專利名稱：一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維膜表面改性技術(shù)，尤指一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法。
背景技術(shù)：
后基因組時代，科學(xué)家們已將研究重點由基因組學(xué)研究轉(zhuǎn)向功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究。蛋白質(zhì)組學(xué)以研究細(xì)胞蛋白質(zhì)的組成和機構(gòu)，蛋白-蛋白相互作用以及他們與疾病發(fā)病機理之間的關(guān)系為主。高通量的多肽陣列技術(shù)是研究蛋白質(zhì)與其它生物大分子如其它蛋白質(zhì)、核酸及多糖之間的相互作用研究中關(guān)鍵且最好的技術(shù)之一。多肽陣列即通過自動化儀器使用化學(xué)合成的方法在固相載體上(玻璃片，纖維素膜，光盤等)同時進(jìn)行成百上千個多肽的合成，多肽點以陣列的形式存在與固相載體上，目前多肽陣列廣泛用于藥物篩選、靶標(biāo)確認(rèn)、表位定位、疫苗開發(fā)，以及蛋白相互作用研究。傳統(tǒng)纖維膜表面結(jié)構(gòu)以羥基(OH)組成，該羥基是纖維膜上能夠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的活性基團(tuán)。根據(jù)膜上多肽陣列合成要求，膜表面需要進(jìn)行化學(xué)改性，鍵合化學(xué)惰性的聯(lián)接物。例如:傳統(tǒng)膜化學(xué)改性技術(shù)是，通過鍵合上單層或多層P-Ala，可以降低膜表面對多肽陣列的背景影響。該方法雖然能使P-Ala很好地與羥基結(jié)合生成惰性聯(lián)接物，覆蓋膜表面，減少羥基對多肽陣列的影響。但缺點是:1) P-Ala是以酯鍵(-C00-)與膜相連，在做多肽陣列點膜時，酯鍵(-C00-)易在強酸性條件下斷裂，發(fā)生多肽脫落；2) P-Ala分子鏈較短，即使鍵和多層以上，仍不能很好降低膜表面對多肽陣列的背景影響。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種更為穩(wěn)定的纖維素膜表面修飾方法，該方法修飾后的纖維素膜解決傳統(tǒng)修飾方法易斷裂、反應(yīng)背景高等問題。通過一系列化學(xué)反應(yīng)，使纖維膜表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以醚鍵(-0-)形式穩(wěn)定地連接上11氨基i^一酸酯(Il-AUN)。即使在強酸性條件下，仍能保持膜上多肽穩(wěn)定，并且能很好降低膜表面對多肽陣列的背景影響。本發(fā)明首先把氨 基端保護(hù)的2，3環(huán)氧丙胺通過醚鍵結(jié)合到纖維素膜，然后成功地耦合上聯(lián)接物11氨基十一酸酯。通過此改性后的纖維素膜適合于固相的多肽或其他寡聚物合成。本發(fā)明是一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，該方法包括以下步驟:I)用20ml 25%三氟乙酸/ 二氯甲烷溶液漂洗空白定量濾紙兩次，每次20分鐘；2)用20ml 二氯甲烷漂洗濾紙兩次，每次2分鐘；3)用20ml 10%三乙基胺/ 二氯甲烷溶液浸泡、反應(yīng)上述濾紙兩次，每次20分鐘，加蓋；4)上述反應(yīng)完畢后，用20ml 二氯甲烷漂洗濾紙兩次，每次5分鐘；
5)用20ml四氫呋喃漂洗濾紙兩次，每次5分鐘；6)分別配制反應(yīng)液I和反應(yīng)液II，反應(yīng)液I為=IOml的N-(2, 3-epoxypropyl)phthalimide溶液，反應(yīng)液II為:10ml氯化鋅的四氫呋喃溶液；將步驟5)得到的濾紙放置反應(yīng)盒中，加入上述配制的反應(yīng)液I和反應(yīng)液II，加蓋密封后，震蕩反應(yīng)24小時后得到濾紙膜；7)停止反應(yīng)并依次用下述試劑漂洗濾紙膜:1.20ml四氫呋喃，漂洗濾紙膜兩次，每次20分鐘；i1.20ml 二甲基甲酰胺，漂洗濾紙膜三次，每次5分鐘；ii1.20ml 二氯甲烷，漂洗濾紙膜二次，每次2分鐘；iv.20ml無水乙醇，漂洗濾紙膜三次，每次2分鐘；8)將濾紙膜放置反應(yīng)盒中，加入肼反應(yīng)液，加蓋密封，震蕩反應(yīng)24小時；9)停止反應(yīng),棄去反應(yīng)液,再重復(fù)一次上述步驟8)的反應(yīng)；10)停止反應(yīng)，棄去反應(yīng)液，并依次用下述試劑漂洗濾紙膜:1.20ml乙醇/甲 醇溶液,3次，每次5分鐘；i1.20ml 10%醋酸/ 二氯甲烷溶液，3次，每次2分鐘；ii1.20ml 10%三乙基胺/ 二甲基甲酰胺溶液，3次，每次2分鐘；iv.20ml 二甲基甲酰胺，3次，每次2分鐘；V.20ml乙醇/甲醇溶液,3次，每次2分鐘；v1.