PTA-10212所保藏的微生物的突變菌株。在進一步的實施方式中，該突變菌株是以ATCC登錄號PTA-10213、PTA-10214或PTA-10215所保藏的菌株。與ATCC登錄號PTA-10213、PTA-10214及PTA-10215相關的微生物按照布達佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美國維吉尼亞州 20110-2209 馬納沙斯(Manassas)大學大道(University Boulevard) 10801 號的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(PatentDepository)。
[0077]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號ΡΤΑ-10208所保藏物種的經(jīng)分離的微生物。與ATCC登錄號ΡΤΑ-10208相關的分離的微生物在本文中也稱為裂殖壺菌屬種(Schizochytrium sp)ATCC ΡΤΑ-10208。與 ATCC 登錄號 ΡΤΑ-10208 相關的微生物按照布達佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美國維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學大道(University Boulevard) 10801號的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Cul ture Collection)的專利保藏庫(Patent Depository)。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號ΡΤΑ-10208所保藏的經(jīng)分離的菌株。
[0078]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號ΡΤΑ-10208所保藏物種的經(jīng)分離的微生物，其中由微生物生產(chǎn)的總脂肪酸包含超過約10重量％、超過約11重量％、超過約12重量％、超過約13重量％、超過約14重量％、超過約15重量％、超過約16重量％、超過約17重量％、超過約18重量％、超過約19重量％或超過約20重量％的EPA。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號PTA-10208保藏物種的經(jīng)分離的微生物，其中由微生物生產(chǎn)的總脂肪酸包含約10重量％至約55重量％、約10重量％至約50重量％、約10重量％至約45重量％、約10重量％至約40重量％、約10重量％至約35重量％、約10重量％至約30重量％、約15重量％至約55重量％、約15重量％至約50重量％、約15重量％至約45重量％、約15重量％至約40重量％、約15重量％至約35重量％、約15重量％至約30重量％、約20重量％至約55重量％、約20重量％至約50重量％、約20重量％至約45重量％、約20重量％至約40重量％、約20重量％至約35重量％或約20重量％至約30重量％的EPA。
[0079]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及具有以ATCC登錄號PTA-10208所保藏物種的特征的經(jīng)分離的微生物，其中由微生物生產(chǎn)的總脂肪酸包含以重量計超過約10%的二十碳五烯酸。以ATCC登錄號PTA-10208所保藏的微生物的特征包括其生長性質(zhì)與表型性質(zhì)(表型性質(zhì)的例子包括形態(tài)學性質(zhì)和繁殖性質(zhì))、其物理性質(zhì)和化學性質(zhì)(比如干重和脂質(zhì)譜)、其基因序列及其組合，其中所述特征使這些種區(qū)別于先前鑒定過的種。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及具有以ATCC登錄號PTA-10212所保藏物種的特征的經(jīng)分離的微生物，其中所述特征包括:包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列的18s rRNA，以ATCC登錄號PTA-10208所保藏物種的形態(tài)學性質(zhì)與繁殖性質(zhì)，以及以ATCC登錄號PTA-10208所保藏物種的脂肪酸分布。在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的微生物具有與以ATCC登錄號PTA-10208所保藏的那些微生物基本相同的物理和化學性質(zhì)。 [0080]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及以ATCC登錄號PTA-10208所保藏的微生物的突變菌株。在進一步的實施方式中，該突變菌株是以ATCC登錄號PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211所保藏的菌株。與ATCC登錄號PTA-10209、PTA-10210和PTA-10211相關的微生物按照布達佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年9月25日保藏于美國維吉尼亞州 20110-2209 馬納沙斯(Manassas)大學大道(University Boulevard) 10801 號的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(PatentDepository)。
