專利名稱：組蛋白脫乙?；敢种苿┑闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抑制組蛋白脫乙?；?HDAC)的酶活性化合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及它們的制備方法、包含它們的組合物以及它們在體外和體內(nèi)抑制HDAC和作為藥物的用途，例如作為抑制增生狀況的藥物，如癌癥和牛皮癬。
在所有真核細(xì)胞中，染色質(zhì)中基因組DNA與組蛋白結(jié)合形成核小體。每個(gè)核小體由兩組H2A、H2B、H3和H4組蛋白所形成的蛋白質(zhì)八聚體組成。DNA纏繞在該蛋白核上，組蛋白的堿性氨基酸與DNA帶負(fù)電的磷酸根基團(tuán)相互作用。最常見的核心組蛋白翻譯后修飾是保守的強(qiáng)堿性N末端賴氨酸殘基的ε-氨基的可逆乙酰化。通過競爭性組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和此處被稱為“HDAC”的組蛋白脫乙?；钢g的動(dòng)態(tài)平衡，建立組蛋白乙酰化的穩(wěn)定狀態(tài)。長期以來組蛋白的乙?；兔撘阴；徽J(rèn)為與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。最近編碼不同組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙?；傅幕蚩寺榻M蛋白乙?；娃D(zhuǎn)錄調(diào)控之間的關(guān)系提供了可能的解釋。組蛋白的可逆乙?；蓪?dǎo)致染色質(zhì)的重建，因而成為基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制。通常，組蛋白過乙?；欣诨虻谋磉_(dá)，而組蛋白脫乙酰化與轉(zhuǎn)錄阻抑相關(guān)聯(lián)。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶顯示出轉(zhuǎn)錄輔激活因子的作用，而組蛋白脫乙酰基酶屬于轉(zhuǎn)錄阻抑路徑。
組蛋白乙?；兔撘阴；g的動(dòng)態(tài)平衡對于細(xì)胞的正常生長是必需的。組蛋白脫乙?；傅囊种茖?dǎo)致細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞分化、編程性細(xì)胞死亡和轉(zhuǎn)化表型的逆轉(zhuǎn)。因此HDAC抑制劑在治療細(xì)胞增生性疾病或狀況方面有很強(qiáng)的治療潛力。(Marks等，Nature ReviewCancer 1194-202，2001)。
對組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)抑制劑的研究表明實(shí)際上這些酶在細(xì)胞增生和分化中有著重要的作用。抑制劑曲古抑菌素A(TSA)在G1和G2階段都能導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯，逆轉(zhuǎn)不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化表型，并誘導(dǎo)Friend白血病細(xì)胞和其它細(xì)胞的分化。據(jù)報(bào)道TSA(和辛二酰苯胺異羥肟酸SAHA)在小鼠中可以抑制細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)終末分化以及防止腫瘤的形成(Finnin等，Nature，401188-193，1999)。
也有報(bào)道曲古抑菌素A在治療纖維樣變性方面有用，例如肝纖維化和肝硬化(Geerts等，歐洲專利申請EP 0 827 742，1998年3月11日公開)。
2001年5月31日公開的專利申請WO01/38322中與其它抑制劑一起公開了通式Cy-L1-Ar-Y1-C(O)-NH-Z組蛋白脫乙?；敢种苿峁┝酥委熂?xì)胞增生疾病和狀態(tài)的組合物和方法。
2001年9月27日公開的專利申請WO01/70675公開了式Cy-X-Y1-W和Cy-S(O)2-NH-Y3-W組蛋白脫乙?；敢种苿?，并進(jìn)一步提供了治療細(xì)胞增生疾病和狀態(tài)的組合物和方法。
所要解決的問題是提供具有高度酶活性的組蛋白脫乙?；敢种苿?，該抑制劑還要顯示優(yōu)越的性質(zhì)例如細(xì)胞活性和提高的生物有效性，優(yōu)選口服生物有效性，以及具有較少或者沒有副作用。