將經(jīng)過上述步驟漂洗過的濾紙膜在空氣中干燥得到纖維膜；11)將干燥的改性纖維膜放置在反應(yīng)盒中，加入0.3M氨基酸反應(yīng)混合液，加蓋，搖擺震蕩反應(yīng)4小時；12)棄去上述反應(yīng)液，用20ml 二甲基甲酰胺漂洗3次，每次2分鐘；13)加入20ml 20%六氫砒啶/ 二甲基甲酰胺溶液，震蕩反應(yīng)10分鐘后，棄去廢液，用20ml 二甲基甲酰胺漂洗4次，2分鐘/次；再用20ml 二氯甲烷漂洗3次，每次2分鐘；用風(fēng)機吹干后，密封在塑料薄膜中保存。所述步驟I)中空白定量濾紙型號為Whatman50，三氟乙酸/ 二氯甲烷溶液體積比為 1: 4。所述步驟3)中三乙基胺/ 二氯甲烷溶液體積比為1: 9。所述步驟6)中N_(2, 3_epoxypropyl)phthalimide溶液濃度為0.6摩爾，氯化鋅的四氫呋喃溶液濃度為8.8摩爾，在密閉條件下震蕩反應(yīng)24小時。所述步驟7)中四種溶液洗膜順序、條件不能顛倒混用。所述步驟8)中肼反應(yīng)液配制方法如下:40ml無水乙醇中加入3ml肼溶液，并在密閉條件下震蕩反應(yīng)24小時。所述步驟10)中洗滌溶劑的洗滌順序、條件不能顛倒混用，乙醇/甲醇溶液體積比為17: 3，醋酸/ 二氯甲烷溶液的體積比為1: 9，三乙基胺/ 二甲基甲酰胺溶液體積比為I: 9，乙醇/甲醇溶液體積比為17: 3。所述步驟11)中0.3M氨基酸反應(yīng)液配制方法如下=Fmoc-氨基i^一酸/1-羥基苯并三唑/ 二異丙基碳二亞胺溶解在15ml 二甲基甲酰胺中；密閉震蕩反應(yīng)4小時。所述步驟13)中六氫砒啶/ 二甲基甲酰胺溶液體積比為1: 5 ;風(fēng)機使用冷風(fēng)，將膜吹干后，密封在塑料薄膜中，在0°c的條件下進(jìn)行保存。本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于:I)通過一系列化學(xué)反應(yīng)，使纖維膜表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以醚鍵(-0-)形式穩(wěn)定地連接上11氨基i^一酸酯(Il-AUN)。2)在強酸性條件下，仍能保持膜上多肽穩(wěn)定，并且能很好降低膜表面對多肽陣列的背景影響。3)使用此方法修飾的纖維素膜，不僅用于多肽陣列的合成，還可用于蛋白質(zhì)陣列、抗體陣列的合成。4)通過此改性后的纖維素膜適合于固相的多肽或其它含游離羧基的寡居生物大分子在纖維素膜上的結(jié)合。


圖1:本發(fā)明的原理示意圖。圖2:本發(fā)明的纖維素膜的結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式

作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明是一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，該方法包括以下步驟:I)用20ml 25%三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(CH2Cl2)溶液漂洗空白定量濾紙兩次，每次20分鐘；其中，空白定量濾紙型號為Whatman50，三氟乙酸/ 二氯甲烷溶液體積比為I: 4。2)進(jìn)行完上述步驟I)后，將濾紙再用20ml 二氯甲烷(CH2Cl2)漂洗濾紙兩次，每次2分鐘。3)用20ml 10%三乙基胺/ 二氯甲烷溶液浸泡、反應(yīng)上述濾紙兩次，每次20分鐘，加蓋；其中，三乙基胺/ 二氯甲烷溶液體積比為1: 9。4)上述反應(yīng)完畢后，用20ml 二氯甲烷(CH2Cl2)漂洗濾紙兩次，每次5分鐘。