專利名稱：一株甲醛降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有甲醒降解能力的新菌株-甲基桿菌(Methylobacterium
sp. ) XJLW及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲醛是一種重要的室內(nèi)空氣污染物，可經(jīng)呼吸道吸收，幾乎對所有生物都有毒性。長期接觸低劑量甲醛可引起人體慢性呼吸道疾病、妊娠綜合癥，引起新生兒體質(zhì)降低、染色體異常，高濃度甲醛則對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肝臟等都有毒害。因其對人體極強的毒害作用，甲醛在我國有毒化學(xué)品優(yōu)先控制名單中高居第二位。甲醛也是生物體一碳代謝過程中的關(guān)鍵性中間產(chǎn)物，幾乎所有的生物對甲醛都有各自的解毒機制。由于微生物具有對污染物有較強降解能力、較快的適應(yīng)能力等特點，利用微生物降解甲醛已成為近年來人們研究 的重點。目前，發(fā)現(xiàn)有甲醛代謝能力的微生物主要為甲基營養(yǎng)型細(xì)菌，也有一些真菌和非甲基營養(yǎng)菌。國內(nèi)關(guān)于甲醛降解菌的報道較少，如黃賽花(黃賽花，陳能場.一株甲醛降解真菌Aspergillus spp. H4的分離鑒定[J].生態(tài)環(huán)境，2007,16 (4) : 1175-1179.)等曾分離出一株甲醒降解真菌AspergiIIus f lavus H4,能在144h內(nèi)降解99. 7%的初始濃度為I. 241g/L的甲醛。國外關(guān)于甲醛降解菌的文獻(xiàn)報道則相對較多，如Adroer (ADROER N, CASAS C7DEMASC, et al. Mechanism of formaldehyde biodegradation by Pseudomonas putida[J].Appl microbio Ibio techno 1,1990, 33 (2) : 217-220)等分離出 P. put i da A2 能在 I. 25h 內(nèi)降解 380mg/L 的甲醛；Yamazaki (YAMAZAKI T, TSUGAffA W，SSDE K. Biodegradation offormaldehyde by a formaldehyde-resistant bacterium isolated from seawater[J].Biotechnol appl bioc, 2001,91 (3) : 213-217.)等分離的 Methylobacterium sp. MFl 能夠在 200h 內(nèi)降解 I. 2g/L 的甲醛；Iwahara Masayoshi (IffAHARA M, FUKUDA R, NAKAHARA K,et al. Isolation and properties of Paecilomyces sp. No. 5capable of degrading highconcentrations of formaldehyde [J]. Biocontrol sci, 2002, 7 (2) : 107-110)等分離的Paecilomyces sp. no. 5是目前文獻(xiàn)中甲醒耐受濃度最高的甲醒降解菌，能在甲醒初始濃度為20g/L的培養(yǎng)液中存活，并在20d內(nèi)將其完全降解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株具有甲醛降解能力的菌株，并對其降解條件進(jìn)行優(yōu)化，為生物法降解甲醛應(yīng)用于室內(nèi)空氣凈化打下基礎(chǔ)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一株甲醒降解菌-甲基桿菌(Methylobacterium sp. )XJLW,保藏于中國典型培
養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC NO M2012065,保藏日期2012年3月8日。該菌株篩選至浙江臺州黃巖污水處理廠的土壤，可以甲醛或甲醇為唯一碳源生長。
