專利名稱：一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物技術領域，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
背景技術：
農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中對防治病蟲害、提高農(nóng)作物產(chǎn)量必不可少，然而，農(nóng)藥在廣泛使用的同時也給環(huán)境造成了嚴重的污染，使得農(nóng)業(yè)產(chǎn)量和環(huán)境質(zhì)量之間的矛盾日益突出，許多農(nóng)藥對人和非靶動物具有干擾內(nèi)分泌作用和“三致”作用(致癌、致畸和致突變)。阿維菌素(Avermectins簡稱 AVMs)是由放線菌 iStreptomyces avermi til is)產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，已在很多國家登記使用，在我國已成為甲胺磷等高毒農(nóng)藥的替代品，其單劑和混劑產(chǎn)品在害蟲防治工作中發(fā)揮著重要作用，廣泛適用于蔬菜、果樹、棉花和花齊等。近年來，阿維菌素及其復配農(nóng)藥品種和使用量不斷增長，但是，由于其被公認屬于生物源農(nóng)藥，致使其對土壤和環(huán)境的殘留污染隱患，一直未被公眾重視。但是，按世界衛(wèi)生組織(WHO)五級分級標準，AVMs仍屬高毒化合物，會對環(huán)境或生物直接造成影響，而且進入到環(huán)境中的藥物可能在生物體內(nèi)富集，并通過食物鏈的傳遞而影響到人類的安全，因此AVMS在生物組織中的殘留必須引起我們的重視。目前，阿維菌素類藥物在農(nóng)產(chǎn)品或畜產(chǎn)品中的最聞殘留限量(MRLs)已有規(guī)定，歐盟規(guī)定AVMs在果蔬廣品、谷物等農(nóng)廣品中MRLs為10ug/kgo然而，目前學術界對AVMs殘留降解問題研究報道甚少，市場上也沒有可以工業(yè)化生產(chǎn)和大面積使用的阿維菌素殘留降解劑產(chǎn)品問世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌及用其生產(chǎn)的菌劑。研究表明，微生物對土壤和水環(huán)境中殘留農(nóng)藥的降解有重要的作用，從自然環(huán)境中馴化和篩選出來的土著微生物，對農(nóng)藥有一定的降解作用。本發(fā)明人從長期堆放的阿維菌素發(fā)酵廢渣中，分離、篩選到一株可降解阿維菌素的菌株，經(jīng)鑒定為嗜熱脂肪芽孢桿菌stearothermophilus\舊株命名為kl\\。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，名稱為嗜熱脂肪芽孢桿菌
5tearo thermophilus )AZ 11，保藏號為 CGMCC NO. 6119，保藏日期為 2012年5 月 17 日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。本發(fā)明人使用上述嗜熱脂肪芽孢桿菌iBaciIlus s tearo thermophiIus )菌株AZ11，經(jīng)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)過程，制備了阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌劑(含菌量30X 108cfu/g)，該菌劑對阿維菌素殘留的降解率達到90%以上，可廣泛用于土壤、水體中阿維菌素污染的修復及阿維菌素發(fā)酵廢渣中殘留的降解。本發(fā)明的技術方案包括以下方面
本發(fā)明提供了一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌株，該菌株是從長期堆放的阿維菌素發(fā)酵廢渣中，分離、篩選獲得的一株可降解阿維菌素的菌株AZ11，經(jīng)鑒定為耐高溫的嗜熱脂肪芽孢桿菌{Bacillus s tearo thermophi Ius ),革蘭氏染色為陽性；鏡檢觀察菌體呈桿狀，可形成芽孢，芽孢為橢圓形，端生。在LB平板上菌落圓形，灰白色，表面干燥光滑，邊緣整齊，半透明；菌株AZll能在葡萄糖復合瓊脂上進行厭氧生長，且能在含7% NaCl肉湯培養(yǎng)基中生長，V. P.試驗呈陰性，檸檬酸鹽利用試驗、卵磷脂酶反應、淀粉水解試驗、酪素水解試驗均呈陽性反應，甲基紅試驗、吲哚產(chǎn)生試驗和苯丙氨酸脫氨試驗呈陰性反應，具有分解葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、甘露醇和木糖的能力，適宜生長PH為7. 0-8. O。上述阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌劑的生產(chǎn)過程包括如下步驟
