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      一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因18個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片的制作方法

      文檔序號(hào):5879810閱讀:602來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因18個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及基因芯片檢測(cè)領(lǐng)域,具體涉及一種快速檢測(cè)2型糖尿病易感基因多個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片,位點(diǎn)涵蓋目前明確與2型糖尿病相關(guān)易感基因。
      背景技術(shù)
      糖尿病是一種由胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙所致的復(fù)雜代謝性疾病, 發(fā)病率逐年上升,我國(guó)的糖尿病發(fā)病人數(shù)位居世界第二,其中90%為2型糖尿病,且發(fā)病年 齡趨向年輕化。持續(xù)高血糖所引發(fā)的慢性并發(fā)癥已成為腎功能衰竭、失明和心腦血管疾病 的主要原因,給個(gè)人、社會(huì)和國(guó)家醫(yī)療保健帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān),成為全球性的社會(huì)衛(wèi)生和經(jīng) 濟(jì)問(wèn)題。由于T2DM具有家族性特征,且不同種族間發(fā)病率存在明顯差異,另外同卵雙生和 異卵雙生個(gè)體發(fā)病率和病情也不同,因此遺傳成分在該病的發(fā)病中起重要作用。因此,通過(guò) 連鎖或關(guān)聯(lián)分析確定糖尿病的易感或致病基因,對(duì)于從基因角度闡釋糖尿病發(fā)病機(jī)制有重 要意義?;蛐酒墙陙?lái)興起的一項(xiàng)重要生物技術(shù),越來(lái)越多地應(yīng)用于基因多態(tài)性分 析和診斷[1][2]。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展,到2007年[3]用全基因組SNP基因芯片進(jìn)行 糖尿病易感基因篩查的研究迅速增多,Diabetes Gene DiscoveryGroup[4],F(xiàn)inland-US Investigation of NIDDM Genetics (FUSION)[5],deC0DEGenetics[6],DiaGenm 等研究使 用 Illumina 100K 或 Illumina 300KSNP 基因芯片,Diabetes Genetics Initiative , Wellcome Trust Case Control Consortium ,Pima[10], Starr County, Texas[11], Old Order Amish[12],Framingham Health Study[13]等研究使用 Affymetrix 100K 或 Affymetrix 500K 芯片,Japanese multi-disease collaborativegenome scan[14]使用 JSNP Genome Scan IOOK SNP 芯片,BioBank Japan[15]使用定制的 268K SNP 芯片。這些研究中發(fā)現(xiàn)了許多新的易感基因位點(diǎn)與2型糖尿病有關(guān),總結(jié)目前已發(fā)現(xiàn)的 與2型糖尿病有關(guān)的易感基因位點(diǎn)(risk variants)主要有以下幾類(lèi)(1)通過(guò)候選基因關(guān)聯(lián)分析(candidate-gene associations)確定的易感基 因位點(diǎn)Prol2Ala位于過(guò)氧化物酶體增殖活化受體gamma基因(PPARG,peroxisome proliferator-activated receptor gamma),該石馬 thiazolidinedione @月夷島素ii1 敏劑的靶點(diǎn)。Glu23Lys位于內(nèi)向整流型鉀離子通道亞家族J基因(KCNJll,the potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 11)該基因編碼磺脲類(lèi)降糖藥的革巴 點(diǎn)ο(2)通過(guò)基于微衛(wèi)星多態(tài)性關(guān)聯(lián)分析確定的易感基因位點(diǎn)rs7903146位于 TCF7L2基因內(nèi)含子區(qū),該基因編碼Wnt信號(hào)通路中一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。該位點(diǎn)在目前所 有已知2型糖尿病相關(guān)的易感基因中效應(yīng)最強(qiáng)。(3)通過(guò)大規(guī)模候選通路研究確立的易感基因位點(diǎn)rsl0010131位于 WFSl (Wolfram syndrome 1)基因內(nèi)含子外顯子交界,該基因可能參與調(diào)解beta細(xì)胞功能。 rs757210位于HNFlB (肝細(xì)胞核因子1B)基因內(nèi)含子區(qū),該基因與胰島發(fā)育和功能有關(guān)。
