專利名稱：綠色木霉h1在降解甲醛中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及甲醛降解菌技術領域，具體涉及一種綠色木霉HI在 降解甲醛中的應用。
技術背景關于甲醛降解菌的甲醛降解能力的研究很早以前就有報道，早期 人們著手于低濃度降解甲醛的研究，近年來高濃度降解甲醛時有報 道。Adroer等(1990)分離的Pseudomonas putida A2能降解甲醛 250mg*L"; Azachil等(1995)分離了的Halomonas sp. MAC僅能耐 受甲醛75-100 mg*L"; Doronina等(1997)分離的Pseudomonas. alcaligenes能降解甲醛200 mg吃-1，菌株Pseudomonas putida J3能降 解甲醛450 mg'I/1， Methylobacterium extorquens能降解甲醛500-1000 mg'L—1; —株Pseudomonas alcaligenes培養(yǎng)3天后能降解甲醛 2000mg.L-1。 Mirdamadi等(2005)J艮道Methylobacterium extorquens (ESS和PSS)和四株Pseudomonas pseudoalcaligenes (LSW， SSW, NSW， OSS)能降解甲醛1850 mg'L—、其中菌株Pseudomonas pseudoalcaligenes OSS培養(yǎng)24 h3700 mg^I/1甲醛被100%消耗，培養(yǎng) 72h消耗5920 mg*L"甲醛70%， Methylobacterium extorquens ESS和 Methylobacterium extorquens PSS還能完全降解甲醛2960 mg'L"。 Bonastre等(1986)報道在C甲醛為2300 mg'dm—3的活性污泥做基質(zhì)的實驗里能部分的降解甲醛，甲醛能在好氧條件下被好氧菌降解；當以甲醛為碳源時降解甲醛400 mg，dm—3，在活性污泥廠的廢水處理中完 全降解甲醛2300mg'dm—3和苯酚2400mg*dm—3(Zagornaya et al ， 1990)。 Yamazaki等(2001)從海水里分離了一株甲醛耐受細菌，發(fā)現(xiàn)它在3% 的氯化鈉里能降解甲醛400 mg，dm-3，在Eiroa等(2004)設計的模型里， 指出硝化作用可以降解甲醛，當以甲醛為碳源、甲醇為伴生碳源時， 硝化細菌可以降解甲醛的濃度是30-3890 mg*dm—3，而反硝化細菌在 有甲醛和甲醇存在時可以降解1360mg*dm—3甲醛(Eiroa et al， 2006)。 然而大部分是降解甲醛細菌和降解甲醛酵母菌的研究，霉菌的研究報 道很少，Kondo等(2002)從土壤中分離了一株甲醛耐受真菌 Aspergillus nomius IRI013，它能生長在最高w(甲醛尸0.459fc里并把它完 全消耗掉。降解甲醛機理也有相關的報道，羥甲基細菌含有己酮糖磷酸合成 酶(HPS)和己酮糖磷酸異構酶(Pffl)，也屬于解毒系統(tǒng)(Mitsui et al， 2000)。耐熱的甲基營養(yǎng)菌Bacillus brevis Sl(Yurimoto et al， 2002)的 HPS和PHI基因表達3-己酮糖-6-磷酸酶和6-己-3-磷酸酶，磷酸核酮 糖路徑操縱子編碼甲醛固定。近年來也有發(fā)現(xiàn)非羥甲基細菌也存在這 一途徑，如Bacillus subtilis在與甲醛接觸之后HPS和PHI也得到了 表達(Yasueda et al， 1999)。據(jù)Marx等,艮道Methylobacterium extorquens AMI有一個很好的體系來氧化和同化甲醛(Marx et al， 2003a; 2003b)， 它的轉(zhuǎn)移/水解聯(lián)合酶(Fhc)可將甲醇和甲醛氧化成C02，產(chǎn)生甲酸鹽 (Pomper et al， 2002)。據(jù)Marx等報道Methylobacterium extorquens AMI有一個很好的體系來氧化和同化甲醛(Marx et al， 2003)，它的轉(zhuǎn)移/ 水解聯(lián)合酶(Fhc)可將甲醇和甲醛氧化成C02，產(chǎn)生甲酸鹽(Pomper et al， 2002)。 Mitsui等人(2005)分離一株Methylobacteriumsp.MFl，會旨 生長在多種碳源的培養(yǎng)基上，也能生長在只有甲醛為碳源的培養(yǎng)基 上。當培養(yǎng)基使用1.2g*L—i的甲醛作為碳源時，在200h內(nèi)將甲醛全部 消耗完。