專利名稱：蛋白酶穩(wěn)定化的、?；葝u素類似物的制作方法
蛋白酶穩(wěn)定化的、酰化胰島素類似物發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及對蛋白酶顯示抗性的新型?；葝u素類似物，制備這樣的胰島素類似 物的方法，包含本發(fā)明的胰島素類似物的胰島素制劑，和使用這些胰島素類似物來治療糖 尿病的方法。
發(fā)明背景
糖尿病是代謝病，在這種病中，使用葡萄糖的能力部分或完全喪失。在所有人中大 約5%的人患有糖尿病，并且這種疾病接近流行比例。自從在1920年代引入胰島素以來，人 們?yōu)榱烁倪M糖尿病的治療而進行了不斷的努力。由于患有糖尿病的人需要在幾十年內(nèi)進行 長期治療，安全、方便和生活質(zhì)量得到改進的胰島素制劑是主要需要。
到目前為止，口服途徑是最廣泛使用的給藥途徑，并且通常能夠被患者很好地接 受，尤其是長期治療的患者。然而，由于一些障礙，例如，在胃腸(GI)道和腸粘膜中的酶降 解、藥物射流泵、從腸粘膜中吸收不充分和發(fā)生變化、以及在肝中的首過代謝，治療肽或蛋 白的給藥常常局限于腸胃外途徑，而不是優(yōu)選的口服途徑。
通常，胰島素制劑是通過皮下注射給藥的。然而，由于患者的依從性、安全性和便 利性，通過其它途徑例如口服或肺部給藥是有利的。一些可商購的胰島素制劑的特點在于 快速起作用，其它制劑起效相對緩慢，但具有或多或少的延長作用。對于糖尿病患者非常重 要的是，市場上存在大量的具有不同作用時限(作用特征)的胰島素。簡而言之，胰島素可 分為短效、中效或長效。
WO 2008/034881涉及某些胰島素類似物，其中至少兩個疏水性氨基酸被親水性氨 基酸取代，所述胰島素類似物不是酰化的。
EP 2008/060733和EP 2008/060733涉及某些酰化胰島素類似物，其中所述胰島 素類似物包含一延長部分，其一氨基酸或肽殘基的C末端與A21氨基酸相連。
EP 2008/060734涉及某些?；葝u素，其中?；糠峙c母體胰島素相連接且其中 所述?；糠职ê瑏喭榛贾貜?fù)單元的氨基酸。
發(fā)明方面
本發(fā)明的一個方面涉及提供胰島素類似物，當(dāng)口服給藥時，其可以得到令人滿意 的血糖水平控制。
本發(fā)明的另一個方面涉及提供胰島素類似物，當(dāng)口服給藥時，其可以延遲降低葡 萄糖水平。
本發(fā)明的另一個方面涉及提供基本胰島素類似物，當(dāng)口服給藥時，其可以延遲降 低葡萄糖水平。
本發(fā)明的另一個方面涉及提供基本胰島素類似物，當(dāng)口服給藥時，其在每日三次 給藥后可以得到令人滿意的血糖水平控制。
本發(fā)明的另一個方面涉及提供基本胰島素類似物，當(dāng)口服給藥時，其在每日兩次 給藥后可以得到令人滿意的血糖水平控制。
本發(fā)明的另一個方面涉及提供基本胰島素類似物，當(dāng)口服給藥時，其在每日一次8給藥后可以得到令人滿意的血糖水平控制。
本發(fā)明的另一個方面涉及提供基本胰島素類似物，其為親水的。
本發(fā)明的另一個方面涉及提供基本胰島素類似物，其比人胰島素更親水。
本發(fā)明的另一個方面涉及提供基本胰島素類似物，正如通過本文中描述的相對疏 水性(k’ rel)測定的，其不如人胰島素疏水。
本發(fā)明的另一方面涉及基本胰島素類似物的提供，正如通過本文中所述的相對疏 水性(k’ rel)所測定的，所述基本胰島素類似物不如用相同?；糠瞩；南嗨频姆堑鞍?酶穩(wěn)定化的母體胰島素疏水。
本發(fā)明基本胰島素類似物的K’rel優(yōu)選少于5，更優(yōu)選少于3，更優(yōu)選少于2，更優(yōu) 選少于1，更優(yōu)選少于0. 8，更優(yōu)選少于0. 6，更優(yōu)選少于0. 5，更優(yōu)選少于0. 4，更優(yōu)選少于 0. 3，更優(yōu)選少于0.2，更優(yōu)選少于0. 1。
本發(fā)明的另一方面涉及提供基本胰島素類似物，當(dāng)口服給藥時，其具有令人滿意 的生物利用度。與相同劑量的沒有蛋白酶穩(wěn)定化突變的相似的?；葝u素的生物利用度相 比，本發(fā)明優(yōu)選化合物的生物利用度比所述非蛋白酶穩(wěn)定化的比較物至少高10%，優(yōu)選高 20 %，優(yōu)選高25 %，優(yōu)選高30 %，優(yōu)選高35 %，優(yōu)選高40 %，優(yōu)選高45 %，優(yōu)選高50 %，優(yōu)選 高55 %，優(yōu)選高60 %，優(yōu)選高65 %，優(yōu)選高70 %，優(yōu)選高80 %，優(yōu)選高90 %，優(yōu)選高100 %， 優(yōu)選高超過100%。
本發(fā)明的另一方面涉及提供基本胰島素類似物，當(dāng)口服給藥時，其具有令人滿意 的生物利用度。本發(fā)明優(yōu)選化合物的生物利用度(相對靜脈給藥)為至少0.3%，優(yōu)選> 0. 5%，優(yōu)選> 1%，優(yōu)選> 1. 5%，優(yōu)選> 2%，優(yōu)選> 2. 5%，優(yōu)選> 3%，優(yōu)選> 3. 5%，優(yōu) 選> 4%，優(yōu)選> 5%，優(yōu)選> 6%，優(yōu)選> 7%，優(yōu)選> 8%，優(yōu)選> 9%，優(yōu)選> 10%。
本發(fā)明的另一方面涉及提供基本胰島素類似物，當(dāng)通過靜脈輸液給藥時，其具有 令人滿意的功效。與人胰島素的功效相比，本發(fā)明優(yōu)選的蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素類似物的 功效優(yōu)選> 5%，優(yōu)選> 10%，優(yōu)選> 20%，優(yōu)選> 30%，優(yōu)選> 40%，優(yōu)選> 50%，優(yōu)選> 75%和優(yōu)選> 100%。
本發(fā)明的另一方面涉及提供胰島素類似物，當(dāng)通過肺部給藥時，其可得到令人滿 意的血糖水平控制。
本發(fā)明的另一方面涉及提供胰島素類似物，當(dāng)通過肺部給藥時，其可得到令人滿 意的血糖水平控制，同時起效相對緩慢，和/或具有或多或少的延長作用。
本發(fā)明的另一方面涉及提供胰島素類似物，其在肺部給藥后具有令人滿意的長效 作用。與相同劑量的沒有蛋白酶穩(wěn)定化突變的相似的?；葝u素相比，本發(fā)明優(yōu)選化合物 的作用時間比比較物長至少10 %，優(yōu)選長20 %，優(yōu)選長25 %，優(yōu)選長30 %，優(yōu)選長35 %，優(yōu) 選長40 %，優(yōu)選長45 %，優(yōu)選長50 %，優(yōu)選長55 %，優(yōu)選長60 %，優(yōu)選長65 %，優(yōu)選長70 %， 優(yōu)選長80%，優(yōu)選長90%，優(yōu)選長100%，優(yōu)選長超過100%。作用時間可通過抑制血糖的 時間，或通過測定相關(guān)藥物動力學(xué)特性，例如tl/2或MRT(平均停留時間)來測定。
本發(fā)明的另一方面涉及提供胰島素類似物，其具有令人滿意的肺部生物利用度。 與人胰島素的生物利用度相比，或與相同劑量的沒有蛋白酶穩(wěn)定化突變的相似?；葝u素 相比，本發(fā)明優(yōu)選化合物的生物利用度比比較物高至少10 %，優(yōu)選高20 %，優(yōu)選高25 %，優(yōu) 選高30%，優(yōu)選高35%，優(yōu)選高40%，優(yōu)選高45%，優(yōu)選高50%，優(yōu)選高55%，優(yōu)選高60%，優(yōu)選高65 %，優(yōu)選高70 %，優(yōu)選高80 %，優(yōu)選高90 %，優(yōu)選高100 %，優(yōu)選高超過100 %。
本發(fā)明的另一方面涉及提供胰島素類似物，其具有提高的表觀體內(nèi)功效。
本發(fā)明的另一方面涉及提供具有口服生物利用度的長效胰島素。
本發(fā)明的另一方面涉及提供胰島素類似物，與人胰島素的穩(wěn)定性相比，其具有提 高的蛋白水解穩(wěn)定性。與人胰島素相比，本發(fā)明優(yōu)選化合物的蛋白水解穩(wěn)定性比比較物至 少2倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選3倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選4倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選5倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選6倍地更 穩(wěn)定，優(yōu)選7倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選8倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選9倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選10倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選 12倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選14倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選16倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選18倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選20倍地 更穩(wěn)定，優(yōu)選25倍地更穩(wěn)定，優(yōu)選超過25倍地更穩(wěn)定。蛋白水解穩(wěn)定性可通過將所述胰島 素暴露于蛋白水解酶(的混合物)，例如，本文中所述腸道酶提取物來測定。
本發(fā)明的目的是克服或或改善現(xiàn)有技術(shù)的至少一個缺點，或提供有用的替代品。
定義
本文中，術(shù)語胰島素包括天然存在的胰島素，例如人胰島素，以及其胰島素類似 物。人胰島素由兩個多肽鏈組成，所述兩個多肽鏈被稱為A和B鏈，其分別包含21個和30 個氨基酸殘基且其通過兩個胱氨酸二硫鍵連接。
本文中，術(shù)語氨基酸殘基包括從氨基上除去氫原子和/或從羧基上除去羥基和/ 或從巰基上除去氫原子的氨基酸。不嚴(yán)密地說，氨基酸殘基可以被稱為氨基酸。
本文中，疏水性的氨基酸應(yīng)理解為天然存在的氨基酸色氨酸(Trp，W)，苯丙氨酸 (Phe, F)，纈氨酸(Val, V)，異亮氨酸(lie, I)，亮氨酸(Leu, L)和酪氨酸(Tyr, Y)(在括號 中是三個字母和一個字母縮寫)。
本文中，親水性的氨基酸應(yīng)理解為天然氨基酸，其不是按照上面定義的疏水性氨 基酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的親水性氨基酸選自谷氨酸(Glu，E)，天冬氨酸(Asp， D)，組氨酸(His, H)，谷氨酰胺(Gin, Q)，天冬酰胺(Asn, N)，絲氨酸(Ser, S)，蘇氨酸(Thr， T)，脯氨酸(Pro，P)，甘氨酸(Gly，g)，賴氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R)。在另一實施方案 中，本發(fā)明的親水性氨基酸選自谷氨酸(Glu，E)，天冬氨酸(Asp，D)，組氨酸(His，H)，谷氨 酰胺(Gln，Q)，天冬酰胺(Asn，N)，賴氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R)。
本文中，術(shù)語胰島素類似物包括多肽，其通過去除和/或取代(置換)天然胰島素 中存在的一個或多個氨基酸殘基和/或通過添加一個或多個氨基酸殘基，具有形式上可以 源自于天然存在胰島素例如人胰島素結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)。添加和/或取代的氨基酸殘基可以 是可編碼的氨基酸殘基或其它天然存在的氨基酸殘基或純粹合成的氨基酸殘基。在優(yōu)選的 實施方案中，與人胰島素相比，所述胰島素類似物具有兩個或更多個突變。
本文中，術(shù)語蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素是指沒有附加?；糠值囊葝u素。所述蛋白 酶穩(wěn)定化的胰島素對抗蛋白酶的降解作用具有改善的穩(wěn)定性。
本文中，術(shù)語母體胰島素是指沒有附加?；糠趾蜎]有突變來改善針對蛋白酶降 解作用的穩(wěn)定性的胰島素。相對于人胰島素，所述母體胰島素任選具有突變。由此，母體胰 島素還是上面定義的胰島素類似物。本文中，術(shù)語母體胰島素和非蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素 包括相同化合物。
本文中，術(shù)語突變包括氨基酸序列的任何變化(用可編碼的氨基酸進行取代和插 入，以及缺失)。10
本文中，術(shù)語人胰島素的A鏈的類似物和B鏈的類似物分別包括人胰島素的A和B 鏈，其分別相對于人胰島素的A和B鏈，分別具有A和B氨基酸鏈的一個或多個取代、缺失 和/或延長(添加)。
本文中，術(shù)語例如Al、A2、A3等等分別表明胰島素A鏈中的位置1、2和3 (從N端 計算)。類似地，術(shù)語例如Bl、B2、B3等等分別表明胰島素B鏈中的位置1、2和3 (從N端計 算)。使用氨基酸的一個字母代碼，術(shù)語例如A21A、A21G和A21Q表示在A21位的氨基酸分 別是A、G和Q。使用氨基酸的三個字母代碼，相應(yīng)的表達分別是AlaA21、GlyA21和GlnA21。
本文中，術(shù)語A(O)或B(O)表示分別在A或B鏈中分別與Al或Bl位相鄰的N-末 端位置。術(shù)語A(-l)或B(-l)分別表示第一個氨基酸N-末端相對于A(O)或B(O)的位置。 因此，A(-2)和B(-2)分別表示相對于A(-l)和B(-l)的N-末端位置，A(_3)和B(_3)分別 表示相對于A (-2)和B (-2)的N-末端位置，等等。
本文中，術(shù)語例如desB^和desB30分別表示缺乏B^或B30氨基酸殘基的胰島 素類似物。
本文中，術(shù)語“快速起作用的胰島素”包括比正?；蚱胀ǖ娜艘葝u素起效更快的胰島素。
本文中，術(shù)語“長效胰島素”或術(shù)語“基本胰島素”包括具有比正?；蚱胀ǖ娜艘葝u 素更長的作用時間的胰島素。優(yōu)選地，時間-作用超過5或8小時，特別地為至少9小時。 優(yōu)選地，基本胰島素具有至少10小時的時間-作用。因此，基本胰島素可以具有范圍為大 約8至M小時，優(yōu)選在大約9至大約15小時的時間-作用。
對胰島素類似物、胰島素和A和B鏈中的位置加以編號，以使母體化合物是具有用 于它的編號的人胰島素。
本文中，術(shù)語“?；囊葝u素”包括通過連接基將一個或多個?；糠峙c蛋白酶穩(wěn) 定化的胰島素連接的胰島素的改型。
具有胰島素活性的?；囊葝u素是指適當(dāng)給藥之后(例如，靜脈內(nèi)或皮下給 藥)，具有降低哺乳動物血糖的能力，其在合適的動物模型中測定，動物模型可以是例如大 鼠、兔子或豬模型，或具有胰島素受體結(jié)合親和性的?；囊葝u素。
本文中，術(shù)語烷基包括飽和、支鏈或直鏈烴基。
本文中，術(shù)語烷氧基包括自由基“烷基-0-”。代表性的實例是甲氧基，乙氧基，丙氧 基(例如，1-丙氧基和2-丙氧基)，丁氧基(例如，1-丁氧基，2-丁氧基和2-甲基-2-丙 氧基)，戊氧基(1-戊氧基和2-戊氧基)，己氧基(1-己氧基和3-己氧基)，等等。
