專利名稱：新的腫瘤阻抑基因的制作方法
本申請是1993年12月20日遞交的序號為U.S.08/170,586的申請的部分續(xù)申請，該申請的內(nèi)容作為本發(fā)明的參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明屬于腫瘤阻抑基因(抗—癌基因)領(lǐng)域，并且總的來說涉及實(shí)施針對各種人癌癥的廣譜腫瘤阻抑基因治療法所用的產(chǎn)品和方法。特別是本發(fā)明涉及治療腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括(1)以含有為本文中稱作為H-NUC的新的蛋白質(zhì)編碼的核酸序列的載體給藥或者(2)以有效量的由該核酸序列編碼的蛋白質(zhì)給藥。
在美國癌癥和腫瘤是第二大最流行的死亡原因，每年導(dǎo)致450,000人死亡。在三個美國人中將有一人得癌癥并且五個人中有一個將死于癌癥(Scientific American Medicine，第12部分，I，1，章節(jié)，1987年)。在鑒別引發(fā)癌癥的某些類似環(huán)境和遺傳原因方面取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)步，而癌癥死亡率統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)字表明對癌癥和其它相關(guān)疾病和紊亂的治療有待實(shí)質(zhì)性的改善。
已有人識別出許多與癌癥的遺傳方式相關(guān)的所謂癌癥基因，即癌癥病因?qū)W中涉及的基因，并存在于許多的經(jīng)過充分研究的腫瘤細(xì)胞中。對癌癥基因進(jìn)行研究可幫助我們弄懂腫瘤發(fā)生過程。而有關(guān)癌癥基因仍遺留許多問題有待研究，目前已知的癌癥基因可用作為理解腫瘤發(fā)生的有效的模型。
從廣義上說可將癌基因劃分為“癌基因”，和“腫瘤阻抑基因”，當(dāng)將“癌基因”活化時(shí)，可促進(jìn)腫瘤發(fā)生，而將“腫瘤阻抑基因”破壞時(shí)，不能阻抑腫瘤發(fā)生。這些分類方式提供了用于將腫瘤發(fā)生概念化的有效方法，而依據(jù)某個基因的特定的等位基因形式，其調(diào)節(jié)元件，遺傳背景以及其起作用的組織環(huán)境不同，一個特定的基因可以產(chǎn)生不同的作用。
一種普遍認(rèn)為的假設(shè)的癌癥活動方式如下(1)大多數(shù)各種類型的人癌癥是遺傳疾病并且(2)癌癥是由特定基因(即正常細(xì)胞生長調(diào)節(jié)基因的突變形式或病毒或其它外源基因)在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行不恰當(dāng)，不定時(shí)的表達(dá)或表達(dá)失敗或其它各類重要的生長調(diào)節(jié)基因的異位表達(dá)引起的。
對瘤形成的生物基礎(chǔ)的較簡單看法是存在兩個大類的癌基因。第一種類是由正常細(xì)胞基因的徑突變的或另外的異常的等位基因組成的，它們參與對細(xì)胞生長或復(fù)制的控制。這些基因是細(xì)胞的原癌基因。被突變時(shí)，它們可以編碼破壞正常細(xì)胞生長和復(fù)制的新的細(xì)胞功能。這些變化的結(jié)果是產(chǎn)生了顯性表達(dá)的腫瘤表現(xiàn)型。在該顯性表達(dá)癌基因的模型中，由于出現(xiàn)了瘤形成的遺傳和突異基礎(chǔ)的概念，形成了一種居支配地位的觀點(diǎn)，假設(shè)在細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程或生長特性中單個野生型某位基因的存在不足于阻止瘤形成的變化。因此對這些癌基因的活化起作用的遺傳因素被想象的“單擊”事件。在伯基特氏淋巴瘤中mye癌基因的腫瘤發(fā)生活動的活化，和在患有慢性骨髓性的白血病的患者中表達(dá)bcr-ab1嵌合基因產(chǎn)物，以及其它腫瘤中H-ras和K-ras癌基因的活化代表了在臨床人癌癥中有所述轉(zhuǎn)化癌基因參與的某些證據(jù)。針對顯性表達(dá)瘤形成疾病的基因治療的方法可能要求負(fù)責(zé)基因的表達(dá)特定地關(guān)閉或失活。腫瘤阻抑基因最新發(fā)現(xiàn)的癌相關(guān)基因族是所謂的腫瘤阻抑基因，有時(shí)稱作為抗癌基因，生長阻抑或癌阻抑基因。最近研究強(qiáng)烈地暗示在該類基因中喪失了功能突變，所述基因可能參與高百分?jǐn)?shù)的人癌癥的發(fā)生；在幾種人癌癥中已經(jīng)鑒別出許多個人腫瘤阻抑基因的合適的候選物。已經(jīng)鑒別并克隆了參與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(rb)，乳腺，結(jié)腸和其它癌(p53)，wilm腫瘤(wt)以及結(jié)腸癌(dcc)的發(fā)病機(jī)制的腫瘤阻抑基因。已經(jīng)闡明了它們在人腫瘤形成的作用的某些方面。
成視網(wǎng)膜細(xì)胞病(RB)是原養(yǎng)型腫瘤阻抑基因。在各種各樣的人腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該基因的突變(Bookstein andLee，Crit.Rev.Oncog.，2211-227(1991)；Goodrich andLee，Biochim.Biophys.Acta.，115543-61(1993)；Riley etal.，Annu.Rev.Cell Biol.，101-29(1994))。在裸鼠中將單拷貝的正常RB重導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中抑制了其形成腫瘤的能力(Huang et al.，Science，2421563-1566(1988)；Sumegiet al.，Cell Growth Differ.，1247-250(1990)；Bookstein efal.，Science，247712-715(1990)Chen et al.，Cell GrowthDiffer.，3119-125(1992)；Goodrich et al.，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA，885257-5261(1991)。另外，在細(xì)胞周期的G1期早期將未磷酸化的Rb蛋白質(zhì)微注射到細(xì)胞中阻止其發(fā)育到S期，表明Rb蛋白根本上參與了細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)過程(Goodrich et al.，Cell，67293-302(1991))。通過最近在基因工程鼠系中觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果。從一個人Rb轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)的Rb蛋白結(jié)果導(dǎo)致生物體水平上的生長延滯(Bignon et al.，Genes Del.，71654-1662(1993))。此外，在由于RB基因的純合失活而導(dǎo)致功能性Rb表達(dá)完全消除的鼠胚胎中，未成熟時(shí)停止發(fā)育并且胚胎死于子宮內(nèi)(Lee et al.Nature，359288-294(1992)；Jacks等人，Nature，359295-300(1992)；Clarke et al.，Nature，359328-330(1992))。這些實(shí)驗(yàn)為確定Rb蛋白在細(xì)胞生長和體內(nèi)分化中的重要性提供了基本資料。
Rb基因編碼一種核蛋白，該蛋白質(zhì)的絲氨酸和蘇氨酸殘基以依賴細(xì)胞周期的方式被磷酸化(Lee et al.，Nature，329642-645(1987)；Buchkovich et al.，Cell，581097-105(1989)；Chen ef al.，Cell，581193-1198(1989)；De Caprioet al.，Cell，581085-1095(1989)。在細(xì)胞周期的G1階段，按照微注射試驗(yàn)，蛋白質(zhì)是活化時(shí)，Rb以低磷酸化狀態(tài)存在(Goodrich et al.，Cell，67293-302(1991)；Goodrich andLee，Nature，360177-179(1992))，低磷酸化的Rb也存在于G0階段。在該靜止期，該Rb似乎是有維持細(xì)胞的關(guān)鍵作用，而在該階段，Rb等待著對外部信號作出應(yīng)答并作出進(jìn)入細(xì)胞周期或者進(jìn)行分化的決定(Goodrich and Lee，Biochim.Biophys.Acta.，115543-61(1993)；Pardee，A.B.，Science，246603-608(1989)。
在晚G1，S，和M期，可能由CDK激酶族成員將Rb高磷酸化(Lees et al.，EMBO J.，104729-4290(1991)；Lin etal.，EMBO J.，10857-864(1991)；Hu et al.，Mol Cell.Bi-ol.，12971-980(1992))。Rb上某些殘基發(fā)生磷酸化可能允許細(xì)胞進(jìn)行增殖。Rb蛋白質(zhì)的磷酸化方式與其生長抑制功能有關(guān)，因此目前可接受的假設(shè)是磷酸化作用對該蛋白質(zhì)的生長阻抑功能具有負(fù)調(diào)節(jié)作用(Hollingsworth et al.，Cu-ur.Opin.Genet.Dev.，355-62(1993)；Sherr，C.J.，TrendCell Biol.，415-18(1994))。在中M期出現(xiàn)了Rb蛋白的去磷酸化作用，并導(dǎo)致在下一細(xì)胞周期之前使該蛋白質(zhì)被重活化。有證據(jù)強(qiáng)力地表明1型蛋白磷酸酶是該脫磷酸化作用的關(guān)鍵(Alberts et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90388-392(1993)；Durfee et al.，Genes Dev.，7555-569(1993))。
目前尚未完全闡明Rb參與這些細(xì)胞活動的分子機(jī)理。一種通用的模式認(rèn)為Rb與許多不同的細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用，并且借助這些復(fù)合物發(fā)揮其功能。如果Rb蛋白質(zhì)的功能是將細(xì)胞保持在G0/G1階段，Rb必須將是活性的并且是進(jìn)入G1期必要的其它蛋白質(zhì)圍在一起并使之失活(Lee etal.，CSHSOB，LVI211-217(1991))。這種“圍捕”假設(shè)與最近觀察結(jié)果相一致，最近實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為一種重要的生長加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子，E2F-1以負(fù)方式嚴(yán)格地受Rb調(diào)節(jié)(Helin et al.，Cell，70337-350(1992)；Kaelin et al.，Cell 70351-364(1992)；Shan et al.，Mol.Cell.Biol.，125620-5631(1992)；Helin et al.，Mol.Cell.Biol.136501-6508(1993)Shen ef al.，Mol.Cell.Biol.，14229-309(1994)。本文公開的蛋白質(zhì)，H-NUC與Rb蛋白質(zhì)相結(jié)合，并因此參與調(diào)節(jié)有絲分裂。
采用連鎖分析方法分析某一家簇的乳腺癌基因BRCA-1在染色體17q21-22上的定位圖。尚不清楚的是該基因起著腫瘤阻抑基因的作用或者起著顯性癌基因的作用。但是，在人家簇癌綜合癥例如Li-Fraumeni綜合癥中涉及的基因p53明顯地具有傳統(tǒng)的腫瘤阻抑基因的作用；同樣，RB基因的丟失與遺傳性成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤有關(guān)(Knudson，1993，見上文)。多個步驟以及癌基因的合作在轉(zhuǎn)化癌基因和純隱性腫瘤阻抑基因的這兩個最大的圖譜之間存在許多明顯地與許多人腫瘤的瘤形成變化特性演化相關(guān)的其它原理。許多年來已經(jīng)確信許多人癌可能是由多種相互影響的遺傳缺陷癥引發(fā)的，任何一種缺陷癥單獨(dú)存在不足于使腫瘤演化，腫瘤的發(fā)育要求所有遺傳缺陷癥出現(xiàn)。在哺乳動物的瘤形成中細(xì)胞原癌基因和生長調(diào)節(jié)腫瘤阻抑基因的真實(shí)作用被認(rèn)為相當(dāng)于這兩類基因之間的系列復(fù)合的相互作用。
發(fā)明概述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了一種編碼具有腫瘤阻抑能力的新蛋白質(zhì)(H-NUC)的核酸分子。已將該核酸分子定位于染色體17的q21-22區(qū)。H-NUC(從全長CDNA得到的氨基酸序列；能夠與DNA結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄；在某些乳腺腫瘤細(xì)胞系中將該編碼序列進(jìn)行重排或丟失)的特性與H-NUC作為一種核蛋白和腫瘤阻抑蛋白的特性相符合。新近公開的全長cDNA編碼了一種新824氨基酸蛋白質(zhì)。該新的蛋白質(zhì)含有TPR(34個氨基酸的肽)蛋白質(zhì)族的十個34氨基酸重復(fù)區(qū)特性。