在有甲醇和甲醛同時存在時，Methylobacterium sp. MF1先 利用甲醇作為碳源并吸收甲醛，通過甲醇脫氫酶形成代謝媒介，甲醛 被甲醛脫氫酶以NAD+為輔酶、谷胱甘肽存在的條件下被代謝或吸收。 Cos等人(2005)在分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)酵母菌Pichia pastoris使用乙醇氧化酶和甲醛脫氫酶兩個不同的調(diào)節(jié)催化劑時，表 達不同的蛋白質(zhì)(脂肪酶)。Aggelis(2000)等人提出Candidaboidinii酵 母菌不但含有甲醛脫氫酶、甲酸鹽脫氫酶還含有甲醇脫氫酶，當然也 能利用甲醛、甲醇等多樣C源。Yasuhara等(2002)發(fā)現(xiàn)，Methylobacillus sp.(桿狀細菌)，Pseudomonas sp.(假單胞菌)禾n Streptomyces moderates(鏈霉菌)細胞里含有醛氧化酶(ALOD)，該酶能廣范圍的氧 化醛類，包括甲醛、脂肪族的醛、芬芳族的醛，雖然該酶的誘導對各 種醛類的依賴程度不一樣。對于綠色木霉Hl， 1996年Kuhls，K.和Lieckfeldt,E.等人對其進 行過研究報道，具體文獻為"Kuhls，K.， Lieckfeldt，E.， Samuels，G.J.， Kovacs,W., Meyer，W" Petrini，O.， Gams,W., Bomer,T. and Kubicek， C.P. Molecular evidence that the asexual industrial fungus Trichoder ma reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocreajecorina.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (15)， 7755-7760 (1996)。"，到目前為止，有報道綠色木霉不但能產(chǎn)生多種具活性的酶系，而且又是資 源豐富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用，還在 基因工程上有一定的應用。但是對于綠色木霉H1能降解甲酸，尚未見相關文獻報道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種綠色木霉H1在降解甲醛中的應用，其 可有效、快速地降解甲醛。本發(fā)明的上述目的通過以下技術方案實現(xiàn)一、甲醛降解菌一綠色木霉Hl的分離與鑒定1、培養(yǎng)基配方基本培養(yǎng)基1.0免(wv—1)葡萄糖，0.2%(wv-i)NaN03 ， 0.1呢(w.v")K2HP04， 0.059Kw.v、MgS。4.7H20 ， 0.05免(w-v"KCl ， 0.001免(w.v")FeS04.7H20， 0.019KwV"酵母膏，0.1免(w.v-i)甲醛(甲 醛用市售甲醛標準溶液)，培養(yǎng)基最終pH為6.0 (如沒有特別說明， 以下基本培養(yǎng)基均為此配方培養(yǎng)基)。察氏培養(yǎng)基配方3.0免(w-v-1)蔗糖，0.3呢(w-v")NaN03 ， 0.1呢(w.v、K2HP04， 0.05呢(w一)MgS04.7H20 ， 0.05%(w.v-"KC1 ， 0.001免(w.v")FeS04.7H20， 1.5—2.0免(w.v")瓊脂。麥芽汁培養(yǎng)基配方2.0免(w.v")麥芽浸膏，0.1免(wv")蛋白胨， 2.0免(w.v")葡萄糖，1.5—2.0呢(w.一)瓊脂。PDA培養(yǎng)基配方20免(w.v")土豆(去皮)，2.0免(w.v")葡萄糖，1.5—2.0% (w.v—b瓊脂。(土豆切碎，加水煮沸30min，用雙層紗布過 濾，取其濾液。)2、分離純化與結果分析樣品采自未經(jīng)過處理的家具廠出水口的淤泥，其甲醛氣味濃烈， 甲醛污染嚴重，從而保證了甲醛降解目的菌的存在。將上述樣品接種于基本培養(yǎng)基里，搖床上160r.mii^3(TC培養(yǎng)5d， 生長起來的霉菌再多次用PDA培養(yǎng)基平板畫線，經(jīng)多次純化，分離 到一株霉菌，編號H1。然后將菌株H1分別接種于察氏培養(yǎng)基、麥 芽汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上，25'C培養(yǎng)8d，觀察其菌落特征。