專利名稱：一株苯酚降解真菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域，具體的是涉及一株苯酚降解真菌，該菌株可在 PH5. 0-8. 0，溫度10°C -40°C的條件下，對苯酚進(jìn)行生物降解。
背景技術(shù)：
苯酚做為防腐劑在油漆、皮革和紡織品工業(yè)中廣泛地使用，同時也用在酚樹脂、消毒劑、藥物，己內(nèi)酰胺和雙酚A的生產(chǎn)中(Rana Kidak et al. Ultrasonics Sonochemistry. 2006, 13:195-199)。水環(huán)境中存在的苯酚能對水生生物造成重大危害， 5 to 25 mgL-1的低濃度苯酚至對魚來說，都是致死的(P. R. Gogate, et al. Environ. Res. 8 (2004) 501 - 551. ) ;Kumar等報道，苯酚對人類具有致癌作用，所以，含苯酚的廢水必須處理才能排放。同理化處理方法相比，生物法處理苯酚因其成本低，無二次污染而更具優(yōu)勢，苯酚生物降解是由細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物活動的結(jié)果。目前的研究多集中于細(xì)菌，而真菌對苯酚的生物降解報道的較少，已發(fā)現(xiàn)能降解苯酚的真菌有鐮孢霉屬 Fusarium floccieferum (Anselmo et al. Water Sci Technol 1992,25161 - 168),煙曲霉Aspergillus fumigatus (Jones et al. Arch Microbiol 1995，163:176 - 181)，粘束孢屬 Graphium sp. (Santos et al. J Basic Microbiol. 2003,43:238 - 248)，皮膚毛孢子菌 trichosporon cutaneumhave (Gaal A et al. Arch Microbiol. 1981, 130 54 - 58 and Godjevargova T et al. Process Biochem . 2003, 38:915 - 20),青霉屬Penicillium sp. (Leitao. Int J Environ Res Public Health .2009, 6:1393 - 1417. Sumaya Ferreira Guedes et al. Biodegradation. 2011，22:409 - 419)，多變擬青霉 Paecilomyces variotii (Wang et al. J Hazard Mater. 2010, 183:366 - 371),熱帶酵母 Candida tropicalis(Jiang Y et al. Biochem Eng J. 2005, 24:243 - 247),絲狀真菌filamentous fungi (Santos V L & Linardi V R. Process Biochem. 2004，39:1001—1006)，白腐菌 white rot fungi (Sanin S. et al. Bull Environ. Contam Toxicol. 2005, 75:466 - 473),這些真菌已被證實具有苯酚降解的潛力。真菌較細(xì)菌具有更強(qiáng)的環(huán)境耐受力，可以在更寬的溫度、PH及更為苛刻的條件下生長繁殖，因而受到越來越多的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)而篩選一株苯酚降解真菌，并提供該苯酚降解真菌在苯酚生物降解中的應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一株苯酚降解真菌，其特征在于該真菌菌株為黃曲霉(Aspergillus真菌菌株P(guān)HDE-4，已于2011年8月31號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 5189 ；其生物學(xué)特性真菌株P(guān)HDE-4在普通PDA培養(yǎng)基生長的菌落為凸起呈圓形、黃綠色，菌落大、質(zhì)地緊密， 表面干而粗糙，邊緣清晰，在以苯酚為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基中生長的菌落為成片凸起，呈淺咖啡色，菌落較小、薄而疏松，表面干而粗糙，邊緣清晰；菌株P(guān)HDE-4的顯微結(jié)構(gòu)如下分生孢子呈圓形，黃綠色，帶有雙層小梗的分生孢子頭，分生孢子梗單生，直立，無橫隔，淡褐色；菌株P(guān)HDE-4在PDA培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基上的顯微結(jié)構(gòu)有差異，在篩選培養(yǎng)基上由于苯酚的抑制作用，孢子和孢子頭明顯變小，菌絲變細(xì)。