斜面、搖瓶種子培養(yǎng)-種子發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)-生產(chǎn)發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)-與載體混勻-產(chǎn)品包裝。上述阿維菌素殘留降解菌劑的具體生產(chǎn)步驟和工藝條件如下
1)將阿維菌素降解菌AZll斜面保存試管種子，接種至LB液體培養(yǎng)基中，40-45°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；
2)將培養(yǎng)好的菌液以10%的接種量接種到IOL種子發(fā)酵罐中，40-45°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期。種子發(fā)酵罐的培養(yǎng)及配方為玉米粉2%;豆餅粉1%;葡萄糖0.5%;K2HP04 0 . 4%;MgSO4 7H20 0. 02% ；CaCO3 0. 2% ；pH 7. 2-7. 5 ；
3)將種子發(fā)酵罐的發(fā)酵液以10%的接種量接種到生產(chǎn)發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)中使用的培養(yǎng)基配方為玉米粉3% ;豆餅粉2% ；CaCO3 0. 5% ；K2HPO4 0. 2% ；ZnSO4 5H20 0. 05% ；MgSO4 7H20 0. 05% ；pH 值 7. 2 ;
發(fā)酵生產(chǎn)的工藝條件為培養(yǎng)溫度40— 45°C，攪拌速度150r/min，罐壓為0. 04—0. 06Mpa，無菌空氣通氣量1:0. 8-1，培養(yǎng)48小時菌數(shù)達到35 X 108cfu/mL。4)發(fā)酵完成后，發(fā)酵完成后，發(fā)酵液可以直接稀釋為液體菌劑作為產(chǎn)品使用，也可以用草炭或硅藻土吸附，形成固體菌劑，調(diào)整菌數(shù)為30X 108cfu/g，然后分裝為袋裝產(chǎn)品。。本發(fā)明所制備的阿維菌素降解菌劑對阿維菌素殘留的降解率達到90%以上，可廣泛用于土壤、水體中阿維菌素殘留污染的修復，也可用于阿維菌素發(fā)酵廢渣及其他有機肥料原料中的阿維菌素殘留的降解，還可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中直接噴灑于土壤或植物表面，可有效降解去除阿維菌素農(nóng)藥殘留，使用方便，成本低，可有效降解去除阿維菌素等農(nóng)藥殘留，去除率達到97%以上；還可以直接用于阿維菌素廢渣的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，使廢渣發(fā)酵產(chǎn)品達到無害化、資源化利用。本發(fā)明對于保護環(huán)境、土壤及水體污染修復和減少農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)具有重要的意義，適合用于無公害綠色農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)及利用阿維菌素發(fā)酵廢渣進行無殘留生物有機肥料的生產(chǎn)應用。


圖I為添加外源營養(yǎng)物質(zhì)對阿維菌素降解的影響 圖2為不同濃度阿維菌素對菌株AZll生長的影響
圖3為阿維菌素對溫室盆栽模擬污染土壤的降解效果。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，但本發(fā)明并不局限于此。實施例I:降解菌株的分離
取阿維菌素發(fā)酵廢渣樣品10g，加入裝有90mL無菌水的三角瓶中(250mL規(guī)格，內(nèi)裝玻璃珠)。振蕩15min，靜止澄清后，取ImL上清加入99mL基礎培養(yǎng)基，分別置4(rC、50°C、60°C恒溫箱中，150r/min振蕩培養(yǎng)。3天為一周期進行馴化，共5個周期，阿維菌素濃度設置為25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，每個馴化周期逐步提高。將每次的馴化培養(yǎng)液按照10_\10_2和10_3稀釋度涂布基礎培養(yǎng)基平板(作為對照)及含阿維菌素的選擇培養(yǎng)基平板，挑選生長速度快且能以阿維菌素為唯一碳源的單菌落進一步分離純化，直至有單菌落出現(xiàn)。
將生長良好的菌株，搖菌培養(yǎng)后，接種到含阿維菌素(濃度為100mg/L)的基礎培養(yǎng)基中，置于400C、500C和600C搖床中，150r/min振蕩培養(yǎng)，設不接菌的處理為對照，每處理重復3次。分別于接種后6h、12h、24h、48h、72h取培養(yǎng)液，4 °C，lOOOOr/min離心5min，取上清液2mL，用HPLC方法測定阿維菌素含量，計算降解率。降解率(%) = (對照樣品殘留量-處理樣品殘留量)/對照樣品殘留量X 100%。
__表I. ___薩麵釀銖觀_
權利要求