同時， 顯微鏡下觀察顯微結構，并記錄好結構特征，結合提取DNA，檢測 DNA濃度和純度，PCR 18S rDNA擴增等一系列的分子鑒定手段得出 結論本發(fā)明分離純化得到的甲醛降解菌H1的18SrDNA序列與已 報道的綠色木霉(7Wc/io^w^ wW&)同源率達99.6%，其培養(yǎng)特征 及顯微特征也與綠色木霉(7Wc/^^rm"wW^)最相似。綠色木霉Hl的報道文獻為Kuhls，K.， Lieckfeldt，E.， Samuels，G丄, Kovacs，W.， Meyer，W.， Petrini,O.， Gams，W.， Borner，T. and Kubicek，C.P. Molecular evidence that the asexual industrial fungus Trichoderaia reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocreajecorina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (15)， 7755-7760 (1996)由此可見，本發(fā)明篩選到的降解甲醛菌HI為綠色木霉，18SrDNA 序列長度為1075bp，上傳GenBank申請?zhí)柎a為bankit890445。二、綠色木霉H1的最佳生長pH值霉菌一般喜好生長在偏酸的環(huán)境里，但其嗜酸性的程度差別很 大，因此了解其最佳生長的pH，有利于對其進行快速培養(yǎng)和應用。1、 一級種子的制取選取產(chǎn)孢良好的綠色木霉Hl，接種在基本培養(yǎng)基中，搖床 160r.min—1， 30。C培養(yǎng)2 3d，當霉菌進入快速生長期時，定時測定 0/)475值，當6^475值快速上升時，此菌液即可作為一級種子。2、 樣品制備選取大口 150mL三角瓶，配制pH分別為4.0， 4.5， 5.0， 5.5，6.0的液體基本培養(yǎng)基，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口 (無菌封口培養(yǎng) 膜是環(huán)凱公司生產(chǎn)的雙層膜，上有直徑0.6cm的圓孔兩個，中間有直 徑3cm的、孔徑小于0.2pi的無菌濾紙片，多用于組培生產(chǎn))，培養(yǎng) 一級種子(0/)475值為0.189)，除空白外接入一級種子5mL，置搖床 上30。C160r.min"培養(yǎng)，在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h 取樣，每次取2瓶測量菌絲干重，OZ)值測定用北京普析通用儀器有 限責任公司TU-1800型紫外可見分光光度計，菌絲干重用重量法測 量，結果取其平均值作圖。3、 結果分析綠色木霉Hl在5種不同pH培養(yǎng)基中培養(yǎng)144h (見圖l)，菌 絲干重分別從0.0031、 0.0031、 0.0030、 0.0032、 0.0031 mg.1/1上升到 0.0996、 0.1049、 0.1000、 0.0922、 0.0818 mgL—1，菌絲干重最大的是 pH4.5。三、綠色木霉H1對甲醛的降解能力選取大口 150mL三角瓶，配制基本培養(yǎng)基，C(申船按約0.1免、 0.15%、 0.2%、 0.25% (w.v")加入，pH分別選取已經(jīng)測得的最適pH (pH4.5)，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，培養(yǎng)一級種子(0￡)475值為 0.192)，除空白外每瓶接入5mL，置搖床上SCTCWOr.min-1培養(yǎng)，并 在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取3瓶，其 中一瓶為空白，7000X離心15min、過濾，濾液用AHMT分光光度 法檢測C(鴨)，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已稱至恒重的燒杯中測菌絲干重， 菌絲干重用重量法測量，結果取其平均值作圖。的檢測用AHMT分光光度法，結果以實際測量數(shù)據(jù)為準， 并取其平均值作圖。