本文中，術(shù)語亞烷基包括具有1至12個碳原子的飽和、支鏈或直鏈二價烴基。代表 性的實例包括但不局限于亞甲基；1，2-亞乙基；1，3-亞丙基；1，2-亞丙基；1，3-亞丁基； 1，4_亞丁基；1，4-亞戊基；1，5_亞戊基；1，5-亞己基；1，6-亞己基；等等。
本文中，術(shù)語“中性直鏈氨基酸”包括。中性直鏈氨基酸的非限定性實例為。
本文中，術(shù)語“環(huán)狀氨基酸”包括。環(huán)狀氨基酸的非限定性實例為。
本文中，術(shù)語“酸性氨基酸”包括。酸性氨基酸的非限定性實例為。
本文中，術(shù)語“脂肪酸”包括直鏈或支鏈脂族羧酸，其具有至少兩個碳原子并為飽 和或不飽和的。脂肪酸的非限定實例為肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸。
本文中，術(shù)語“脂肪族二酸”包括直鏈或支鏈脂族二羧酸，其具有至少兩個碳原子11并為飽和或不飽和的。脂肪族二酸的非限定實例為琥珀酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷 二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸和二十烷二酸。
本文中，胰島素的命名按照以下原則進行根據(jù)相對人胰島素的突變和修飾(酰 化)給予名稱。就?；糠值拿?，按照IUPAC命名法進行命名，其它情況下按照肽命 名法。例如，命名以下?；糠?br> ΓHw人 OZ0^rNz0 O AHO
可例如為“十八烷二酰-Y Glu-OEG-OEG”或“ 17-羧基十七烷酰-Y Glu-OEG-OEG”， 其中
OEG 是氨基酸 NH2 (CH2) 20 (CH2) 20CH2C02H 的簡化符號，
y Glu是氨基酸、谷氨酸的簡化符號。
氨基酸的其它簡化符號有，例如
PEG3 是 NH2 ((CH2) 20) 4CH2CH2C02H
PEG7 是 NH2 ((CH2) 20) 8CH2CH2C02H
例如，實施例9的胰島素(具有下面給出的序列/結(jié)構(gòu))命名為“A14E，B25H， Β29Κ(Νε十八烷二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30人胰島素”，以指出人胰島素中的A14位的 氨基酸Y已突變成E，人胰島素中B25的氨基酸F已突變成H，人胰島素中B^位的氨基酸 K通過在B29的賴氨酸殘基中的ε氮(表示為Νε)上被十八烷二酰-γ Glu-OEG-OEG殘基 ?；恍揎棧腿艘葝u素中B30位的氨基酸T缺失。下式中的星號表示與人胰島素相比， 提到的殘基是不同的(即經(jīng)過突變)。本申請中，給出了本發(fā)明優(yōu)選胰島素的式和名稱。
本文中，術(shù)語“化學(xué)穩(wěn)定性，，和“高度化學(xué)穩(wěn)定性，，是指，從化學(xué)上，本發(fā)明的胰島 素在所需制劑中足夠穩(wěn)定。也就是，僅形成不損害最終藥物產(chǎn)物的保質(zhì)期的量的化學(xué)降解12產(chǎn)物?；瘜W(xué)降解產(chǎn)物包括脫酰胺產(chǎn)物、異天冬氨酸酯形成、二聚體形成、外消旋化產(chǎn)物、從脫 水過程等產(chǎn)生的產(chǎn)物?；瘜W(xué)穩(wěn)定性可通過老化樣品或制劑的HPLC分析測定。
本文中，術(shù)語“高度物理穩(wěn)定性”包括原纖化傾向小于人胰島素原纖化傾向的 50%。原纖化可以通過在給定條件下原纖維開始形成之前的滯后時間來描述。
具有胰島素受體和IGF-I受體親和性的多肽是在合適結(jié)合測定中能夠與胰島素 受體和人IGF-I受體相互作用的多肽。這種受體測定在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且進一步 在實施例中描述。本發(fā)明的酰化胰島素不會與IGF-I受體結(jié)合，或與所述受體具有相當(dāng)?shù)?的親和性。更確切地說，本發(fā)明的?；葝u素對IGF-I受體的親和性基本上與人胰島素的 親和性相同或更小。
本文中所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指適合于正常藥物應(yīng)用，即不會在患者體 內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重的不利事件。
本文使用的術(shù)語治療和醫(yī)冶是指為了抵御疾病、障礙或病癥而對患者進行的處理 和護理。該術(shù)語意在包括延遲疾病、障礙或病癥的進展，減輕或緩和癥狀和并發(fā)癥，和/或 治愈或消除疾病、障礙或病癥。待治療的患者優(yōu)選哺乳動物，尤其是人。
本文使用的術(shù)語治療疾病是指處理和護理已經(jīng)形成疾病、障礙或病癥的患者。治 療的目的是抵御疾病、病癥或障礙。治療包括給予活性化合物，以消除或控制疾病、病癥或 障礙，以及減輕與疾病、病癥或障礙有關(guān)的癥狀或并發(fā)癥。
本文使用的術(shù)語疾病的預(yù)防定義為在疾病的臨床發(fā)作之前，處理和護理處于形 成疾病危險之中的個體。預(yù)防的目的是抵御疾病、病癥或障礙的進展，并且包括給予活性化 合物，以預(yù)防或延遲癥狀或并發(fā)癥的發(fā)作，和預(yù)防或延遲相關(guān)疾病、病癥或障礙的進展。
本文使用的術(shù)語有效量是指與不治療相比較，有效治療患者的充足劑量。
POT是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)磷酸丙糖異構(gòu)酶基因，TPIl 是釀酒酵母(S. cerevisiae)磷酸丙糖異構(gòu)酶基因。
前導(dǎo)序列是指由前肽原(pre-p印tide)(信號肽)和前肽(pro-p印tide)組成的 氨基酸序列。
術(shù)語信號肽應(yīng)理解為是指在蛋白的前體物形式上以N端序列存在的前肽。信 號肽的功能是使異源蛋白質(zhì)便于遷移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。在該過程期間，信號肽通常被剪切 掉。信號肽可以是與制備蛋白的酵母有機體異源或同源的?？梢耘c本發(fā)明的DNA構(gòu)建 體一起使用的許多信號肽包括酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP;3)信號肽或任何功能性的類 似物(Egel-Mitani 等人(1990) YEAST 6 :127-137 和 US 5，726，038)和 MF α 1 基因的 α _ 因子/[言號(Thorner (1981), The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae (釀酒酵母的分子生物學(xué))，Strathern 等人編輯，pp 143-180，Cold Spring Harbor Laboratory, NY 和 US 4，870，00)。
本文中，術(shù)語“前肽(pro-p印tide) ”包括多肽序列，其功能是使表達的多肽從內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)中直接進到高爾基體中，并且進一步進入分泌小泡中，以分泌到培養(yǎng)基中(即，多肽穿過 細胞壁或至少通過細胞膜輸出到酵母細胞的周質(zhì)間隙中)。前肽可以是酵母α -因子前肽， 參閱US 4，546，082和4，870，008?；蛘撸半目梢允呛铣汕半?，也就是說，在自然界中未發(fā) 現(xiàn)的前肽。合適的合成前肽是在US5, 395，922,5, 795，746,5, 162，498和WO 98/32867中公 開的那些前肽。前肽優(yōu)選包含在C端的肽鏈內(nèi)切酶加工位點，例如Lys-Arg序列，或其任何13功能性的類似物。
除非明確表示，否則本文提到的氨基酸是L-氨基酸。進一步的，肽的氨基酸序列 的左和右端分別是N-和C-端，除非另作說明。
發(fā)明概述
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對蛋白降解作用穩(wěn)定(通過具體突變)和在B29-賴氨酸處?；囊葝u 素是有效的和作用延長的，并且作為可以通過肺部或口服給藥的延長的胰島素具有很高的 潛力。?；沟媒Y(jié)合到血清白蛋白，進而延長。此外，與對蛋白降解作用不穩(wěn)定的類似的酰 化胰島素相比，本發(fā)明的酰化胰島素顯示了大大降低的胰島素受體親和性。本發(fā)明白蛋白 結(jié)合胰島素的胰島素受體親和力降低歸功于循環(huán)中酰化胰島素的延長，因為胰島素內(nèi)化并 在受體激活后降解。因此，本發(fā)明胰島素的清除率降低。胰島素受體親和力的降低或許不會 導(dǎo)致功效損失，例如，如在本文中描述的高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗中所測試的。因此， 高白蛋白結(jié)合親和力和低胰島素受體親和力的結(jié)合有利于獲得長的胰島素(基本胰島素) 作用時間。此外，口服之后，這些?；葝u素具有比類似的已知酰化胰島素(其對蛋白降解 作用不穩(wěn)定)更高程度的生物利用度。因此，這些?；葝u素類似物對于口服給藥具有價 值。類似地，肺部給藥之后，這些?；鞍酌阜€(wěn)定化的胰島素顯示了比類似的已知?；葝u 素(其對蛋白降解作用不穩(wěn)定)更高的表觀功效和/或生物利用度。此外，當(dāng)通過肺部給 予哺乳動物時，這些?；鞍酌阜€(wěn)定化的胰島素顯示了延長的時間-作用特性。因此，這些 ?；囊葝u素類似物對于肺部給藥具有價值。
對蛋白降解作用穩(wěn)定的上述胰島素在本文中稱為蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素。
正如說明書詳述部分所解釋的，相對于人胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素分子的 有限量的天然氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及酰化的胰島素，其中蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素類似 物在一個或多個下列的缺失或取代方面與人胰島素不同Q在A18位，A、G或Q在A21位，G 或Q在Bl位或在Bl位沒有氨基酸殘基，Q、S或T在B3位或在B3位沒有氨基酸殘基，Q在 B13位，在B27位沒有氨基酸殘基，D、E或R在似8位，以及在B30位沒有氨基酸。
另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的?；葝u素和合適佐劑和添加劑的藥物制 劑，佐劑和添加劑例如一或多種適合于穩(wěn)定、保藏或等滲壓的試劑，例如，鋅離子、苯酚、甲 酚、對羥基苯甲酸酯、氯化鈉、甘油或甘露糖醇。存在于制劑中的鋅含量可以是每6個胰島 素分子0-大約6個鋅原子。藥物制劑的pH值可以在大約4和大約8. 5之間，在大約4和 大約5之間，或在大約6. 5和大約7. 5之間。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及?；葝u素作為藥物用于降低哺乳動物血糖水 平，特別用于治療糖尿病的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及?；葝u素用于制備藥物制劑的用途，該藥物制劑用于降 低哺乳動物血糖水平，特別用于治療糖尿病。
另一方面，本發(fā)明涉及降低哺乳動物血糖水平的方法，其通過給予需要這種治療 的患者治療活性劑量的本發(fā)明的酰化胰島素。
在本發(fā)明的另一方面，?；囊葝u素與一種或多種其它活性物質(zhì)以任何合適比例 聯(lián)合給藥。這種其它活性劑可以選自人胰島素，快速作用的胰島素類似物，抗糖尿病藥，抗 高血脂藥，抗肥胖劑，抗高血壓藥和用于治療源于糖尿病或與其有關(guān)的并發(fā)癥的藥劑。
在一個實施方案中，所述兩種活性組分以混合藥物制劑形式給予。在另一個實施 方案中，所述兩種組分可以同時或依次地單獨給藥。
在一個實施方案中，本發(fā)明的酰化胰島素可以與快速作用的人胰島素或人胰島素 類似物一起給藥。這種快速作用的胰島素類似物可以是如下這種其中在似8位的氨基酸 殘基是Asp、Lys、Leu、Val或Ala，和在B^位的氨基酸殘基是Lys或ftx)，des (B28-B30)人 胰島素，des(B27)人胰島素或des (B30)人胰島素，和其中在B3位的氨基酸殘基是Lys和 在似9位的氨基酸殘基是Glu或Asp的類似物。本發(fā)明的?；葝u素和快速起作用的人胰 島素或人胰島素類似物可以下列比例混合大約90%的酰化胰島素與大約10%的快速起 作用的人胰島素或人胰島素類似物；優(yōu)選大約70%的酰化胰島素與大約30%的快速起作 用的人胰島素或人胰島素類似物，且更優(yōu)選大約50%的?；葝u素與大約50%的快速起 作用的人胰島素或人胰島素類似物(％是重量百分?jǐn)?shù))。
本發(fā)明的?；葝u素還可以與抗糖尿病藥一起用于聯(lián)合治療。
抗糖尿病藥包括胰島素，在WO 98/08871、WO 99/43706、US 5424286 W000/09666、W02006/097537、PCT/EP2008/061755 和 PCT/EP2008/061830 中描述的 GLP-I (1-37)(胰高血糖素樣肽-1)，GLP-2，exendin-4 (1-39)，其促胰島素分泌片段，其促 胰島素分泌類似物和其促胰島素分泌衍生物。GLP-I (1-37)的促胰島素分泌片段是促胰島 素分泌肽，其整個序列可以在GLP-I (1-37)的序列中得到，并且缺失至少一個端部氨基酸。
本發(fā)明的酰化胰島素也可以與口服抗糖尿病藥例如噻唑烷二酮、二甲雙胍及其它 用于口服治療的II型糖尿病藥物制劑一起用于聯(lián)合治療。
此外，本發(fā)明的?；葝u素可以與一種或多種抗肥胖藥劑或食欲調(diào)節(jié)劑聯(lián)合給藥。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的?；葝u素和合適佐劑和添加劑的 肺部給藥的藥物制劑，所述佐劑和添加劑例如一種或多種適合于穩(wěn)定化、保藏或等滲壓的 試劑，例如，鋅離子、苯酚、甲酚、對羥基苯甲酸酯、氯化鈉、甘油、丙二醇或甘露糖醇。
應(yīng)該理解，認為?；葝u素與飲食和/或鍛煉、一種或多種上述化合物和任選一 種或多種其它活性物質(zhì)的任何合適組合在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
優(yōu)選實施方案的說明
胰島素的穩(wěn)定性和溶解性是現(xiàn)行胰島素療法的重要的基礎(chǔ)方面。通過提供穩(wěn)定 的、?；囊葝u素類似物，本發(fā)明致力于解決這些問題，其中?；梢越档头肿尤嵝?，并同 時降低原纖化傾向和限度或改變PH沉淀區(qū)域。
本發(fā)明的?；葝u素尤其可用于肺部或口服給藥，這是由于它們與例如人胰島素 和?；娜艘葝u素相比具有比較高的生物利用率。此外，?；囊葝u素具有延長的胰島素 活性。
如上所述，對蛋白降解作用穩(wěn)定的胰島素在本文中稱為蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素。 本發(fā)明的?；葝u素是本文所描述的已酰化的所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素。