      (4)通過(guò)全基因關(guān)聯(lián)分析確定的易感基因位點(diǎn)rs8050136位于FTO基因內(nèi)含子 區(qū);rslll875 位于 HHEX/IDE(hematopoietically expressed homeobox[HHEX]/insulin degrading enzyme) SESTffif 7. 7kb^h ;rs7754840^TCDKALl (CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1)基因內(nèi)含子區(qū);rs4402960 位于 IGF2BP2 (insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2)基因內(nèi)含子區(qū);rsl0811661 位于 CDKN2A/ B (cyclin-dependent kinase inhibitors 2a and 2b)基因上訪(fǎng),125kb 處;rsl3266634 編 碼 SLC30A8 (solute carrier family 30, member 8)基因 R325W 突變。(5)通過(guò)對(duì)全基 因組關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行meta分析確定的易感基因位點(diǎn)rsl0923931 位于N0TCH2 (Notch homologue 2,Drosophila)基因內(nèi)含子區(qū),該基因參與胰腺發(fā)育; rs4607103 ^ T ADAMTS9(ADAM metallopeptidase withthrombospondin type 1 motif 9)基因上游 38kb 處;rsl2779790 臨近 CAMKlD(calcium/calmodulin—d印endent protein kinase ID)基因;rs864745 位于 JAZFl (juxtaposed with another zinc finger gene 1)基因內(nèi)含子區(qū);rs7961581 位于 TSPAN8/LGR5 (tetraspanin 8 (TSPAN8)/leucine-rich repeat-containing G-proteincoupled(LGR5)) ■ @ 內(nèi) ^·〒 IK ;rs7578597 IS 碼 THADA (thyroid adenomaassociated) ·@Τ1187Α,$。如何高通量簡(jiǎn)便快速的對(duì)這些已知易感基因位點(diǎn)進(jìn)行分型,對(duì)于驗(yàn)證不同人群這 些位點(diǎn)相關(guān)性差異,或重復(fù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果,即(implication studies)有重要意義。并且 對(duì)大樣本人群進(jìn)行這些位點(diǎn)分型,可判斷通過(guò)這些位點(diǎn)從基因角度預(yù)測(cè)2型糖尿病的效能 (Meigs, J. B. , Prediction of type 2 diabetes :the dawn ofpolygenetic testing for complex disease. Diabetologia, 2009. 52 (42) :p. 568-570.)。例如 Valeriya Lyssenko 等(Narayan, K. Μ. V. and Μ. B. Weber, Clinical Risk Factors, DNA Variants, and the Development of Type 2 Diabetes. New England Journal ofMedicine,2009. 360(13) p. 1360-1360.)對(duì) 16,061 名瑞典人和 2770 芬蘭人分析 16 種 SNP(TCF7L2 (rs7903146), KCNJll (rs5219),PPARG (rsl801282),CDKALl (rs7754840),IGF2BP2 (rs4402960),CDKN2A/ CDKN2B(rsl0811661),F(xiàn)TO (rs9939609),HHEX (rs1111875),SLC30A8 (rsl3266634), WFSl (rsl0010131) , JAZFl (rs864745),CDC123/CAMK1D(rsl2779790),TSPAN8/ LGR5(rs7961581), THADA(rs7578597), ADAMTS9(rs4607103), and N0TCH2(rsl0923931).) 基因型,以檢測(cè)這些易感基因位點(diǎn)預(yù)測(cè)2型糖尿病的效能,發(fā)現(xiàn)在常規(guī)易感因素上,加入 易感基因信息,可提高預(yù)測(cè)效能(加入易感基因信息后,ROC曲線(xiàn)下面積AUC由0. 74升為 0. 75,P= 1. OXliT4)。