按上述方案，所述的苯酚降解真菌，其rDNA的ITS全序列含608bp，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的另外一個目的是提供苯酚降解真菌在有氧降解苯酚中的應(yīng)用。按上述方案，在pH5. 0-8. 0條件下對苯酚進(jìn)行有氧降解。按上述方案，在溫度15_40°C條件下對苯酚進(jìn)行有氧降解。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明的苯酚降解真菌株P(guān)HDE-4，具有較強(qiáng)的環(huán)境耐受力，可以在寬的溫度、PH及較為苛刻的環(huán)境條件下，以苯酚為唯一碳源和能源生長繁殖，具有較好地清除環(huán)境中苯酚污染的能力。


圖1為本發(fā)明的PHDE-4菌株的ITS序列；
圖2為本發(fā)明的PHDE-4菌株的基因組DNA，其中泳道3: PHDE-4 ； 圖3為本發(fā)明的PHDE-4菌株的r DNA的ITS擴(kuò)增序列，其中泳道1、2: PHDE-4 ； 圖4為本發(fā)明的PHDE-4菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹；
圖5本發(fā)明的PHDE-4菌株在PDA培養(yǎng)基和以苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長狀況， 其中左以苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)基；右PDA培養(yǎng)基；
圖6為本發(fā)明的PHDE-4菌株在PDA培養(yǎng)基中的1000X顯微結(jié)構(gòu)； 圖7本發(fā)明的PHDE-4菌株在以苯酚為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中的1000X顯微結(jié)
構(gòu)；
圖8本發(fā)明的PHDE-4菌株對不同起始濃度苯酚的生物降解； 圖9為pH對本發(fā)明的PHDE-4菌株降解苯酚的影響； 圖10為溫度對本發(fā)明的PHDE-4菌株的降解苯酚的影響。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。一株苯酚降解真菌，該真菌菌株為黃曲霉(Aspergillus fIavus)真菌菌株 PHDE-4，已于2011年8月31號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 5189 ；其生物學(xué)特性真菌株P(guān)HDE-4在普通PDA培養(yǎng)基生長的菌落為凸起呈圓形、黃綠色，菌落大、質(zhì)地緊密，表面干而粗糙，邊緣清晰，在以苯酚為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基中生長的菌落為成片凸起，呈淺咖啡色，菌落較小、薄而疏松，表面干而粗糙，邊緣清晰(見圖5所示)；菌株P(guān)HDE-4的顯微結(jié)構(gòu)如下分生孢子呈圓形，黃綠色，帶有雙層小梗的分生孢子頭，分生孢子梗單生，直立，無橫隔，淡褐色(見圖6所示);菌株P(guān)HDE-4在PDA培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基上的顯微結(jié)構(gòu)有差異，在篩選培養(yǎng)基上由于苯酚的抑制作用，孢子和孢子頭明顯變小，菌絲變細(xì)(見圖7所示)。所述的苯酚降解真菌，其rDNA的ITS全序列含608bp，具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。分別與從GenBank獲取的20個相似序列后經(jīng)DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4所示)，結(jié)合PHDE-4形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定為As/^rpVAAs fIavus0本發(fā)明的真菌株P(guān)HDE-4在有氧降解苯酚中的應(yīng)用，真菌株P(guān)HDE-4在模擬廢水中苯酚含量小于1200 mg/L時，10天后苯酚降解率均能達(dá)到95% ；當(dāng)苯酚含量超過1600 mg/L 時，真菌株P(guān)HDE-4受到苯酚的強(qiáng)烈抑制，10天苯酚的降解率只有14% (見圖7所示)。在pH5. 0-8. 0條件下對苯酚進(jìn)行有氧降解。真菌株P(guān)HDE-4在較寬的pH范圍對苯酚具有降解能力，在PH8. 0時，苯酚的降解率大于60% ；在pH5. 5-6. 5的范圍內(nèi)PHDE-4對苯酚的降解率大于90% (見圖9所示)。在溫度10_40°C條件下對苯酚進(jìn)行有氧降解。真菌株P(guān)HDE-4在較寬的溫度范圍對苯酚具有降解能力，如在溫度為15°C時，對濃度為800 mg/L苯酚的降解率大于60 %，而在溫度為20-35°C范圍內(nèi)，苯酚的降解率大于80%;達(dá)到苯酚最佳降解率對應(yīng)的溫度范圍為 28 0C -32 0C (見圖 10 所示)。實施例1