所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素源自于本文中稱為母體胰島素或非蛋白酶穩(wěn)定化的 胰島素的胰島素化合物。
在一個實施方案中，母體胰島素選自a)人胰島素；b)人胰島素的胰島素類似物， 其中在B^位的氨基酸殘基是Pro、ASp、LyS、Leu、Val或Ala，在B^位的氨基酸殘基是Lys或ftx)，和任選地，在B30位的氨基酸殘基缺失；c)胰島素類似物，其是des(B28-B30)人胰 島素，des(B27)人胰島素或des(B30)人胰島素；d)人胰島素的胰島素類似物，其中在B3 位的氨基酸殘基是Lys，和在似9位的氨基酸殘基是Glu或Asp ；e)人胰島素的胰島素類似 物，其中在A21位的氨基酸殘基是Gly，且其中胰島素類似物在B鏈的C端進一步用兩個精 氨酸殘基延長；f)胰島素衍生物，其中B30位的氨基酸殘基被蘇氨酸甲酯取代；和g)胰島 素衍生物，其中des(B30)人胰島素的似9位的賴氨酸的N ε位上連接有十四烷?；?。這 些中的每一個是具體實施方案。
在另一個實施方案中，母體胰島素選自人胰島素；desB30人胰島素；AspB^A 胰島素；AspB28，DesB30人胰島素；LysB3，GluB29人胰島素；LysB28，ProB29人胰島素； GlyA21, ArgB31, ArgB32 人胰島素；和 desB30，ArgB31, ArgB32 人胰島素。
更具體而言，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素是相對于母體胰島素A和/或B鏈具有兩個 或更多個突變的胰島素分子。已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在胰島素上的兩個或更多個蛋白酶位 點內(nèi)或其緊密相鄰處用親水性的氨基酸取代兩個或多個疏水性的氨基酸，可以獲得比母體 胰島素蛋白水解更穩(wěn)定的胰島素類似物(即，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素)。在一個寬范圍的方 面，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素是相對于母體胰島素其中至少兩個疏水性的氨基酸已經(jīng)被親水 性的氨基酸取代的胰島素類似物，其中取代在母體胰島素的兩個或更多個蛋白酶裂解位點 內(nèi)或其緊密相鄰處，且其中這種胰島素類似物任選還包含一個或多個其它突變。
在另一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素是胰島素類似物，其中
在A12位的氨基酸是Glu或Asp，和/或在A13位的氨基酸是His、Asn、Glu或 Asp，和/或在A14位的氨基酸是Asn、Gin、Glu、Arg、Asp、Gly或His，和/或在A15位的氨 基酸是Glu或Asp ；和
在BM位的氨基酸是His，和/或在B25位的氨基酸是His，和/或在B^位的 氨基酸是His、Gly、Asp或Thr，和/或在B27位的氨基酸是His、Glu、Lys.Gly或Arg,和/ 或在B^位的氨基酸是His、Gly或Asp ；和
其任選還包含一個或多個其它突變。
在另一實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素是類似物，其包含與B27中的突變結(jié) 合的B25H或B25N突變，任選與其它突變結(jié)合。
在另一實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素是類似物，其包含與B27中的突變結(jié) 合的B25H或B25N突變，任選與其它突變結(jié)合。所述B27中的突變可為，例如Glu或Asp。
這些包含B25和B27突變的蛋白酶穩(wěn)定化的?；葝u素類似物包含具有有利特 性。
在另一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素是胰島素類似物，其包含式1的A鏈 氨基酸序列
XaaA(—2)_XaaA(—D-XaaA0_Gly-Il e-Val-Glu-Gln-Cy s_Cy s-XaaA8-Ser_I le_Cy s_XaaA12 -XaaA13-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21
式(1) (SEQ ID No :1)
和式2的B鏈氨基酸序列
XaaB(—2)_XaaB(—D-XaaBo-XaaBfXaa^-XaaBs-XaaM-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaawo-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-XaaB25-XaaB26-XaaB27-XaaB2-XaaB29-XaaB30-XaaB31_XaaB:0119]0120] 0121] 0122]0123]0124]0125]0126]0127]0128]0129]0130]0131]0132]0133]0134]0135]0136]0137]0138]0139]0140]0141]0142]0143] Glu ；0144]0145]■32式(2) (SEQ ID No 2)其中XaaA(_2)不存在，或是Gly ； XaaA(_D不存在,或是Pro ； XaaA0不存在,或是Pro ； XaaA8獨立地選自Thr和His ； XaaA12獨立地選自Ser、Asp和Glu ；XaaA13 獨立地選自 Leu、Thr> Asn、Asp、Gin、His、Lys> Gly、Arg、Pro、Ser 禾口 Glu ；XaaA14 獨立地選自 Tyr、Thr, Asn、Asp、Gin、His、Lys, Gly、Arg、Pro、Ser 和 Glu ；XaaA15獨立地選自Gin、Asp和Glu ；XaaA18獨立地選自Asn、Lys和Gln ；XaaA21獨立地選自Asn和Gln ；XaaB(_2)不存在，或是Gly ；Xaa13^1)不存在,或是Pro ；XaaB0不存在,或是Pro ；XaaB1不存在，或獨立地選自Phe和Glu ；XaaB2不存在,或是Val ；XaaB3不存在，或獨立地選自Asn和Gln ；XaaB4獨立地選自Gln和Glu ；XaaB10 獨立地選自 His、Asp、Pro 和 Glu ；XaaB16 獨立地選自 Tyr、Asp、Gin、His、Arg 和 Glu ；XaaB24獨立地選自Phe和His ；XaaB25獨立地選自Asn、Phe禾口 His ；XaaB26不存在，或獨立地選自Tyr、His、Thr、Gly和Asp ；XaaB27 不存在，或獨立地選自 Thr、Asn、Asp、Gin、His、Lys, Gly、Arg、Pro、Ser 和XaaB28不存在，或獨立地選自ftx)、His、Gly和Asp ；XaaB29不存在，或獨立地選自Lys、Arg和Gln ；且優(yōu)選，XaaB29不存在，或獨立地選 自 Lys 和 Gln ；0146]XaaB30 不存在，或是 Thr ；0147]Xaa1331 不存在,或是 Leu ；0148]Xaara2不存在，或是Glu ；0149]C端可以任選衍生酰胺；0150]其中A鏈氨基酸序列和B鏈氨基酸序列在A鏈7位的半胱氨酸和B鏈7位的半胱 氨酸之間和在A鏈20位的半胱氨酸和B鏈19位的半胱氨酸之間通過二硫鍵連接，且其中 A鏈的6位和11位的半胱氨酸通過二硫鍵連接；
在另一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素是胰島素類似物，其包含式3的A鏈 氨基酸序列
Gly-11 e-Val-Glu-Gln-Cy s-Cy s-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaA13-XaaA14-XaaA15-L eu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21
XaaB1-Val-XaaB3-XaaB4-Hi s-Leu-Cy s-Gly-Ser-XaaB10-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-XaaB1 6-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-XaaB24-His-XaaB26-XaaB27-XaaB28-XaaB29-XaaB30
其中
XaaA8獨立地選自Thr和Hi s ；
XaaA12 獨立地選自 Ser、Asp 和 Glu ；
XaaA13 獨立地選自 Leu、Thr> Asn、Asp、Gin、His、Lys> Gly、Arg、Pro、Ser 禾口 Glu ；
XaaA14 獨立地選自 Thr> Asn、Asp、Gin、His、Lys> Gly、Arg、Pro、Ser 禾口 Glu ；
XaaA15 獨立地選自 Gin、Asp 和 Glu ；
Xaaiu8 獨立地選自 Asn、Lys 和 Gln ；
XaaA21 獨立地選自 Asn 和 Gln ；
XaaB1獨立地選自Phe和Glu ；
XaaB3獨立地選自Asn和Gln ；
XaaB4獨立地選自Gln和Glu ；
XaaB10 獨立地選自 Hi s、Asp、Pro 和 Glu ；
XaaB16 獨立地選自 Tyr、Asp、Gin、His、Arg 和 Glu ；
XaaB24 獨立地選自 Phe 禾口 Hi s ；
XaaBM 不存在，或獨立地選自 Tyr、His、Thr、Gly 和 Asp ；
XaaB27 不存在，或獨立地選自 Thr、Asn、Asp、Gin、His、Lys, Gly、Arg、Pro、Ser 和 Glu ；
存在，或獨立地選自ftx)、His、Gly和Asp ；
XaaB29不存在，或獨立地選自Lys、Arg和Gln ；且優(yōu)選地，XaaB29不存在，或獨立地 選自Lys和Gln ；
XaaB30 不存在，或是 Thr ；
C端可以任選衍生為酰胺；
其中A鏈氨基酸序列和B鏈氨基酸序列在A鏈7位的半胱氨酸和B鏈7位的半胱 氨酸之間和在A鏈20位的半胱氨酸和B鏈19位的半胱氨酸之間通過二硫鍵連接，且其中 A鏈的6位和11位的半胱氨酸通過二硫鍵連接。
在另一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素是胰島素類似物，其中
XaaA8獨立地選自Thr和Hi s ；
XaaA12 獨立地選自 Ser 和 Glu ；
XaaA13 獨立地選自 Leu、Thr、Asn、Asp、Gin、His、Lys> Gly、Arg、Pro、Ser 禾口 Glu ；
XaaA14 獨立地選自 Asp、Hi s 禾口 Glu ；
XaaA15 獨立地選自 Gln 和 Glu ；
Xaaiu8 獨立地選自 Asn、Lys 和 Gln ；0153]0154]式(3) (SEQ ID No 3) 和式4的B鏈氨基酸序列0156]式(4) (SEQ ID No 4)18
XaaA21 獨立地選自 Asn 和 Gln ；
XaaB1獨立地選自Phe和Glu ；
XaaB3獨立地選自Asn和Gln ；
XaaB4獨立地選自Gln和Glu ；
XaaB10 獨立地選自 Hi s、Asp、Pro 和 Glu ；
XaaB16 獨立地選自 Tyr、Asp、Gin、His、Arg 和 Glu ；
XaaB24 獨立地選自 Phe 禾口 His ；
XaaB25 獨立地選自 Phe、Asn 禾口 Hi s ；
XaaB26 獨立地選自 Tyr、Thr、Gly 和 Asp ；
XaaB27 獨立地選自 Thr、Asn、Asp、Gin、His、Lys、Gly、Arg 禾口 Glu ；
XaaB28 獨立地選自 Pro、Gly 和 Asp ；
XaaB29 獨立地選自 Lys 和 Gln ；
XaaB30 不存在，或是 Thr ；
C端可以任選衍生為酰胺；
其中A鏈氨基酸序列和B鏈氨基酸序列在A鏈7位的半胱氨酸和B鏈7位的半胱 氨酸之間和在A鏈20位的半胱氨酸和B鏈19位的半胱氨酸之間通過二硫鍵連接，且其中 A鏈的6位和11位的半胱氨酸通過二硫鍵連接。
下面討論蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的其它實施方案。
“蛋白酶(protease)”或“蛋白酶(protease enzyme) ”是消化酶，其可以使蛋白和 肽降解，并且可以在人體的各種組織中發(fā)現(xiàn)它，例如胃(胃蛋白酶)，腸腔(糜蛋白酶，胰蛋 白酶，彈性酶，羧肽酶，等等)或胃腸道的粘膜表面(氨肽酶，羧肽酶，腸肽酶，二肽基肽酶， 內(nèi)肽酶，等等)，肝(胰島素降解酶，組織蛋白酶D等等)，和在其它組織中。
蛋白水解穩(wěn)定的胰島素類似物(也稱為蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素)在本文中被理解 為相對于人胰島素而被一種或多種蛋白酶降解較慢的胰島素類似物。在一個實施方案中， 相對于母體胰島素，一種或多種蛋白酶對蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的降解較慢。在另一實施 方案中，使蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素對一種或多種選自如下的酶的降解作用保持穩(wěn)定胃蛋 白酶(例如，同種型胃蛋白酶A，胃蛋白酶B，胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶F)，糜蛋白酶(例 如，同種型糜蛋白酶A，糜蛋白酶B和/或糜蛋白酶C)，胰蛋白酶，胰島素-降解酶(IDE)，彈 性酶(例如，同種型胰腺彈性酶I和/或II)，羧肽酶(例如，同種型羧基肽酶A，羧肽酶A2 和/或羧肽酶B)，氨肽酶，組織蛋白酶D及存在于來自大鼠、豬或人的腸內(nèi)提取物中的其它 酶。
在一個實施方案中，使蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素對一種或多種選自下列如下的酶的 降解作用保持穩(wěn)定糜蛋白酶，胰蛋白酶，胰島素-降解酶(IDE)，彈性酶，羧肽酶，氨肽酶和 組織蛋白酶D。在另一實施方案中，使蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素對一種或多種選自如下的酶的 降解作用保持穩(wěn)定糜蛋白酶，羧肽酶和IDE。在另一實施方案中，使蛋白酶穩(wěn)定化的胰島 素對一種或多種選自下列的酶的降解作用保持穩(wěn)定糜蛋白酶和羧肽酶。
T1/2可以按照實施例中描述的方法來測定，其作為蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素對蛋白 酶例如糜蛋白酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A的蛋白降解穩(wěn)定性的量度。在本發(fā)明的一個 實施方案中，相對于人胰島素，T1/2得到提高。在另一實施方案中，相對于母體胰島素，T1/2得到提高。在另一實施方案中，相對于母體胰島素，T1/2提高了至少2倍。在另一實施方 案中，相對于母體胰島素，T1/2提高了至少3倍。在另一實施方案中，相對于母體胰島素， T1/2提高了至少4倍。在另一實施方案中，相對于母體胰島素，T1/2提高了至少5倍。在 另一實施方案中，相對于母體胰島素，T1/2提高了至少10倍。