Lango 等(Lango,H. ,et al. ,Assessing thecombined impact of 18 common genetic variants of modest effect sizes on type 2diabetes risk. Diabetes, 2008. 57 (11) :p. 3129-35.)對(duì)2,598名對(duì)照和2,309名2型糖尿病患者分析18種SNP分型 發(fā)現(xiàn),以攜帶10-12個(gè)易感等位基因組為基準(zhǔn),攜帶彡25個(gè)等位基因組OR為4. 2 (95% CI 2. 11-8. 56)。提示攜帶大量易感等位基因個(gè)體患病可能性更大。對(duì)傳統(tǒng)的糖尿病易感基因檢測(cè)方法主要包括PCR-RFLP、AS-PCR和DNA測(cè)序方法 等,這些方法在基因突變檢測(cè)中起了重要作用,但普遍存在著明顯的不足,傳統(tǒng)的糖尿病易 感基因檢測(cè)方法主要包括PCR-RFLP、AS-PCR和DNA測(cè)序方法等,這些方法在基因突變檢測(cè) 中起了重要作用,但普遍存在著明顯的不足,諸如檢測(cè)基因位點(diǎn)有限、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等, 不適用于大批量、系統(tǒng)檢測(cè),給糖尿病的臨床診斷帶來(lái)困難。
      PCR-RFLP方法是經(jīng)典的生物學(xué)方法,但由于限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)有限,難以實(shí) 現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn),且耗時(shí)較長(zhǎng);AS-PCR方法雖能準(zhǔn)確檢測(cè)突變,但要求擴(kuò)增條件非常 優(yōu)化,且引物要有高度的特異性,否則易出現(xiàn)假限性或假陽(yáng)性結(jié)果;DNA測(cè)序雖是目前公認(rèn) 的檢測(cè)新突變的金標(biāo)準(zhǔn),但由于其對(duì)特殊結(jié)構(gòu)DNA序列無(wú)法測(cè)序,而且只有異質(zhì)性水平> 25%時(shí)才能檢出,而臨床常用標(biāo)本外周血白細(xì)胞中異質(zhì)性水平通常都達(dá)不到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn),因 此很易漏檢。目前常用的SNaPshot和Sequenom技術(shù),應(yīng)用成本高,則需要購(gòu)買(mǎi)昂貴的專(zhuān)門(mén)設(shè) 備。本課題組采用定制基因芯片技術(shù),通過(guò)自動(dòng)化基因芯片點(diǎn)樣儀將預(yù)先合成的探針點(diǎn)樣 于醛 基修飾的玻璃載片上,構(gòu)成專(zhuān)門(mén)針對(duì)2型糖尿病大樣本關(guān)聯(lián)分析用的基因芯片,為檢 測(cè)該芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性,本發(fā)明對(duì)外周血樣本應(yīng)用該芯片進(jìn)行檢測(cè),并測(cè)序驗(yàn)證 芯片檢測(cè)結(jié)果,芯片檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相符。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因18個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種包括上述基因芯片的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明首先提供一種檢測(cè)2型糖尿病18基因位點(diǎn)突變的基因芯 片,其包括固定在固相載體上的用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針,其 核苷酸序列如SEQ ID No. 1 36所示。所述固相載體優(yōu)選為醛基玻片。所述探針5’端有 15個(gè)多聚T,5’端經(jīng)修飾氨基基團(tuán)后固定在醛基玻片上。上述基因芯片點(diǎn)陣布控為玻璃芯片為117個(gè)樣點(diǎn)組成的10行X 12列的矩陣見(jiàn) 附圖1,包括質(zhì)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng),質(zhì)控系統(tǒng)為(1)芯片陽(yáng)性對(duì)照,為SEQID No. 1 14探 針的等量混合的溶液,設(shè)計(jì)布控于左下角,作為陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn),共3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn);(2)芯片 平行對(duì)照,采用25uM的探針溶液點(diǎn)樣,每種探針平行點(diǎn)3個(gè)點(diǎn)(3個(gè)重復(fù)),即每3個(gè)點(diǎn)檢測(cè) 一個(gè)等位基因型;左右共6個(gè)點(diǎn),共同構(gòu)成一個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)區(qū);(3)芯片陰性對(duì)照,為點(diǎn)樣 溶液以及雙蒸水,各三個(gè)點(diǎn),共6個(gè)陰性對(duì)照樣點(diǎn),位于右下角。