綠色木霉HI接種后144h，處理0.1%C (甲酵)從1047 mg.L"下降 到7.6mg.L-1，降解率為99.3%，實驗空白在1056-1106 mg.L1，幾乎 沒有揮發(fā)損失，96h內(nèi)，C(甲配下降迅速，菌絲增長緩慢，96h后， 菌絲干重增長迅速，但C(申醒)下降緩慢；處理0.15免C(甲醛)從1365 mg.L—1 下降到42mg丄"，降解率為96.9%，實驗空白在1516-1581 mg-L"， 揮發(fā)損失很少，96h內(nèi)，Cw酸)下降迅速，菌絲增長緩慢，96h后， 菌絲干重增長迅速，但C(甲整)下降緩慢；處理0.20呢C(甲酸)從2333mg丄—1 下降到628mg.1/1，降解率為73.1%，實驗空白在2494-2581mg*L—、 揮發(fā)損失不多，48h內(nèi)，C(甲醛)下降緩慢，48h后，C(甲酸)下降迅速， 菌絲干重增長緩慢；處理0.25%(^( )從2934mg.L—1下降到949mg.L—1， 降解率為67.7%，實驗空白在3125-3372mg.L-1，揮發(fā)很少，48h內(nèi)，C(甲&下降緩慢，72h后，C(申酸)下降迅速，菌絲干重增長緩慢。在4個不同濃度的處理中，菌絲干重分別從0.0030、0.0031、0.0030、0.0031g 'L"上升為0. 1047、 0.0825、 0.0162、 0.0164g'L—1。綠色木霉m的降解曲線總的規(guī)律是由慢到快，再由快到慢， 有兩個閾值。在高濃度甲醛里曲線從緩慢下降轉(zhuǎn)入到快速下降，這個閾值大約是1500mg丄—i左右；在低濃度甲醛里曲線從快速下降解轉(zhuǎn)入 到緩慢下降，這個閾值大約是50mg丄"左右。 四、綠色木霉Hl的碳源代謝及最佳碳源選取4種常用碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，按 培養(yǎng)基體積的10免添加(wv—、，設置5種不同處理的碳源，分別為 0.1%甲醛、0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛 +10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖，其余成分同基本培養(yǎng)基，pH值 Hl為4.5， H2為5.0， H4為5.5，選用大口 150mL三角瓶分裝，瓶 口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，接入一級種子5mL (00475值為0.199)， 置搖床上30°C160r.min—4咅養(yǎng)，并在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， U4h取樣，每次取2瓶，測C順)和菌絲干重值，H4培養(yǎng)基里 有葡萄糖的處理，加測C權萄糖)，并帶只加葡萄糖不加菌的培養(yǎng)基空 白。OD值測定用北京普析通用儀器有限責任公司TU-1800型紫外可 見分光光度計，取樣后7000X離心15min、過濾，濾液用來測量C押 醛)和C 萄糖)，C押薛)用AHMT分光光度法檢測，C m萄糖)用蒽酮比色 法檢測，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已稱至恒重的燒杯中測菌絲干重。結果以 實際測量數(shù)據(jù)為準，并取其平均值作圖。綠色木霉H1在5種不同的碳源里都能有效的降解甲醛，菌絲干重分別從0.0038、 0.0036、 0.0039、 0.0039、 0.0037 g'L"上升到0.0443、 0.1071、 0. 1021、 0. 1019、 0. 1068g'L"，在處理0.1%甲醛+10%蔗糖、 0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛+10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖 中，C伸醛)分別從1231、 1204、 1194、 1229mg*L"下降到1.80、 2.70、 3.60、 5.10mg'L1，降解率分別為99.9、 99.8、 99.7、 99.6%， 96h內(nèi)， C(甲醛)下降迅速，菌絲增長較慢，96h后，菌絲干重增長較快，但C(甲 瞎)下降緩慢。在只有甲醛作為碳源的處理中，培養(yǎng)144h時Hl的C押醒)從 1226mg'L—1降到142 mg*L—、降解率為88.4%，降解曲線24h后下降 速度加快，后期沒有出現(xiàn)緩慢下降期，菌絲干重增長緩慢，沒有出現(xiàn) 快速增長期。所以綠色木霉H1能單獨利用甲醛為碳源并降解甲醛， 但降解效果不如加復合碳源。