測定蛋白酶解穩(wěn)定性的一種替代方式為測定相對于比較物例如人胰島素的相對 穩(wěn)定性。相對穩(wěn)定性定義為T1/2/T1/2 (比較物)，其中T1/2和Tl/2 (對比物)分別是降解 分析中所述類似物與比較物的半衰期。在實施例部分中，給出了本發(fā)明選定胰島素針對從 大鼠的十二指腸提取的酶混合物的相對穩(wěn)定性(相對于人胰島素及相對于未酰化的蛋白 酶耐受胰島素)。
蛋白酶裂解位點(本文也稱為蛋白酶位點)應(yīng)該被理解為通過蛋白酶辨別的氨基 酸殘基和/或通過蛋白酶將其肽鍵裂解的氨基酸殘基。蛋白酶裂解位點可以通過HPLC、MS 或LC-MS分析測定裂解“熱點”來測定，和/或通過基于待測定蛋白酶裂解位點的蛋白酶的 酶特異性的預(yù)測來測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何測定蛋白酶裂解位點，例如，基于例如 Handbook of Proteolytical Enzymes (蛋白酶手冊)，第二版，Barrett, A. J. , Rawlings, N. D.，Woesner, J. F.編輯，Elsevier Academic Press 2004 中描述的酶特異性。例如，可 以預(yù)計糜蛋白酶將肽鍵C端裂解為芳香殘基(Trp，Tyr，Phe或Leu)，其后面不是ftx)。類似 地，可以預(yù)計胰蛋白酶將肽鍵C端裂解為堿性殘基Lys或Arg，其后面不是ft~o，預(yù)計彈性酶 將殘基C端裂解為Ala、Val、Gly或kr，以及羧基肽酶A可以除去任何C端氨基酸，但不是 Arg、Lys或ftx)。預(yù)計胰島素降解酶(IDE)可以裂解人胰島素的下列位置B9_10，B10-11， B13-14, B14-15, B24-25，B25-26，A13-14 和 A14-15。
術(shù)語在蛋白酶裂解位點“內(nèi)部或其緊密相鄰處”的取代氨基酸在本文用于表示在 母體胰島素的位置內(nèi)部或其緊密相鄰處的氨基酸的取代，其中已經(jīng)確定該位置是蛋白酶裂 解位點。在一個實施方案中，在胰島素上的兩個或更多個蛋白酶位點內(nèi)部或其緊密相鄰處 的兩個或更多個疏水性氨基酸被取代，其中所述疏水性的氨基酸被親水性的氨基酸取代。 在另一實施方案中，在胰島素上的兩個或更多個蛋白酶位點內(nèi)的兩個或更多個疏水性氨基 酸被親水性的氨基酸取代。在另一實施方案中，與胰島素上的兩個或更多個蛋白酶位點相 鄰的兩個或更多個疏水性氨基酸被親水性的氨基酸取代。在另一實施方案中，位于離胰島 素上的兩個或更多個蛋白酶位點兩個氨基酸處的兩個或更多個疏水性氨基酸被親水性的 氨基酸取代。在另一實施方案中，位于離胰島素上的兩個或更多個蛋白酶位點三個氨基酸 處的兩個或更多個疏水性氨基酸被親水性的氨基酸取代。在另一實施方案中，位于離胰島 素上的兩個或更多個蛋白酶位點多達四個氨基酸處的兩個或多個疏水性氨基酸被親水性 的氨基酸取代。在另一實施方案中，位于離胰島素上的兩個或更多個蛋白酶位點或在該兩 個或更多個蛋白酶位點之內(nèi)的一個、兩個或三個氨基酸處的兩個或更多個疏水性氨基酸被 親水性的氨基酸取代。在另一實施方案中，位于離胰島素上的兩個或更多個蛋白酶位點或 在該兩個或更多個蛋白酶位點之內(nèi)的一個或兩個氨基酸處的兩個或更多個疏水性氨基酸 被親水性氨基酸取代。在另一實施方案中，在胰島素上的兩個或更多個蛋白酶位點相鄰處 或在該兩個或更多個蛋白酶位點之內(nèi)的兩個或更多個疏水性氨基酸被親水性的氨基酸取 代。
蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素可以具有凈電荷，該凈電荷不同于母體胰島素的凈電荷。在一個實施方案中，所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的凈電荷比母體胰島素的凈電荷更具正電 性。在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的凈電荷比母體胰島素的凈電荷更具負電 性。在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的平均正凈電荷在0.5和5之間(在水溶 液中測定)。在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的平均正凈電荷在1和5之間。在 一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的平均正凈電荷在1和4之間。在一個實施方案 中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的平均正凈電荷在1和3之間。在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定 化的胰島素的平均正凈電荷在2和3之間。在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的 平均負凈電荷在-0.5和-5之間(在水溶液中測定)。在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的 胰島素的平均負凈電荷在-1和-5之間。在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的平 均負凈電荷在-1和-4之間。在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的平均負凈電荷 在-1和-3之間。在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的平均負凈電荷在-2和-3 之間。
在一個實施方案中，相對于人胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素可以具有提高的溶 解性。在另一實施方案中，相對于人胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH值為3-9時具有提 高的溶解性。在另一實施方案中，相對于人胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH值為4-8. 5 時具有提高的溶解性。在另一實施方案中，相對于人胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH 值為4-8時具有提高的溶解性。在另一實施方案中，相對于人胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島 素在PH值為4. 5-8時具有提高的溶解性。在另一實施方案中，相對于人胰島素，蛋白酶穩(wěn) 定化的胰島素在PH值為5-8時具有提高的溶解性。在另一實施方案中，相對于人胰島素， 蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH值為5. 5-8時具有提高的溶解性。在另一實施方案中，相對于 人胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH值為6-8時具有提高的溶解性。
在一個實施方案中，相對于人胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在pH值為2-4時具 有提高的溶解性。
在一個實施方案中，相對于母體胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素可以具有提高的 溶解性。在另一實施方案中，相對于母體胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH值為3-9時 具有提高的溶解性。在另一實施方案中，相對于母體胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH 值為4-8. 5時具有提高的溶解性。在另一實施方案中，相對于母體胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的 胰島素在PH值為4-8時具有提高的溶解性。在另一實施方案中，相對于母體胰島素，蛋白 酶穩(wěn)定化的胰島素在PH值為4. 5-8時具有提高的溶解性。在另一實施方案中，相對于母體 胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH值為5-8時具有提高的溶解性。在另一實施方案中， 相對于母體胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH值為5. 5-8時具有提高的溶解性。在另一 實施方案中，相對于母體胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在PH值為6-8時具有提高的溶解 性。
在一個實施方案中，相對于母體胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在pH 2-4時具有 提高的溶解性。
“在給定pH值下具有提高的溶解性”是指相對于母體胰島素，在溶液的pH值下，更 大濃度的蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素溶于水溶液或緩沖溶液中。測定包含在溶液中的胰島素是 否溶解的方法在本領(lǐng)域是已知的。
在一個實施方案中，可以將溶液在30，OOOg下離心20分鐘，然后可以通過RP-HPLC測定上清液中的胰島素濃度。如果該濃度在實驗誤差范圍內(nèi)等于制備組合物最初所使用的 胰島素濃度，那么該胰島素在本發(fā)明的組合物中是完全溶解的。在另一個實施方案中，在本 發(fā)明組合物中的胰島素的溶解性可以簡單地通過眼睛檢驗容器來確定，其中組合物容納于 該容器中。如果用眼睛觀察時溶液是澄清的并且沒有顆粒物質(zhì)懸浮或沉淀在容器的側(cè)面/ 底部，那么胰島素是可溶的。
當(dāng)依據(jù)測定進行比較時，相對于母體胰島素，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素可以具有提 高的表觀功效和/或生物利用率。
測定胰島素體外功效或生物利用率的標(biāo)準(zhǔn)試驗對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知 的，并且尤其包括(1)胰島素放射性受體測定，其中胰島素的相對功效定義為置換50% 125I-胰島素所要求的胰島素與胰島素類似物的比例，其中125I-胰島素特異性地與細胞膜例 如大鼠肝臟質(zhì)膜片段上存在的胰島素受體結(jié)合；( 脂肪形成試驗，例如用大鼠脂肪細胞 進行，其中相對胰島素功效定義為獲得[3- ]葡萄糖轉(zhuǎn)化為有機-可萃取物質(zhì)(即脂質(zhì)) 的最大轉(zhuǎn)化的50%所要求的胰島素與胰島素類似物的比例；C3)分離脂肪細胞中的葡萄糖 氧化試驗，其中胰島素類似物的相對功效定義為獲得葡萄糖-i-[14c]轉(zhuǎn)化為[wCO2]的最 大轉(zhuǎn)化的50%的胰島素與胰島素類似物的比例；(4)胰島素放射免疫測定，通過測定胰島 素或胰島素類似物與125I-胰島素競爭與特異性抗胰島素抗體結(jié)合的效果，其可以測定胰島 素類似物的免疫原性；和( 其它試驗，其測定胰島素或胰島素類似物與動物血漿樣品中 的抗體的結(jié)合，例如，具有特異性胰島素抗體的ELISA試驗。
提高的表觀體內(nèi)功效可通過比較被討論的胰島素與相似劑量的無蛋白酶穩(wěn)定化 突變的相似胰島素的血糖與時間曲線來估計/評價。相對于比較物，本發(fā)明胰島素會具有 提高的血糖降低作用。
測定胰島素生物利用度的標(biāo)準(zhǔn)檢驗對本領(lǐng)域中技術(shù)人員而言是已知的并尤其包 括測定相同物種中肺部或口服和靜脈(i.v.)給藥被討論的胰島素的濃度曲線下的相對面 積(AUC)等等。血液(血漿)樣品中胰島素濃度的定量可采用例如抗體檢測(ELISA)或質(zhì) 譜分析來進行。肺部給藥可通過幾種方式進行。例如，胰島素可通過點滴給予大鼠，或通過 干粉噴射給予豬。
可以任選分析蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的其它蛋白酶位點，該位點可以進行一個或 多個疏水性氨基酸被親水性氨基酸的進一步取代。蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素可以是胰島素類 似物，與母體胰島素(第一個改性胰島素)相比，其在蛋白酶位點具有至少兩個親水性酸， 并且在第一個改性胰島素的新蛋白酶位點其還具有至少一個氨基酸取代，其中至少一個疏 水性氨基酸已經(jīng)被至少一個親水性氨基酸取代。
為了便利性起見，下面是編碼的天然氨基酸名稱，用常見的在括號中的三個字母 代碼和一個字母代碼甘氨酸(Gly & G)，脯氨酸(Pro & P)，丙氨酸(Ala & A)，纈氨酸(Val & V)，亮氨酸(Leu & L)，異亮氨酸(lie & I)，甲硫氨酸(Met & M)，半胱氨酸(Cys & C)， 苯丙氨酸(Phe & F)，酪氨酸(Tyr & Y)，色氨酸(Trp & W)，組氨酸(His & H)，賴氨酸(Lys & K)，精氨酸(Arg & R)，谷氨酰胺(Gln & Q)，天冬酰胺(Asn & N)，谷氨酸(Glu & E)，天 冬氨酸(Asp & D)，絲氨酸(Ser & S)和蘇氨酸(Thr & T)。如果由于打字錯誤而與通常使 用的編碼不符合，則采用通常使用的編碼。優(yōu)選地，存在于本發(fā)明的胰島素中的氨基酸為可 以通過核酸編碼的氨基酸。在一個實施方案中，胰島素或胰島素類似物用下列取代Gly，Glu, Asp, His, Gin, Asn, Ser, Thr, Lys, Arg 禾口 / 或 Pro，禾口 / 或 Gly, Glu, Asp, His, Gin, Asn，Ser，Thr，Lys, Arg,和/或Pro加到胰島素或胰島素類似物中。在一個實施方案中，胰 島素或胰島素類似物用下列取代:6111^8 ，見8，6111^811，1^8和/或六印，和/或6111，八8 ， His, Gin, Asn, Lys和/或Arg加到胰島素或胰島素類似物中。