[0081]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)甘油三酯組分的本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物，其中甘油三酯組分的EPA含量為至少約12重量％、至少約13重量％、至少約14重量％、至少約15重量％、至少約16重量％、至少約17重量％、至少約18重量％、至少約19重量％或至少約20重量％。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)甘油三酯組分的經(jīng)分離的微生物，其中甘油三酯組分的EPA含量為約12重量％至約55重量％、約12重量％至約50重量％、約12重量％至約45重量％、約12重量％至約40重量％、約12重量％至約35重量％、約12重量％至約30重量％、約15重量％至約45重量％、約15重量％至約40重量％、約15重量％至約35重量％、約15重量％至約30重量％或約20重量％至約30重量％。
[0082]在一些實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)甘油三酯組分的本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物的突變株、變異株或重組菌株，其中甘油三酯組分的EPA含量為至少約10重量％、至少約11重量％、至少約12重量％、至少約13重量％、至少約14重量％、至少約15重量％、至少約16重量％、至少約17重量％、至少約18重量％、至少約19重量％或至少約20重量％。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)甘油三酯組分的本發(fā)明的經(jīng)分離的微生物的突變株、變異株或重組株，其中甘油三酯組分的EPA含量為約12重量％至約55重量％、約12重量％至約50重量％、約12重量％至約45重量％、約12重量％至約40重量％、約12重量％至約35重量％、約12重量％至約30重量％、約15重量％至約55重量％、約15重量％至約50重量％、約15重量％至約45重量％、約15重量％至約40重量％、約15重量％至約35重量％、約15重量％至約30重量％、約20重量％至約55重量％、約20重量％至約50重量％、約20重量％至約45重量％、約20重量％至約40重量％、約20重量％至約35重量％或約20重量％至約30重量％。可以通過公知的程序來產(chǎn)生突變菌株。常用的程序包括輻射、高溫處理及用誘突變劑處理。變異菌株可以是本文中所述物種的其它天然存在的分離株和/或亞分離株?？梢酝ㄟ^分子生物學中用于表達外源基因或改變內(nèi)源基因的功能或表達的任何公知的方法來產(chǎn)生重組菌株。在一些實施方式中，突變株、變異株或重組菌株比野生型菌株生產(chǎn)更高量的ω-3脂肪酸(特別是EPA)。在一些實施方式中，突變株、變異株或重組菌株生產(chǎn)較低量的一種或多種脂肪酸，比如較低量的DHA、ARA、DPA η-6或其組合。在一些實施方式中，突變株、變異株或重組菌株比野生型菌株每升培養(yǎng)物產(chǎn)生更大的細胞干重。這種突變株、變異株或重組菌株是由本發(fā)明的分離的微生物所衍生的菌株的例子。
[0083]在一些實施方式中，本發(fā)明的分離的微生物(包括其突變株、變異株或重組株)在由該微生物所分離的一種或多種組分中包含脂肪酸分布。由該微生物所分離的一種或多種組分包括總脂肪酸組分、固醇酯組分、甘油三酯組分、游離脂肪酸組分、固醇組分、甘油二酯組分、極性組分(包括磷脂組分)及其組合。特 定組分的脂肪酸分布可包括與本文中所公開的特定組分相關聯(lián)的任一種脂肪酸分布。
[0084]本發(fā)明涉及生產(chǎn)突變株的方法，其包括對本發(fā)明的任一種微生物進行誘變處理并分離突變菌株。
[0085]培養(yǎng)物和分離的生物質(zhì)
[0086]本發(fā)明涉及下述培養(yǎng)物，其包含本發(fā)明的一種或多種分離的微生物。用于接種、生長和回收微生物區(qū)系(比如微藻與破囊壺菌)的各種發(fā)酵參數(shù)在本領域中是已知的。見美國專利N0.5130242，所述參考文獻以其整體通過引用并入本文。液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基可以含有天然海水或人造海水。供異養(yǎng)型生長的碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、海藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪、油、甘油、乙酸鈉和甘露糖醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母提取物、聚蛋白胨、麥芽提取物、肉提取物、酪蛋白胺基酸、玉米浸液、有機氮源、谷氨酸鈉、尿素、無機氮源、乙酸銨、硫酸銨、氯化銨及硝酸銨。