本文公開了利用核酸和蛋白質(zhì)H-NUC的診斷方法。本發(fā)明還涉及在不具有內(nèi)源性野生型H-NUC蛋白質(zhì)的已建立的癌細(xì)胞中施用野生型H-NUC腫瘤阻抑基因或蛋白質(zhì)用于阻抑，根除或逆轉(zhuǎn)瘤形成表現(xiàn)型。本發(fā)明第一次證實(shí)了將野生型H-NUC基因施用到已建立的癌細(xì)胞中可以阻抑或逆轉(zhuǎn)丟失了野生型H-NUC蛋白質(zhì)的已建立的人癌細(xì)胞中瘤形成表現(xiàn)型或特性。這種對瘤形成表現(xiàn)型的阻抑作用繼而阻抑或根除類似癌細(xì)胞的不正常群體即腫瘤，這種阻抑作用繼而可能降低動物體對這種腫瘤的負(fù)擔(dān)，繼而可以增強(qiáng)被治療動物的存活率。被監(jiān)測和逆轉(zhuǎn)的瘤形成特性包括喪失了正常H-NUC蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，生長情況，以及最令人驚奇的是腫瘤發(fā)生性。因此，動物“腫瘤細(xì)胞負(fù)擔(dān)降低”是在以野生型H-NUC腫瘤阻抑基因給藥之后“阻抑了瘤形成表現(xiàn)型”的結(jié)果?！傲鲂纬杀憩F(xiàn)型”可理解為是指細(xì)胞特性方面表現(xiàn)型的變化例如形態(tài)學(xué)，生長速率(例如加倍所需時(shí)間)，飽和密度，軟瓊脂菌落形成以及腫瘤性質(zhì)(tumorici-ty)。
因此，本發(fā)明提供了編碼H-NUC的載體和用于治療腫瘤或癌癥的H-NUC蛋白質(zhì)，以及制備適用于治療方法中的H-NUC蛋白質(zhì)和載體的方法。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動物例如人的方法，以及治療異常增殖細(xì)胞例如癌癥或腫瘤細(xì)胞的方法或者阻抑瘤形成表型的方法。廣義上說，本發(fā)明關(guān)注用任何合適方式治療異常增殖細(xì)胞或者治療以具有異常增殖細(xì)胞為特點(diǎn)的疾病的哺乳動物，已知所適用的方法允許與宿主細(xì)胞相容的H-NUC編碼載體或一種H-NUC蛋白質(zhì)進(jìn)入待治療的細(xì)胞，從而達(dá)到阻抑增殖的目的。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括通過給具有以異常增殖細(xì)胞為特性的疾病的哺乳動物施用一種編碼H-NUC的表達(dá)載體，將表達(dá)載體插入到異常增殖細(xì)胞，并在異常增殖細(xì)胞中表達(dá)其量能有效地抑制那些細(xì)胞增殖的H-NUC，從而對具有以異常增殖細(xì)胞的特性的疾病的哺乳動物進(jìn)行治療的方法。所述表達(dá)載體通過病毒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，聚凝胺—介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，CaPO4介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和電擊穿，插入到異常增殖的細(xì)胞中。按照需要重復(fù)治療。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括通過將一個編碼H-NUC的表達(dá)載體插入到異常增殖的細(xì)胞中并在其中表達(dá)能有效抑制所述細(xì)胞增殖的量的H-NUC，而對一種哺乳動物的異常增殖細(xì)胞進(jìn)行治療的方法。如果需要治療可重復(fù)進(jìn)行。
在另一種可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種能夠阻抑異常增殖細(xì)胞生長的DNA分子。該DNA分子編碼一種Rb結(jié)合蛋白，該分子包括一個具有至少與C-末端的9個四三共肽重復(fù)區(qū)有60％同源性的一個亞序列，條件是該DNA分子不再為S.pombe母NUC 2，構(gòu)巢曲霉bimA和CDC27編碼。這樣一種Rb結(jié)合蛋白的實(shí)例是基本上具有SEQ ID NO.-的氨基酸序列的H-NUC蛋白質(zhì)。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該DNA分子具有SEQ ID NO.1的DNA序列，并且由一種表達(dá)載體所表達(dá)。該表達(dá)載體可以是與任何宿主細(xì)胞相容性載體。優(yōu)選地是該載體選自于由反轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體和皰疹病毒載體組成的組。
在另一個可選擇方案中，本發(fā)明提供了基本上具有SEQID NO.-的氨基酸序列的H-NUC蛋白質(zhì)及其生物學(xué)活性片段。
在另一個可選擇方案中，本發(fā)明提供了采用下列步驟生產(chǎn)H-NUC蛋白質(zhì)的方法將含有H-NUC編碼基因的相容性表達(dá)載體插入到宿主細(xì)胞中并使該宿主細(xì)胞表達(dá)H-NUC蛋白質(zhì)。
在另一個可選擇方案中，本發(fā)明包括按下列步驟給患有異常增殖細(xì)胞的哺乳動物體外治療的方法從哺乳動物中取出需要治療的組織樣品，該組織樣品包括異常增殖細(xì)胞；將需要治療的組織樣本與有效劑量的編碼H-NUC的表達(dá)載體相接觸；在異常增殖細(xì)胞中表達(dá)能有效地抑制異常增殖細(xì)胞的增殖所需量的H-NUC。按照需要進(jìn)行重復(fù)治療；將待治療的組織樣品返回到原始或其它哺乳動物中。優(yōu)選的是，體外治療的組織是血或骨髓組織。
在另一個可選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括給哺乳動物治療特征在于異常細(xì)胞增殖的疾病的方法，該包括下列步驟給患有以異常細(xì)胞增殖為特征在疾病的哺乳動物施用H-NUC蛋白質(zhì)，結(jié)果是H-NUC蛋白質(zhì)以有效地抑制細(xì)胞的異常增殖的量插入到異常增殖細(xì)胞中。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，H-NUC蛋白質(zhì)是為了插入到待治療細(xì)胞而用膠囊包被的脂質(zhì)體中。按照需要可重復(fù)治療。
在另一個可選擇實(shí)施方案中，提供了能夠與H-NUC基因雜交的寡核苷酸片段以及利用這些片段的檢測方法。這些寡核苷酸至少含5個核苷酸，而由約20-約30個寡核苷酸組成的寡核苷酸是優(yōu)選的。這些寡核苷酸非強(qiáng)制性地用放射性同位素(例如氚，32P和35S酶(例如堿性磷酸酶和辣根過氧化物氧化酶)，熒光化合物(例如，熒光素，錠，鋱絡(luò)合物)或化學(xué)發(fā)光化合物(例如吖啶鎓酯，異魯末諾等等)進(jìn)行標(biāo)記。這些。這些以及其它標(biāo)記物，例如在“Non-isotopic DNAProbe Techmrques”，L，J.Kricka，Ed.，Academic Press，NewYork，1992，(引入本文作參考)討論的，可與本文的寡苷酸一起使用?？蓪⑺鼈冇糜诔Ｒ?guī)形式的DNA探針檢測中，例如Southern和northern印跡分析。這種常規(guī)形式檢測方法的描述可參見例如“Nacleic Acid Hybridization-A Practical Ap-proach”，B.D.Hames and S.J.Higgins，Eds.，IRL Press，Wash-ington，D.C.，1985，引入本文作參考，優(yōu)選的是這些探針能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與H-NUC基因進(jìn)行雜交。也可將這些寡核苷酸用作為聚合鏈反應(yīng)技術(shù)的引物，如在例如“PCR Technol-ogy”，H.A.Ehrlich，Ed.，Stockton Press，New York，1989以及類似的參考資料描述的技術(shù)。
附圖描述

圖1A和1B顯示為了與H-NUC和T-抗原結(jié)合需要的RB的類似區(qū)域。圖1A是用于確定結(jié)合區(qū)的Gal4-RB融合體的圖解。將Gal4 DNA結(jié)合區(qū)(1-147位氨基酸)與各種RB突變體融合。影線框顯示RB的T/EIA結(jié)合區(qū)。打點(diǎn)框描述了受突變影響的區(qū)域。圖1B顯示在體內(nèi)檢測到的H-NUC和RB突變體之間的相互作用。用指定的一組Gal4-RB突變體成員識及Gal4-CH-NUC)表達(dá)克隆(Gal4-(C-49))或YIpPIG10共轉(zhuǎn)化Y153。根據(jù)Durfee等人，GenesDevel.7555-569(1993)(引入本文作參考)描述，采用氯苯-紅-β一半乳糖苷比色檢測法(CPRG)對β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行定量檢測，每種轉(zhuǎn)化設(shè)置三個同樣的實(shí)驗(yàn)組。
圖2A和2B顯示H-NUC與未磷酸化的RB的結(jié)合。圖2A顯示GST以及框架內(nèi)GST與編碼H-NUC的cDNA的融合(GST-491)以及大腸桿菌中表達(dá)的SV40 T抗原(GST-T)的氨基末端273氨基酸。GST和GST-融合體與谷胱肽-瓊脂糖珠結(jié)合并充分地洗滌。通過對SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色而對樣品定量檢測，并且每一泳道中使用等同的蛋白質(zhì)量。圖2B顯示的是從WR2E3細(xì)胞制備的提取物，所述細(xì)胞在室溫下與結(jié)合樣品混合30分鐘。在經(jīng)過廣泛洗滌之后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離復(fù)合物并轉(zhuǎn)移進(jìn)行免疫吸印。通過用抗-Rb mAb 11D7抗體進(jìn)行免疫沉淀(泳道1)而確定WR2E3細(xì)胞中存在的Rb蛋白質(zhì)的量以及其磷酸化程度。用抗Rb mAb 11D7探查該印跡并采用熒光X線照相術(shù)進(jìn)行觀察。
圖3是全長H-NUC cDNA和蛋白質(zhì)的核苷酸(SEQ.I.D.NO1)和推測的氨基酸(SEQ.I.D.NO2)序列。
圖4A和4B顯示全長H-NUC編碼蛋白質(zhì)的34個氨基酸的肽重復(fù)(TPR)族的成員。圖4A顯示十個34-殘基多肽重復(fù)單元在H-NUC，裂殖酵母S.pombe nuc2+和構(gòu)巢曲霉bim A蛋白質(zhì)中的定位。示意圖顯示了此十個(0～9)34-殘基多肽重復(fù)單元(TPR)在nuc2+、H-NUC、和bim A蛋白質(zhì)中的位置。稱作34v-重復(fù)的該三個多肽中的重復(fù)單元3(斜線框所示)缺乏保守基元。圖4B是這9個TPR重復(fù)單元(1-9)氨基酸序列在nuc2+、-H-NUC和bim A蛋白質(zhì)中的線性排列。框線內(nèi)的保守殘基。所有三個蛋白質(zhì)的TPR重復(fù)單元6在第6位為甘氨酸。nuc2的重復(fù)6的甘氨酸6被認(rèn)為是必要的。
圖5A和5B顯示H-NUC的C末端TPR重復(fù)與RB蛋白質(zhì)結(jié)合。圖5A是用來測定結(jié)合域的Gal4-H-NUC融合體的圖解。Gal4反式活化正被融合到各種H-NUC缺失突變體。-H-NUC的TPR重復(fù)單元示于斜線影線框。圖5B顯示在活體內(nèi)RB和H-NUC缺失突變體之間相互作用的測試結(jié)果。所示泳道的Gal4-H-NUC突變體或者與Gal4-RB2或者與Gal4-H209一起共轉(zhuǎn)化Y153。每次轉(zhuǎn)化重復(fù)三次b-半乳糖苷酶活性的CPRG定量。
圖6A和6B顯示出640位氨基酸殘基的必要甘氨酸的突變產(chǎn)生了溫度敏感H-NUC突變體，該突變體在不許可溫度下與RB的結(jié)合能力降低。圖6A詳細(xì)示出了在H-NUC(640D)中的氨基酸取代。muc2的必要甘氨酸(G)(540位的氨基酸)在溫度敏感突變體中被精氨酸(D)所取代。因此，H-NUC的640位氨基酸殘基的甘氨酸變成了天冬氨酸(D)。圖6B顯示在37℃RB和H-NUC(640D)突變體間的相互作用。Gal4-RB2或者和Gal4-H-NUC或者和Gal4-H-NUC(640D)一起共轉(zhuǎn)化Y153。轉(zhuǎn)化子在液體培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)24小時(shí)。用新鮮培養(yǎng)基稀釋過夜酵母培養(yǎng)物，并將其培養(yǎng)于37℃。在不同的時(shí)間點(diǎn)取等分的酵母培養(yǎng)物來測定酵母的生長(OD660)和β-半乳糖苷酶活性。每次轉(zhuǎn)化β-半乳糖苷酶活性的CPRG定量做三個重復(fù)。