葡萄糖的加入量為13240 mg.L—1， C^萄糖)呈加速度下降，24h前 稍慢，僅消耗葡萄糖400 mg吃-1， 48h又消耗葡萄糖1191mg'1/1，以 后每隔24h消耗的量為1438、 4000、 3001、 3021mg'i;1，到144h C權 萄糖)是189 mg L—、只加葡萄糖沒加菌的空白，C憤萄和穩(wěn)定，計算葡 萄糖消耗量時可忽略此空白。綠色木霉H1以甲醛和葡萄糖為碳源的的利用規(guī)律是前期，C押 瞎)下降快，C，細下降比后斯侵，此時甲醛還能抑制菌體的繁殖， 綠色木霉H1先以甲醛和葡萄糖同時為碳源，并優(yōu)先利用甲醛；當C 伸醛)減少到不足以抑制綠色木霉H1生長時，綠色木霉H1則主要以葡萄糖為碳源，C 下降速度比前期慢。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn) 已有菌種綠色木霉HI具有降解甲醛的能力，同時提供了綠色木霉 Hl在降解甲醛的應用中的一系列數(shù)據(jù)，如最適生長pH、碳源和甲醛 降解能力等，極大地補充了降解甲醛菌的資料庫，并且填補了國內(nèi)甲醛降解菌研究的空白；2.綠色木霉在自然界中分布范圍廣，且具有繁 殖快，生長能力強等優(yōu)點，所以本發(fā)明提供的綠色木霉H1在降解甲 醛中的應用，為甲酵污染的生物處理工程，提供了強有力的幫助。


圖1為綠色木霉H1在察氏培養(yǎng)基(25°C， 7d)上的菌落形態(tài)； 圖2為綠色木霉H1在在麥芽汁培養(yǎng)基(25°C， 7d)上的菌落形態(tài)；圖3為綠色木霉H1在PDA培養(yǎng)基(加有孟加拉紅，25°C， 7d) 上的菌落形態(tài)；圖4為綠色木霉Hl的分生孢子梗、小梗；圖5為綠色木霉Hl在不同pH時的生長曲線；圖6為綠色木霉Hl在不同C 時的降解曲線；圖7為綠色木霉Hl在不同C伸酸)時的生長曲線；圖8為綠色木霉Hl在不同碳源里的C ，s)的降解曲線；圖9為綠色木霉HI在不同復合碳源里的生長曲線；圖IO為綠色木霉HI的C輸萄糖)的下降曲線；圖11為綠色木霉HI C伸酸)和C r葡萄糖)的下降曲線比較；其中，l為甲醛，2為甲醛+蔗糖，3為甲醛+麥芽糖，4為甲醛+ 淀粉，5為甲醛+葡萄糖，6為葡萄糖，ck為空白對照。通過借助以下實施例將更詳細說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明 性的，本發(fā)明并不受這些實施例的限制。
具體實施方式
實施例1甲醛降解菌的分離與鑒定1、 培養(yǎng)基的配制基本培養(yǎng)基配方1.0免(w-v")葡萄糖，0.2%(w*v—i)NaN03 ， 0.19Hw.v")K2HP04， 0.059Kw.一)MgSCV7H20 ， 0.05免(w.v")KCl ， 0.001呢(w'v")FeSCV7H20， 0.019Kw.v")酵母膏，0.19Hw.v")的甲醛(甲 醛用市售甲醛標準溶液)，培養(yǎng)基最終pH為6.0。察氏培養(yǎng)基配方3.0%(w.v—b蔗糖，0.3呢(w.v")NaN03 ， 0.1免(w.v")K2HP04， 0.05呢(w.v")MgS04.7H20 ， 0.05免(w.v")KCl ， 0.001呢(w'v")FeS04.7H20， 1.5 2.0免(w.v")瓊脂。麥芽汁培養(yǎng)基配方2.09Kwv")麥芽浸膏，0.19Hw-v")蛋白胨， 2.09Kw.v")葡萄糖，1.5 2.0^(w.v")瓊脂。PDA培養(yǎng)基配方20% (w.v-i)土豆，2.0免(w.一)葡萄糖，1.5 2.0% (w-v—、瓊脂。(土豆去皮切碎，加水煮沸30，用雙層紗布過濾，取其 濾液。)2、 分離樣品采自未經(jīng)過處理的家具廠出水口的淤泥，其甲醛氣味濃烈，甲醛污染嚴重，從而保證了甲醛降解目的菌的存在。在超凈工作臺上，取10g上述淤泥樣置于90mL無菌水中，振蕩 15 min，放置20秒，取lmL上清液接種于培養(yǎng)液里，在搖床上 160r.mii^3(TC培養(yǎng)5d，生長起來的真菌再多次用PDA培養(yǎng)基平板畫 線，經(jīng)過多次畫線純化，分離到一株霉菌。3、鑒定(1) 平板觀察選取察氏培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，將接種針經(jīng)火 焰滅菌并冷卻后，蘸取極少量的孢子，點植于平板的中間位置，將平 板置于25。C培養(yǎng)8d，觀察菌落的特征并記錄。(2) 顯微觀察用解剖針從培養(yǎng)皿的菌落上，姚取少許菌體，置載玻片的水滴中， 于顯微鏡下觀察其形態(tài)特征并記錄。(3) 分子鑒定DNA的提取參照CTAB法進行，DNA濃度和純度的檢測，采用核 酸/蛋白分析儀于Nucleic Acid程序下測定。