[0087]用于培養(yǎng)以ATCC登錄號PTA-10212所保藏的微生物的典型培養(yǎng)基示于表1中:
[0088]表1:PTA-10212器皿培養(yǎng)基
[0089]成分ESMM
Na2SO4 g/L31.0()-5()、15-45 或 25-35
NaCl g/L0.6250-25、0.l-tO-?ic 0.5-5
KCl g/L〗.()0-5、0.25-3 if 0.5-2
MgSO4-7H20 g/L5.0(HO、2-8 成 3-6
(NH4)2SO4 g/L0.44(HO、0.25-5 -? 0.05-3
MSG-1H2O g/L6.00-10、4-8 成 5-7
CaCl2 g/L0.290.1-5、0.15-3 或 0.2-1
T 154(醉母提取物) g/L6.00-20, 0.1-10 mJc 1-7
KH2PO4 g/L0.80.1-10, 0.5-5 ?Ε 0.6-1.8
rtii(滅丨爾后(ΦΜ)
檸橡酸 mg/L3,50.1-5000、10-3000 或 3-2500
[0090]
FeSO4-TH2O mg/L10.300.1-10?, 1-50 成 5-25
MnCl2*4II2O mg/L3.100.1-10?, 1-5()1? 2-25
/nS{)4-7II2C) mg/L3.100.01-100, 1-50 成 2-25
CoCI2.6H2() mg/L0.040-1、0.001 -0.1 成 0.01 -0.1
Na2MoO4-1II2O mg/L0.040.001-K 0.005-0.5 ?K 0.01-0.1
CuSO4-SII2O mg/L2.070.1-100, 0.5-50?.! 1-25
NiS04-6H2C) mg/L2.070.1-100, 0.5-50t?K 1-25
AIK火.丨 ?Μι?)
硫胺素 mg/L9.750.1-100、丨-50 成 5-25
維卞泰 BI2 mg/L0.160.01-100, 0,05-5 成 0.1-1
CaH-泛 _ mg/1.2,060.1-100、0.1-50 或 1-】O
屮物桌 mg/L3.210.1 -100、0.1 -50 成 1-10
MJiicWln.......Lili—
甘油 g/L30.05-150、10-100 或 20-50
lit進料:
成分?jt
MSG-1H2O g/L170-150, I O-1 OOii 15-50
[0091]典型的培養(yǎng)條件包括下述條件:
[0092]
pl I約 6.5-約 9.5、約 6.5-約 8.0、成約 6,8-約 7.8;
IiJfc約15-約30 m氏度、約18-約28 M氏度、成約2丨至約23扱氏度
溶解氧；約0.1 -約100%飽#11度、約5-約50%飽和度、或約I O-約3 0%飽#11
度；和域
將甘油控在: 約5-約50 g/L、約I O-約40 g/L、或約15-約35 g/L β
[0093]在一些實施方式中，以ATCC登錄號PTA-10212所保藏的微生物或其突變株、變異株或重組株在作為碳源的甘油上異養(yǎng)地生長，而在作為碳源的葡萄糖上不生長。[0094]用于培養(yǎng)以ATCC登錄號ΡΤΑ-10208所保藏的微生物的典型的培養(yǎng)基在表2中示出:
[0095]表2:ΡΤΑ-10208器皿培養(yǎng)基
[0096]
【權(quán)利要求】
1.富集的微生物油，其包含至少70重量％的DHA與EPA的組合，其中所述油包含至少10重量％的EPA。
2.如權(quán)利要求1所述的油，其包含至少50重量％的DHA和至少20重量％的EPA。
3.如權(quán)利要求1所述的油，其中所述油包含甘油三酯組分，并且其中在所述甘油三酯組分中至少50重量％的脂肪酸是DHA，并且在所述甘油三酯組分中至少20重量％的脂肪酸是 EPA。
4.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的油，其中所述DHA和所述EPA是以酯形式存在的。
5.如權(quán)利要求4所述的油，其中DHA酯和EPA酯是乙基酯。
6.富集的微生物油，其包含至少30重量％的EPA。
7.如權(quán)利要求6所述的油，其中所述油包含甘油三酯組分，并且其中在所述甘油三酯組分中至少30重量％的脂肪酸是EPA。
8.如權(quán)利要求6或7所述的油，其中所述EPA是以酯形式存在的。
9.如權(quán)利要求8所述的油，其中EPA酯是乙基酯。
10.如前面權(quán)利要求中任意一項所述的油，其中所述油是從裂殖壺菌屬物種的分離的微生物中可以獲得的。
11.如權(quán)利要求1-9 中任意一項所述的油，其為從以ATCC登錄號PTA-10208保藏的物種的分離的微生物中可以獲得的，其中所述微生物所產(chǎn)生的總脂肪酸包含超過10重量％的 EPA。
12.如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的油，其為從具有以ATCC登錄號PTA-10208保藏的物種的特征的分離的微生物中可以獲得的，其中所述微生物所產(chǎn)生的總脂肪酸包含超過約10重量^^^EPA。