圖7A和7B顯示抗H-NUC抗血清的產(chǎn)生及在人細(xì)胞系中H-NUC的檢測。圖7A中，用Gst-491融合蛋白來免疫小鼠。免前血清(泳道1)、免疫血清(泳道2)、與Gst蛋白預(yù)保溫的免疫血清(泳道3)和與Gst-491蛋白質(zhì)預(yù)保溫的免疫血清用來進(jìn)行免疫沉淀。從K-562細(xì)胞中制備S35-標(biāo)記的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。等量的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物用于免疫沉淀。所得的免疫沉淀物在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。圖7B中，從CV-1細(xì)胞中制備S35-標(biāo)記的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。等量的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物被用于免前血清(泳道1)、或免疫血清(泳道2和3)的免疫沉淀。將所得的免疫沉淀物在200μl含溶液(泳道3)的2％SDS中煮沸變性，用200μl的NETN緩沖液稀釋之。在SDS-聚丙烯凝膠電泳上分離該免疫沉淀物。如箭頭所指，免疫血清特異地識別出90KD的蛋白質(zhì)。
圖8顯示H-NUC蛋白具有DNA-結(jié)合活性。S35-甲硫氨酸代謝標(biāo)記的K562蛋白溶胞產(chǎn)物通過雙鏈小牛胸腺DNA-纖維素柱，并用增高濃度的NaCl洗脫。洗脫物或者用(A)mAb 11D7免疫沉淀來定位RB蛋白，或者用(B)免疫血清識別H-NUC來定位H-NUC。(C)等量的洗脫物不用來與谷胱甘肽瓊脂糖珠一起溫育。
圖9顯示編碼H-NUC的基因定位于染色體17q21-22。
圖10A和10B是用H-NUC做探針時(shí)，乳腺瘤細(xì)胞DNA的Southern印跡分析的結(jié)果。從細(xì)胞系中抽提DNA，用EcoRI消化之。圖10A中探針標(biāo)記的細(xì)胞系印跡均是正常的。圖10B中，細(xì)胞系TA47D和MB157K中H-NUC基因的純合缺失很明顯。14Kbp EcoRI片段的雜交的減少揭示在細(xì)胞系MB231、BT0578-7和BT549中出現(xiàn)了該基因的雜合缺失。
圖11顯示在活體外AC-H-NUC抑制T-47D乳腺瘤細(xì)胞的細(xì)胞生長。左上方顯示用ACN(MOI10)感染3天的并用結(jié)晶紫染色的MDA-BAB-231細(xì)胞。右上方顯示由ACN(MOI10)感染的T-47D細(xì)胞。左下方顯示由AC-H-NUC(MOI10)感染的MDA-MB-231細(xì)胞。右下方顯示由AC-H-NUC感染的T-47D細(xì)胞。(+/-)表示MDA-MB-231細(xì)胞對H-NUC來說是雜合的。(-/-)表示T-47D細(xì)胞含有H-NUC的純合缺失(ref.Lee，W.H.)。AC-H-NUC是重組的人腺病毒，其含有在人CMV啟動子控制下的H-NUC腫瘤阻抑基因。ACN是不含H-NUC腫瘤阻抑基因的同樣的重組人腺病毒載體。
圖12顯示AC-H-NUC在活體外阻抑T-47D腫瘤細(xì)胞的生長。將T47-D(H-NUC缺失的)和MDA-MB-231(H-NUC雜合的)乳腺癌細(xì)胞鋪96孔板，并用AC-H-NUC或ACN從10和100倍復(fù)數(shù)感染之(重復(fù)四次)。細(xì)胞生長5天，用摻入到細(xì)胞核酸中的3H-胸苷來測量增殖。AC-H-NUC數(shù)據(jù)(平均數(shù)±SD)對ACN對照的平均增殖的百分?jǐn)?shù)在相應(yīng)的MOI做圖。
圖13顯示AC-H-NUC抑制裸鼠中T-47D腫瘤生長。在體外用ACN或AC-H-NUC以30感染復(fù)數(shù)(N＝4/組)處理T-47D人乳腺癌細(xì)胞。將大約107細(xì)胞皮下注射到裸鼠的脅腹，每只動物在一側(cè)脅腹接受ACN處理的細(xì)胞，對照側(cè)接受AC-H-NUC細(xì)胞。用測經(jīng)器測量腫瘤大小，用球體幾何學(xué)計(jì)算估測來源于ACN和AC-CBTSG細(xì)胞所得的腫瘤做圖。來源于未處理細(xì)胞的雙側(cè)腫瘤的平均體積(±SD)做的圖用作對照。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了新型的定名為H-NUC的哺乳動物蛋白質(zhì)。H-NUC由824個氨基酸組成(圖3)，具有大約95KD的分子量，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它與非磷酸化的全長的成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)蛋白相互作用。還發(fā)現(xiàn)H-NUC的衍生物，為H-NUC蛋白的截短型，在其C-末端含有最后6個“TPR”區(qū)(34個氨基酸的肽，34-氨基酸重復(fù))，換名話說，含有從559到770位的氨基酸，與野生型Rb蛋白質(zhì)結(jié)合。對該蛋白質(zhì)的突變破壞其成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤—結(jié)合的功能可引起超增殖病理學(xué)，即RB阻性細(xì)胞的特征，如乳腺癌細(xì)胞。
H-NUC蛋白質(zhì)是人蛋白，因此能從人組織中純化之?！凹兓碑?dāng)用來描述H-NUC蛋白質(zhì)或核酸序列的狀態(tài)時(shí)，指的是該蛋白質(zhì)或編碼H-NUC的DNA不含在天然環(huán)境中與H-NUC蛋白質(zhì)或編碼H-NUC的DNA正常結(jié)合的其它蛋白質(zhì)或分子。在此所用的術(shù)語“天然”指的是DNA、蛋白質(zhì)、多肽、抗體或其片段是從自然界中分離出來的形式或者是沒有有意的氨基酸變化，即取代、缺失或增加的那些形式。用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的方法可從SDS凝膠中收獲純化95kd H-NUC蛋白質(zhì)，例如按下面更詳細(xì)的描述將含H-NUC的細(xì)胞抽提物首先與抗-H-NUC抗體反應(yīng)進(jìn)行沉淀。分離蛋白抗體復(fù)合物，并用在此引作文獻(xiàn)的Fisher等，Techniques in Protein Chemistry，ed.T.E.Hugli，AcademicPress，Inc.，PP.36～41(1989)中所描述的方法的SDS凝膠中洗脫收獲該95kd H-NUC蛋白質(zhì)。
在此所用的術(shù)語“超增殖細(xì)胞”包括但不限于具有自主生長，即不依賴于正常調(diào)控機(jī)制存活和再生能力的細(xì)胞。超增殖疾病可分成病理學(xué)類，即源于正常細(xì)胞的特征化或組成性疾病，或者可分成非—病理學(xué)類，即源于正常但與疾病的狀態(tài)無關(guān)。病理學(xué)超增殖細(xì)胞是下列疾病狀態(tài)的特征甲狀腺增生—格雷夫斯氏病、銀屑病、良性前列腺肥大、Li-Frau-meni綜合癥、癌包括乳腺癌、肉瘤和其它贅生物、膀胱癌、結(jié)腸癌、肺癌、各種白血病及淋巴瘤。非病理學(xué)超增殖細(xì)胞的例子也被發(fā)現(xiàn)了，例如，在哺乳動物泌乳發(fā)育過程的導(dǎo)管上皮細(xì)胞中和與傷口恢復(fù)相關(guān)的細(xì)胞中。病理學(xué)超增殖細(xì)胞特征性地表現(xiàn)出接觸性抑制的喪失和選擇性粘附的下降，該選擇性粘附揭示細(xì)胞表面性質(zhì)的變化和細(xì)胞間連結(jié)的進(jìn)一步打破。這些變化包括分裂的剌激及蛋白水解酶的分泌能力。而且，將該蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入細(xì)胞使失去的H—NUC功能從導(dǎo)入或補(bǔ)充能使該細(xì)胞恢復(fù)到非—超增殖狀態(tài)。然后細(xì)胞的惡性增殖能被阻止了。
如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，術(shù)語“蛋白質(zhì)”指由肽鍵連接的特定順序的線性氨基酸聚合體。除非特別指出在此所用的術(shù)語“氨基酸”指氨基酸的D或L立體異構(gòu)型。H-NUC衍生物或等同物，如具有純化的H-NUC蛋白質(zhì)的生物活性H-NUC截短的蛋白、多肽或H-NUC肽也被包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。H-NUC衍生物是指遠(yuǎn)離天然存在的蛋白質(zhì)或多肽的線性序列，但具有氨基酸改變，即取代、缺失或插入以致所得的H-NUC衍生物保留H-NUC生物學(xué)活性。“生物學(xué)活性或生物活性”將意味著一方面具有能同非磷酸化成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白P110RB結(jié)合的能力。如果，例如高度保守的甘氨酸(640位氨其酸)被變成精氨酸時(shí)，H-NUC結(jié)合Rbd37℃喪失。這些H-NUC衍生物可由于一個或多個相關(guān)氨基酸的氨基酸缺失、取代或插入而同天然序列區(qū)別開來，例如，相似的帶電氨基酸或側(cè)鏈或官能團(tuán)的取代或修飾。
進(jìn)一步認(rèn)識到在不破壞其功能的情況下，可對H-NUC的初級序列進(jìn)行限制性修飾，而且為影響活性只需整個初級序列的一部分，所影響的一個方面即為與p110RB結(jié)合的活性。編碼p110RB的核酸序列已由Lee，W.H.等在Science 2351394-1399(1987)公開發(fā)表，將其在此引為參考文獻(xiàn)。它的生物學(xué)功能的另一方面是H-NUC與DNA結(jié)合的能力。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可用Lee，W.-H.等在Nature(London)329642～645(1987)中描述的方法來測定其結(jié)合DNA的能力，該篇文獻(xiàn)在此引作參考。一種生物學(xué)活性的H-NUC衍生物是在H-NUC的C-未端的含有最后6個TPR區(qū)蛋白質(zhì)和融合蛋白-Gal4-C49，下面將詳述之。Gal4-C49衍生物具有如圖3所示的從559位氨基酸到該序列末端的序列。含有衍生物的TPR為圖3所示具有559位到770位的氨基酸序列。而且，除了前面所述的Gal4-C49融合蛋白或TPR衍生物外，那些保留了整個蛋白功能的具有圖3所示氨基酸序列的片段也被包括在H-NUC衍生物的定義之內(nèi)。這些H-NUC衍生的可通過限制性酶消化圖3的核酸分子并將所得的片段重組表達(dá)而產(chǎn)生。認(rèn)識到對初級氨基酸序列的較小修飾能得到與圖3所列的序列相比，其具有實(shí)質(zhì)上等同的或增強(qiáng)的功能的蛋白質(zhì)。這些突變可以是很精細(xì)的，如通過定點(diǎn)突變，或者是隨機(jī)的，如通過H-NUC產(chǎn)物的受體的突變。只要保留H-NUC的生物活性，所有這些修飾都將被包括在內(nèi)。
“抑制性活性”將意味著H-NUC蛋白突變體或片段(突變蛋白)，該突變蛋白以顯隱性形式抑制蛋白質(zhì)的正常功能，即抑制H-NUC的生物學(xué)作用—介導(dǎo)受體細(xì)胞分裂和/或受體細(xì)胞增殖的作用。這些蛋白質(zhì)和片段可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的那些化學(xué)方法得到。這些突變蛋白和抑制性活性片段在促進(jìn)細(xì)胞的超增殖的治療中十分有用，并可用于生產(chǎn)如抗體的診斷試劑。
用下述的方法在活體外或活體內(nèi)將細(xì)胞與該試劑接觸，這些試劑將有利于促進(jìn)或抑制細(xì)胞的生長或增殖。相應(yīng)地，本發(fā)明了提供了一種通過將細(xì)胞與試劑接觸，抑制例如象乳腺癌細(xì)胞的超增殖細(xì)胞的生長或增殖的方法還提供了治療，如乳腺癌，由超增殖細(xì)胞生長特征化的病理學(xué)的方法，即通過對適當(dāng)?shù)闹黧w施給有效量濃度的這些試劑使細(xì)胞增殖得以抑制。該方法適當(dāng)?shù)闹黧w包括但不限于脊椎動物、猿猴、鼠類和人類患者。
本發(fā)明也提供了含有上面所述的任一組分和一種或多種藥物學(xué)可接受的載體的藥物組合物。藥物學(xué)可接受的載體是本領(lǐng)域所熟知的包括水溶液如生理緩沖的水或其它溶劑或載體如乙二醇、甘油、植物油(如橄欖油)或可注射的有機(jī)酯。藥物學(xué)可接受的載體可用于在活體外對細(xì)胞或在活體內(nèi)對主體給藥H-NUC或其衍生物。
藥物學(xué)可接受的載體可含有生理學(xué)上可接受的化合物，這些化合物起作用，例如穩(wěn)定蛋白質(zhì)或多肽或增加或減少該試劑的吸收。生理學(xué)上可接受的化合物包括，例如，碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、葡聚糖，抗氧化劑如抗壞血酸、谷光甘肽，螯合劑，低分子量的蛋白質(zhì)或其它穩(wěn)定劑或賦形劑。其它生理可接受的化合物包括增濕劑、乳化劑、分散劑或?qū)Ψ乐刮⑸锷L或作用特別有用的防腐劑。各種防腐劑均是熟知的，包括，例如，石炭酸和抗壞血酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道依據(jù)，例如，多肽給藥的途徑和該特定多肽的特殊的生理—生化特性來選擇藥物學(xué)可接受的載體，包括生理學(xué)可接受的化合物。例如，象單硬脂酸鋁或明膠的生理學(xué)可接受的化合物作為延遲劑是十分有用的。它們能延長施給主體的藥物組合物的吸收速率。載體、穩(wěn)定劑或佐劑的進(jìn)一步的例子可在Martin，Remington′s Pharm.Sci.15th Ed.(Mack Publ.Co.，Easton，1975)中找到，這篇文獻(xiàn)的此引作參考。如果需要，也可將藥物組合物摻入到脂質(zhì)體、微球體或其它多聚體基質(zhì)中(Gregoriadis，Liposome Technology，Vol.1(CRC Press，BocaRaton，F(xiàn)lorida 1984，該文獻(xiàn)在此引作參考)。脂質(zhì)體，例如，由磷脂或其它類脂組成，相對來說較容易制得和施給，是無毒性的生理可接受的和可代謝的載體。