在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素選自下列化合物A14E，B25H, desB30 人胰島素；A14H, B25H, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B16E, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B28D, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27E, desB30 人 胰島素；A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B16E, B25H, B27E, desB30 人 胰島素；A8H, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A8H, A14E, B25H, B27E, desB30 人胰島素；A8H, A14E, ΒΙΕ, B25H, desB30 人胰島素；A8H, A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, desB30 人胰島素；A8H, A14E, ΒΙΕ, B16E, B25H, B27E, desB30 人胰島素；A8H, A14E, B16E, B25H, desB30 人胰島素； A14E, B25H, B26D, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B27E, desB30 人胰島素；A14E, B27E, desB30 人胰島素；A14E, B28D, desB30 人胰島素；A14E, B28E, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B28E, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B27E, B28E, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, desB30 人胰島素；A14D, B25H, desB30 人胰島素； B25N, B27E, desB30 人胰島素；A8H, B25N, B27E, desB30 人胰島素；A14E, B27E, B28E, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B28E, desB30 人胰島素；B25H, B27E, desB30 人胰島素；ΒΙΕ, B25H, B27E, desb30 人胰島素；A8H, ΒΙΕ, B25H, B27E, desB30 人胰島素；A8H, B25H, B27E, desB30 人胰島素；B25N, B27D, desB30 人胰島素；A8H, B25N, B27D, desB30 人胰島素；B25H, B27D, desB309 人胰島素；A8H, B25H, B27D, desB30 人胰島素；A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A14E，B (-1) P，B (O)P, B25H，desB30 人胰島素；A (-1) P，A (0) P，A14E，B (-1) P，B (0) P, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B30T, B31L, B32E 人胰島素；A14E, B25H 人胰島素； A14E, B16H, B25H, desB30 人胰島素；A14E, BlOP，B25H, desB30 人胰島素；A14E, B10E, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B4E, B25H, desB30 人胰島素；A14H, B16H, B25H, desB30 人胰島素； A14H, B10E, B25H, desB30 人胰島素；A13H, A14E, B10E, B25H, desB30 人胰島素；A13H, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B24H, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人胰島素；A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, desB30 人胰 島素；A14E, A18Q, A21Q, B3Q, B25H, B27E, desB30 人胰島素；A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30 人胰島素；A13H, A14E, ΒΙΕ, B25H, desB30 人胰島素；A13N, A14E, B25H, desB30 人胰島素； A13N, A14E, ΒΙΕ, B25H, desB30 人胰島素；A(-2)G, A(-1)P, A(0)P, A14E, B25H, desB30 人胰 島素；A14E, B (-2) G, B (-1) P，B (O)P, B25H, desB30 人胰島素；A (-2) G, A (-1) P，A (O)P, A14E, B(-2)G, B(-1)P, B(O)P，B25H, desB30 人胰島素；A14E, B27R, B28D, B29K, desB30 人胰島 素；A14E, B25H, B27R, B28D, B29K, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B26T, B27R, B28D, B29K, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27R, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27H, desB30 人胰島素； A14E, A18Q, B3Q, B25H, desB30 人胰島素；A13E, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A12E, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A15E, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A13E, B25H, desB30 人胰島素； A12E, B25H, desB30 人胰島素；A15E, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B25H, desB27, desB3023人胰島素；A14E, B25H, B26D, B27E, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27R, desB30 人胰島素； A14E, B25H, B27N, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27D, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27Q, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27E, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27G, desB30 人胰島素； A14E, B25H, B27H, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27K, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27P, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27S, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27T, desB30 人胰島素； A13R, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A13N, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A13D, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A13Q, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A13E, A14E, B25H, desB30 人胰島素； A13G, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A13H, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A13K, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A13P, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A13S, A14E, B25H, desB30 人胰島素； A13T, A14E, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B16R, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B16D, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B16Q, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B16E, B25H, desB30 人胰島素； A14E, B16H, B25H, desB30 人胰島素；A14R, B25H, desB30 人胰島素；A14N, B25H, desB30 人 胰島素；A14D, B25H, desB30 人胰島素；A14Q, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B25H, desB30 人胰島素；A14G, B25H, desB30 人胰島素；A14H, B25H, desB30 人胰島素；A8H, B10D, B25H 人 胰島素；和A8H，A14E，B10E, B25H, desB30人胰島素且該實施方案可任選包括A14E，B25H, B29R, desB30人胰島素；B25H，desB30人胰島素；和B25N，desB30人胰島素。
在優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素選自以下化合物A14E，B25H, desB30 人胰島素；A14E, B16H, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B16E, B25H, desB30 人胰島素； A14E, B25H, B29R, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島素；B25H, desB30 人胰島素和 A14E，B25H, desB27, desB30 人胰島素。
在優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素選自任一還包含desB27突變的上 述組。
在優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素選自以下化合物A14E，B25H, desB27, desB30 人胰島素；A14E, B16H, B25H, desB27, desB30 人胰島素；A14E, B 16E, B25H, desB27, desB30 人胰島素；A14E, B25H, desB27, B29R, desB30 人胰島素和 B25H, desB27, desB30人胰島素。
在一個實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素選自任一還包含在A21和/或B3位的 以下突變以提高化學(xué)穩(wěn)定性的上述組A21G，desA21, B3Q或B3G。
在優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素選自以下的蛋白酶穩(wěn)定化的胰島 素:A14E, A21G, B25H, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B16H, B25H, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B16E, B25H, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島 素；A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人胰島素；A21G, B25H, desB30 人胰島 素和A21G，B25N，desB30人胰島素；且優(yōu)選地，其選自以下的蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素A14E， A21G, B25H, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B16H, B25H, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B16E, B25H, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人胰島素；A21G, B25H, desB30 人胰島素和 A21G, B25N, desB30 人胰島素。
在優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在B^位中的B29K的ε氮位?；?。
在優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在Al位中的Al的α氮位酰化。
在優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素在Al位中Al的α氮位?；宜龅鞍酌阜€(wěn)定化的胰島素包含B29R突變。利用例如在美國專利US 6，500，645中公開的眾所周知的技術(shù)，在合適宿主細胞 中，通過表達編碼所述討論的胰島素的DNA序列來制備蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素。該蛋白酶 穩(wěn)定化的胰島素既可以直接表達、也可以以B鏈上具有N端延長的前體分子的形式表達。這 種N端延長可以具有提高直接表達產(chǎn)物的產(chǎn)率的功能，并且可具有高達15個氨基酸殘基長 度。從培養(yǎng)肉湯中分離之后，N端延長被體外裂解，并因此具有緊鄰Bl的裂解位點。本發(fā) 明中的合適類型的N端延長在美國專利US 5，395，922和歐洲專利765，395Α中公開。編碼蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的多核苷酸序列可以利用已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成 產(chǎn)生,例如，Beaucage等人(1981) Tetrahedron Letters絲1859-1869所描述的亞磷酰胺 (phosphoamidite)方法，或 Matthes 等人(1984)EMB0 Journal 3:801-805 所描述的方法。 按照亞磷酰胺(phosphoamidite)方法合成寡核苷酸，例如在DNA自動合成儀中合成，純化， 形成雙螺旋和連接，以形成合成DNA構(gòu)建體。制備DNA構(gòu)建體的目前優(yōu)選方式是聚合酶鏈 式反應(yīng)(PCR)。多核苷酸序列也可以為混合基因組、cDNA和合成源。例如，編碼前導(dǎo)肽的基因組 或cDNA序列可以與編碼A和B鏈的基因組或cDNA連接，而后，按照眾所周知的方法，通過 插入編碼同源重組的所需氨基酸序列的合成寡核苷酸，可以在位點處修飾DNA序列，或優(yōu) 選使用合適寡核苷酸，通過PCR產(chǎn)生所需序列。重組方法一般使用載體，其能夠在所選擇的微生物或宿主細胞中復(fù)制，并且其帶 有編碼蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的多核苷酸序列。重組載體可以是自主復(fù)制載體，即，以額外 染色體實體形態(tài)存在的載體，其中的復(fù)制與染色體的復(fù)制無關(guān)，例如質(zhì)粒、額外的染色體單 元、極微染色體或人工染色體。載體可以包括保證自我復(fù)制的任何手段?；蛘?