本發(fā)明的新化合物解決了上述問題。這些化合物與現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)構(gòu)不同。
本發(fā)明化合物顯示出極好的體外抑制組蛋白脫乙?；傅拿富钚浴１净衔镌诩?xì)胞活性方面具有優(yōu)越的性質(zhì)，并具有在G1和G2檢測點(diǎn)(p21誘導(dǎo)能力)抑制細(xì)胞周期過程的特定性質(zhì)。本發(fā)明化合物顯示良好的代謝穩(wěn)定性和較高的生物有效性，尤其是它們顯示出口服生物有效性。
本發(fā)明涉及式(I)化合物 其N-氧化物形式、藥學(xué)上可接受的加成鹽及其立體化學(xué)異構(gòu)體形式，其中n為0、1、2或3，且當(dāng)n為0時(shí)，為直接的鍵；每個(gè)Q為氮或者 每個(gè)X為氮或者 每個(gè)Y為氮或者 每個(gè)Z為氮或者 R1為C(O)NR5R6、-N(H)C(O)R7、-C(O)-C1-6鏈烷二基(alkanediyl)SR7、-NR8C(O)N(OH)R7、-NR8C(O)C1-6鏈烷二基SR7、-NR8C(O)C＝N(OH)R7或者另一個(gè)Zn-螯合基團(tuán)，其中R5和R6各自獨(dú)立地選自氫、羥基、C1- 6烷基、羥基C1-6烷基、氨基C1-6烷基或氨基芳基；R7獨(dú)立地選自氫、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、芳基C1-6烷基、C1-6烷基吡嗪基、吡啶環(huán)酮(pyridinone)、吡咯烷環(huán)酮(pyrrolidinone)或甲基咪唑基；R8獨(dú)立地選自氫或C1-6烷基；R2為氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、二(C1-6烷基)氨基、羥基氨基或者萘磺?；拎夯籖3為氫、C1-6烷基、芳基C2-6烯二基(alkenediyl)、呋喃羰基、萘基羰基、-C(O)苯基R9、C1-6烷基氨基羰基、氨基磺酰基、芳基氨基磺?；?、氨基磺酰基氨基、二(C1-6烷基)氨基磺?；被?、芳基氨基磺?；被?、氨基磺酰基氨基C1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基磺酰基氨基C1-6烷基、芳基氨基磺?；被鵆1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-12烷基磺?；?、二(C1-6烷基)氨基磺?；?、三鹵C1-6烷基磺酰基、二(芳基)C1-6烷基羰基、苯硫基C1-6烷基羰基、吡啶基羰基或者芳基C1-6烷基羰基，其中各個(gè)R9獨(dú)立地選自苯基；被一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)獨(dú)立地選自鹵素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羥基C1-4烷基、羥基C1-4烷氧基、氨基C1-4烷氧基、二(C1-4烷基)氨基C1-4烷氧基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、羥基C1-4烷基哌嗪基C1-4烷基、C1-4烷氧基哌啶基C1-4烷基、羥基C1-4烷氧基C1-4烷基哌嗪基、C1-4烷基哌嗪基C1-4烷基、二(羥基C1-4烷基)氨基C1-4烷基、吡咯烷基C1-4烷氧基、嗎啉基C1-4烷氧基、或者嗎啉基C1-4烷基的取代基取代的苯基；苯硫基；或者被二(C1-4烷基)氨基C1-4烷氧基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、吡咯烷基C1-4烷氧基、C1-4烷基哌啶基C1-4烷基、二(羥基C1-4烷基)氨基C1-4烷基或嗎啉基C1-4烷氧基取代的苯硫基。
R4為氫、羥基、氨基、羥基C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、芳基C1-6烷基、氨基羰基、羥基羰基、氨基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基、羥基羰基C1-6烷基、羥基氨基羰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基氨基C1-6烷基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；