純化的H-NUC(蛋白質(zhì))或H-NUC(核酸)藥物組合物對抑制細(xì)胞，如乳腺癌細(xì)胞的生長很有用，即通過使細(xì)胞與純化的H-NUC或活性片段或含這些多肽或蛋白質(zhì)的組合物接觸。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的接觸效果可在活體外、離體或活體內(nèi)取得。當(dāng)在活體外抑制細(xì)胞時(shí)，通過將本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)組合物與細(xì)胞培養(yǎng)基混合，然后以之飼喂細(xì)胞達(dá)到接觸的效果或者通過直接將核酸組合物或蛋白質(zhì)加到培養(yǎng)基中達(dá)到接觸的效果。測量有效量的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說都是熟知的。
本方法也可用于治療和預(yù)防與主體活體內(nèi)的異常增殖細(xì)胞相關(guān)的病理學(xué)。因此，當(dāng)在活體內(nèi)取得接觸的效果時(shí)，以抑制該主體細(xì)胞增殖的有效量給藥有效量的本發(fā)明組合物。為本發(fā)發(fā)明的目的，“主體”指任何脊椎動物，如動物，哺乳動物、人或大鼠。本方法對治療和預(yù)防具有無功能H-NUC蛋白產(chǎn)物的患者的乳腺癌患者是特別有用的。
藥物給藥的方法在本領(lǐng)域是熟知的，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥?？蛇B續(xù)地或間斷地實(shí)現(xiàn)給藥，如同用其它治療重組蛋白質(zhì)一樣，給藥方式隨著主體的不同而異。(Landman等，J.Interferon Res.12(2)103-111(1992)；Aulitzky等，Eur.J.Cancer 27(4)462-467(1991)；Lantz等，Cytokine 2(6)402-406(1990)；Supersaxo等，Pharm.Res.5(8)472-476(1988)；Demetri等，J.Clin.On-col.7(101545-1553(1989)；和LeMaistre等Lancet.3371124-1125(1991))。
本發(fā)明不進(jìn)一步提供了編碼相應(yīng)于純化的哺乳動物H-NUC蛋白質(zhì)H-NUC衍生物、突變蛋白、其活性片段和抗-H-NUC抗體的氨基酸序列的分離的核酸分子。在此所用的“核酸”是指單鏈和雙鏈DNA、cDNA和mRNA。在一個實(shí)施方案中，編碼H-NUC蛋白質(zhì)和片段的核酸分子具有圖3所示的序列或其部分。那些在嚴(yán)謹(jǐn)條件能與核酸分子或其補(bǔ)體雜交的核酸分子，例如圖3所示的序列，也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這些雜交的核酸分子或探針可通過，例如圖3的核酸分子的缺口翻譯而制備，在這種情況下，雜交的核酸分子可以是該分子、圖3所示序列的隨機(jī)片段。制備這些片段的方法學(xué)，參見Sambrook等，Molecular CloningA Laborato-ry Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，該書在此引作參考。含至少10個核苷的核酸片段作為雜交探針十分有用。分離的核酸也用于產(chǎn)生新的肽。反過來，這些肽被用作產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體的免疫原。制備和使用這些探針和免疫原的方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的。
這些核酸分子也用于抑制細(xì)胞的細(xì)胞分裂和增殖。將該核酸分子插入細(xì)胞，使細(xì)胞培養(yǎng)在該核酸能編碼H-NUC蛋白質(zhì)，并使之達(dá)到有效濃度的條件下，從而抑制細(xì)胞的生長。為達(dá)本發(fā)明的目的，可通過脂質(zhì)體或脂質(zhì)體DNA或其它基因載體如Sambrook等在Supra公開發(fā)表的病毒載體將該核酸插入，Supra在此引作參考。具有突變的H-NUC蛋白質(zhì)產(chǎn)物的乳腺癌細(xì)胞即為得益于本方法的細(xì)胞。
用轉(zhuǎn)基因治療人類疾病現(xiàn)在已從理論階段進(jìn)入到實(shí)踐的階段。第一例人類基因療法開始于1990所9月，即將腺苷脫氨酶基因轉(zhuǎn)入患者的淋巴細(xì)胞，該患者患有此酶的致命性缺陷，產(chǎn)生了免疫缺陷。這一開創(chuàng)性試驗(yàn)的結(jié)果具有極大的鼓舞作用，并有助于進(jìn)一步推動臨床試驗(yàn)(Culver，K.W.，An-derson，W.F.，Blaese，R.M.，Hum.Gene.Ther.1991，2107)。
到目前為此，大部分已成功的人類轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)均依賴于逆病毒載體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文所稱的逆病毒載體是已除去或變更了所有病毒基因的逆病毒，從而使受該載體感染的細(xì)胞不產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)。用產(chǎn)生所有病毒蛋白質(zhì)不產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)。用產(chǎn)生所有病毒蛋白質(zhì)但并不產(chǎn)生有侵染性病毒的逆病毒包裝細(xì)胞提供病毒的復(fù)制功能。逆病毒載體DNA導(dǎo)入包裝細(xì)胞，結(jié)果產(chǎn)生病毒粒子，該病毒粒子帶有載體RNA并能侵染靶細(xì)胞，但侵染后不能進(jìn)一步產(chǎn)生病毒的傳播。為了區(qū)別這一過程與天然病毒侵染的不同，其中天然病毒侵染后繼續(xù)復(fù)制和傳播，術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”比“侵染”更常用。
僅為描述的目的，核酸的插入傳遞系統(tǒng)是復(fù)制—非競爭性逆病毒載體。在此所用的術(shù)語“逆病毒”包括，但不限于，載體或具有選擇靶位并使核酸導(dǎo)入分裂細(xì)胞能力的傳遞載體。在此所用的術(shù)語“復(fù)制—非競爭”定義為不能產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)，防止該載體在受侵染的寄主細(xì)胞內(nèi)傳播。
復(fù)制—非競爭性逆病毒載體的另一個例子是LNL6(Miller，A.D等，BioTechniques 7980～990(1989))，該文獻(xiàn)在此引作參考。用復(fù)制—非競爭性逆病毒進(jìn)行標(biāo)記基因的逆病毒—介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的方法已經(jīng)很好地建立了(Correll，P.H.等，PNAS USA 868912(1989)；Bordigton，C.等，PNASUSA 868912-52(1989)；Culver，K.等，PNAS USA 883155(1991)；Rill，D.R.等，Blood 79(10)2694～700(1991)，所有的這些文獻(xiàn)在此均引作參考。臨床研究表明沒有或幾乎沒有與該病毒載體相關(guān)的副作用(Anderson，Sci-ence 256808～13(1992))。
逆病毒載體用于基因療法的主要的好處是將基因高效轉(zhuǎn)入復(fù)制細(xì)胞，轉(zhuǎn)入基因精確整合到DNA上，和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后沒有該序列的進(jìn)一步傳播(Miller，A.D.，Nature，1992，357455～460)。
在生產(chǎn)逆病毒載體的過程中，復(fù)制—競爭性(輔助)病毒產(chǎn)生的潛在可能性仍是人們關(guān)心的問題，雖然在實(shí)際應(yīng)用中此問題已經(jīng)解決了。迄今為此，所有的FDA—合格的逆病毒載體是用PA317雙性逆病毒包裝細(xì)胞制得的(Miller，A.D.，和Buttimore，C.，Molec.Cell Biol.，1986，62895～2902)。在PA317細(xì)胞內(nèi)使用沒有或很少與病毒序列重疊的載體可免除輔助病毒的產(chǎn)生，即使在允許此類事件放大的嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)中(Lynch，C.M.，和Miller，A.D.，J.Viral，1991，653887～3890)。也可用其它包裝細(xì)胞系。例如，設(shè)計(jì)用來分離不同質(zhì)粒上不同的逆病毒編碼區(qū)的細(xì)胞系可通過重組減少輔助病毒產(chǎn)生的可能性。由這些包裝細(xì)胞系產(chǎn)生的載體也為人類的基因療法提供了有效的系統(tǒng)(Miller，A.D.，1992 Nature，357455～460)。
已經(jīng)考慮非—逆病毒載體用于遺傳治療。一個這樣的選擇即為腺病毒(Rosenfeld，M.A.，等1992，Cell，68143～155；Jaffe，H.A.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896482～6486)。腺病毒載體的主要優(yōu)點(diǎn)是它們能攜帶大DNA片段(36kb的基因組)，效價(jià)高(1011/ml)，能在原位特別是在肺部侵染組織。迄今為止使用該載體最令人興奮的是通過氣管內(nèi)滴注將人包囊纖維化轉(zhuǎn)膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)(CFTR)基因?qū)朊奘蟮臍獾辣砥?Rosenfeld，M.A.，等，Cell，1992，63145～155)類似地，證明了皰疹病毒對人類的基因療法也是有價(jià)值的(Wolfe，J.H.等，1992，Nature Genetics，1379～384)。當(dāng)然，其它任何合適的病毒載體可用于本發(fā)明的遺傳療法。
用于人類的由FDA證明的其它轉(zhuǎn)基因的方法是在人細(xì)胞的原位用質(zhì)脂體直接轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA(Nabel，E.G.，等1990Science，2491285～1288)。質(zhì)粒DNA應(yīng)易于證明能用于人基因療法，因?yàn)椴幌竽娌《据d體，它可以被純化成均質(zhì)的。除了質(zhì)脂體—介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移外，其它幾種物理學(xué)DNA轉(zhuǎn)移方法如通過將質(zhì)粒DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合使DNA定位于細(xì)胞上的受體的那些方法已在人類基因療法中顯示了前景(Wu，G.Y.，等1991 J.Biol.Chem.，26614338～14342；Curiel，D.T.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888850～8854)。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將本發(fā)明的H-NUC的編碼基因置于表達(dá)載體，如質(zhì)?；虿《颈磉_(dá)載體上。通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、質(zhì)脂體(例如，LIPOFECTIN)—介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、DEAE—葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、聚凝胺—介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔和將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其它方法可將質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞。
病毒表達(dá)載體可通過感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)型導(dǎo)入靶細(xì)胞。這樣的病毒載體包括，但不限于，逆病毒、腺病毒、皰疹病毒和禽痘病毒。當(dāng)H-NUC在任何異常增殖的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞的復(fù)制周期被阻礙，因此結(jié)果是細(xì)胞老化和細(xì)胞死亡并且最終是異常組織，即腫瘤或癌的體積的減小。可以用任何有效的方法將能將基因?qū)氚屑?xì)胞并能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)H-NUC的載體以細(xì)胞增殖—抑制量給藥。