，載體可以是 當(dāng)被引入到宿主細胞中時可以整合到基因組中、并且與它所整合入的染色體一起復(fù)制的載 體。此外，可以使用單一載體或質(zhì)?；騼煞N或更多種載體或質(zhì)粒，它們一起包含被引入到宿 主細胞的基因組中的全部DNA，或使用轉(zhuǎn)位子。載體可以是線型或閉合環(huán)形的質(zhì)粒，并且優(yōu) 選包含可使載體穩(wěn)定整合到宿主細胞的基因組中或可使載體在獨立于基因組的細胞中自 發(fā)復(fù)制的元件。重組表達載體能夠在酵母中復(fù)制。能夠使載體在酵母中復(fù)制的序列的實例是酵母 質(zhì)粒2 μ m復(fù)制基因REP1-3和復(fù)制起點。載體可以包含一個或多個容易選擇轉(zhuǎn)化細胞的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是基 因，其產(chǎn)物可提供殺菌或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型，等等。細菌 選擇性標(biāo)記的實例是來源于枯草桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或可賦予抗菌素耐藥 性的標(biāo)記，例如氨芐西林、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素耐藥性。用于細絲狀霉菌宿主細胞 的選擇性標(biāo)記包括amdS(乙酰胺酶)，argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)，pyrG(乳清酸核 苷-5' _磷酸鹽脫羧酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸酯合酶)。酵母宿主細胞的合適標(biāo)記是 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRPl和URA3。對于酵母，較好匹配的選擇性標(biāo)記是裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pompe)TPI 基因(Russell (1985)Gene 40:125-130)。在載體中，多核苷酸序列操作性地與合適啟動子序列連接。該啟動子可以是任 何核酸序列，其在選擇的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性，包括突變、截短和雜合啟動子，并且可以從編碼胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得，該多肽對于宿主細胞既可以是同源的也可以是異源 的。

在細菌宿主細胞中引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列中獲得的啟動子大 腸桿菌乳糖操縱子，天藍色鏈霉菌瓊脂水解酶基因(dagA)，枯草桿菌果聚糖蔗糖酶基因 (sacB)，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)，嗜熱脂肪芽孢桿菌生麥芽糖淀粉酶基因 (amyM)，解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)，和地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)。 在細絲狀霉菌宿主細胞中引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列的基因獲得的啟動子米 曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α _淀粉酶，和黑曲霉酸穩(wěn)定性 α -淀粉酶。在酵母宿主中，有用的啟動子是釀酒酵母Mal，TPI，ADH或PGK啟動子。編碼蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的多核苷酸序列一般也會操作性地與合適終止子 連接。在酵母中，合適終止子是TPI終止子(Alber等人(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 419-434)。用于連接分別編碼蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素、啟動子和終止子的多核苷酸序列的方 法、和將它們插入到合適載體(其包含在所選擇宿主中進行復(fù)制所必需的信息)中的方法 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的?？梢岳斫?，可以如下構(gòu)建載體首先制備包含編碼 本發(fā)明胰島素的完整DNA序列的DNA構(gòu)建體，隨后將該片段插入到合適表達載體中，或依次 插入包含個體元件(例如信號，肽原，連接肽，A和B鏈)的遺傳信息的DNA片段，而后進行 連接。將包含編碼蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的多核苷酸序列的載體引入到宿主細胞中，以 使載體作為染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體保持。術(shù)語“宿主細胞”包括母細胞的 任何子代，由于在復(fù)制期間存在突變，其與母細胞不相同。宿主細胞可以是單細胞微生物， 例如原核生物，或非單細胞微生物，例如真核生物。有用的單細胞細胞是細菌細胞，例如革 蘭氏陽性細菌，包括但不限于桿菌細胞，鏈霉菌屬細胞，或革蘭氏陰性細菌細胞，例如，大 腸桿菌和假單胞菌屬。真核生物細胞可以是哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個實施 方案中，宿主細胞是酵母細胞。酵母有機體可以是任何合適的酵母有機體，其在培育時產(chǎn)生 大量的本發(fā)明的單鏈胰島素。合適酵母有機體的實例是選自下列酵母種屬的菌株釀酒酵 母，克魯維酵母菌，粟酒裂殖酵母，葡萄汁酵母，乳酸克魯維酵母，漢遜酵母，巴斯德畢赤氏 酵母，甲醇畢赤酵母，克魯維畢赤酵母，解脂耶氏酵母，假絲酵母，產(chǎn)朊假絲酵母，可可假絲 酵母，地霉菌，和發(fā)酵地霉。酵母細胞的轉(zhuǎn)化可以例如通過原生質(zhì)體形成實現(xiàn)，而后以本身已知的方式進行轉(zhuǎn) 化。用于培育細胞的培養(yǎng)基可以是適合于培育酵母有機體的任何常規(guī)培養(yǎng)基。利用常規(guī)方 法，包括從培養(yǎng)基中離心分離酵母細胞，通過離子交換基質(zhì)或通過反相吸收基質(zhì)將胰島素 前體物過濾或獲得，將上清液的蛋白組份沉淀，或利用鹽例如硫酸銨進行過濾，而后利用各 種色譜方法進行純化，例如，離子交換色譜、親和色譜等等，可以恰當(dāng)加工的形式從培養(yǎng)基 中回收分泌的胰島素(顯著比例存在于培養(yǎng)基中)。優(yōu)選地，本發(fā)明的?；葝u素是單取代的，在所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素分子中
僅有一個?；鶊F與賴氨酸氨基酸殘基連接。在一個實施方案中，與所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素相連的酰基部分具有以下通 式
Acy-AAln-AA2m-AA3p- (I)，其中η為0或1-3的整數(shù)；m為 或1-10的整數(shù)；ρ為 或1-10的整數(shù)； Acy為包含大約8個至大約24個碳原子的脂肪酸或脂肪族二酸；AAl為中性線型或 環(huán)狀氨基酸殘基;ΑΑ2為酸性氨基酸殘基;ΑΑ3為中性的、含亞烷基二醇的氨基酸殘 基；所述式中ΑΑ1、ΑΑ2和ΑΑ3出現(xiàn)的順序可獨立地相互交換；ΑΑ2可沿著所述式出現(xiàn) 幾次(例如Acy-AA2-AA32-AA2_) ；AA2可沿著所述式獨立地(不同)出現(xiàn)幾次(例如 Acy-AA2-AA32-AA2-) ；Acy、AAl、AA2和/或AA3之間的連接基為酰胺(肽)鍵，其形式上可 通過除去Acy，AAl，AA2和AA3各自的氫原子或羥基(水)來獲得；且與蛋白酶穩(wěn)定化的胰 島素連接可以從式⑴?；糠值腁A1，AA2或AA3殘基的C-末端或從式⑴部分存在的 AA2殘基的一個側(cè)鏈開始進行。另一實施方案中，與所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素相連的?；糠志哂型ㄊ?Acy-AAln-AA2m-AA3p-(I)，其中 AAl 選自 Gly、D-或 L_Ala、β Ala、4_ 氨基丁酸、5-氨基戊 酸、6-氨基己酸、D-或L-Glu- α -酰胺、D-或L_Glu_ γ -酰胺、D-或L-Asp- α -酰胺、D-或 L-Asp-β-酰胺或下式之一的基團
權(quán)利要求
1.酰化的、蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素，其中，所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素形式上由非蛋白 酶穩(wěn)定化的胰島素(母體胰島素)組成，其中至少一個疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代， 且其中所述取代是在所述非蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素(母體胰島素)的一個或多個蛋白酶裂 解位點內(nèi)部或與其緊密相鄰處，和其中這種蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素任選還包含一個或多個 其它突變，條件是所述穩(wěn)定化的胰島素僅有一個賴氨酸殘基，且其中?；糠峙c所述蛋白 酶穩(wěn)定化的胰島素的賴氨酸殘基或N-末端位置相連接。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的酰化的、蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素，其中所述非蛋白酶穩(wěn)定 化的胰島素中的至少兩個疏水性氨基酸被親水性氨基酸取代。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的?；摹⒌鞍酌阜€(wěn)定化的胰島素，其中所述酰 基部分與所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的賴氨酸殘基相連接。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的酰化的、蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素，其中所述酰 基部分與所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素的A鏈N-末端殘基的氨基相連接。
5.根據(jù)前述、可能的權(quán)利要求中的任一項所述的?；?、蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素，其 中所述蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素選自:A8H, B25N, B27E, desB30人胰島素；A14E, A18L，B25H, desB30 人胰島素;A14E，A21G，B25H，desB27，desB30 人胰島素；A14E,ΒΙΕ,B25H,B27E,B28E, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B27E, B28E, desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B28E, desB30 人胰島素；A14E, B16H, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B25H, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27E, desB30 人胰島素；A14E, B25H, desB27, desB30 人胰島素；A14E, B25H, B29R, desB30 人胰島 素；A14E, B28D, desB30 人胰島素；A14E, B28E, desB30 人胰島素；B25N, B27E, desB30 人胰島 素；A14E, A21G, B16H, B25H, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島素；B25H, desB30 人胰島素；A21G, B25H, desB30 人胰島素；A14E, A21G, B25H, desB30 人胰島素和 A14E, A21G, B25H, desB27, desB30 人胰島素。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的?；?、蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素，其中與所述 蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素相連接的?；糠值耐ㄊ綖锳cy-AAln-AA2m-AA3p- (I)，其中η為 或 1-3的整數(shù)；m為0或1-10的整數(shù)；ρ為0或1_10的整數(shù)；Acy是包含約8-約M個碳原子 的脂肪酸或脂肪族二酸；AAl是中性的線形或環(huán)狀氨基酸殘基；AA2是酸性的氨基酸殘基； AA3是中性的、含亞烷基二醇的氨基酸殘基；AA1、AA2和AA3在所述式中出現(xiàn)的順序可獨立 地相互交換；AA2可沿著所述式出現(xiàn)幾次(例如Acy-AA2-AA32-AA2_) ；AA2可沿著所述式獨 立(不同的)出現(xiàn)幾次(例如Acy-AA2-AA32-AA2_) ；Acy、AAl、AA2和/或AA3之間的連接基 為酰胺(肽)鍵，其形式上可通過除去Acy、AAl、AA2和AA3各自的氫原子或羥基(水)獲 得；且與蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素連接可從式(I)的?；糠值腁A1、AA2或AA3殘基的C-末 端或式(I)部分存在的AA2殘基的側(cè)鏈之一開始。