本發(fā)明還進(jìn)一步提供所述基因芯片的制備方法,其包括如下步驟合成SEQID No. 1 36所示的探針,探針在合成時(shí)5’端多合成15個(gè)多聚T,并經(jīng)氨基基團(tuán)修飾,將修飾 后的探針用TE Buffer制成50uM的溶液,點(diǎn)樣前按1 1比例與點(diǎn)樣溶液混合,終濃度為 25 μ M ;將玻片醛基化修飾;將終濃度為25 μ M的探針溶液按點(diǎn)樣矩陣排列在96孔板;PBS 溶液清洗點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣針,校正,按圖1矩陣點(diǎn)樣;預(yù)點(diǎn)20次,點(diǎn)間間距200um,室溫水合固定 24h。在固定后按下述步驟進(jìn)行洗滌室溫下2XSSC-0. 1% SDS洗滌液中上下提放2-3次, 1XSSC-0. 1% SDS洗滌液中上下提放2min,0.2 X SSC洗滌液中上下提放2min,雙蒸水中抽 提2-3次,離心甩干。進(jìn)一步,本發(fā)明還提供一種含有上述基因芯片的檢測(cè)試劑盒,其還包括用于擴(kuò)增 易感基因位點(diǎn)所在區(qū)域的引物,引物序列為SEQ ID No. 37 72所示的寡核苷酸,所擴(kuò)增區(qū) 域?yàn)镾EQ ID No. 73 90所示。此外其還可以包括以下試劑中的一種或多種雜交液、封閉液、PCR緩沖液、 dNTPs、DNA聚合酶以及MgC12。具體地,為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)步驟
      (1)通過(guò)對(duì)2型糖尿病易感基因位點(diǎn)突變進(jìn)行篩選,應(yīng)用Primer3.0(http:// frodo. wi. mit. edu/primer3/)禾口 NCBI BLAST (http //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. Cgi)輔助設(shè)計(jì)相關(guān)探針和引物,使目的片段擴(kuò)增、雜交反應(yīng)能在同一條件下進(jìn)行。其核苷 酸序列如SEQ ID N o. 1 72所示。這些探針?lè)譃橐赘形稽c(diǎn)檢測(cè)探針和非易感位點(diǎn)檢測(cè)探 針,對(duì)下述 SNP 位點(diǎn)rsl801282、rs5219、rs7903146、rsl0010131、rs757210、rs4430796、 rs8050136、rsllll875、rs7754840、rs4402960、rsl0811661、rsl3266634、rsl0923931、 rs4607103、rs7578597、rs864745、rsl2779790、rs7961581 (具體如表 1 所示)。(2)芯片點(diǎn)陣布控玻璃芯片為117個(gè)樣點(diǎn)組成的10行X 12列的矩陣,包括質(zhì)控 系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng),質(zhì)控系統(tǒng)為(1)芯片陽(yáng)性對(duì)照,為所選的各寡核苷酸探針的等量混合的 溶液(SEQ ID No.l 36),設(shè)計(jì)布控于左下角,共3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn);(2)芯片平行對(duì)照, 采用25uM的探針溶液,各位探針平行點(diǎn)3個(gè)點(diǎn),即每3個(gè)點(diǎn)檢測(cè)一個(gè)等位基因型;左右共 6個(gè)點(diǎn),共同構(gòu)成一個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)區(qū);(3)芯片陰性對(duì)照,為點(diǎn)樣溶液(Micro Spotting Solution Plus 2X,Telechem)以及雙蒸水,各三個(gè)點(diǎn),共6個(gè)陰性對(duì)照樣點(diǎn),位于右下角, 探針具體排布見(jiàn)圖1。(3)包括玻片醛基修飾,點(diǎn)樣,固定,DNA模板提取,PCR擴(kuò)增和標(biāo)記,雜交,洗滌,熒 光檢測(cè)在內(nèi)的多種復(fù)雜反應(yīng)。(4)熒光信號(hào)檢測(cè),通過(guò)ScanAlyze軟件分析各點(diǎn)熒光強(qiáng)度,通過(guò)易感位點(diǎn)和非易 感位點(diǎn)熒光信號(hào)強(qiáng)度步驟,確定基因型。一種檢測(cè)2型糖尿病18個(gè)易感基因位點(diǎn)的微陣列芯片制備步驟是(1)以醛基玻片為載體玻片經(jīng)鉻酸洗液浸泡過(guò)夜,去除表面有機(jī)物等雜質(zhì),然后蒸餾水清洗,再用25%氨 水浸泡過(guò)夜,水洗。pH為4. 5氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇浸泡20min,再用95%乙醇 超聲清洗,純水超聲清洗,115°C烘烤45min,最后在5 %的戊二醛溶液中50min,超聲IOmin, 水洗兩次,置于室溫干燥備用。