小菜蛾對阿維菌素靶標(biāo)抗性的分子檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小菜蛾對阿維菌素祀標(biāo)抗性的分子檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，專 用于小菜蛾對廣譜殺蟲殺瞞劑阿維菌素（由Avermectin Bla和Avermectin B化混合組 成）祀標(biāo)抗性的高靈敏度、快速分子檢測。 技術(shù)背景
[0002] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來我國蔬菜種植面積接近3億畝/年，已是世界第一大十字花科蔬菜 種植和生產(chǎn)國，因小菜蛾為害造成的蔬菜減產(chǎn)和治理費(fèi)用極其高昂。小菜蛾屬于鱗翅目菜 蛾科，是世界范圍內(nèi)一種重要的十字花科蔬菜害蟲，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)40~50億美 元。該物種寄主植物種類達(dá)40多種，由于其繁殖周期短、適應(yīng)能力強(qiáng)、世代重疊嚴(yán)重及田間 混亂用藥，使小菜蛾至少已對92種殺蟲活性成份產(chǎn)生了不同程度的抗性，幾乎涉及目前所 有的防治用藥，其中包括多種新型藥劑如阿維菌素。小菜蛾抗藥性進(jìn)化問題給十字花科蔬 菜的產(chǎn)量和質(zhì)量帶來嚴(yán)重威脅和巨大挑戰(zhàn)，科學(xué)有效的防治小菜蛾已成為植保工作者的肩 頭重任，開發(fā)快速準(zhǔn)確的殺蟲劑抗性檢測技術(shù)迫在眉睫。
[0003] 阿維菌素（Avermectin)是日本北里研究所于1975年從±壤中分離的阿維鏈霉菌 (Str巧tomyces avermitilis)發(fā)酵液中分離出來得到的一種大環(huán)內(nèi)醋化合物，1981年由美 國默克公司商品化作為獸藥投放市場并獲得良好業(yè)績。阿維菌素于20世紀(jì)90年代初進(jìn)入 我國并很快實(shí)現(xiàn)了自主生產(chǎn)，該藥劑殺蟲譜廣，具有殺蟲殺瞞殺線蟲活性，能有效防治鱗翅 目、蠟瞞目、半翅目W及線蟲等農(nóng)林害蟲，曾在害蟲種群控制方面發(fā)揮了積極作用。但是，隨 著使用量的增加和使用年限的延長，昆蟲自身也對阿維菌素逐漸演化出抗藥性，在我國多 個(gè)省份呈現(xiàn)逐年加重的趨勢。谷氨酸配體口控氯離子通道（GluCl)是阿維菌素的主要作用 革己標(biāo)，在線蟲化enorh油ditiselegans中研究比較廣泛而深入，果觸DmGluCla亞基的第二 跨膜區(qū)存在P299S點(diǎn)突變，通過外源表達(dá)證實(shí)該氨基酸替換導(dǎo)致果觸對球抱子酸、伊維菌 素和谷氨酸的敏感性降低了 10倍，為球抱子酸和伊維菌素作用于DmGluCl通道提供了直接 證據(jù)化ane等，2000)。在抗阿維菌素的二斑葉瞞Tetranychusudicae品系中研究人員發(fā) 現(xiàn)化GluCl存在G323D點(diǎn)突變，送一點(diǎn)突變在回交后代的個(gè)體中證實(shí)與阿維菌素抗性相關(guān) (Kwon等,2010)。Dermauw等（2012)通過對二斑葉瞞的基因組測序，注釋了多個(gè)cysLGIC 家族的基因，并進(jìn)一步利用遺傳學(xué)方法對GluCl的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)化GluCll(G314D)和 TuGluC13 (G326巧中存在阿維菌素抗性突變位點(diǎn)，認(rèn)為化GluCll和化GluC13是阿維菌素對 二斑葉瞞的主要作用祀點(diǎn)。
[0004] 目前，世界多地區(qū)的田間小菜蛾已對阿維菌素產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，但國內(nèi)外尚 未建立小菜蛾谷氨酸配體口控氯離子通道（PxGIuCI)突變導(dǎo)致的祀標(biāo)抗性的分子檢測方 法，基于該祀標(biāo)基因的抗性檢測技術(shù)局限于英光定量PCR檢測方法（專利號(hào)CN102154468B， 下簡稱對比文件）?！不?21544688根據(jù)梁延坡在2009提交的01此1(1亞基基因序列 (GQ221939.1)設(shè)計(jì)了一序列GluCl a亞基基因的特異性引物，并根據(jù)特異性引物對小菜 蛾抗性與GluCl a亞基基因表達(dá)量之間的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)GluCl a亞基基因表達(dá)量與 小菜蛾對阿維菌素的抗性呈正相關(guān)。根據(jù)送一結(jié)果，將選得的一對特異性引物F16結(jié)合英 光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法提供一種鑒定小菜蛾抗性種群的方法；測定小菜蛾的 GluCl a亞基基因表達(dá)量，并與與陰性對照的基因表達(dá)量比較是否具有顯著差異，有顯著差 異說明待測小菜蛾為抗性種群。