當(dāng)R3和R4在同一個(gè)碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成下式的二價(jià)基團(tuán)-C(O)-NH-CH2-NR10-(a-1)其中R10為氫或芳基；當(dāng)R3和R4在相鄰的碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成下式的二價(jià)基團(tuán)＝CH-CH＝CH-CH＝ (b-1)；以上的芳基為苯基，或者被一個(gè)或者多個(gè)各自獨(dú)立地選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、氰基或羥基羰基的取代基取代的苯基。
術(shù)語“組蛋白脫乙?；敢种苿被蛘摺敖M蛋白脫乙酰基酶的抑制劑”是用于表示一種化合物，它能夠與組蛋白脫乙?；赶嗷プ饔貌⒁种破浠钚裕唧w地說抑制其酶活性。抑制組蛋白脫乙?；傅拿富钚砸馕吨档徒M蛋白脫乙?；笍慕M蛋白上除去乙酰基的能力。優(yōu)選地，這種抑制是特異性的，即組蛋白脫乙?；敢种苿┰谝欢舛认履軌蚪档徒M蛋白脫乙酰基酶從組蛋白上除去乙?；哪芰?，該濃度低于該抑制劑產(chǎn)生一些其它不相關(guān)的生物效應(yīng)所需的濃度。
如以上定義中和以下所使用，鹵素是氟、氯、溴和碘的總稱；C1-4烷基定義為具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或者支鏈飽和烴基，如甲基、乙基、丙基、丁基、1-甲基乙基、2-甲基丙基等；C1-6烷基包括C1-4烷基和其具有5至6個(gè)碳原子的更高同系物，例如戊基、2-甲基-丁基，己基、2-甲基戊基等；C1-6鏈烷二基定義為具有1至6個(gè)碳原子的二價(jià)直鏈或支鏈飽和烴基，例如亞甲基、1，2-乙二基、1，3-丙二基、1，4-丁二基、1，5-戊二基、1，6-己二基及其支鏈異構(gòu)體例如2-甲基戊二基、3-甲基戊二基、2，2-二甲基丁二基、2，3-二甲基丁二基等；三鹵代C1-6烷基定義為含有三個(gè)相同或不同鹵素取代基的C1-6烷基如三氟甲基；C2-6烯二基定義為具有一個(gè)雙鍵并具有2至6個(gè)碳原子的二價(jià)直鏈或支鏈烴基，例如乙烯二基、2-丙烯二基、2-丁烯二基、2-戊烯二基、3-戊烯二基、3-甲基-2-丁烯二基等等；以及氨基芳基定義為被氨基取代的芳基。
術(shù)語“另一個(gè)Zn-螯合基團(tuán)”指能夠與可能位于酶結(jié)合位點(diǎn)的Zn-離子相互作用的基團(tuán)。
藥學(xué)上可接受的加成鹽包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽和藥學(xué)上可接受的堿加成鹽。上述藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的含義包括式(I)化合物能夠形成的具有治療活性的無毒酸加成鹽的形式。具有堿性的式(I)化合物可以通過用合適的酸處理所述堿性形式而轉(zhuǎn)化成它們藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。合適的酸包括，例如，無機(jī)酸例如氫鹵酸，如鹽酸或氫溴酸；硫酸；硝酸；磷酸等酸；有機(jī)酸，例如，乙酸、三氟乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲基苯磺酸、環(huán)己烷氨基磺酸、水楊酸、對-氨基-水楊酸、撲酸(pamoic acid)等酸。
具有酸性的式(I)化合物可以通過用合適的有機(jī)或無機(jī)堿處理所述酸的形式而轉(zhuǎn)化為它們的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽。合適堿性鹽形式包括，例如，銨鹽、堿金屬鹽和堿土金屬鹽、如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣等鹽，與有機(jī)堿的鹽、如benzathine、N-甲基-D-葡糖胺、hydrabamine的鹽，以及氨基酸例如精氨酸、賴氨酸等的鹽。
術(shù)語“酸或堿加成鹽”也包括式(I)化合物能夠形成的水合物和溶劑加成形式。這些形式的實(shí)例有例如水合物、醇化物等。
此處所用術(shù)語“式(I)化合物的立體化學(xué)異構(gòu)體形式”定義為由相同的原子以相同的鍵序列構(gòu)成但具有不同的式(I)化合物可能具有的三維結(jié)構(gòu)的所有可能的化合物，上述三維結(jié)構(gòu)不能相互轉(zhuǎn)換。除非另有說明或指示，化合物的化學(xué)名稱包括所述化合物具有的所有可能的立體化學(xué)異構(gòu)體形式的混合物。所述混合物可以含有所述化合物的基本分子結(jié)構(gòu)的所有非對映體和/或?qū)τ丑w。所有以純的形式或者相互摻和物形式的式(I)化合物的立體化學(xué)異構(gòu)體形式都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