(2)探針和引物設(shè)計(jì)本發(fā)明研制的微陣列芯片可檢測(cè)目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的與2型糖尿病相關(guān)的18 個(gè)易感基因位點(diǎn)。應(yīng)用 Primer3. 0 (http//frodo. wi. mit. edu/primer3/)和 NCBI BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)輔助設(shè)計(jì)相關(guān)探針和引物,設(shè)計(jì)探針 36條,退火溫度為58士2°C ;以及擴(kuò)增相應(yīng)片段的18對(duì)引物。位點(diǎn)涵蓋了目前明確的與2 型糖尿病相關(guān)的易感位點(diǎn)。(3)芯片點(diǎn)陣布控玻璃芯片為117個(gè)樣點(diǎn)組成的10行X 12列的矩陣,包括質(zhì)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng), 質(zhì)控系統(tǒng)為(1)芯片陽(yáng)性對(duì)照,為所選的各寡核苷酸探針的等量混合的溶液(SEQ ID No. 1 36),設(shè)計(jì)布控于左下角,共3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn);(2)芯片平行對(duì)照,采用25uM的探針 溶液,各位探針平行點(diǎn)3個(gè)點(diǎn),即每3個(gè)點(diǎn)檢測(cè)一個(gè)等位基因型;左右共6個(gè)點(diǎn),共同構(gòu)成一 個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)區(qū);(3)芯片陰性對(duì)照,為點(diǎn)樣溶液(Micro Spotting Solution Plus 2X, Telechem)以及雙蒸水,各三個(gè)點(diǎn),共6個(gè)陰性對(duì)照樣點(diǎn),位于右下角,探針具體排布見(jiàn)圖1。(4)芯片的點(diǎn)樣,固定和洗滌將終濃度為25 μ M的探針溶液按點(diǎn)樣矩陣(點(diǎn)樣矩陣排布見(jiàn)圖1)排列在96孔板;PBS溶液清洗點(diǎn)樣儀(SpotBot3,Telechem)點(diǎn)樣針,校正,按圖1矩陣點(diǎn)樣;預(yù)點(diǎn)20次,點(diǎn)間間距200um,室溫水合固定24h。所述芯片洗滌過(guò)程為室溫下2XSSC-0. 1% SDS洗滌液 中上下提放2-3次,1XSSC-0. 1% SDS洗滌液中上下提放2min,0. 2X SSC洗滌液中上下提 放2min,雙蒸水中抽提2-3次,離心甩一種檢測(cè)2型糖尿病18個(gè)易感基因位點(diǎn)的微陣列芯片檢測(cè)步驟是(1)收取病人標(biāo)本,提取DNA模板。(2)采用SEQ ID No. 37 72所示引物,擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)液是由 10Xbuffer,10ymol/L 的正向引物,lOymol/L 反向弓丨物,25mmol/L MgCl2, IOmmol/ LdNTPs (含0. 5nM Cy3_dCTP,由Amersham公司提供)和無(wú)菌雙蒸水組成。擴(kuò)增條件為95°C 預(yù)變性3min, 35個(gè)循環(huán)(94°C變性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸30s),72°C延伸7min。(3斤0 產(chǎn)物1001變性,驟冷。(4) 42°C預(yù)雜交30min封閉非特異性結(jié)合;預(yù)加熱變性的Cy3_DNA與雜交液(DIG Easy Hyb,R0Che)按1 10混勻,42°C雜交4h,每個(gè)樣本同時(shí)用兩個(gè)相同矩陣重復(fù)檢測(cè)。(5)室溫下2XSSC-0. 1% SDS洗滌液中上下提放2-3次,1XSSC-0. 1% SDS洗滌 液中上下提放2min,0. 2 X SSC洗滌液中上下提放2min,雙蒸水中抽提2_3次,離心甩干。(6) LuxScan 10K-A (CapitalBio, Beijing)芯片掃描儀在 570nm 波長(zhǎng)采集芯片圖 像(分辨率10um,激光器功率95%,PMT增益650)。所得結(jié)果通過(guò)ScanAlyze軟件分析, 獲得芯片分析數(shù)據(jù)。根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度比值(易感等位基因各點(diǎn)熒光強(qiáng)度均值/非易感等 位基因各點(diǎn)熒光強(qiáng)度均值,具體分析方法同ScanAlyze軟件手冊(cè)介紹),若比值大于3則判 為易感等位基因純合型,在0. 3以下非易感等位基因純合型,介于0. 3-3之間,判為雜合型。 (比值衡量標(biāo)準(zhǔn)參考Du W,Marsac C,Kruschina M,Ortigao F,Florentz C. Functionalized self-assembled monolayer ongold for detection of human mitochondrial tRNA gene mutations. Anal Biochem. 