PCR采用真菌18S rDNA擴 增通用引物(上游引物GATCCTGCCAGTAGTCATATGC;下游引 物GCTGCGTTCTTCATCGATGC)，反應條件為94。C 5min， 30個 循環(huán)(94°C lmin、 56°C lmin、 72°C lmin) ， 72。C反應7min。用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳40min，于UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結果。擴增產(chǎn)物測序由上海英俊生物技術有限公司完成，測序結果在 Genbank數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行同源序列搜索，找出該菌株與數(shù)據(jù)庫中同源性最高的模式菌株。4、結果與分析經(jīng)平板觀察和顯微觀察，菌株在察氏培養(yǎng)基上生長不良，極稀薄， 呈蔓延狀，擴展至整皿，有少量綠色物，為產(chǎn)孢結構(圖l);在麥 芽汁培養(yǎng)基上菌絲生長茂盛，3d即可長滿整皿，質(zhì)地疏松，棉絮狀， 接種點附近稍凹陷，菌絲淡白色，表面呈綠色，為產(chǎn)孢結構，反面淡黃色(圖2);在PDA培養(yǎng)基上生長速度中等，3d長滿半個皿，疏 松絮狀，有綠色，為產(chǎn)孢結構(圖3)。分生孢子梗有隔膜，垂直對生分枝，頂枝尖端細削，微彎，基部溢縮，中部膨大，呈瓶形或錐形，分生孢子著生于瓶梗頂端，球形，直徑2-13,，孢壁具小疣狀突起， 淡綠色(圖4)。經(jīng)分子鑒定，該菌株的18SrDNA序列與已報道的綠色木霉Hl (7Wc/w&rma wW&)同源率達99.6%，其培養(yǎng)特征及顯微特征也與 綠色木霉H1 (7Wc/w&rmflvzW&)最相似。 綠色木霉H1的報道文獻為Kuhls，K.， Lieckfeldt,E" Samuels,G丄，Kovacs，W.， Meyer，W" Petrini，O., Gams,W.， Borner,T. and Kubicek，CP. Molecular evidence that the asexual industrial fungus Trichoderma reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocreajecorina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (15), 7755-7760 (1996)。結合上述的平板觀察、顯微觀察和分子鑒定結果，得出如下結論本發(fā)明篩選到的甲醛降解菌為綠色木霉Hl， 18SrDNA序列長度為1075bp，上傳GenBank申請?zhí)柎a為bankit890445 。'實施例2綠色木霉H1的最佳生長pH值 霉菌一般喜好生長在偏酸的環(huán)境里，但其嗜酸性的程度差別很 大，因此了解其最佳生長的pH，有利于對其進行快速培養(yǎng)和應用。1、 一級種子的制取選取產(chǎn)孢良好的綠色木霉Hl，接種在基本培養(yǎng)基中，搖床 160r.mii!-1， 3(TC培養(yǎng)2 3d，當霉菌進入快速生長期時，定時測定 (9/)475值，當0/>475值快速上升時，此菌液即可作為一級種子。2、 培養(yǎng)基的配制選取大口 150mL三角瓶，配制pH分別為4.0， 4.5， 5.0， 5.5， 6.0的基本培養(yǎng)基，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口 (無菌封口培養(yǎng)膜是 環(huán)凱公司生產(chǎn)的雙層膜，上有直徑0.6cm的圓孔兩個，中間有直徑 3cm的、孔徑小于0.2n的無菌濾紙片，多用于組培生產(chǎn))，培養(yǎng)一 級種子(02>475值為0.189)，除空白外接入接入一級種子5mL，置搖 床上30。C160r.min"培養(yǎng)，在接種的第0， 24， 48， 72， 96， 120， 144h 取樣，每次取2瓶測量菌絲干重，OD值測定用北京普析通用儀器有 限責任公司TU-1800型紫外可見分光光度計，菌絲干重用重量法測 量，結果取其平均值作圖。3、 菌絲干重的測量燒杯在105。C烘lh至恒重，記錄稱量結果，將菌液用濾紙過濾 后，連同濾紙一起轉(zhuǎn)入已恒重的燒杯中，于8(TC烘至恒重，每次帶空白兩個以上。菌絲干重(g.L—1)=[(燒杯+菌的重量+紙)-(燒杯+紙)]*1000/樣品量。