式(I)化合物的N-氧化物形式的含義包括其中一個(gè)或多個(gè)氮原子被氧化成所謂的N-氧化物的式(I)化合物，特別是其中一個(gè)或多個(gè)哌啶-、哌嗪或噠嗪基-氮被N-氧化的N-氧化物。
一些式(I)化合物也可以以它們的互變異構(gòu)體形式存在。這種形式雖然在上述式中沒有明確表明，但也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在任何下文中所使用的術(shù)語“式(I)化合物”還包括藥學(xué)上可接受的加成鹽和所有立體異構(gòu)體形式。
這里所用的術(shù)語“組蛋白脫乙酰基酶”和“HDAC”指從位于組蛋白N-端的賴氨酸殘基的ε-氨基上除去乙?；拿讣易宓娜魏我粋€(gè)成員。除非在上下文中另有指示，術(shù)語“組蛋白”指來源于任何物種的任何組蛋白，包括H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人類HDAC蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物包括但不局限于HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9和HDAC-10。組蛋白脫乙酰基酶也可以來自于原生動(dòng)物或真菌源。
第一組感興趣的化合物包括施加一個(gè)或者多個(gè)以下限定的式(I)化合物a)n為0或1；b)每個(gè)Q為 c)R1為-C(O)NH(OH)或-NHC(O)C1-6鏈烷二基SH；d)R2為氫或硝基；e)R3為C1-6烷基、芳基C2-6烯二基、呋喃羰基、萘基羰基、C1-6烷基氨基羰基、氨基磺?；?、二(C1-6烷基)氨基磺酰基氨基C1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-12烷基磺?；?、二(C1-6烷基)氨基磺?；?、三鹵代C1-6烷基磺?；⒍?芳基)C1-6烷基羰基、苯硫基C1-6烷基羰基、吡啶基羰基或者芳基C1-6烷基羰基；f)R4為氫；g)當(dāng)R3和R4在同一個(gè)碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成式(a-1)的二價(jià)基團(tuán)，其中R10為芳基；當(dāng)R3和R4在相鄰的碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成式(b-1)的二價(jià)基團(tuán)。
第二組感興趣的化合物包括施加一個(gè)或者多個(gè)以下限定的式(I)化合物a)n為1；b)每個(gè)Q為 c)每個(gè)Z為氮；d)R1為-C(O)NH(OH)；e)R2為氫；f)R3為萘基羰基、C1-12烷基磺酰基或者二(芳基)C1-6烷基羰基；g)R4為氫；
第三組感興趣的化合物包括式(I)化合物，其中R2為氫。
第四組感興趣的化合物包括式(I)化合物，其中R1為-C(O)NH(OH)。
第五組感興趣的化合物包括式(I)化合物，其中R2為氫且R1為-C(O)NH(OH)。
第六組感興趣的化合物包括施加一個(gè)或者多個(gè)以下限定的式(I)化合物a)R1為C(O)NR5R6、-C(O)-C1-6鏈烷二基SR7、-NR8C(O)N(OH)R7、-NR8C(O)C1-6鏈烷二基SR7、-NR8C(O)C＝N(OH)R7或者另一個(gè)Zn-螯合基團(tuán)，其中R5和R6各自獨(dú)立地選自氫、羥基、羥基C1-6烷基或氨基C1-6烷基；b)R2為氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基或二(C1-6烷基)氨基；c)R3為氫、C1-6烷基、芳基C2-6烯二基、呋喃羰基、萘基羰基、-C(O)苯基R9、C1-6烷基氨基羰基、氨基磺?；?、芳基氨基磺?；?、氨基磺?；被?、二(C1-6烷基)氨基磺?；被⒍?C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-12烷基磺?；⒍?C1-6烷基)氨基磺?；蛘哌拎せ驶渲懈鱾€(gè)R9獨(dú)立地選自苯基；被一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)獨(dú)立地選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基的取代基取代的苯基；或苯硫基；d)R4為氫、羥基、氨基、羥基C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、芳基C1-6烷基、氨基羰基、氨基C1-6烷基、C1-6烷基氨基C1-6烷基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基。