例如，可通過局部、眼內(nèi)、腸胃外口服、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或其它任何有效的方法給藥含有有效濃度活性載體的生理上適當(dāng)?shù)娜芤?。特別地，用針頭將治療靶組織腫瘤細(xì)胞有效量的載體直接注射到靶癌或腫瘤組織。
選擇地，在體腔內(nèi)存在的癌或腫瘤，如在眼內(nèi)、胃腸道內(nèi)、泌尿生殖道內(nèi)(例如尿道膀胱)、肺和支氣管系統(tǒng)內(nèi)和其它存在的癌或腫瘤可接受生理上適當(dāng)?shù)慕M合物(即溶液如鹽水或磷酸鹽緩沖液，懸浮液、或乳劑，除載體外它們是經(jīng)過消毒的)，該組合物含有效濃度的活性載體，通過針頭直接注射或?qū)Ч芑蚱渌糜谠馐馨┗蚰[瘤痛苦的中空的器官中的傳遞管給藥該組合物。任何可想到的裝置如X—射線、聲波圖或視纖維成像系統(tǒng)可用于靶組織的定位和用于針頭和導(dǎo)管的指引。
在另一個可選擇的方案中，對那些不能直接到達(dá)并可被解剖分離出的腫瘤或癌進(jìn)行治療?？蓪⒑杏行舛然钚暂d體的生理上適當(dāng)?shù)娜芤和ㄟ^血液循環(huán)系統(tǒng)地給藥。
在另一個可選擇的方案中，可用任何已知的方法將H-NUC蛋白質(zhì)導(dǎo)入靶腫瘤或癌細(xì)胞而對其進(jìn)行治療。例如，脂質(zhì)體是人工膜載體，它們可用于在活體外或活體內(nèi)(Manni-no，R.J.等，1988，Biotechniques，6682～690)將藥物、蛋白質(zhì)和質(zhì)粒載體傳入靶細(xì)胞(Newton，A.C.和Huestis，W.H.，Biochemistry，1988，274655～4659；Tanswell，A.K.等1990，Biochmica et Biophysica Acta，1044269～274；和Ceccoll，J.等，Journal of Investigative Dermatology，1989，93190～194)。因此，H—NUC蛋白質(zhì)可與脂質(zhì)體載體高效地包入囊中，并將之在活體內(nèi)或活體外導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞。
質(zhì)脂體—包裹的H-NUC蛋白質(zhì)可通過局部、眼內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、支氣管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或其它任何有效的方式以有效治療靶組織異常增殖細(xì)胞的劑量給藥。將含有有效濃度的包裹的H-NUC蛋白質(zhì)的任何生理上適當(dāng)?shù)慕M合物以脂質(zhì)體給藥。
其它載體用于本發(fā)明也是合適的，并將選擇出有效傳遞編碼H-NUC的基因的載體。該核酸可以是DNA，cDNA或RNA。
在一個獨(dú)立的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子與RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子連接在一起。這些核酸分子用于重組生產(chǎn)H-NUC蛋白質(zhì)和多肽或作為載體用于基因治療。
本發(fā)明也提供了在其中插有上面所述分離的核酸分子的載體。例如，合適的載體可以是，但不限于質(zhì)粒，粘粒或病毒載體。合適載體的例子參見Sambrook等，Supra，和Zhu等，Science 261209～211(1993)，該文獻(xiàn)在此引作參考。當(dāng)插入適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞即原核或真核細(xì)胞時(shí)，可重組產(chǎn)生H-NUC。適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞或包括哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、和細(xì)菌細(xì)胞。參見在此引作參考的Sambrook等，Supra。
本發(fā)明提供了生產(chǎn)H-NUC重組體或其衍生物的方法，將上面所述的寄主細(xì)胞生長在適當(dāng)?shù)臈l件下使編碼H-NUC或其片段的核酸得以表達(dá)。合適的條件用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法確定。例子參見在此引作參考的Sambrook等，Supra。本發(fā)明也提供了由此方式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和多肽。
本發(fā)明也提供了能與H-NUC蛋白質(zhì)或其片段特異地形成復(fù)合體的抗體。術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體和單克隆抗體?？贵w包括但不限于小鼠、大鼠、兔或人的單克隆抗體。
在此所用的“抗體或多克隆抗體”指的是對抗原或受體進(jìn)行免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。術(shù)語“單克隆抗體”意思是由單克隆細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白。由該克隆產(chǎn)生的所有單克隆抗體在化學(xué)上和結(jié)構(gòu)上是一致的，并且對單一抗原決定簇是特異的。
生產(chǎn)多克隆抗體和單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)方法在本領(lǐng)域是已知的，參見在此引作參考的Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)。本發(fā)明的單克隆抗體可通過將H-NUC或其片段導(dǎo)入動物，如小鼠或兔子而生物制得。將動物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞分離出來，并將之與瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交細(xì)胞或雜交瘤。相應(yīng)地，也提供了生產(chǎn)本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤。以這種方式生產(chǎn)的單克隆抗體包括，但不限于下面所述的單克隆抗體。
因此，用H-NUC蛋白質(zhì)或其衍生物，和熟知的方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能生產(chǎn)和篩選具有和H-NUC結(jié)合能力的本發(fā)明抗體的雜交瘤細(xì)胞和抗體。
本發(fā)明也提供了上面所述的具有生物學(xué)活性的多克隆和單克隆抗體的片段。這些“抗體片段”保留了一些和抗原或免疫原選擇性地結(jié)合的能力。這樣的抗體片段可包括，但不限于(1)Fab，該片段含有單價(jià)抗原—結(jié)合的抗體分子片段，所述的抗體分子通過用木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生完整的輕鏈和一重鏈的一部分而產(chǎn)生；(2)Fab′，該片段是用胃蛋白酶處理，接下來還原，以產(chǎn)生完整的輕鏈和部分重鏈而獲得的抗體分子片段；每個抗體分子可獲得兩個Fab′片段；(3)(Fab′)2，該片段是用胃蛋白酶處理但不進(jìn)行隨后的還原步驟而獲得的抗體片段；(Fab′)2是由兩個二硫鍵連在一起的兩個Fab′的聚合體；(4)Fv，定義為含有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)表達(dá)作為兩鏈的遺傳工程片段；和
(5)SCA，定義為由適當(dāng)?shù)亩嚯慕宇^連接的含有輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)和遺傳融合的單鏈分子的遺傳工程分子。
制備這片片段的方法在本領(lǐng)域是已知的，例子參見Har-low和Lane，Supra，這篇文獻(xiàn)在此引作參考。
“生物活性抗體片段”的特異的例子包括抗體的CDR區(qū)。
本發(fā)明還提供了與抗體或其生物活性片段特異起反應(yīng)的抗——獨(dú)特型肽。在此所用的“抗——獨(dú)特型肽”是從一個種中純化的抗體，該抗體被注射到遠(yuǎn)緣種中，被識別為外源抗原而且產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。對一般方法學(xué)的討論，參見在此引為參考的Harlow和Lane的Supra。
那些重組產(chǎn)生的、生化合成的、化學(xué)合成的或化學(xué)修飾的保留了與H-NUC或其片段結(jié)合能力的，如同相應(yīng)的天然多克隆或單克隆抗體的蛋白質(zhì)或多肽也包括在本發(fā)明之內(nèi)。用本領(lǐng)域所知的抗原結(jié)合試驗(yàn)如抗體捕獲試驗(yàn)測定與抗原或免疫原結(jié)合的能力。例子參見在此引為參考的Harlow和Lane的Supra。
在一個實(shí)施方案中，抗體或核酸同檢測試驗(yàn)連接起來，用于檢測樣品中的H-NUC蛋白質(zhì)和片段，所用方法為標(biāo)準(zhǔn)的免疫化學(xué)技術(shù)如由Harlow和Lane在Supra中描述的免疫組織化學(xué)，該文獻(xiàn)在此引作參考；或者用在“Principles andPractice of Immunoassays”，eds.C.J.Price and D.J.New-man，Stockton Press，New York，(1991)中描述的技術(shù)，該文獻(xiàn)在此引為參考。
在一獨(dú)立的實(shí)施方案中，給藥抗體使之與H-NUC結(jié)合并改變其在細(xì)胞內(nèi)的功能。用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法給藥抗體，以有效的濃度施給以使H-NUC的功能得以恢復(fù)。該抗體也可用來治療，即通過與已喪失了與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白結(jié)合能力的H-NUC的結(jié)合以抑制細(xì)胞生長或增殖。這個抗體與H-NUC結(jié)合，引起了它重新折疊成活性構(gòu)象。換句話說，該試劑恢復(fù)了H-NUC的天然生物活性。
本發(fā)明的抗體和核酸分子用于檢測或測定從患者身上取出的細(xì)胞或樣品中的H-NUC蛋白或者選擇性地變化了的-H-NUC蛋白或者選擇性的變化了的-H-NUC基因的存在與否。這樣，乳腺癌或患乳腺癌的可能性則可被診斷出來。
綜上所述，上述的蛋白質(zhì)、多肽、核酸、抗體、和其片段可用于制備治療的藥劑。
現(xiàn)在將結(jié)合下面的實(shí)施例對本發(fā)明做更進(jìn)一步的詳述。這些實(shí)例用于說明，但并不限制本發(fā)明。試驗(yàn)方法和結(jié)果用酵母雙雜交系統(tǒng)，已分離出25個與RB(p56-RB)的C-末端區(qū)域相互作用的克隆。其中之一是克隆C49(Durfee等，Gene Devel.，7555～569(1993)。RB蛋白質(zhì)的C-末端部分具有兩個非鄰近的對于幾種DNA腫瘤病毒的癌蛋白的結(jié)合是必需的區(qū)域，和與DNA的結(jié)合活性有關(guān)的C-末端區(qū)。這里，一種RB-相關(guān)蛋白質(zhì)的特征已被測定，其具有初級序列，并其生化性質(zhì)類似于S.Pombe酵母的nuc2蛋白質(zhì)和真菌中構(gòu)巢曲霉的bimA的那些性質(zhì)。這后兩個基因在低等真核細(xì)胞中的突變使細(xì)胞停滯在中期，指示出這些蛋白質(zhì)在有絲分裂的正常過程中起著重要的作用。這兩個蛋白質(zhì)含有新的以34個殘基為基元的重復(fù)氨基酸，稱之為TPR基元。這些重復(fù)的功能還不清楚，但據(jù)推斷，它們可形成親水脂的α-螺旋，原則上該螺旋使蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。這里報(bào)道的這些蛋白質(zhì)是人類首次分離出并報(bào)道的人TPR蛋白質(zhì)。cDNA文庫的篩選和序列分析為分離全長的H-NUC cDNA，用Durfee等的方法按上面描述的分離1.5kb的C-49 Bgl II片段，將其用缺口翻譯標(biāo)記，并通過噬菌斑雜交來篩選人成纖維細(xì)胞cDNA文庫。將cDNA插入片段亞克隆到pBSK+載體(stratagene，SanDiego，CA.)的EcoRI位點(diǎn)，從而使之能進(jìn)行DNA測序。按照商家的說明(US Biochemicals)，用雙脫氧-NTPs和測序酶進(jìn)行測序。用DNASTAR軟件進(jìn)行序列分析和同源搜索(DNAS-TRA，Inc，Madison，WI)。GST融合體的構(gòu)建、蛋白質(zhì)的制備和在活體外的結(jié)合為構(gòu)建GST-491，用Bgl II消化質(zhì)粒C-49并將1.3kb的插入片段亞克隆到pDGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，N.J.)的BamHI位點(diǎn)。通過用Hind III切Y62-25-2，用Klenow補(bǔ)平末端，并將該823bp的片段亞克隆到用SmaI切斷的pGEX-3X上而制得GST-T。用0.1mM IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)(Smith和Johnson，Jene，6731～40(1988))。將細(xì)胞在10K離心5分鐘，將所得到沉淀物重新懸浮于Lysis 250緩沖液(25mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris(pH8.0)，0.1％NP40，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，8μg亮抑酶肽，8μg木瓜蛋白酶抑制劑)。加入4mg溶菌酶，并使細(xì)胞置于4℃30分鐘，用超聲作用使細(xì)胞裂解。離心(10K 30分鐘)除去細(xì)胞碎片，將上清液加到谷光甘肽包被珠中。