本發(fā)明還涉及所述甲基桿菌XJLW在微生物降解甲醛中的應(yīng)用。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，該菌株降解甲醛的最適溫度為30°C，最適pH值為7. O。該菌株優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為酵母膏l(xiāng)g/L，K2HPO4O. 8g/L，KH2PO4O. 7g/L，MgSO4O. 5g/L，微量元素母液200 μ L/L，溶劑為水，pH7. O。經(jīng)馴化后，菌株XJLW對甲醛的耐受濃度提高為I. 2g/L。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，對初始濃度為O. 6,0. 9、I. 2g/L的甲醛，52h的降解率分別為94%，39%，31%。在休止細(xì)胞的情況下，菌株XJLW能耐受并且降解極高初始質(zhì)量濃度的甲醛，初始濃度分別為2、15、30、45、60g/L，8h的降解率分別為100%、96. 8%、84. 0%、26· 5%,22. 5%;56h 的降解率分別為 100%、100%、96· 0%、29· 5%,24. 4%。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株對甲醛有較高降解能力的新菌株，并對其降解條件進(jìn)行了優(yōu)化，為生物法降解甲醛應(yīng)用于室內(nèi)空氣凈化提供了基礎(chǔ)。


圖I為甲基桿菌XJLW的透射電鏡圖；圖2為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；圖3為不同元素對Methylobacterium sp. XJLff降解甲醒的影響；圖4為不同pH (a)、溫度(b)對Methylobacterium sp. XJLW降解甲醒的影響；圖5為不同濃度甲醛降解過程；圖6為菌株休止細(xì)胞對不同高濃度甲醛的降解過程。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實施例I :I材料與方法I. I試劑與儀器甲醛溶液(含量為37 40%，衢州巨化試劑有限公司)，其余試劑均為分析純。JEOLJEM-1230型透射電子顯微鏡(日本)。I. 2培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基=KH2PO4O.7g/L, K2HPO4O. 85g/L, (NH4)2SO4L 2g/L, MgSO4 · 7Η200· lg/L,CaCl2O. 01g/L, FeSO4 · 7Η200· 001g/L，微量元素母液 0. lmL/L, ρΗ7· 0，溶劑為水，115°C滅菌30mino微量元素母液H3B036g/L，CoCl2· 6H204g/L，ZnSO4 · 7H202g/L，MnCl2 · 4Η200· 6g/L, Na2MoO4 · 7H200. 6g/L, NiCl2 · 6H200. 4g/L, CuCl2 · 2H200. 2g/L，溶劑為水。乙酰丙酮溶液(GB13197-1991水質(zhì)甲醛的測定乙酰丙酮分光光度法[S] ) 50g乙酸銨、6mL冰乙酸及0. 5mL乙酰丙酮試劑溶于IOOmL水中。I. 3 方法I. 3. I甲醛測定方法甲醛測定方法參照修訂后的GB/T13197-1991。吸取適量樣品于25mL具塞刻度管中，用水稀釋至刻度線，加入2. 5mL乙酰丙酮溶液顛倒數(shù)次混勻，60°C水浴15min，取出室溫冷卻Ih后檢測在波長414nm處的吸光度，以水為參比。I. 3. 2菌株的篩選、分離純化及馴化取少量在黃巖污水處理廠收集的土壤樣品，置于IOOmL無菌生理鹽水中，加玻璃珠震蕩15min，用針筒取15mL上清，用濾膜進(jìn)行過濾，將濾膜取出置于基本培養(yǎng)基，加入O. lg/L的甲醛，180r/min和30°C搖床培養(yǎng)。平板涂布法分離得到單菌落，觀察菌落形態(tài)并挑取單菌落做進(jìn)一步鑒定。將菌液加入新鮮的基本培養(yǎng)基中，逐步提高甲醛濃度馴化菌株，于30°C搖床中培養(yǎng)，測定樣品及對照中的甲醛濃度。I. 3. 3菌株的鑒定菌株染色及生理生化分析，采用透射電鏡觀察菌株形態(tài)[10]。
提取該菌全基因組DNA，采用正向引物5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCGA-3’ 和反向引物5’ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ 擴(kuò)增 16S rDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海 invitrogen 公司測序，將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上BLAST比對。利用軟件MEGA4. I構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。I. 3. 4培養(yǎng)條件對菌株降解能力的影響及降解過程的研究分別選取有機氮源蛋白胨和酵母膏；無機氮源KNO3, (NH4)2SO4，尿素，測定甲醛降解率。在選擇較佳氮源的基礎(chǔ)上，再考察氮源添加量對該菌降解甲醛的影響，并且考察K2HPO4, MgSO4，微量元素對該菌降解甲醛的影響?？疾鞙囟葘υ摼到饧兹┑挠绊?，甲醛的揮發(fā)率與溫度密切相關(guān)，所以每個溫度都要設(shè)定對照?？