菌絲干重取其平均值作圖。4、結果與分析綠色木霉H1在5種不同pH培養(yǎng)基中(圖5)，菌絲干重在接 種后24h相差不大，48h后菌絲干重開始隨著pH的不同發(fā)生變化， 到144h不同處理之間就有了較大的差別，其中菌絲干重最大的是處 理pH4.5為0.1049 g'l/1，其次是pH4.0、 5.0、 5.5，菌絲干重分別為 0.0996、 0.1000、 0.0992g'L"， pH6.0菌絲生長稍慢，菌絲干重為0.818g L—、所以綠色木霉H1的適宜生長pH范圍為pH4.0 5.5，最適pH 為pH4.5。實施例3綠色木霉Hl對甲醛的降解能力 1、樣品制取選取大口 150mL三角瓶，配制基本培養(yǎng)基，C(甲醛)按約0.1免、 0.15%、 0.2%、 0.25% (w.v—b加入，pH分別選取已經(jīng)測得的最適pH (pH4.5)，瓶口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，培養(yǎng)一級種子(0￡>475值為 0.192)，除空白外每瓶接入5mL，置搖床上3(TC160r.min—1培養(yǎng)，并 在接種的第O， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取3瓶，其 中一瓶為空白，7000X離心15min、過濾，濾液用AHMT分光光度 法檢測C(￥S)，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入己稱至恒重的燒杯中測菌絲干重菌絲干重用重量法測量，結果取其平均值作圖。C(鴨)的檢測用AHMT分光光度法，原理為甲醛與4-氨基-3聯(lián) 氨-5-巰基-l,2，4-三氮雜茂(簡稱AHMT)在堿性條件下縮合，然后經(jīng) 高碘酸鉀氧化成6-巰基-5-三氮雜茂[4，3-b]-S-四氮雜苯紫紅色化合物， 其色澤深淺與甲醛含量成正比。上述樣品經(jīng)7000X離心15min并過濾后，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已 稱至恒重的燒杯中測菌絲干重，取其平均值作圖；濾液用AHMT分 光光度法檢測C(甲薛)，具體步驟如下取100ml容量瓶，吸取l.Oml稀釋了 100倍的上述濾液，加入 5mol.L—i氫氧化鉀溶液1.0ml， 0.5%AHMT溶液l.Oml，蓋上管塞， 顛倒混勻三次，放置20min，加入1.5%高碘酸鉀0.3ml，充分振搖， 放置5min，定容至100ml。用lcm比色皿，波長550nm，隨樣品帶空 白，測量吸光值，甲醛標液購自百靈威化學技術有限公司。甲醛標線 的操作步驟，跟樣品的相同，制作標準曲線，得出標線方程，樣品含 量由標線方程換算得出。3、結果與分析如圖6、 7所示，綠色木霉Hl接種后144h，處理0.1免C(鴨)從 1047 mg.L—1下降到7.6 mg.L",降解率為99.3%，實驗空白在1056-1106 mg.L—1，幾乎沒有揮發(fā)損失，96h內(nèi)，C(甲酸)下降迅速，菌絲增長緩慢， 96h后，菌絲干重增長迅速，但C(,)下降緩慢；處理0.15呢Cw酵) 從1365 mg.L—1下降到42mg.L/1，降解率為96.9%，實驗空白在1516-1581 mg.1/1，揮發(fā)損失很少，96h內(nèi)，C(甲酵,下降迅速，菌絲增 長緩慢，96h后，菌絲千重增長迅速，但C(^)下降緩慢；處理0.20%C (甲醛)從2333mg.L"下降到628mg.L—1，降解率為73.1%，實驗空白在 2494-2581mg.L—1，揮發(fā)損失可忽略，48h內(nèi)，C(甲酵)下降緩慢，48h 后，C(甲醛)下降迅速，菌絲干重增長緩慢；處理0.25免C(甲醛)從2934mg-L" 下降到949mg.L—1，降解率為67.7%，實驗空白在3125-3372mg丄"， 揮發(fā)很少，48h內(nèi)，C(甲薛)下降緩慢，72h后，C(甲醛〉下降迅速，菌絲 干重增長緩慢。綠色木霉Hl的降解曲線總的規(guī)律是由慢到快，再由快到慢， 有兩個閾值。在高濃度甲醛里曲線從緩慢下降轉(zhuǎn)入到快速下降，這個 閾值大約是1500mgi—i左右；在低濃度甲醛里曲線從快速下降解轉(zhuǎn)入 到緩慢下降，這個閾值大約是50mg.L"左右。