5)然后,再用20ml四氫呋喃漂洗濾紙兩次,每次5分鐘。6)分別配制反應(yīng)液I和反應(yīng)液II，反應(yīng)液I為:10ml的N-(2, 3-epoxypropyl)phthalimide溶液，反應(yīng)液II為:10ml氯化鋅的四氫呋喃溶液；將步驟5)得到的濾紙放置反應(yīng)盒中，加入上述配制的反應(yīng)液I和反應(yīng)液II，加蓋密封后，震蕩反應(yīng)24小時后得到濾紙膜；其中，N-(2, 3-epoxypropyl) phthalimide溶液濃度為0.6摩爾，氯化鋅的四氫呋喃溶液濃度為8.8摩爾，在密閉條件下震蕩反應(yīng)24小時。7)停止反應(yīng)并依次用下述試劑漂洗濾紙膜:1.20ml四氫呋喃，漂洗濾紙膜兩次，每次20分鐘；i1.20ml 二甲基甲酰胺，漂洗濾紙膜三次，每次5分鐘；ii1.20ml 二氯甲烷，漂洗濾紙膜二次，每次2分鐘；iv.20ml無水乙醇，漂洗濾紙膜三次，每次2分鐘；
以上四種溶液洗膜順序、條件不能顛倒混用。8)將濾紙膜放置反應(yīng)盒中，加入肼反應(yīng)液，加蓋密封，震蕩反應(yīng)24小時；其中，肼反應(yīng)液配制方法如下:40ml無水乙醇中加入3ml肼溶液，并在密閉條件下震蕩反應(yīng)24小時。9)停止反應(yīng),棄去反應(yīng)液,再重復(fù)一次上述步驟8)的反應(yīng)；10)停止反應(yīng)，棄去反應(yīng)液，并依次用下述試劑漂洗濾紙膜:1.20ml乙醇/甲醇溶液,3次，每次5分鐘；i1.20ml 10%醋酸/ 二氯甲烷溶液，3次，每次2分鐘；ii1.20ml 10%三乙基胺/ 二甲基甲酰胺溶液，3次，每次2分鐘；iv.20ml 二甲基甲酰胺，3次，每次2分鐘；V.20ml乙醇/甲醇溶液,3次，每次2分鐘；v1.將經(jīng)過上述步驟漂洗過的濾紙膜在空氣中干燥得到纖維膜；以上洗滌溶劑的洗滌順序、條件不能顛倒混用，其中，乙醇/甲醇溶液體積比為17: 3，醋酸/ 二氯甲 烷溶液的體積比為1: 9，三乙基胺/ 二甲基甲酰胺溶液體積比為
I: 9，乙醇/甲醇溶液體積比為17: 3。11)將干燥的改性纖維膜放置在反應(yīng)盒中，加入0.3M氨基酸反應(yīng)混合液，力口蓋，搖擺震蕩反應(yīng)4小時；其中，0.3M氨基酸反應(yīng)液配制方法如下=Fmoc-氨基i^一酸(Fmoc-NH-(CH2) 1(l-C00H}/1-羥基苯并三唑(HOBt) / 二異丙基碳二亞胺(DIC)溶解在15ml二甲基甲酰胺(DMF)中；密閉震蕩反應(yīng)4小時。12)棄去上述反應(yīng)液，用20ml 二甲基甲酰胺漂洗3次，每次2分鐘；13)加入20ml 20%六氫砒啶/ 二甲基甲酰胺溶液，震蕩反應(yīng)10分鐘后，棄去廢液，用20ml 二甲基甲酰胺漂洗4次，2分鐘/次；再用20ml 二氯甲烷漂洗3次，每次2分鐘；其中，六氫砒啶/ 二甲基甲酰胺溶液體積比為1: 5。風(fēng)機使用冷風(fēng)，將膜吹干后，密封在塑料薄膜中，在0°C的條件下進(jìn)行保存。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)用20ml25%三氟乙酸/ 二氯甲烷溶液漂洗空白定量濾紙兩次，每次20分鐘； 2)用20ml二氯甲烷漂洗濾紙兩次，每次2分鐘； 3)用20ml10%三乙基胺/ 二氯甲烷溶液浸泡、反應(yīng)上述濾紙兩次，每次20分鐘，力口蓋； 4)上述反應(yīng)完畢后，用20ml二氯甲烷漂洗濾紙兩次，每次5分鐘； 5)用20ml四氫呋喃漂洗濾紙兩次，每次5分鐘； 6)分別配制反應(yīng)液I和反應(yīng)液II，反應(yīng)液I為:10ml的N-(2,3-epoxypropyl)phthalimide溶液，反應(yīng)液II為:10ml氯化鋅的四氫呋喃溶液；將步驟5)得到的濾紙放置反應(yīng)盒中，加入上述配制的反應(yīng)液I和反應(yīng)液II，加蓋密封后，震蕩反應(yīng)24小時后得到濾紙膜； 7)停止反應(yīng)并依次用下述試劑漂洗濾紙膜: 1.20ml四氫呋喃，漂洗濾紙膜兩次，每次20分鐘； i1.20ml 二甲基甲酰胺，漂洗濾紙膜三次，每次5分鐘； ii1.20ml 二氯甲烷，漂洗濾紙膜二次，每次2分鐘； iv.20ml無水乙醇，漂洗濾紙膜三次，每次2分鐘； 8)將濾紙膜放置反應(yīng)盒中，加入肼反應(yīng)液，加蓋密封，震蕩反應(yīng)24小時； 9)停止反應(yīng),棄去反應(yīng)液,再重復(fù)一次上述步驟8)的反應(yīng)； 10)停止反應(yīng)，棄去反應(yīng)液，并依次用下述試劑漂洗濾紙膜: 1.20ml乙醇/甲醇溶液，3次，每次5分鐘； i1.20ml10%醋酸/ 二氯甲烷溶液，3次，每次2分鐘； ii1.20ml 10%三乙基胺/ 二甲基甲酰胺溶液，3次，每次2分鐘； iv.20ml 二甲基甲酰胺，3次，每次2分鐘； V.20ml乙醇/甲醇溶液，3次，每次2分鐘； v1.