疾霵H對該菌降解甲醛的影響。其他培養(yǎng)條件為O. 4g/L甲醛，轉(zhuǎn)速180r/min，30°C，降解時間為72h，以無菌的含O. 4g/L甲醛的基本培養(yǎng)基為對照。在優(yōu)化后的降解條件下，以不同濃度甲醛作為碳源，每隔4h取樣，測定甲醛濃度，繪制甲醛降解過程曲線。I. 3. 5菌株休止細(xì)胞對甲醛的降解能力及降解過程的研究無機鹽培養(yǎng)基中添加甲醇，濃度為I 養(yǎng)菌6d，離心重懸獲得菌體，將菌接入新的無機鹽培養(yǎng)基，添加不同濃度的甲醛，定時取樣，測定甲醛濃度，繪制甲醛降解過程曲線。2結(jié)果與分析2. I菌株的篩選及分離純化采用以O(shè). lg/L甲醛為唯一碳源的基本培養(yǎng)基，從黃巖污水處理廠的土壤中篩選到一株甲醛降解菌，菌株編號為XJLW。通過不斷向培養(yǎng)基中添加甲醛進(jìn)行馴化，該菌株對甲醛的耐受由O. lg/L提高至I. 2g/L。2. 2菌株的鑒定平板涂布分離得到的單個菌落呈粉色，圓形，突起，邊緣整齊，表面光滑，革蘭氏染色為陰性。通過透射電鏡觀察菌株，呈短桿狀，有鞭毛，0.8 2.0μπι (參見圖I)。對該菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以細(xì)菌16S rDNA通用引物，擴(kuò)增到1475bp的DNA片段，GenBank中登錄號為⑶586226。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示該菌株與甲基桿菌屬(Methylobacterium)的序列同源性最高，采用MEGA4. I軟件將該菌株的16S rDNA序列與Genbank中的若干個相關(guān)種的16S rDNA序列進(jìn)行分析比對，以Microvirga aerophila (AB682367)為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所不，該菌株與Methylobacterium sp. MP3 (EF015480)位于同一個系統(tǒng)發(fā)育的分支。該菌株可以甲醛或甲醇為唯一碳源生長，對其多項生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，并與Methylobacterium 的標(biāo)準(zhǔn)種 Methylobacterium organophilum進(jìn)行比較，結(jié)果如表 I 所不，該菌株除吲哚試驗與木糖利用試驗結(jié)果不同外，其余檢測指標(biāo)均相同。根據(jù)該菌株形態(tài)特征和生理生化特征及16S rDNA序列分析，并參考《常見細(xì)菌鑒定手冊》，該菌株與(Methylobacterium)特征相符，故將該菌株命名為Methylobacteriumsp. XJLff,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址中國，武漢,武漢大學(xué)，郵編430072，保藏日期2012年3月8日，保藏編號CCTCC No :M2012065。表I :細(xì)菌生理生化分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株甲醒降解菌-甲基桿菌(Methylobacterium sp. )XJLW,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號=CCTCC NO :M2012065，保藏日期2012年3月8日。
2.如權(quán)利要求I所述的甲基桿菌XJLW在微生物降解甲醛中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解在30°C、pH7.O條件下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株甲醛降解菌——甲基桿菌(Methylobacteriumsp.)XJLW及其應(yīng)用，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC NOM2012065，保藏日期2012年3月8日。本發(fā)明提供了對甲醛有較高降解能力的新菌株，并對其降解條件進(jìn)行了優(yōu)化，為生物法降解甲醛應(yīng)用于室內(nèi)空氣凈化提供了基礎(chǔ)。
文檔編號B01D53/84GK102816714SQ20121023518
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者鐘衛(wèi)鴻, 邱樂泉, 吳婉欣, 鐘莉, 吳石金, 陳雯雯, 金晶 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)