實施例4綠色木霉Hl的碳源代謝及最佳碳源 選取4種常用碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，按 培養(yǎng)基體積的10呢添加(wv—1)，設置5種不同處理的碳源，分別為 0.1%甲醛、0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛 +10%淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖，其余成分同基本培養(yǎng)基，pH值 Hl為4.5， H2為5.0， H4為5.5，選用大口 150mL三角瓶分裝，瓶 口用無菌封口培養(yǎng)膜封口，接入一級種子5mL (m、 H2、 H46>D475 值分別為0.199， 0.210， 0.187)，置搖床上30°C160r.min—1培養(yǎng)，并在 接種的第O， 24， 48， 72， 96， 120， 144h取樣，每次取2瓶，測Cw醛)和菌絲干重值，H4培養(yǎng)基里有葡萄糖的處理，加測C憤萄糖)，并帶 只加葡萄糖不加菌的培養(yǎng)基空白。O"值測定用北京普析通用儀器有限責任公司TU:1800型紫外可見分光光度計，取樣后7000X離心 15min、過濾，濾液用來測量C伸瞎)和C 用AHMT分光光度法檢測，CV葡萄糖)用蒽酮比色法檢測，濾紙和菌一起轉(zhuǎn)入已稱至 恒重的燒杯中測菌絲干重。結果以實際測量數(shù)據(jù)為準，并取其平均值 作圖。綠色木霉H1在5種不同的碳源里都能有效的降解甲酸，在處理 0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛+10%淀粉、 0.1%甲醛+10%葡萄糖中，CV甲醛)分別從1231、 1204、 1194、 1229mg'L—1 下降到1.80、 2.70、 3.60、 5.10mg爭L1 (圖8)，降解率分別為99.9、 99,8、 99.7、 99.6%， 96h內(nèi)，C(甲腔)下降迅速，菌絲增長較慢，96h 后，菌絲干重增長較快，但C(鴨)下降緩慢。綠色木霉m在5種不同的碳源里都能有效的降解甲醛(圖8)，在處理0.1%甲醛+10%蔗糖、0.1%甲醛+10%麥芽糖、0.1%甲醛+10% 淀粉、0.1%甲醛+10%葡萄糖中，降解甲醛速率相差不大，在144h甲 醛從1200mg'L—1左右降到10 mg'L"以下，前期48h以前C (甲酸)下降稍慢，菌絲干重上升也慢(圖9) ， 96h后C押酸)和菌絲干重進入快 速變化階段，4個碳源組合沒有明顯的優(yōu)劣勢。在只有甲醛作為碳源的處理中，144hC押薛)從1236mg'L-l左右 降到142mg'L-l， 96h后下降速度稍快，變化趨勢也是先慢后快，菌 絲干重增長緩慢，沒有出現(xiàn)快速增長期。所以綠色木霉H1能單獨利用甲醛為碳源并降解甲醛，但降解效果不如加復合碳源。葡萄糖的下降(圖10)， C(葡萄糖)從13240mg'L—1下降到189mg'L—1， 減少速率是先慢后快，C從1229mg，I^下降到5.1 mg*L—\降解 速度是先快后慢。在72h前，甲醛降解曲線下降迅速，C凍萄糖)的下 降曲線相對較慢，較高濃度的甲醛對菌體繁殖有抑制作用，綠色木霉 Hl以甲醛和葡萄糖同時為碳源，且有優(yōu)先利用甲醛的趨勢(圖11); 72h后，CV甲醛)下降緩慢，CV葡萄糖)的曲線下降得很快，當C伸醛)減少 到不足以抑制霉菌生長時，綠色木霉H1則主要以葡萄糖為碳源，菌 絲干重快速上升。
權利要求
1、綠色木霉H1在降解甲醛中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供綠色木霉H1在甲醛降解中的應用。關于甲醛降解菌的研究很早以前就有報道，然而大部分是關于甲醛降解細菌和甲醛降解酵母菌的研究，甲醛降解霉菌的研究報道很少，目前尚無甲醛降解菌的報道，本發(fā)明公開了已有菌株——綠色木霉H1在降解甲醛中的應用，同時提供了綠色木霉H1在降解甲醛的應用中的一系列數(shù)據(jù)，如最適生長pH、碳源和甲醛降解能力等，極大地補充了降解甲醛菌的資料庫，填補了國內(nèi)甲醛降解菌研究資料的空白，此外，綠色木霉H1在自然界中分布范圍廣，繁殖快，生長能力強，因此本發(fā)明提供的綠色木霉H1在降解甲醛中的應用，為甲醛污染的生物處理工程，提供了強有力的幫助。
文檔編號A62D101/28GK101250487SQ200810027399
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月14日 優(yōu)先權日2008年4月14日
發(fā)明者盧普相, 周建民, 孫翠香, 陳能場, 黃賽花 申請人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所