2003 Nov 1;322(1) 14-25.)(7)該芯片具有下優(yōu)點(diǎn)①一張芯片可同時(shí)檢測(cè)1-5份不同標(biāo)本的18個(gè)易感基 因位點(diǎn);②操作簡(jiǎn)單,標(biāo)記擴(kuò)增同步完成,在保證目的片段豐度同時(shí),完成標(biāo)記反應(yīng),無(wú)需顯 色;③可檢測(cè)目前已明確的18個(gè)易感基因位點(diǎn),無(wú)漏檢和誤診。④根據(jù)野生型和突變型熒 光強(qiáng)度比值,以及背景信號(hào)強(qiáng)度,判斷被檢位點(diǎn)基因型,結(jié)果科學(xué)客觀。各位點(diǎn)片內(nèi)平行對(duì) 照點(diǎn)間熒光強(qiáng)度一致性好,變異系數(shù)小于6. 4%,片間同位點(diǎn)間變異系數(shù)小于8. 63%,檢測(cè) 結(jié)果假陽(yáng)性率為2. 65%,假陰性率為0. 76% ;⑤成本低,反應(yīng)體系微量,一次雜交反應(yīng)體系 為100微升。發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明研制了一種快速檢測(cè)18個(gè)2型糖尿病相關(guān)位點(diǎn)的微陣列芯片。該芯片可 ①18對(duì)引物擴(kuò)增和Cy3熒光染料標(biāo)記可在同一條件下進(jìn)行,在保證后續(xù)反應(yīng)所需DNA量的 同時(shí)完成標(biāo)記,省時(shí)并降低了實(shí)驗(yàn)成本。②Cy3熒光染料標(biāo)記,洗片后可直接熒光掃描儀觀 察結(jié)果,無(wú)需顯色,根據(jù)兩種探針雜交信號(hào)強(qiáng)弱,可判定被測(cè)位點(diǎn)基因型,省時(shí)。③探針退 火溫度為58士2°C,在42°C雜交可獲得滿(mǎn)意的雜交效果;④芯片包含檢測(cè)系統(tǒng)和質(zhì)控系統(tǒng) 兩個(gè)體系,可系統(tǒng)檢測(cè)2型糖尿病相關(guān)18個(gè)易感基因位點(diǎn),并有質(zhì)量控制;位點(diǎn)涵蓋了目 前已確定的與2型糖尿病易感基因明確相關(guān)的基因位點(diǎn)。相對(duì)于目前常用的SNaPshot和 Sequenom技術(shù),該芯片方法不需要特殊的昂貴儀器,實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的熒光顯微鏡即可進(jìn)行檢測(cè)。該芯片適用于大樣本低成本2型糖尿病易感基因關(guān)聯(lián)分析。


      圖1為2型糖尿病易感基因18個(gè)位點(diǎn)突變位點(diǎn)檢測(cè)微陣列芯片點(diǎn)樣矩陣圖,其 中·為陽(yáng)性對(duì)照;〇為陰性對(duì)照(雙蒸水); 為點(diǎn)樣液對(duì)照(點(diǎn)樣溶液Micro Spotting Solution Plus 2X,Telechem) ;◎?yàn)榉且赘械任换驒z測(cè)探針;Θ為易感等位基因檢測(cè)探 針;圖2為Cy3標(biāo) 記18個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)微陣列玻璃芯片檢測(cè)結(jié)果,同一標(biāo)本平行做兩 矩陣重復(fù)對(duì)照。圖3為微陣列芯片檢測(cè)的18個(gè)易感基因位點(diǎn)測(cè)得基因型測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果圖。
      具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明,但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特 別指明,實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1探針和引物設(shè)計(jì)本發(fā)明通過(guò)對(duì)2型糖尿病易感基因位點(diǎn)突變進(jìn)行篩選,設(shè)計(jì)相關(guān)探針,經(jīng)過(guò)反復(fù) 試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證,得到了一組雜交特異性高準(zhǔn)確度好的探針,探針序列如表1所示。表1 18個(gè)位點(diǎn)野生型和突變型探針序列
      權(quán)利要求