苯酚降解真菌株的篩選及鑒定
無機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)(mg/L) NaNO3 2. 000 g, K2HPO4 1. 000 g, KCl 0. 500 g, MgSO4. 7H20 0. 500 g, FeSO4. 7H20 0. 010 g ；
篩選平板介質(zhì)(mg/L) NaNO3 2. 000 g, K2HPO4 1. 000 g, KCl 0. 500 g, MgSO4. 7H20 0.500 g, FeSO4. 7H20 0.010 g,苯酚 0.200 g，agar 18.000 g, H2OlOOO mL ；
儲存介質(zhì)(mg/L) 土豆 200.0 g,蔗糖 20. 0 g,苯酚 0. 100 g,瓊脂 18. 00 g，H2O 1000
mL ；
PDA 培養(yǎng)介質(zhì)(mg/L) 土豆 200. 0 g,蔗糖 20. 0 g,瓊脂 18. 00 g, H2O 1000 mL。取寧波附近的中國東海(經(jīng)度125-128°，緯度32-35° )海水樣品，先將0.22 μπι 微孔濾膜過濾器滅菌，然后取海水樣液通過無菌的微孔濾膜過濾，使樣液中的微生物被截留在濾膜上。取出濾膜剪碎后放入滅菌后的錐形瓶中，浸入一定量的無菌水。玻璃珠振蕩錐形瓶使附著在濾膜上的微生物溶入無菌水中，即得到含大量樣液微生物的濃縮原菌液。將處理好的水樣5.0 mL轉(zhuǎn)移至45 mL含苯酚(100 mg/L)的無機(jī)介質(zhì)中，將錐形瓶置于、150rpm無光條件下振搖培養(yǎng)48 h ；再移取5 mL混合菌液到新配制的45 mL 含相同濃度苯酚的無機(jī)培養(yǎng)介質(zhì)中，繼續(xù)富集培養(yǎng)，如此馴化培養(yǎng)約10次。移取經(jīng)過10次馴化培養(yǎng)的混合菌液0. 1 mL,涂布篩選培養(yǎng)介質(zhì)上，于無光環(huán)境中培養(yǎng)10天，挑取生長良好的菌落，在篩選培養(yǎng)介質(zhì)上，采用連續(xù)稀釋分離法分離出單菌落，最終獲得6株純培養(yǎng)物，接種在儲存介質(zhì)上4°C保存。其中一株編號PHDE-4的通過菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)觀察，初步鑒定為真菌。采用液氮和氯化節(jié)法(Fredrieks DN et al. J Clin Microbiol. 2005, 435122-5128)提取 PHDE-4的基因組DNA (參見附圖2)，以提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增PHDE-4 rDNA 的ITS全序列(真菌鑒定PCR試劑盒，TaKaRa Code:D317，寶生物大連生物技術(shù)有限公司)。50 μ L的PCR擴(kuò)增體系包括模板DNA1-2 μ L, PCR premix 25 μ L,正向引物 forward primer 0. 5 μ L,反向引物perverse primer lor perverse primer 2 0. 5 μ L, 16SrRNA-free ddH20 up to 50 μ L。PCR擴(kuò)增程序采用94°C預(yù)變性5 min后開始循環(huán)94° C 變性lmin, 55° C退火lmin，72° C延伸1. 5 min，循環(huán)30次，最后72° C延伸5 min 結(jié)束，4° C保藏。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離(參見附圖3)，回收目標(biāo)片段，送寶生物大連生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果(參見附圖1)表明PHDE-4菌株的ITS序列有608bp，序列如SEQ ID NO 1所示。