7.根據(jù)前述、可能的權(quán)利要求中的任一項所述的?；?、蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素，所述 ?；摹⒌鞍酌阜€(wěn)定化的胰島素是以上說明書中明確提到的化合物中的任何一種。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的?；?、蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素，所述?；?、 蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素選自A14E，B25H，B K(Nε-十六烷二酰)，desB30人胰島素；A14E， B25H, B29K(Νε 十八燒二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K(Νε 二 十燒二 酰-YGlu)，desB30人胰島素；A14E, B25H, Β29Κ(Νε3-羧基_5_十八烷二酰氨基苯甲酰)，desB30人胰島素；A14E, B25H, B^K (Nε-N-十八烷二酰-N-(2-羧乙基)甘氨酰)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, Β29Κ(Νε (N-十八烷二酰-N-羧甲基)-β -丙氨酰)，desB30人胰島 素；A14E，B25H, Β29Κ(Νε4_α4-({19-羧基十九烷二酰氨基}甲基)反式環(huán)己烷甲酰 基]-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K (Nε 十七燒二酰-y Glu)，desB30 人胰島 素；A14E，B25H, B29K(Νε 十八烷二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K (Νε 十四燒基)，desB30 人胰島素；Α14Ε，B25H, B29K (Νε 二十燒二酰-γ Glu-γ Glu)， desB30人胰島素；Α14Ε，B25H, B29K(Νε4-( -({19-羧基十九烷酰氨基}甲基)反式環(huán)己 烷甲酰基]-yG1u-yG1u)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, Β29Κ(Νε 十八烷二 酰-Y Glu- y Glu)，desB30 人胰島素；A14E, B28D, B29K (Νε 十八烷二酰-Y Glu)，desB30 人 胰島素；A14E, B25H, B29K(Νε 十八烷二酰-γ Glu_PEG7)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B29K (Νε 二十燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K (Νε 二十燒二 酰-YGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-YGlu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K (Νε 十六燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E， B25H, B29K(Νε 十六燒二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K(Νε 十七燒二 酰-丄Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，B29K(Νε 十八烷二 酰-iGlu-iGlu-iGlu-iGlu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K (Νε 二 十烷二 酰- γ Glu-y Glu-y Glu), desB30 人胰島素；A14E，B25H, B27E, B29K (Νε 十八燒二 酰-iGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Νε 十八烷二 酰-iGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B16H，B25H，Β^Κ(Νε 十八燒二 酰-IGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B16E，B25H，Β^Κ(Νε 十八燒二 酰-IGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B16H, B25H, B29K (Νε 十六烷二酰 _X_Glu)， desB30 人胰島素；Α14Ε，Β25Η，Β^Κ(Νε 二十烷二酰-iGlu-OEG-iGlu)，desB30 人胰島素； A14E, B16E, B25H, B29K(Νε 十六燒二酰-jGlu)，desB30 人胰島素；A14E，B16H, B25H, B29K(Νε 十八燒二酰-iGlu-jGlu-iGlu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Νε 十六燒二酰- jGlu)，desB30 人胰島素；A14E，B16H, B25H, B29K (Νε 十八燒 二 酰-xGlu-xGlu), desB30 人胰島素；A14E，B16H, B25H, B29K (Νε 二 十燒二 酰-IGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，B29K(Νε 十八燒二 酰-OEG-xGlu-xGlu), desB30 人胰島素；A 14E, A18L, B25H, B29K (Νε 二 十燒二 酰-IGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，A18L，B25H，Β^Κ(Νε 十八燒二 酰-IGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，B27E，Β^Κ(Νε 二 十燒二 酰-iGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A1G(N° 十八燒二酰-iGlu-OEG-OEG)，A14E，B25H， B29R,desB30 人胰島素；A14E，B1F(N° 十八燒二酰lu-OEG-OEG), Β25Η, B29R, desB30 人 胰島素；A1G(N° 十六燒二酰-iGlu)，A14E, B25H, B29R, desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K(Νε 十八烷二酰-iGlu-Abu-Abu-Abu-Abu)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B29K(Na 二十烷二酰)，desB30人胰島素；A14E，B25H, Β29Κ(Να4-[16-(1Η-四唑-5-基)十六烷酰 氨磺?；鵠丁酰)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, Β29Κ(Νε 十八烷二 酰-XGlu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，B^G，B27G，B^G，B^K (Νε 二十烷二酰 _x_Glu)， desB30 人胰島素；A14E，B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Νε 十八燒二酰)，desB30 人胰島素； A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Νε 二十燒二酰)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B26G,B27G，B28G，B29K(NE 二十烷二酰-iGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，B29K (Νε 二十二 烷二酰-YGlu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K (Νε 二十 二烷二 酰-Y Glu-γ Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，B29K (N ε 二 十烷二 酰-Y Glu-OEG-OEG-γ Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，Β^Κ(Νε 十八燒二 酰-Y Glu-OEG-OEG- y Glu)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B29K (Νε (N- 二十烷二酰-N-羧 甲基)-β Ala)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B29K(Nε 3-[2-(2-{2-[2-(17-羧基十七烷酰 氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰-Y Glu)，desB30人胰島素；A14E，B25H, B29K (Νε 3-[2-{2-[2-(19-羧基十九烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙 酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A 1 4E，B25H，B29K (N ε 十八烷二 酰-YGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰)，desB30人胰 島素；A14E，B25H，B29K(Nε十八烷二酰-Y Glu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙 氧基}乙氧基)丙酰-YGlu)，desB30人胰島素；A14E，B25H, Β29Κ(Νε 二十烷二 酰-YGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰)，desB30人胰 島素；A14E，B25H, Β29Κ(Νε4_α4-({17-羧基十九烷酰氨基}甲基)反式環(huán)己烷甲酰 Sl-YGlu), desB30 人胰島素；Α14Ε，B25H, B29K(Νε4-( -({17-羧基十七烷酰氨基}甲 基)反式環(huán)己烷甲?；鵠-￥6111-^6111)，(^8830人胰島素；A14E，B28D，B29K(Νε十六烷二 酰-YGlu)，desB30 人胰島素；A14E, B28D, B29K (Νε 二十烷二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素； A14E, B28D, B29K (Νε 十八烷二酰-y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B28D, B29K (Νε 二十烷二酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B28E，B^K (Νε 十六烷二酰-Y Glu)， desB30 人胰島素;Α14Ε，Β28Ε，Β29Κ(Νε 十八烷二酰-γ Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B28E， B29K (Νε 二十燒二酰-Y Glu), desB30 人胰島素；A14E，B28E, B29K (Νε 十八燒二 酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B28E，B29K (Νε 二十烷二酰-γ Glu-OEG-OEG)， desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (Νε 十六烷二酰-γ Glu)，desB30 人胰島素；A14E, Β1Ε,Β28Ε,Β29Κ (Νε 十八烷二酰-γ Glu)，desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (Νε 二十 烷二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B28E, B29K (Νε 十六烷二酰-Y Glu-OEG-OEG)， desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B28E, B29K (Νε 十八燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島 素；A14E，B1E，Β^Ε，Β^Κ(Νε 二十燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B1E， B27E，B28E，B29K (Νε 十六燒二酰-y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B1E，B27E，B28E，B29K (Νε 十八燒二酰-YGlu)，desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (Νε 二 十燒二 酰-YGlu)，desB30 人胰島素；A14E，B1E，B27E，Β^Ε，Β^Κ(Νε 十六燒二 酰-y Glu-OEG-OEG), desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K(Νε 十八燒二 酰-y Glu-OEG-OEG), desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B27E, B28E, B29K (Νε 二 十燒二 酰-y Glu-OEG-OEG), desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K (Νε 十六燒二 酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B1E，B25H，B28E, B29K (Νε 十八燒二酰-y Glu)，desB30 人胰島素；A14E, ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K (Νε 二十烷二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E, B1E，B25H，B28E，B29K (Νε 十六烷二酰-y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B1E，B25H， B28E, B29K (Νε 十八燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B25H, B28E, B29K (Νε 二十燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (Νε 十六燒二酰-y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B1E，B25H，B27E, B28E, B29K (Νε 十八4燒二酰-YGlu)，desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (Νε 二 十燒二 酰- γ Glu), desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (Νε 十六燒二 酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K(Νε 十八燒二 酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，ΒΙΕ, B25H, B27E, B28E, B29K (Νε 二十燒二 酰-YGlu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B28D，B29K (Νε 十六烷二酰-γ Glu-OEG-OEG)， desB30 人胰島素；A14E，B28E, B29K (Νε 十六燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素； B25N, B27E, B29K (Νε 