將經(jīng)過上述步驟漂洗過的濾紙膜在空氣中干燥得到纖維膜； 11)將干燥的改性纖維膜放置在反應(yīng)盒中，加入0.3M氨基酸反應(yīng)混合液，加蓋，搖擺震蕩反應(yīng)4小時； 12)棄去上述反應(yīng)液，用20ml二甲基甲酰胺漂洗3次，每次2分鐘； 13)加入20ml20%六氫砒啶/ 二甲基甲酰胺溶液，震蕩反應(yīng)10分鐘后，棄去廢液，用20ml 二甲基甲酰胺漂洗4次，2分鐘/次；再用20ml 二氯甲烷漂洗3次，每次2分鐘；用風(fēng)機吹干后，密封在塑料薄膜中保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，其特征在于，所述步驟I)中空白定量濾紙型號為Whatman50，三氟乙酸/ 二氯甲烷溶液體積比為I: 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，其特征在于，所述步驟3)中三乙基胺/ 二氯甲烷溶液體積比為1: 9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，其特征在于，所述步驟6)中N-(2, 3-epoxypropyl)phthalimide溶液濃度為0.6摩爾，氯化鋅的四氫呋喃溶液濃度為8.8摩爾，在密閉條件下震蕩反應(yīng)24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，其特征在于，所述步驟7)中四種溶液洗膜順序、條件不能顛倒混用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，其特征在于，所述步驟8)中肼反應(yīng)液配制方法如下:40ml無水乙醇中加入3ml肼溶液，并在密閉條件下震蕩反應(yīng)24小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，其特征在于，所述步驟10)中洗滌溶劑的洗滌順序、條件不能顛倒混用，乙醇/甲醇溶液體積比為17: 3，醋酸/ 二氯甲烷溶液的體積比為1: 9，三乙基胺/ 二甲基甲酰胺溶液體積比為I: 9，乙醇/甲醇溶液體積比為17: 3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，其特征在于，所述步驟11)中0.3M氨基酸反應(yīng)液配制方法如下:FmoC-氨基i^一酸/1-羥基苯并三唑/ 二異丙基碳二亞胺溶解在15ml 二甲基甲酰胺中；密閉震蕩反應(yīng)4小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，其特征在于，所述步驟13)中六氫砒啶/ 二甲基甲酰胺溶液體積比為1: 5;風(fēng)機使用冷風(fēng)，將膜吹干后，密封在塑料薄膜中， 在0°C的條件下進(jìn)行保存。
全文摘要
本發(fā)明是一種用于蛋白芯片合成的纖維素膜的穩(wěn)定修飾方法，本發(fā)明涉及纖維膜表面改性技術(shù)通過化學(xué)方法將其表面微觀的羥基(OH)結(jié)構(gòu)改變，以醚鍵(-0-)形式穩(wěn)定地連接上11氨基十一酸酯(11-AUN)，使其能夠作為多肽陣列合成的基膜。也可用于蛋白芯片，抗體芯片的合成。該方法修飾后的纖維素膜解決傳統(tǒng)修飾方法易斷裂、反應(yīng)背景高等問題。即使在強酸性條件下，仍能保持膜上多肽穩(wěn)定，并且能很好降低膜表面對多肽陣列的背景影響。
文檔編號D21H17/07GK103225230SQ201310082
公開日2013年7月31日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月15日
發(fā)明者趙樹民, 鮑勇剛, 石松傳 申請人:趙樹民