一組優(yōu)選的化合物包括以下式(I)化合物，其中R1為C(O)NR5R6、-C(O)-C1-6鏈烷二基SR7、-NR8C(O)N(OH)R7、-NR8C(O)C1-6鏈烷二基SR7、-NR8C(O)C＝N(OH)R7或者另一個(gè)Zn-螯合基團(tuán)，其中R5和R6各自獨(dú)立地選自氫、羥基、羥基C1-6烷基或氨基C1-6烷基；R2為氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基或二(C1-6烷基)氨基；R3為氫、C1-6烷基、芳基C2-6烯二基、呋喃羰基、萘基羰基、-C(O)苯基R9、C1-6烷基氨基羰基、氨基磺?；?、芳基氨基磺?；被酋；被⒍?C1-6烷基)氨基磺?；被?、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-12烷基磺?；⒍?C1-6烷基)氨基磺?；蛘哌拎せ驶?，其中各個(gè)R9獨(dú)立地選自苯基；被一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)獨(dú)立地選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基的取代基取代的苯基；苯硫基；和R4為氫、羥基、氨基、羥基C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、芳基C1-6烷基、氨基羰基、氨基C1-6烷基、C1-6烷基氨基C1-6烷基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基。
進(jìn)一步優(yōu)選的一組化合物包括以下式(I)化合物，其中n為0或1；每個(gè)Q為 R1為-C(O)NH(OH)或-NHC(O)-C1-6鏈烷二基SH；R2為氫或硝基；R3為C1-6烷基、芳基C2-6烯二基、呋喃羰基、萘基羰基、C1-6烷基氨基羰基、氨基磺?；?、二(C1-6烷基)氨基磺酰基氨基C1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-12烷基磺?；?、二(C1-6烷基)氨基磺酰基、三鹵代C1-6烷基磺?；?、二(芳基)C1-6烷基羰基、苯硫基C1-6烷基羰基、吡啶基羰基或者芳基C1-6烷基羰基；R4為氫；當(dāng)R3和R4在同一個(gè)碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成式(a-1)的二價(jià)基團(tuán)，其中R10為芳基；或當(dāng)R3和R4在相鄰的碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成式(b-1)的二價(jià)基團(tuán)。
更優(yōu)選的一組化合物包括以下式(I)化合物，其中n為1；每個(gè)Q為 每個(gè)Z為氮；R1為-C(O)NH(OH)；R2為氫；R3為萘基羰基、C1-12烷基磺?；蚨?芳基)C1-6烷基羰基；R4為氫。
最優(yōu)選的化合物為18號、5號和24號化合物。

式(I)化合物、它們的藥學(xué)上可接受的鹽及其N-氧化物和立體化學(xué)異構(gòu)體形式可以通過常規(guī)的方式制備。
一般性的合成路線作為實(shí)例包括a)其中R1為-C(O)NH(OH)的式(I)異羥肟酸，該化合物被稱作式(I-a)化合物，可以通過將式(II)中間體與合適的酸如三氟乙酸進(jìn)行反應(yīng)制得。所述反應(yīng)在合適的溶劑中進(jìn)行，例如甲醇。
b)式(II)中間體可以通過將式(III)中間體與式(IV)中間體在合適的試劑如N’-(乙基碳化亞氨(ethylcarbonimidoyl))-N，N-二甲基-1，3-丙二胺，單鹽酸鹽(EDC)和1-羥基-1H-苯并三唑(HOBT)的存在下進(jìn)行反應(yīng)制備。該反應(yīng)可以在合適的溶劑例如DCM和THF的混合物中進(jìn)行。
c)式(III)中間體可以通過將式(V)中間體與合適的堿例如NaOH在合適的溶劑例如乙醇的存在下進(jìn)行反應(yīng)制得。