活體外的結(jié)合試驗(yàn)按下述方式進(jìn)行。在室溫下將2×106個2E3細(xì)胞(Chen等，1992，infra，在此引作參考)的抽提物與含有2～3μg GST或GST融合蛋白的珠子在Lysis 150緩沖液中一起溫育30分鐘，所述Lysis 150緩沖液為50mMTris(pH7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，0.1％NP-40，50mM NaF，1mM PMSF，每ml 1μg亮抑抑酶肽，每ml 1μg木瓜蛋白酶抑制劑。用Lysis 150緩沖液充分洗滌復(fù)合物，并將之在上樣緩沖液中煮沸，在7.5％的SDS-PAGE上跑膠。將凝膠轉(zhuǎn)移到固定化膜上，用抗-RB單克隆抗體，11D7進(jìn)行免疫印跡。在加入了堿性—磷酸酶—接合的二級抗體后，用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸甲苯銨和氮藍(lán)四唑(BCIP；NBT；Promega Madison，WT)可見結(jié)合的RB蛋白質(zhì)?？贵w的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)的鑒定用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法生產(chǎn)抗-H-NUC抗體，Harlow和Lane的AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)，在此引作參考。簡言之，用大約100μg的GST-491融合蛋白質(zhì)免疫小鼠，并進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫。從免疫的小鼠中收集血清，并將其直接用于免疫沉淀試驗(yàn)。用34S—蛋氨酸對每個細(xì)胞系的大約1×107個細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記2小時(shí)，并隨后將之在冰冷的Lysis 250緩沖液中溶胞產(chǎn)。將澄清的裂解物與各種抗體在4℃溫育1小時(shí)，然后加入蛋白A瓊脂糖珠，并將之在4℃繼續(xù)保溫30分鐘。用裂解緩沖液充分洗滌后，在SDS樣品緩沖液中煮沸瓊脂糖珠，用7.5％SDS-PAGE進(jìn)行分離免疫沉淀物。為進(jìn)行雙免疫沉淀，將所得的免疫復(fù)合物在200ml分離緩沖液I(20mMTrisCl，pH7.4，50mM NaCl，1％SDS和5mM 5Mm DTT)中煮沸以變性蛋白質(zhì)。該變性的蛋白質(zhì)用200ml分離緩沖液II(20mM TrisCl，pH7.4，50mM NaCl，1％NP40和1％脫氧膽酸鈉)稀釋并用抗體再進(jìn)行免疫沉淀。細(xì)胞分級分離步驟分離膜、核、和細(xì)胞漿級分的步驟由Lee，H.W.，等Na-ture(1987)Supra中而來，該文獻(xiàn)在此引作參考。所有的三個級分均按上面所述通過免疫沉淀對RB蛋白質(zhì)和H-NUC含量進(jìn)行分析，而且將等分的每一級分與谷光甘肽珠進(jìn)行溫育以證實(shí)每部分的組合物。DNA結(jié)合分析大約1×107個K562人慢性骨髓性白血病細(xì)胞(ATCC)用35S-蛋氨酸進(jìn)行標(biāo)記，然后將之在Lysis 250緩沖液中裂解。離心以澄清溶胞產(chǎn)物，并用2體積的上樣緩沖液稀釋，上樣緩沖液為10mM KH2PO4，pH6.2，1mM MgCl2，0.5％NP40，1mM DTT，10％甘油。將稀釋的抽提物過DNA—纖維素柱(天然小牛胸腺DNA，Pharmacia，Piscataway，NJ)，該柱在輕微的振蕩下于40℃溫育1小時(shí)。接下來用5床體積的上樣緩沖液洗滌柱子，然后用含有提高濃度NaCl的同樣的緩沖液洗脫。如上所述用抗-RB抗體或者用抗-H-NUC抗體對級分進(jìn)行免疫沉淀分析。等分的每種級分也與谷光甘肽珠一起溫育用以檢測谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶。H-NUC酵母表達(dá)質(zhì)粒；缺失突變體將源于H-NUC cDNA的DNA片段亞克隆到pSE1170上(Durfee等，1993 Supra)克隆491是由酵母雙雜交篩選分離得到的原初克隆。把33kb的XhoI片段插入到修飾的pSE1107中得到框內(nèi)融合蛋白質(zhì)來構(gòu)建H-NUC，RV含有N-末端XhoI-EcoRV片段。BR208，BR207、B5和B6是Sau3A部分消化的產(chǎn)物，來源于這些構(gòu)建體的Gal4融合蛋白質(zhì)含有的氨基酸分別為H-NUC為1-824位的氨基酸，491為559～824位的氨基酸，RV為1-663位的氨基酸，BR2-8為699～824位的氨基酸，BR2-7為797～824位的氨基酸，B5為559～796位的氨基酸和B6為597～796位的氨基酸。用復(fù)性引物替換H-NUC的NsiI片段可產(chǎn)生溫度敏感突變株。該引物如下引物1TGGTATGACCTAGGAATGATTTATTACAAGCAAGAAAAATTCAGCCTTGCAGAAATGCA引物2TTTCTGCAAGGCTGAATTTTTCTTGCTTGTAATAAATCATTCCTGGTCATACCATGCA所有的構(gòu)建體均已由DNA序列分析得到了證實(shí)。酵母轉(zhuǎn)化和β-半乳糖苷酶活性的定量如以前所述用LiOAC方法進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化(Durfee等，1993，Supra，該文獻(xiàn)在此引作參考)，轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板于缺乏色氨酸和亮氨酸的合成液滴培養(yǎng)基中，以選擇存在的質(zhì)粒。在30℃生長2至3天后，每次轉(zhuǎn)化的單一克隆接種于適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基中。2.5ml培養(yǎng)物在適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基中生長至OD600 1.0～1.2。然后按Guarente，L.，Methods Enzy-mol，101181～191(1983)中描述的制備細(xì)胞，滲透細(xì)胞，該文獻(xiàn)在此引作參考。用氯苯基-紅-β-D吡喃半乳糖苷(CPRG；Boehringer Mannheim)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行定量(Durfe-e，1993，Supra)，該文獻(xiàn)在此引作參考。H-NUC與未磷酸化的RB的類似于SV40 T-抗原結(jié)合區(qū)的區(qū)域結(jié)合構(gòu)建了一批缺失突變體。這些突變體原來是用于描述T-結(jié)合域的，按以前所述將其亞克隆到含有Gal-4 DNA一結(jié)合域的質(zhì)粒，PAS1中(Durfee等，1993，Supra)，該文獻(xiàn)在此引作參考。這些構(gòu)建體中的兩個，Gal-4活化域-C-49融合表達(dá)質(zhì)粒(即原初的克隆C-49)和YIpPTG10——含有β-半乳糖苷酶的指示質(zhì)粒。用于共轉(zhuǎn)化醋母菌株Y153(Dur-fee等，1993，Supra)。用Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manul，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Har-bor，N.Y.(1989)——該文獻(xiàn)在此引作參考中描述的方法通過Weston印跡測量每種RB融合蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，結(jié)果相差不到2～3倍。如上所述對所得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的分析。如圖1所示，由于許多和RB蛋白質(zhì)一樣的突變，包括使SV40 T-抗原結(jié)合喪失的706位氨基酸半胱氨酸突變成苯丙氨酸的點(diǎn)突變，減少了C-49融合蛋白質(zhì)和Gal-4-RB的結(jié)合。然而有一個例外，C-49不能與Ssp突變體結(jié)合，該突變體缺少了RB蛋白質(zhì)的C-末端的160個氨基酸，但T-抗原卻能結(jié)合，盡管親合力降低了。缺失了在兩結(jié)合亞域之間的接頭區(qū)部分的MI缺失(612～632位氨基酸)突變體，是唯一能同H-NUC和T-抗原結(jié)合的突變體。顯然，與RB蛋白質(zhì)類似的但不相同的區(qū)域?qū)Y(jié)合T-抗原和C-49來說是必要的。
接下來，在活體外測量C-49蛋白質(zhì)與p110RB結(jié)合的能力。p110RB的氨基酸序列由Lee，W·H·，等在Science 2351394～1399(1987)中公開，該文獻(xiàn)在此引作參考。1.3kb cD-NA(圖3)克隆在大腸桿菌中表達(dá)谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白(Smith和Johnson，Gene 6731～40(1988)，該文獻(xiàn)在此引作參考)。含有等量GST-C-49蛋白質(zhì)和另外兩種對照的谷光甘肽珠，單獨(dú)的GST和GST-T抗原(圖2A)與從人成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞系(WERI RB27)提取的所有細(xì)胞一起溫育，所述的細(xì)胞系用RB基因重建(Chen等，CellGrowth Differ，3119～125(1992)。在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下，這些WERI(RB+)細(xì)胞表達(dá)不同的同型的RB蛋白質(zhì)，如圖2B(泳道2)所示代表不同的磷酸化狀態(tài)。充分洗滌后，結(jié)合到珠子上的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE和Weston印跡按照Sam-brook等公開的方法分析，Sambrook等Supra在此引作參考。用抗-RB抗體，11D7對所顯的印跡進(jìn)行標(biāo)記(Shan等，Mol.Cell.Biol.125620～5631(1992)，該文在此引作參考)。在這些條件下，H-NUC只能和末磷酸化的p110RB以與Gst-T相似的親合力相結(jié)合，Gst-T作為陽性對照。GST單獨(dú)不能和任何的Rb蛋白質(zhì)相結(jié)合(參見圖1A，2～4道)。這些結(jié)果揭示H-MUC蛋白質(zhì)只能與末磷酸化的天然的全長RB蛋白質(zhì)復(fù)合。全長的cDNA和其序列為更充分地分析該新蛋白質(zhì)的特征，用1.3kb的cDNA作探針來篩選人的成纖維細(xì)胞cDNA文庫。在分離出的12個克隆中，最長的cDNA克隆，3.3kb，其序列已完全測出。其開放的閱讀框編碼824個氨基酸的蛋白質(zhì)(圖3)。該蛋白質(zhì)與兩個已知的蛋白質(zhì)，S.pombe酵母nuc2和構(gòu)巢曲霉bimA在總體上有35％的同源性。已知兩個低等真核蛋白質(zhì)參與有絲分裂，因?yàn)檫@兩個基因的溫度——敏感型突變體將細(xì)胞阻止在中期。nuc2和bimA蛋白質(zhì)含有10個34-氨基酸重復(fù)，如圖4所示，一個重復(fù)在N-末端區(qū)，9個在C-末端區(qū)成族排列。在新的RB——相關(guān)蛋白質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)了類似的重復(fù)排列。如果僅將這三個蛋白質(zhì)的9個重復(fù)區(qū)進(jìn)行比較，相同的序列占60％(圖4B)。然而，nuc2和bimA的第一和第二重復(fù)的序列間具有很低的同源性。來源于C-49的蛋白質(zhì)也存在這樣差的同源性?；谛蛄械耐葱裕蛛x的克隆很象人與酵母nuc2和構(gòu)巢曲霉bimA的同源性。因此，C-49克隆即為H-NUC。