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中小菜蛾對阿維菌素抗性檢測方法靈敏度低、周期 長、材料要求高等問題，根據(jù)我們對小菜蛾阿維菌素抗藥性分子機(jī)理的研究結(jié)果，建立小菜 蛾對阿維菌素抗性祀標(biāo)突變的快速、準(zhǔn)確的分子檢測方法。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 根據(jù)我們克隆的小菜蛾谷氨酸氯離子通道基因序列（GenBank登錄號(hào) JX014231. 1)設(shè)計(jì)的特異性引物，W單頭小菜蛾的基因組DNA為模板，進(jìn)行谷氨酸氯離子通 道基因 TM2和TM3區(qū)域的PCR擴(kuò)增，通過對目標(biāo)片段純化產(chǎn)物直接測序色譜圖的分析，可W 區(qū)分小菜蛾個(gè)體的基因型（敏感純合子SS、抗性雜合子RS和抗性純合子RR)，檢測種群樣 本的抗性等位基因頻率。本發(fā)明涉及小菜蛾谷氨酸氯離子通道A309V抗性點(diǎn)突變的檢測方 法和專用引物序列。
[0008] -種小菜蛾對阿維菌素祀標(biāo)抗性的分子檢測方法，用SEQ ID NO. 1所示的特異性 正向引物PxGlua-Seq-F和沈Q ID NO. 2所示的特異性反向引物PxGlua-Seq-R對谷氨酸 氯離子通道基因 PxGIuCI進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR純化產(chǎn)物直接測序，根據(jù)直接測序色譜圖鑒 定小菜蛾個(gè)體PxGIuCI基因在309位氨基酸是否突變及其具體類型，一次性區(qū)分該個(gè)體為 對阿維菌素的敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子。
[0009] 本發(fā)明涉及的小菜蛾野生型谷氨酸氯離子通道基因因 PxGluClcDNA序列全長 2074bp(GenBank登錄號(hào)為JX014231. 1)，我們研究發(fā)現(xiàn)；阿維菌素敏感型基因序列第926位 核巧酸由C突變?yōu)門 (附圖1 =Abm-R)，其編碼的蛋白質(zhì)由A突變?yōu)閂，并發(fā)現(xiàn)該突變頻率與 種群對阿維菌素的抗藥性化Cw值）相關(guān)，即該突變導(dǎo)致小菜蛾對阿維菌素的高水平祀標(biāo)抗 性。所述的根據(jù)直接測序色譜圖準(zhǔn)確鑒定小菜蛾個(gè)體谷氨酸氯離子通道在309位氨基酸是 否突變及其具體類型，一次性區(qū)分該位點(diǎn)敏感純合子、抗性雜合子和抗性純合子的方法為： 如果識(shí)別序列巧'-CATAGACG-3')前一位堿基為C單峰色譜（附圖2.A)，則表明該小菜 蛾個(gè)體為不攜帶谷氨酸氯離子通道突變的敏感純合子；如果識(shí)別序列前一位堿基為T/C雙 峰色譜（附圖2. B)，則表明該小菜蛾個(gè)體為攜帶309位氨基酸突變的雜合子；如果識(shí)別序 列前一位堿基為T單峰色譜（附圖2. C)，則表明該小菜蛾個(gè)體為攜帶309位氨基酸突變的 純合子。
[0010] 所述的分子檢測方法，優(yōu)選包含如下H個(gè)步驟：
[0011] (1)提取小菜蛾單頭幼蟲或成蟲樣本的基因組DNA ;
[001引 似利用沈Q ID NO. 1所示的引物PxGlua-Seq-F和沈Q ID NO. 2所示的引物 PxGluCn-Seq-R，對上一步提取的小菜蛾基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013] (3)將上一步獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，對目的片段純化回收 后進(jìn)行直接測序，測序引物為SEQ ID NO. 2所示的引物R，通過檢測編碼PxGIuCI基因309 位氨基酸的核巧酸測序色譜圖，一次性區(qū)分在該位點(diǎn)為敏感純合、抗性雜合和抗性純合基 因型的個(gè)體。
[0014] 其中，PCR 反應(yīng)體系優(yōu)選 50ul ;10ul SXPrimeSTAR Buffer，4ul 2. 5mM dNTPs, IOmM的正、反向引物各lul，Iul單頭小菜蛾樣本的基因組DM, I. 2抓PrimeSTAR服DNA聚 合酶，加雙蒸水至反應(yīng)總體積為50ul。PCR反應(yīng)程序優(yōu)選；98°C變性10砂；52°C退火15砂； 72°C延伸30砂；熱循環(huán)數(shù)為30,之后72°C延伸10分鐘。
[0015] 用于分子檢測小菜蛾對阿維菌素祀標(biāo)抗性的引物對，正向引物PxGlua-Seq-F如 沈Q ID NO. 1所示，反向引物PxGlua-Seq-R如沈Q ID NO. 2所示。
[0016] 一種用于檢測小菜蛾對阿維菌素抗性的試劑盒，包含本發(fā)明所述的引物對。
[0017] 本發(fā)明所述的引物對在分子檢測小菜蛾對阿維菌素祀標(biāo)抗性中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明所述的試劑盒對在分子檢測小菜蛾對阿維菌素祀標(biāo)抗性中的應(yīng)用。