將測得的序列提交到美國NCBI 的 GenBank (http//blast, ncbi. nlm. nih. gov/ Blast, cgi),利用Blast程序進(jìn)行序列同源性檢索，獲取對比指標(biāo)靠前的20個相似序列，通過Blast和DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(參見附圖4)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹并結(jié)合比對指標(biāo)同源性和遺傳距離進(jìn)行分析表明PHDE-4為黃曲霉U^argiBM /7an )，是一株新的苯酚降解菌。該真菌菌株于2011年8月31號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 5189。菌株P(guān)HDE-4的培養(yǎng)、菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)菌株P(guān)HDE-4可以在pH5. 0-8. 0，溫度 IO0C -40°c的PDA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基等中生長，最佳培養(yǎng)條件為PH5. 0-6. 0， 溫度-32°C的PDA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基等。菌株P(guān)HDE-4在PDA培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)總結(jié)在表1中(參見附圖5)，在1000X顯微鏡觀察菌株P(guān)HDE-4，分生孢子呈圓形，黃綠色，帶有雙層小梗的分生孢子頭，分生孢子梗單生，直立，無橫隔，淡褐色，(參見圖6、圖7)；菌株P(guān)HDE-4在PDA培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基上的顯微結(jié)構(gòu)有差異，在篩選培養(yǎng)基上由于苯酚的抑制作用，孢子和孢子頭明顯變小，菌絲變細(xì)。表1菌株P(guān)HDE-4在不同平板上的菌落形態(tài)特征
培養(yǎng)基厚/薄大/小松/密表面邊緣形狀顏色PDA培養(yǎng)基厚大密粗糙、干清晰圓、凸黃綠篩選培養(yǎng)基薄小松粗糙、干不清晰成片、凸淺咖啡
PHDE-4菌株對不同起始濃度的苯酚的生物降解模擬苯酚廢水的組成(mg/L) =NaNO3 2.000 g, K2HPO4 1.000 g，KCl 0.500 g, MgSO4. 7H20 0.500 g, FeSO4. 7H20 0.010 g，苯酚。 將PHDE-4菌株接種于無菌的模擬廢水中，于，150 rpm振搖培養(yǎng)，每天取樣，采用4-氨基安替吡啉作顯色劑，510 nm比色法定量測定模擬廢水中苯酚含量的變化(參見附圖8)。苯酚的降解率采用公式(1)計算。
芣酚降解率U) = ^^ χ 100%....................... (1)
. “ ω0公式(1)中ω 0 苯酚的起始濃度(mg/L)，ω 降解t時苯酚的濃度(mg/L)。取寧波附近的中國東海(經(jīng)度125-128°，緯度32_35° )海水，按前述發(fā)明內(nèi)容中降解菌株的篩選與鑒定操作，分離出一株新的降解苯酚的真菌，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，該菌為黃曲霉(As/^r^/BM /7aras)，是一株新的苯酚降解菌。該菌與2011年8 月30號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 5189
實施例2
菌株P(guān)HDE-4對苯酚的生物降解
將菌株P(guān)HDE-4接種到100 mL無菌含苯酚100 mg/L的篩選培養(yǎng)介質(zhì)中，于^°C，150 rpm振搖培養(yǎng)2天至生長對數(shù)期作為種子液。取上述種子液8XlmL，分別接種至100 mL無菌含苯酚200 mg/L,400 mg/L,600 mg/L,800 mg/LU000 mg/L、1200 mg/L、1400 mg/L、1600 mg/L 的模擬廢水中，于 ，150
rpm振搖培養(yǎng)，每天取樣，采用4-氨基安替吡啉作顯色劑，510 nm比色法定量測定殘留苯酚的濃度，結(jié)果表明在附圖8中。模擬廢水中苯酚含量小于800 mg/L時，10天后苯酚能完全降解；而苯酚含量為 1000 mg/L、1200 mg/L時，10后苯酚的降解率達(dá)95% ；苯酚含量為1400 mg/L時，由于菌株 PHDE-4受高濃度苯酚的抑制作用，10后苯酚的降解率只達(dá)61%，；苯酚含量超過1600 mg/L 時，菌株P(guān)HDE-4受到苯酚的強(qiáng)烈抑制，10天苯酚的降解率只有14%。實施例3