1.一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌株，從阿維菌素發(fā)酵廢渣中分離、篩選獲得，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，名稱為嗜熱脂肪芽孢桿菌 Cfeci77w5· stearothermophiIusIklW，媒氣號% CGMCC NO. 6119,保藏日期為 2012 年5月17日。
2.應用權利要求I所述的阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌株AZll生產(chǎn)阿維菌素殘留降解菌劑的方法，其特征在于生產(chǎn)過程如下 斜面、搖瓶種子培養(yǎng)；種子發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)；生產(chǎn)發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)；產(chǎn)品劑型加工、分裝。
3.如權利要求2所述生產(chǎn)阿維菌素殘留降解菌劑的方法，其特征在于具體生產(chǎn)步驟和工藝條件如下 1)將阿維菌素降解菌AZll斜面保存試管種子，接種至LB液體培養(yǎng)基中，40-45°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期； 2)將培養(yǎng)好的菌液以10%的接種量接種到IOL種子發(fā)酵罐中，40-45°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子發(fā)酵罐的培養(yǎng)及配方為玉米粉2% ;豆餅粉1% ;葡萄糖O. 5% ；Κ2ΗΡ04 O. 4% ；MgSO4 · 7H20 O. 02% ；CaCO3 O. 2% ；pH 7. 2-7. 5 ； 3)將種子發(fā)酵罐的發(fā)酵液以10%的接種量接種到生產(chǎn)發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵生產(chǎn)中使用的培養(yǎng)基配方為玉米粉3% ;豆餅粉2% ；CaCO3 O. 5% ；K2HPO4 O. 2% ；ZnSO4 · 5H20 O. 05% ；MgSO4 · 7H20 O. 05% ；pH 值 7· 2 ;發(fā)酵生產(chǎn)的工藝條件為培養(yǎng)溫度40— 45°C，攪拌速度150r/min，罐壓為O. 04—O.06Mpa，無菌空氣通氣量1:0. 8_1，培養(yǎng)48小時菌數(shù)達到35X 108cfu/mL ；4)發(fā)酵完成后，發(fā)酵液可以直接稀釋為液體菌劑或用草炭或硅藻土吸附，形成固體菌劑。
4.如權利要求2或3所述生產(chǎn)方法制備的阿維菌素殘留降解菌劑的應用，其特征在于用于土壤、水體中阿維菌素殘留污染的修復。
5.如權利要求2或3所述生產(chǎn)方法制備的阿維菌素殘留降解菌劑的應用，其特征在于用于阿維菌素發(fā)酵廢渣及其他有機肥料原料中的阿維菌素殘留的降解。
6.如權利要求2或3所述生產(chǎn)方法制備的阿維菌素殘留降解菌劑的應用，其特征在于直接用于阿維菌素廢渣發(fā)酵生產(chǎn)過程中，使廢渣發(fā)酵產(chǎn)品達到無害化。
7.如權利要求2或3所述生產(chǎn)方法制備的阿維菌素殘留降解菌劑的應用，其特征在于在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中直接噴灑于土壤或植物表面，有效降解去除阿維菌素農(nóng)藥殘留。
全文摘要
本發(fā)明為一種阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，涉及嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)AZ11的分離、篩選及用其發(fā)酵生產(chǎn)的菌劑及應用。所述菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC NO.6119。使用所述菌株AZ11發(fā)酵生產(chǎn)的阿維菌素農(nóng)藥殘留降解菌劑可廣泛用于土壤、水體中阿維菌素殘留污染的修復，也可用于阿維菌素發(fā)酵廢渣及其他有機肥料原料中的阿維菌素殘留的降解，還可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中直接噴灑于土壤或植物表面，可有效降解去除阿維菌素農(nóng)藥殘留，使用方便，成本低，還可以直接用于阿維菌素廢渣的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，使廢渣發(fā)酵產(chǎn)品達到無害化、資源化利用。
文檔編號A62D3/02GK102732455SQ201210181069
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月5日 優(yōu)先權日2012年6月5日
發(fā)明者周紅姿, 李紅梅, 李紀順, 楊合同, 陳凱, 魏艷麗 申請人:山東省科學院生物研究所