與RB蛋白質(zhì)結(jié)合的C-末端重復(fù)該H-NUC蛋白質(zhì)既不含已知的L-X-C-X-E基元，該基元是T-抗原和腺病毒E1A用于結(jié)合RB的，也不含已顯示出對結(jié)合RB很重要的E2F的18-氨基酸序列。這一發(fā)現(xiàn)提示H-NUC蛋白質(zhì)用不同的基元結(jié)合RB。為幫助確定這樣基元，構(gòu)建了一系列缺失突變體，每一種突變體含有H-NUCcDNA的不同的區(qū)域，如圖5所示表達(dá)Gal-4融合蛋白質(zhì)。在活體內(nèi)的結(jié)合分析中，用前面所述(Durfee，1993，supra)的酵母雙雜交系統(tǒng)來測定含結(jié)合基元的蛋白質(zhì)區(qū)域。全長的蛋白質(zhì)和原初的克隆(含6個重復(fù))與RB的結(jié)合同樣地好。然而，含有第一個重復(fù)的N-末端都不能與RB結(jié)合。這些數(shù)據(jù)提示H-NUC以一種新的方式與RB結(jié)合，可能通過該蛋白質(zhì)的較大的區(qū)域以特異的二級結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。將640位的甘氨酸變成天冬氨酸產(chǎn)生了敏感型H-NUC突變體，該突變體降低了在非容許溫度下與RB的結(jié)合為了幫助證實(shí)H-NUC與RB的結(jié)合在生理學(xué)上很重要，通過對H-NUC蛋白質(zhì)的定點(diǎn)突變產(chǎn)生在640位氨基酸的單一點(diǎn)突變(Gly→Asp)。nuc2的Gly504變成Asp的相似的變化產(chǎn)生了溫度敏感型表型，該突變阻止S.pombe酵母的中期發(fā)育(Hirano.T.，Y.Hiraoka和M.Yahagida，J.Cell Biol1061171～1183(1988))。既然該甘氨酸殘基在H-NUC蛋白質(zhì)中是保守的，如同酵母的同源序列，產(chǎn)生Gly到Asp的突變將測試在非容許溫度下H-NUC蛋白質(zhì)是否是結(jié)合RB的缺陷型。如圖6所示，含有Gly-640突變的H-NUC蛋白質(zhì)在酵母于37℃(非容許溫度)下生長時(shí)不能與RB相互作用，但在酵母于22℃(容許溫度)下生長時(shí)，該突變蛋白卻保留了其與RB結(jié)合的能力。這些數(shù)據(jù)證明了在假定的中期阻滯的溫度敏感(ts)表型和Rb-結(jié)合特性之間存在著聯(lián)系。H-NUC抗體的制備和H-NUC蛋白質(zhì)的鑒定為在蛋白質(zhì)凝膠和Weston印跡中鑒定該新的H-NUC蛋白質(zhì)，制備了它的小鼠抗體。在大腸桿菌中表達(dá)的Gst-C-49(Smith和Johnson，1988，supra，和Shan等，1992，supra，每篇文獻(xiàn)在此均引作參考)，用谷光甘肽珠純化之，并將其用作抗原來誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體應(yīng)答。然后收獲含多克隆抗-H-NUC抗體的血清。得到抗體后，如前所述，用35S-蛋氨酸代謝標(biāo)記紅白血病細(xì)胞系(K562)，用該細(xì)胞系制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，并用多克隆抗體對之進(jìn)行免疫沉淀。如圖6A所示，用免疫血清(泳道2)沉淀出具有大約95kb分子量的特異蛋白質(zhì)，但用免疫前血清則未沉淀出。該復(fù)合體在凝膠中分離開。因?yàn)?5S-蛋氨酸只對K562特異性地標(biāo)記，因此只有95kDa的蛋白質(zhì)可被見到。當(dāng)用GST蛋白質(zhì)進(jìn)行競爭性免疫沉淀時(shí)，該95kd的蛋白質(zhì)也可被檢出，這證明了多克隆抗體不僅僅只識別GST。另一方面，該原初的抗原能與內(nèi)源性細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行競爭，該95kd的帶變得不可檢測了(泳道3和4)。當(dāng)初級免疫沉淀物變性和再免疫沉淀時(shí)，該抗體的特異性得到了進(jìn)一步證實(shí)。如圖6B所示(泳道3)，95kd蛋白質(zhì)是唯一能被檢出的帶，且背景是清楚的。因此，所有的免疫學(xué)證據(jù)提示95kd蛋白質(zhì)即為H-NUC基因產(chǎn)物。H-NUC蛋白質(zhì)具有DNA-結(jié)合活性用35S-蛋氨酸標(biāo)記大約1×107個細(xì)胞，然后將之在Ly-sis250緩沖液(250mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris(pH8.0)，0.1％NP40，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，8μg/ml的亮抑肽酶和8μg/ml的木瓜蛋白酶抑制劑)中裂解。離心澄清溶胞產(chǎn)物，并用2體積的上樣緩沖液(10mM KH2PO4，pH6.2，1mM MgCl2，0.5％NP40，1mM DTT，10％甘油)稀釋。然后，如前所述，將稀釋的提取物上到DNA-纖維素柱(天然的小牛胸腺DNA，Pharmacia，Poscatawas，NJ)，并使該混合物在輕微振蕩下于4℃保溫1小時(shí)。用5床體積的上樣緩沖液洗滌該柱，然后用含有提高NaCl濃度的同樣的緩沖液洗脫。
用抗成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)的抗體11D7，圖7A)、H-NUC(圖7B)、或GST珠(圖7C)對每種洗脫液的級分進(jìn)行免疫-沉淀分析。等分的每種級分也用來與谷光甘肽一起溫育，用以檢測谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶。RB蛋白質(zhì)具有DNA結(jié)合活性，把其用作陽性對照。H-NUC蛋白質(zhì)具有類似的DNA-結(jié)合活性，但單獨(dú)的谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶卻沒有這樣的活性。同源序列分析表明H-NUC的DNA-結(jié)合區(qū)位于TRP區(qū)域之外。H-NUC定位于染色體17q21～22圖譜如圖9所示3H-標(biāo)記的3.3kb-H-NUC cDNA探針對人染色體的原位雜交表明在17號染色體的q21-22區(qū)顯示出特異性的標(biāo)記。從統(tǒng)計(jì)的150個細(xì)胞的320中，發(fā)現(xiàn)有42例13.1％在17q21-22。背景上其它位點(diǎn)未見標(biāo)記。因?yàn)樗玫奶结樀囊徊糠趾衅浼倩虻耐葱蛄?，在每個受檢測的細(xì)胞中均檢出了近端著絲粒染色體的多重雜交，而且它們被排除在分析之外。用體細(xì)胞雜交法也獲得了相似的做圖結(jié)果，即H-NUC被做圖定位于第17號染色體。H-NUC的定位很有趣，因?yàn)榧易逍匀橄侔┗蛞惨驯蛔鰣D定位于相同的區(qū)域。H-NUC的腫瘤抑制活性在活體外的細(xì)胞培養(yǎng)條件下和在裸鼠動物模型中對H-NUC的腫瘤抑制活性進(jìn)行了估測。用于估測H-NUC腫瘤抑制活性的細(xì)胞系是MDA-MB-231和T-47D，MDA-MB-231含有H-NUC的一個功能性等位基因，T-47D是H-NUC座位的純合突變體。
簡言之，用腺病毒表達(dá)載體表達(dá)H-NUC后對H-NUC對上面兩種細(xì)胞系增殖的作用效果進(jìn)行估測。ACN是缺乏cDNA插入片段的對照腺病毒載體，而AC-H-NUC是在人CMV啟動子控制下的表達(dá)H-NUC的腺病毒載體。含H-NUC的腺病毒載體為構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體，用PCR從Quick Clone雙鏈胎盤eDNA(Clontech)對含有H-NUC全長cDNA的2520個堿基對的片段進(jìn)行擴(kuò)增。為擴(kuò)增H-NUC所用的引物給該片段的5′-末端增加了Kpn I限制酶位點(diǎn)，給3′-末端增加了Xho I位點(diǎn)，這樣使該片段定向克隆到pBluescript II KS+的多克隆位點(diǎn)(5端引物寡核苷酸為5′CGCGGTACCATGACGGTGCTGCAGGAA3′；3端引物的寡物苷酸為5′ATCGGCTCGAGCAGAAGTTAAAATTCATC3′)。PCR循環(huán)如下1圈在94℃1分鐘；30圈在94℃1分鐘，53℃11/2分鐘，72℃2分鐘；和1圈在72℃7分鐘。用TnT Coupled Reticulo-cyte Lysate System(Promega)篩選能產(chǎn)生95KD蛋白質(zhì)的克隆。Bluescript載體的T3啟動子能使H-NUC編碼序列在免網(wǎng)狀細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。每一個網(wǎng)狀細(xì)胞反應(yīng)中加入1μg的微—溶胞產(chǎn)物DNA，并將其在30℃溫育1小時(shí)。10μl的反應(yīng)物與上樣緩沖液混合，在165V電壓下，在10％的聚丙烯酰胺凝膠(Nevex)上跑膠 小時(shí)。干燥凝膠，并將之與膠片過夜曝光。對產(chǎn)生全長蛋白質(zhì)的4個克隆進(jìn)行了測序。用KpnI和HindII消化從載體上收獲H-NUC插入片段，并將之亞克隆到pAdCMVb-載體的KpnI-BgIII位點(diǎn)(載體中BgIII的填入產(chǎn)生了平端)。所有的4個克隆均含有一些突變。將兩個克隆的片段連接起來產(chǎn)生了含有正確的野生型序列的克隆。
為構(gòu)建重組腺病毒，用NruI將上面的質(zhì)粒線化，并與用ClaI消化的d1309突變體的大片段，用CaPO4轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene)共轉(zhuǎn)染(Jones和Shenk，Cell，17683～689(1979)，該文獻(xiàn)在此引作參考)。分離病毒斑，通過限制酶消化分析和用針對于H-NUC cDNA序列的引物的PCR對重組子進(jìn)行鑒定。通過限制性稀釋進(jìn)一步純化重組病毒，用標(biāo)準(zhǔn)方法純化病毒粒子并測定效價(jià)(Graham和Van der Erb，Vi-rology，52456～457(1973)；Graham和Prevec，Manipulationof adenovirus vectors.InMethods in Molecular Biology Vol T；GeneTrans+er and Protocols，Murray E.J.(ed.)The HumanPress Inc.，Clifton N.J.，T109～128(1991))，這兩篇文獻(xiàn)在此均引作參考。
為保證上面的H-NUC載體表達(dá)適當(dāng)大小的蛋白質(zhì)，在提高病毒/細(xì)胞噬斑形成單位的感染復(fù)數(shù)(MOI)的條件下，用對照或者用含H-NUC的重組腺病毒感染T-47D細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞一次，并在裂解緩沖液(50mM Tris-HCl.pH7.5，250mM NaCl，0.1％NP40，50mM NaF，5mM ED-TA，10μg/μl的抑蛋白酶肽，10mg/ml的亮抑酶肽，和1mMPMSF)中收獲之。通過10％SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，并將之轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜與抗-H-NUC抗體溫育，然后將之與連接有辣根過氧化物酶的羊抗-鼠IgG一起溫育，通過化學(xué)發(fā)光在Kodak XAR-5膠片上可見H-NUC的精確表達(dá)(ECL kit，Amersham)。在活體外將乳腺癌細(xì)胞系，MDA-MB-231和T-47D以每100mm板1×106個細(xì)胞接種于Kaighn′s F12/DME培養(yǎng)基中(Irvine Scientific)，對T-47D細(xì)胞，培養(yǎng)基中補(bǔ)加10％FBS和0.2IU的胰島素(Sigma)。該板于37℃7％CO2下保溫過夜。第二天，給細(xì)胞再喂以10ml的生長培養(yǎng)基，并用ACN對照病毒溶胞產(chǎn)物(MOI 10)或者用AC-H-NUC病毒溶胞產(chǎn)物(MOI 10)感染細(xì)胞，在37℃保溫。3天后，除去培養(yǎng)基，用1∶5的乙酸—甲醇溶液固定細(xì)胞。用20％甲醇-0.5％結(jié)晶紫溶液對細(xì)胞染色30分鐘，并用水漂洗以除去多余的染料。
用AC-H-NUC對細(xì)胞的感染，結(jié)果由于H-NUC蛋白質(zhì)的表達(dá)而產(chǎn)生了這些細(xì)胞的生長抑制(圖11)。當(dāng)與ACN對照細(xì)胞相比時(shí)，可觀察到用結(jié)晶紫染色的AC-H-NUC感染的細(xì)胞顯示出細(xì)胞數(shù)目的減少(大約50％)。另外，T-47D細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)變化。該細(xì)胞看起來變得稠密，喪失了其正常生長的特征。當(dāng)T-47D細(xì)胞用對照ACN病毒侵染時(shí)，未發(fā)現(xiàn)明顯的變化。作為對照，雜合細(xì)胞，MDA-MB-231，沒有出現(xiàn)在活體外被ACN或AC-H-NUC的感染。