13.如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的油，其為從產(chǎn)生甘油三酯組分的分離的微生物中可以獲得的，其中所述甘油三酯組分的EPA含量為至少約12重量％。
14.如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的油，其為從以ATCC登錄號PTC-10208保藏的分離的微生物中可以獲得的。
15.如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的油，其為從以ATCC登錄號PTC-10209保藏的分離的微生物中可以獲得的。
16.如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的油，其為從以ATCC登錄號PTC-10210保藏的分離的微生物中可以獲得的。
17.如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的油，其為從以ATCC登錄號PTC-10211保藏的分離的微生物中可以獲得的。
18.食物，其包含如權(quán)利要求1-17中任意一項所述的油。
19.補充劑，其包含如權(quán)利要求1-17中任意一項所述的油。
20.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1-17中任意一項所述的油和藥學上可接受的載劑。
21.口服劑型，其包含如權(quán)利要求1-17中任意一項所述的油。
22.如權(quán)利要求21所述的口服劑型，其包含IOOmg至3000mg的ω-3多不飽和脂肪酸。
23.如權(quán)利要求22所述的口服劑型，其包含500mg至1000mg的DHA與EPA的組合。
24.如權(quán)利要求21所述的口服劑型，其中所述口服劑型為膠囊。
25.如權(quán)利要求21所述的口服劑型，其中所述口服劑型為素食膠囊。
26.用于在有需要的個體中治療心臟病或與其相關的狀況的方法，其包括給個體施用如權(quán)利要求1-17中任意一項所述的油或其混合物以及藥學上可接受的載劑。
27.如權(quán)利要求1-17中任意一項所述的油或其混合物用于制造治療心臟病或與其相關的狀況的藥物的用途。
28.如權(quán)利要求1-17中任意一項所述的油或其混合物用于制造改善心臟狀況或與其相關的狀況、或者維持健康心臟狀況或與其相關的狀況的補充劑的用途。
29.由微生物的生物質(zhì)生產(chǎn)如權(quán)利要求1或6所述的富集的微生物油的方法，其包含: a)在醇和堿存在下加熱并使所述生物質(zhì)反應，從而由所述生物質(zhì)產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的酷； b)將所述生物質(zhì)分離到富含多不飽和脂肪酸的基本上為液體的相中和基本上為固體的相中；并且 c)通過回收含有多不飽和脂肪酸的酯的組分來純化所述基本上為液體的相。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述微生物為裂殖壺菌屬物種的分離的微生物。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述微生物為以ATCC登錄號PTA-10212、PTA-10213、PTA-102 14、PTA-10215、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211 所保藏的種的分離的微生物中的任意一種，及其突變菌株或其混合物。
32.如權(quán)利要求29-31中任意一項所述的方法，其中所述加熱步驟a)是在從約80°C至100°C下進行的。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述加熱步驟a)是在90°C下進行的。
34.如權(quán)利要求29-33中任意一項所述的方法，其中所述堿是氫氧化鉀。
35.如權(quán)利要求29-34中任意一項所述的方法，其中所述醇是乙醇。
36.如權(quán)利要求29-35中任意一項所述的方法，其中所述酯是多不飽和脂肪酸的乙基酯。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述多不飽和脂肪酸是DHA與EPA的組合。
38.如權(quán)利要求29-37中任意一項所述的方法，其中所述分離步驟b)是通過離心或過濾來進行的。
39.如權(quán)利要求29-38中任意一項所述的方法，其中所述純化步驟c)是通過在乙醇中尿素包合結(jié)晶法來進行的。
40.如權(quán)利要求29-38中任意一項所述的方法，其中所述純化步驟c)是通過真空分子分餾來進行的。
【文檔編號】A61K31/202GK104011218SQ201280042656
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月21日
【發(fā)明者】克里希納·拉曼 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司