      一種檢測(cè)2型糖尿病18基因位點(diǎn)突變的基因芯片,其包括固定在固相載體上的用于檢測(cè)2型糖尿病易感基因的特異性寡核苷酸探針,其核苷酸序列如SEQ ID No.1~36所示。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片,其特征在于,所述固相載體為醛基玻片。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因芯片,其特征在于,所述探針5’端有15個(gè)多聚T,5’端 經(jīng)修飾氨基基團(tuán)后固定在醛基玻片上。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述基因芯片,其特征在于,該基因芯片點(diǎn)陣布控玻璃芯片為 117個(gè)樣點(diǎn)組成的10行X 12列的矩陣,包括質(zhì)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng),質(zhì)控系統(tǒng)為(1)芯片陽(yáng) 性對(duì)照,為SEQ ID No.廣36探針的等量混合的溶液,作為陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn),設(shè)計(jì)布控于左下角, 共3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn);(2)芯片平行對(duì)照,采用25uM的探針溶液點(diǎn)樣,每種探針設(shè)置平行 點(diǎn)3個(gè)點(diǎn),即每3個(gè)點(diǎn)檢測(cè)一個(gè)等位基因型;左右共6個(gè)點(diǎn),共同構(gòu)成一個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)區(qū); (3)芯片陰性對(duì)照,為點(diǎn)樣溶液以及雙蒸水,各三個(gè)點(diǎn),共6個(gè)陰性對(duì)照樣點(diǎn),位于右下角。
      5.權(quán)利要求廣4任一項(xiàng)所述基因芯片的制備方法,其包括如下步驟合成SEQID No.廣36所示的探針,探針在合成時(shí)5’端多合成15個(gè)多聚T,并經(jīng)氨基基團(tuán)修飾,將修飾后 的探針用TE Buffer制成50uM的溶液,點(diǎn)樣前按1 1比例與點(diǎn)樣溶液混合,終濃度為25 mM ;將玻片醛基化修飾;將終濃度為25mM的探針溶液按點(diǎn)樣矩陣排列在96孔板;PBS溶液 清洗點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣針,校正,按圖1矩陣點(diǎn)樣;預(yù)點(diǎn)20次,點(diǎn)間間距200um,室溫水合固定24h。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,其還包括在固定后按下述步驟進(jìn)行洗滌 室溫下2XSSC-0. P/oSDS洗滌液中上下提放2-3次,1XSSC-0. 1% SDS洗滌液中上下提放 2min, 0. 2 X SSC洗滌液中上下提放2min,雙蒸水中抽提2_3次,離心甩干。
      7.含有權(quán)利要求廣4任一項(xiàng)所述基因芯片的試劑盒。
      8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒,其還包括用于擴(kuò)增易感基因位點(diǎn)所在區(qū)域的引物, 引物序列為SEQ ID No. 37 72所示的寡核苷酸,所擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镾EQ ID No. 73 90所示。
      9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒,其包括以下試劑中的一種或多種雜交液、封閉 液、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶以及MgCl2。
      全文摘要
      本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)2型糖尿病易感基因18個(gè)位點(diǎn)突變的基因芯片。該芯片以固定在固相載體上的SEQIDNo.1~36所示的探針作為檢測(cè)系統(tǒng),并進(jìn)一步包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和平行對(duì)照組成質(zhì)控系統(tǒng)包。本發(fā)明還同開(kāi)了該基因芯片檢測(cè)的配套引物,這些引物可在同一退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增同時(shí)完成Cy3標(biāo)記,經(jīng)過(guò)1次雜交反應(yīng),即可檢測(cè)18個(gè)基因位點(diǎn)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、快速、效率高,能夠系統(tǒng)地篩選目前國(guó)內(nèi)外報(bào)導(dǎo)的2型糖尿病易感基因18個(gè)位點(diǎn)突變,適用于大樣本低成本2型糖尿病易感基因關(guān)聯(lián)分析。
      文檔編號(hào)G01N21/64GK101956017SQ20101051827
      公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
      發(fā)明者丁峰, 劉松梅, 周新, 梁純子, 王春芳, 袁媛, 謝焱, 鄧冠華, 鄭璇, 馬海波 申請(qǐng)人:廣州陽(yáng)普醫(yī)療科技股份有限公司;武漢大學(xué)
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