胸苷的摻入也用來估測H-NUC對細(xì)胞增殖的作用效果。簡言之，將大約3×103MDA-MB-231和T-47D細(xì)胞鋪板于96-孔板(Costar)的每一孔中，并將之保溫過夜(37℃，7％CO2)。用DMEF12/15％FBS/1％谷氨酸對ACN或AC-H-NUC進(jìn)行系列稀釋，以感染復(fù)數(shù)為10和100(MOI)的每種腺病毒對細(xì)胞進(jìn)行感染(每個MOI做4孔的重復(fù))。感染后24小時(shí)時(shí)更換一半體積的細(xì)胞培養(yǎng)基，并每48小時(shí)換一次，直到收獲細(xì)胞。收獲前18小時(shí)，向每個孔中加入1μCi的3H-胸苷。感染后5天，將細(xì)胞收獲于玻璃-纖維濾紙上，用液閃法檢測摻入到細(xì)胞核酸內(nèi)的3H胸苷(TopCount，Packard Instruments)。每種MOI的細(xì)胞增殖(cpm/孔)以占未處理細(xì)胞增殖平均數(shù)的百分?jǐn)?shù)來表達(dá)。
所得的結(jié)果顯示出用ACN或AC-H-NUC處理后，MDA-MB-231細(xì)胞(對H-NUC而言是雜合的)的增殖是相似的(參看圖12)。作為對照，在T-47D細(xì)胞中觀察到了對AC-H-NUC的特異應(yīng)答，T-47D細(xì)胞是H-NUC缺失的，所述應(yīng)答在高M(jìn)OI時(shí)增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)表明腺病毒—介導(dǎo)的H-NUC基因的轉(zhuǎn)移對H-NUC變化了的細(xì)胞產(chǎn)生抗—增殖的作用。體外基因治療為估測H-NUC的表達(dá)對致瘤性的影響，上面的腫瘤細(xì)胞系在裸鼠模型內(nèi)試驗(yàn)了其產(chǎn)生腫瘤的能力。將大約2×107T-47D細(xì)胞鋪板于T225瓶中，并用含有MOI為3或30的ACN或AC-H-NUC的蔗糖緩沖液處理細(xì)胞。過夜感染后，收獲細(xì)胞，并將大約107細(xì)胞經(jīng)皮下注射到BALB/c裸鼠的左脅和右脅(4只/組)，該裸鼠在此之前經(jīng)皮下接受過17β-雌二醇。一側(cè)脅用ACN-處理的細(xì)胞注射，而對照側(cè)脅則用AC-H-NUC細(xì)胞注射，每只小鼠做為自身的對照。雙側(cè)脅接受未經(jīng)處理的細(xì)胞注射的動物做為腫瘤生長的另外的對照。每周測量二次腫瘤的大小(長、寬、高)和體重。假定腫瘤的半徑等于測得的腫瘤大小平均數(shù)的一半，以球體幾何來估算每只動物腫瘤的體積。
該試驗(yàn)的結(jié)果示于圖13，揭示出在表達(dá)H-NUC的細(xì)胞中腫瘤生長明顯減少。簡言之，在細(xì)胞接種21天后，測量所有動物雙側(cè)的腫瘤。對所有4只小鼠，源于由AC-H-NUC(MOI＝30)處理的細(xì)胞腫瘤小于對照側(cè)源于用ACN(MOI＝30)處理的細(xì)胞的腫瘤。在21天的期間內(nèi)，AC-H-NUC(MOI＝30)處理的細(xì)胞引起的腫瘤的平均大小一直比由ACN(MOI＝30)處理的細(xì)胞引起的腫瘤的大小要小。(參見圖3)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了此處公開的H-NUC的腫瘤抑制活性。H-NUC在活體內(nèi)的腫瘤抑制將人乳腺癌細(xì)胞系T-47D細(xì)胞經(jīng)皮下注射到雌性BALB/C無胸腺裸鼠中。使腫瘤發(fā)育32天。此時(shí)，在腫瘤周圍靠近腫瘤的地方注射一次ACN(對照)或AC-H-NUC(含H-NUC基因)的腺病毒載體。然后在注射腺病毒2天或者7天后，切下腫瘤，并從每個腫瘤中分離多聚腺苷+RNA。然后用使用了H-NUC特異引物的反轉(zhuǎn)錄酶-PCR探測經(jīng)處理的腫瘤中的H-NUC RNA。使用肌動蛋白引物的擴(kuò)增做為RT-PCR反應(yīng)的對照，而含有重組體-(H-NUC)序列的質(zhì)粒做為該重組體-(H-NUC)特異帶的陽性對照。
在一獨(dú)立的試驗(yàn)中，T-47D細(xì)胞經(jīng)皮下注射到小鼠右脅的皮下，并使腫瘤生長2周。小鼠接受每周2次共計(jì)8劑的緩沖液或重組病毒的靠近腫瘤的注射。在整個處理過程中對監(jiān)測接受ACN和緩沖液的對照動物和那些接受AC-H-NUC的動物中腫瘤的生長進(jìn)行。體重和存活時(shí)間也在被監(jiān)測之列。乳腺癌細(xì)胞系T-47D細(xì)胞中外源H-NUC的表達(dá)來自乳腺癌細(xì)胞系T-47D的乳腺癌細(xì)胞，因是H-NUC基因的純合突變而不含有內(nèi)源的H-NUC，因此為H-NUC的功能性研究，提供了干凈的背景。用可比較效價(jià)的AC-H-NUC或?qū)φ誂CN載體感染T-47D細(xì)胞。多數(shù)的克隆各自繁殖成塊狀培養(yǎng)物。
用35S對受侵染的細(xì)胞進(jìn)行代謝標(biāo)記，并將之用來制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物以估計(jì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。根據(jù)在裸鼠中測得的形態(tài)學(xué)、生長速率(例如倍增的時(shí)間)、飽和密度、軟瓊脂集落的形成和致腫瘤性，把AC-H-NUC侵染的培養(yǎng)物和對照細(xì)胞進(jìn)行比較。
雖然本發(fā)明結(jié)合參考文獻(xiàn)對目前優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解為在不背離本發(fā)明精神的前提下可對本發(fā)明進(jìn)行各種修飾。相應(yīng)地，本發(fā)明不受下列權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.分離和純化的編碼Rb結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA序列，所述的蛋白質(zhì)在C-末端含有與9個34個氨基酸的肽重復(fù)有至少60％同源性的亞序列，條件是所述的DNA序列既不編碼S.pombe酵母蛋白nuc2、構(gòu)巢曲霉bimA蛋白質(zhì)，也不編碼啤酒酵母(S.cerevisiae)CDC27蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的分離和純化的編碼Rb結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA序列，所述的DNA序列與Sequence I.D.No.1的465到770位氨基酸有60％的同源性。
3.權(quán)利要求1所述的分離和純化的DNA序列，該序列編碼Sequence I.D.No.1的465到770位的氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的和純化的DNA序列，基本上按照Sequence I.D.No.1中所列的順序編碼H-NUC。
5.含有權(quán)利要求1、2、3或4的分離和純化的DNA的重組載體。
6.權(quán)利要求5的重組載體，其中所述載體是粘粒、質(zhì)粒、或由病毒衍生而來。
7.含有權(quán)利要求1、2、3或4所述的DNA分子的表達(dá)載體，該載體能將所述的DNA分子插入哺乳動物寄主細(xì)胞，并在其中表達(dá)蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體選自由質(zhì)粒和病毒載體所組成的組。
9.權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其中所述的病毒載體選自由逆病毒載體和腺病毒載體所組成的組。
10.權(quán)利要求9的表達(dá)載體，其中所述的表達(dá)載體是AC-H-NUC。
11.用于生產(chǎn)具有H-NUC蛋白質(zhì)生物活性的多肽或蛋白質(zhì)或其生物活性衍生物的寄主—載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括在適宜的寄主細(xì)胞中的權(quán)利要求7、8、9或10的載體。
12.權(quán)利要求11的寄主—載體系統(tǒng)，其中寄主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
13.權(quán)利要求11的寄主—載體系統(tǒng)，其中寄主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
14.含有權(quán)利要求7的載體和藥物學(xué)可接受載體的藥物組合物。
15.含有權(quán)利要求8的載體和藥物學(xué)可接受載體的藥物組合物。
16.含有AC-H-NUC載體和藥物學(xué)可接受載體的藥物組合物。
17.由互補(bǔ)于權(quán)利要求1的DNA序列的至少大約27個核苷酸組成的DNA探針。
18.權(quán)利要求17的DNA探針，其中的核苷酸互補(bǔ)于Se-quence I.D.No.1的DNA序列。
19.分離和純化的結(jié)合Rb蛋白的哺乳動物蛋白質(zhì)，所述的蛋白質(zhì)在C-末端含有具有至少6個34個氨基酸的肽重復(fù)的氨基酸序列，條件是所述的蛋白質(zhì)不是S.pombe酵母的nmc2蛋白質(zhì)、構(gòu)巢曲霉bimA蛋白質(zhì)，也不是啤酒酵母CDC27蛋白質(zhì)。
20.權(quán)利要求19的分離和純化的哺乳動物蛋白質(zhì)，在其C-末端含有具有9個34個氨基酸的肽重復(fù)的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求20的分離和純化的哺乳動物蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是具有Sequence I.D.No.2氨基酸順序的H-NUC。
22.生產(chǎn)權(quán)利要求19的蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟a.將含有編碼權(quán)利要求19的蛋白質(zhì)基因的相容性表達(dá)載體插入寄主細(xì)胞；b.使所述的寄主細(xì)胞表達(dá)所述的蛋白質(zhì)。
23.按照權(quán)利要求22的方法，其中所述的寄主細(xì)胞選自由原核寄主細(xì)胞和真核細(xì)胞組成的組。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述的寄主細(xì)胞是哺乳動物寄主細(xì)胞的真核寄主細(xì)胞，且所述的表達(dá)載體與所述的哺乳動物寄主細(xì)胞是相容的。
25.抑制沒有內(nèi)源性H-NUC蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞成瘤表型的方法，包括對這樣的癌細(xì)胞給藥有效量的權(quán)利要求1、2、3或4的DNA。
26.權(quán)利要求25的方法，其中H-NUC基因的施給是通過重組載體。
27.抑制沒有內(nèi)源性H-NUC蛋白質(zhì)的癌細(xì)胞成瘤表型的方法，包括對這樣的細(xì)胞給藥權(quán)利要求19至21的蛋白質(zhì)。
28.與Rb-結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體，所述的蛋白質(zhì)在其C-末端含有具有至少6個34個氨基酸的肽重復(fù)的亞序列，條件是所述的蛋白質(zhì)既不是S.pombe酵母蛋白質(zhì)nuc2、構(gòu)巢曲霉bimA蛋白質(zhì)、也不是啤酒酵母CDC27蛋白質(zhì)。
29.權(quán)利要求28的抗體，所述抗體與具有Sequence I.D.No.2氨基酸序列的H-NUC蛋白質(zhì)結(jié)合。
30.產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，所述的單克隆抗體與具有Sequence I.D.No.2氨基酸序列的H-NUC蛋白質(zhì)結(jié)合。
31.檢測腫瘤細(xì)胞中H-NUC不存在的方法，包括如下步驟a.從腫瘤中制備組織切片；b.將權(quán)利要求26或27的抗體與所述的組織切片接觸；c.檢測所述的抗體與所述的組織切片的結(jié)合是否存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離和純化的編碼Rb結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA序列、含有所述DNA序列的載體、基于所述DNA的DNA探針和使用所述的DNA的載體進(jìn)行治療的方法。本發(fā)明也涉及由所述DNA編碼的蛋白質(zhì)、使用所述蛋白質(zhì)進(jìn)行治療的方法、和表達(dá)所述蛋白質(zhì)的方法。最后，本發(fā)明還涉及針對所述蛋白質(zhì)的抗體、產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤、和使用所述抗體診斷方法。
文檔編號C07H21/04GK1138295SQ94194569
公開日1996年12月18日 申請日期1994年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月20日
發(fā)明者李文華, 陳芳蘭 申請人:德克薩斯系統(tǒng)大學(xué)董事會