[0019] 有益效果
[0020] 我們在小菜蛾抗阿維菌素的近等基因系材料中，首次發(fā)現(xiàn)PxGIuCI基因的TM2和 TM3之間的Loop結(jié)構(gòu)上存在A309V氨基酸突變，且該突變與小菜蛾對阿維菌素的高水平抗 性密切相關(guān)。該基因突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)可用于監(jiān)測不同地理種群攜帶的阿維菌素抗性等位基 因頻率，并為小菜蛾抗藥性治理提供高效、準(zhǔn)確的分子檢測方法。
[0021] CN102154468B中所述的檢測方法為根據(jù)GluCl a亞基表達(dá)量的高低判定種群抗 性（實(shí)施在基因轉(zhuǎn)錄水平，即檢測mRNA表達(dá)多少，該基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)未變化，屬于量變范 疇），為阿維菌素抗性檢測提供了一種參考方法，但其擴(kuò)增產(chǎn)物不進(jìn)行核巧酸測序、亦不包 含本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)的A309V位突變位點(diǎn)。本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)在于首次發(fā)現(xiàn)PxGIuCI基因的 一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了抗性突變（實(shí)施在基因組水平，即檢測曲NA的等位基因序列，屬于質(zhì)變范 疇），與CN102154468B中的檢測方法有本質(zhì)差異，涉及PxGIuCI基因核巧酸突變介導(dǎo)的與 阿維菌素結(jié)合能力下降或親和性降低的抗性機(jī)制，是對基因的不同等位基因進(jìn)行核巧酸序 列檢測，屬于對基因質(zhì)變的檢測手段；且CN102154468B所述方法無法檢測本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的 PxGIuCI基因 A309V突變情況。本發(fā)明與CN102154468B所述的檢測方法所要解決的科學(xué)問 題不同，且本發(fā)明優(yōu)選的檢測技術(shù)可判定不同種群中突變個(gè)體的基因型，計(jì)算出與抗性有 關(guān)的等位基因突變頻率（常規(guī)生物測定技術(shù)和現(xiàn)有專利技術(shù)均不可實(shí)現(xiàn)）。通過一定數(shù)量 的個(gè)體的檢測，可W確定某個(gè)種群中敏感純合子、雜合子和抗性純合子的頻率，為抗藥性早 期預(yù)警和害蟲綜合治理提供了最直接的依據(jù)。
[0022] 與傳統(tǒng)的抗性監(jiān)測技術(shù)（生物測定）相比，本發(fā)明涉及方法無需將田間試蟲飼養(yǎng) 至適宜蟲齡再進(jìn)行生物測定W確定抗性水平。若采集不同地理種群調(diào)查抗性基因的發(fā)生頻 率則需要更長時(shí)間，對生產(chǎn)實(shí)際用藥的指導(dǎo)意義滯后、不便于針對性開展化學(xué)防控。而本發(fā) 明方法不需飼養(yǎng)試蟲，節(jié)省勞動(dòng)力和資源，可W快速、準(zhǔn)確檢測出小菜蛾對阿維菌素抗性的 突變類型和種群攜帶抗性基因頻率。本發(fā)明優(yōu)選的檢測方法有益效果表現(xiàn)在；（1)快速準(zhǔn) 確：生物測定技術(shù)要求試蟲標(biāo)準(zhǔn)化，取樣誤差和蟲體之間的差異對結(jié)果影響很大，造成結(jié)果 的不穩(wěn)定性；本發(fā)明可直接檢測田間小菜蛾個(gè)體（幼蟲或成蟲），從取得樣本到獲得檢測結(jié) 果在12個(gè)小時(shí)W內(nèi)（若送公司測序也僅需2天時(shí)間）。（2)材料要求少；生物測定技術(shù)中 測定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線至少需要200-300頭標(biāo)準(zhǔn)試蟲，而本發(fā)明對一個(gè)種群的檢測只需要50頭 左右。做靈敏度高：生物測定檢測技術(shù)是一種相對粗略檢測抗性水平的方法，不能檢測早 期抗性或低頻率抗性純合子或雜合子，本發(fā)明利用特異性引物擴(kuò)增目的片段，根據(jù)測序色 譜圖可W直接判斷個(gè)體的基因型。
【附圖說明】
[0023] 圖1小菜蛾谷氨酸氯離子通道基因突變區(qū)域的核巧酸和氨基酸序列
[0024] 圖示小菜蛾谷氨酸氯離子通道基因跨膜區(qū)部分序列，其中ROTH-S序列來自小菜 蛾敏感品系，該基因 CDNA序列第926位核巧酸為C，編碼氨基酸為A ;Abm-R序列來自抗阿 維菌素的ROTH-Abm近等基因系，該基因 CDNA序列第926位核巧酸為T，編碼氨基酸為V。 [00巧]圖2小菜蛾谷氨酸氯離子通道基因突變區(qū)域的直接測序色譜圖
[0026] A =PxGIuCI基因第926位堿基為C單峰色譜，表明