菌株P(guān)HDE-4在不同pH下對苯酚的生物降解
將菌株P(guān)HDE-4接種到100 mL無菌含苯酚100 mg/L的篩選培養(yǎng)介質(zhì)中，于^°C，150 rpm振搖培養(yǎng)2天至生長對數(shù)期作為種子液。取上述種子液6XlmL，分別接種至100 mL無菌含苯酚(1000 mg/L)、pH分別為 5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0的模擬廢水中，于28°C，150 rpm振搖培養(yǎng)10天，采用4-氨基安替吡啉作顯色劑，510 nm比色法定量測定殘留苯酚的濃度，結(jié)果表明在附圖9中。菌株P(guān)HDE-4能在較寬的pH范圍對苯酚進(jìn)行生物降解，但降解率受pH的影響，在 PH為5. 0-7. 0，菌株P(guān)HDE-4對苯酚的降解可達(dá)到最大降解率。實施例4
菌株P(guān)HDE-4在不同溫度下對苯酚的生物降解
將菌株P(guān)HDE-4接種到100 mL無菌含苯酚100 mg/L的篩選培養(yǎng)介質(zhì)中，于^°C，150 rpm振搖培養(yǎng)2天至生長對數(shù)期作為種子液。取上述種子液6 X ImL,分別接種至6 X 100 mL無菌含苯酚(1000 mg/L)的模擬廢水中，分別于 10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C，150 rpm 振搖培養(yǎng) 10 天，采用 4-氨
基安替吡啉作顯色劑，510 nm比色法定量測定殘留苯酚的濃度，結(jié)果表明在附圖10中。菌株P(guān)HDE-4可在較寬的溫度范圍對苯酚進(jìn)行生物降解，但降解率受溫度的影響， 在溫度為-32°C，菌株P(guān)HDE-4對苯酚的降解可達(dá)到最大降解率。
權(quán)利要求
1.一株苯酚降解真菌，其特征在于該真菌菌株為黃曲霉(A^arpVAz1S /Yara1S)真菌菌株P(guān)HDE-4，已于2011年8月31號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏號為 CGMCC No. 5189。
2.按權(quán)利要求1所述的苯酚降解真菌，其特征在于其生物學(xué)特性是真菌株P(guān)HDE-4 在普通PDA培養(yǎng)基生長的菌落為凸起呈圓形、黃綠色，菌落大、質(zhì)地緊密，表面干而粗糙，邊緣清晰，在以苯酚為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基中生長的菌落為成片凸起，呈淺咖啡色，菌落較小、薄而疏松，表面干而粗糙，邊緣清晰；菌株P(guān)HDE-4的顯微結(jié)構(gòu)如下分生孢子呈圓形，黃綠色，帶有雙層小梗的分生孢子頭，分生孢子梗單生，直立，無橫隔，淡褐色；菌株P(guān)HDE-4在 PDA培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基上的顯微結(jié)構(gòu)有差異，在篩選培養(yǎng)基上由于苯酚的抑制作用，孢子和孢子頭明顯變小，菌絲變細(xì)。
3.按權(quán)利要求2所述的苯酚降解真菌，其特征在于所述的苯酚降解真菌，其rDNA的 ITS全序列含608bp，具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1或2或3所述的苯酚降解真菌在有氧降解苯酚中的應(yīng)用。
5.按權(quán)利要求4所述的苯酚降解真菌的應(yīng)用，其特征在于在pH5.0-8. 0條件下對苯酚進(jìn)行有氧降解。
6.按權(quán)利要求4或5所述的苯酚降解真菌的應(yīng)用，其特征在于在溫度15-40°C條件下對苯酚進(jìn)行有氧降解。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株苯酚降解真菌，該真菌菌株為黃曲霉(Aspergillusflavus)真菌菌株P(guān)HDE-4，已于2011年8月31號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.5189；本發(fā)明的苯酚降解真菌株P(guān)HDE-4，具有較強(qiáng)的環(huán)境耐受力，可以在寬的溫度、pH及較為苛刻的環(huán)境條件下，以苯酚為唯一碳源和能源生長繁殖，具有較好地清除環(huán)境中苯酚污染的能力。
文檔編號A62D101/28GK102399701SQ20111035303
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者戶業(yè)麗, 程波 申請人:武漢工程大學(xué)