二十烷二酰-y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；B25N，B27E, B29K (Νε 十八烷二酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；B25N，B27E, B29K (Νε 十六烷二 酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；B25N，B27E, B29K (Νε 二十燒二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；B25N，B27E, Β29Κ(Νε 十八烷二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；B25N，B27E, B29K(Νε 十六燒二酰-YGlu)，desB30 人胰島素；A8H，B25N, B27E, B29K(Νε 二十燒二 酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A8H，B25N，B27E，Β^Κ(Νε 十八燒二 酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A8H，B25N，B27E，Β29Κ(Νε 十六烷二 酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A8H，B25N, B27E, B29K (Νε 二十燒二酰-Y Glu)， desB30 人胰島素；A8H, B25N, B27E, B29K (Νε 十八烷二酰 1 Glu)，desB30 人胰島素；A8H, B25N, B27E, B29K (Νε 十六燒二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K (Νε (N- 二十 烷二酰-N-羧甲基)-β Ala-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B29K(Νε (N-十八烷 二酰-N-羧甲基)-β Ala-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B29K(Νε (N-十六烷二 酰-N-羧甲基)-β Ala-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K(Νε 十八燒二 酰-16111-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰)甲氧基]乙 酰)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, Β29Κ(Νε 二十烷二酰 _iGlu_2-[ (3-{2-[2-(3_ 氨基丙 氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲?；?甲氧基]乙?；?，desB30人胰島素；A14E， Β16Η，Β25Η，Β29Κ(Νε十八烷二酰_lGlu-2_[ (3-{2_[2_ (3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基} 丙基氨基甲?；?甲氧基]乙酰基)，desB30人胰島素；A14E，B16H，B25H，B K(Nε二十烷 二酰-16111-2-[(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基氨基甲酰基)甲氧基] 乙?；?，desB30 人胰島素；B25H，Β29Κ(Νε 十八烷二酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島 素；B25H，B29K (Νε 二十燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；B25H，B29K (Νε 十八燒 二酰-YGlu)，desB30 人胰島素；B25H，Β29Κ(Νε 二十烷二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素； B25H，Β29Κ(Νε 十八烷二酰)，desB30 人胰島素；B25H，Β29Κ(Νε 二十烷二酰)，desB30 人胰 島素；B25H，B29K (Νε 十八燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；B25H，B29K (Νε 二十 烷二酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；B25H，B29K (Νε 十八烷二酰-y Glu)，desB30 人 胰島素；B25H，Β29Κ(Νε 二十烷二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；B25H，Β29Κ(Νε 十八烷二 酰)，desB30 人胰島素；Β25Η,Β29Κ(Νε 二十烷二酰)，desB30 人胰島素；B25H, B29K (Νε 十八 烷二酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；Β25Η，Β^Κ(Νε 二十烷二酰-γ Glu-OEG-OEG)， desB30 人胰島素；B25H，B29K (Νε 十八燒二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；B25H，B29K (Νε 二十燒二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，desB27,B29K (Νε 十八燒二酰)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, desB27, Β29Κ(Νε 二十燒二酰)，desB30 人胰島素；Α14Ε，B25H, desB27,B29K (Νε 十八烷二酰-y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，desB27,B29K (Νε 二十 燒 二 酰-YGlu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，desB27，Β^Κ(Νε 十八燒二5酰-γ Glu-OEG-OEG), desB30 人胰島素；A14E，B25H, desB27, B29K (Νε 二 十燒二 酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，A21G, B25H, desB27, B29K (Νε 十八燒二酰)， desB30 人胰島素；A14E，A21G, B25H, desB27, B29K(Νε 二十燒二酰)，desB30 人胰島素； A14E, A21G, B25H, desB27, B29K(Νε 十八烷二酰-yGIu)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, desB27，B29K (Νε 二十烷二酰-y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，A21G，B25H, desB27，B29K (Νε 十八燒二酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, desB27, B29K (Νε 二十燒二 酰-Y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A1G(N° 十八烷二酰-y Glu-OEG-OEG)，A14E，A21G， B25H, desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K (Νε 二十燒二酰-0EG)，desB30 人胰島素；A14E， B25H, B27K (Νε 十八燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB28, desB29, desB30 人胰島素；A14E， B25H, B29K (Νε (5-二十烷二酰氨基間苯二甲酸))，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B29K (Νε 十八烷二酰)，desB30 人胰島素；Α14Ε，Β29Κ(Νε 十八烷二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人 胰島素；A14E，B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Νε 二十烷二酰-y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰 島素；A14E，B25H, B29K (Νε 十八燒二 酰-γ Glu-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B29K (Νε 二十烷二酰-0EG-0EG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，B^K (Νε 二十烷二酰-Aoc)， desB30 人胰島素；Α14Ε，B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Νε 二十燒二酰-γ Glu-γ Glu)， desB30 人胰島素；Α14Ε，B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Νε 二十燒二酰-γ Glu-γ Glu)， desB30 人胰島素；A14E, B25H, B29K (Νε 十八烷二酰-0EG)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, desB27, B29K (Νε 十八燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B16H, Β29Κ(Νε 十八烷二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；AlG (Na 十八烷二酰)，A14E，B25H, B29R, desB30 人胰島素;Α14Ε，Β16Η，Β25Η，Β29Κ(Νε 二十烷二酰-γ Glu)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B27K (Νε 二十燒二酰-y Glu)，desB28, desB29, desB30 人胰島素；A14E，B25H，B29K (Νε 十八烷二酰-Y Glu-γ Glu-γ Glu)，desB30 人胰島素；A21G, B25H, Β29Κ(Νε 十八烷二酰)， desB30 人胰島素；A14E，A21G，B25H, desB27,B29K (Νε 二十燒二酰-y Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，A21G, B25H, B29K(Νε 十八燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素； A14E, A21G, B25H, B29K (Νε 二十燒二酰-γ Glu-OEG-OEG)，desB30 人胰島素；A14E，A21G, B25H, B29K (Νε 二十燒二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，A21G, B25H, B29K (Νε 二十燒 二酰)，desB30 人胰島素；A14E, A21G，B25H, Β29Κ(Νε 十八烷二酰-Y Glu)，desB30 人胰島 素；A14E, A21G, B25H, B29K (Νε 十八烷二酰)，desB30 人胰島素；A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Νε 十八燒二酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；Α14Ε，B25H, B26G, B27G, B28G, B29K(Νε 十八燒二酰)，desB30 人胰島素；A14E，B25H，B^G，B27G，B^G，B^K(Νε 二十燒二 酰-Y Glu)，desB30 人胰島素；A14E，B25H, B26G, B27G, B28G, B29K (Νε 二十燒二酰)，desB30 人胰島素；AlG (Na 十八烷二酰-YGlu)，A14E，B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島素； AlG (Na 二十烷二酰-y Glu)，A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島素；AlG (Na 十八 燒二酰-YGlu)，A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人胰島素；A1G(N° 二十燒二 酰-Y Glu)，A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人胰島素；AlG (Na 十八烷二酰)， A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島素；AlG (Na 二十烷二酰)，A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, desB30 人胰島素；AlG (Na 十八烷二酰)，A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人胰島素和 AlG (Na 二十烷二酰)，A14E, B25H, B26G, B27G, B28G, B29R, desB30 人胰 島素。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的?；?、蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素，用作藥物。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的?；摹⒌鞍酌阜€(wěn)定化的胰島素，用于治療或 預(yù)防高血糖癥、II型糖尿病、葡萄糖耐量削弱、I型糖尿病、肥胖癥、X綜合征或血脂異常。
11.治療有效量的前述權(quán)利要求中的任一項所述的蛋白酶穩(wěn)定化的胰島素用于制備藥 物制劑的用途，所述藥物制劑用于治療或預(yù)防高血糖癥、II型糖尿病、葡萄糖耐量削弱、I 型糖尿病、肥胖癥、X綜合征或血脂異常。
12.本文中描述的任何新特征或特征的組合。
全文摘要
對蛋白酶表現(xiàn)出抗性的新型?；葝u素類似物可有效地通過肺部或口服給藥。該胰島素類似物包含B25H和A14E或A14H。
文檔編號C07K14/62GK102037008SQ200980118484
公開日2011年4月27日 申請日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月18日
發(fā)明者J·S·彼得森, J·T·科德拉, P·W·加里貝, P·雅各布森, P·馬德森, T·B·克爾德森, T·M·塔格摩斯, T·格倫多夫, T·霍格-詹森 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司