式(I)化合物也可以采用固相合成技術(shù)有利地制得。通常，固相合成包括在合成中將中間體與聚合物載體進(jìn)行反應(yīng)。然后該聚合物-負(fù)載的中間體可以進(jìn)行很多合成步驟。各步驟之后，都過濾樹脂，并且用各種溶劑將其洗滌多次以除去雜質(zhì)。在各步驟中，樹脂可以被分開，以在下一步驟中與各種中間體進(jìn)行反應(yīng)，從而合成很大數(shù)量的化合物。進(jìn)行該方法的最后步驟以后，將樹脂通過一種試劑或者工序進(jìn)行處理以從樣品中除去樹脂。固相化學(xué)中所用技術(shù)的更詳細(xì)解釋在例如“The Combinatorial Index”(B.Bunin，Acedemic Press)和Novabiochem’s 1999 Catalogue & Peptide SynthesisHandbook(Novabiochem AG，Switzerland)中已經(jīng)描述，兩者均結(jié)合于此作為參考。
式(I)化合物和一些中間體在它們的結(jié)構(gòu)中可具有至少一個(gè)手性中心。該手性中心可以以R或者S構(gòu)型存在。
用上述方法制備的式(I)化合物通常為對映異構(gòu)體的外消旋混合物，其可以通過本領(lǐng)域已知的解析方法進(jìn)行相互分離。式(I)外消旋化合物可以通過與合適的手性酸反應(yīng)而被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的非對映體鹽的形式。隨后將所述非對映體鹽的形式通過例如選擇性地或者分步結(jié)晶進(jìn)行分離，再將對映異構(gòu)體用堿從中分離出來。另一種分離式(I)化合物對映異構(gòu)體形式的方法包括采用手性固定相的液相色譜法。所述純的立體化學(xué)異構(gòu)體形式也可以由相應(yīng)的合適原料的純的立體化學(xué)異構(gòu)體形式制得，只要反應(yīng)能夠立體有擇地進(jìn)行。優(yōu)選地，如果需要特定的立體異構(gòu)體，所述化合物將通過立體有擇的制備方法合成。這些方法將有利地采用對映異構(gòu)體純原料。
式(I)化合物、其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽及其立體異構(gòu)體形式具有重要的藥理學(xué)性質(zhì)，因?yàn)樗鼈兙哂袑M蛋白脫乙?；?HDAC)的抑制效果。
本發(fā)明提供一種通過給予有效量的本發(fā)明化合物抑制細(xì)胞包括變形細(xì)胞異常生長的方法。細(xì)胞異常生長是指與正常調(diào)節(jié)機(jī)制無關(guān)的生長(例如失去接觸抑制)。其包括通過促使生長阻滯、終末分化、和/或癌細(xì)胞凋亡直接抑制腫瘤生長，以及通過抑制腫瘤形成新血管而間接抑制腫瘤生長。
本發(fā)明還提供向需要這種治療的受治療者如哺乳動(dòng)物(特別是人)給予有效量的本發(fā)明化合物抑制腫瘤生長的方法。特別地，本發(fā)明提供一種通過給予有效量本發(fā)明化合物抑制腫瘤生長的方法。可以抑制的腫瘤的實(shí)例包括但不局限于肺癌(例如胰腺癌并包括非小細(xì)胞肺癌)、胰腺癌(例如胰腺癌如外分泌性胰腺癌)、結(jié)腸癌(結(jié)腸直腸癌，如結(jié)腸腺癌和結(jié)腸腺瘤)、前列腺癌包括晚期疾病、淋巴造血系統(tǒng)腫瘤(例如急性淋巴性白血病、B-細(xì)胞淋巴瘤、Burkitt′s淋巴瘤)、骨髓性白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))、甲狀腺濾泡癌、脊髓發(fā)育不良綜合癥(MDS)、間質(zhì)細(xì)胞源性腫瘤(例如纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤)、黑色素瘤、畸胎癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、皮膚良性腫瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如晚期乳腺癌)、腎癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。
本發(fā)明化合物可以用于其它治療目的，例如a)在對腫瘤進(jìn)行放射以治療癌癥之前、期間和之后給予根據(jù)本發(fā)明的化合物以促進(jìn)腫瘤的敏感性；b)治療關(guān)節(jié)病和骨狀況例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、多關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡；c)抑制平滑肌細(xì)胞增生包括血管增生失調(diào)、動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄(restenosis)等；d)治療炎癥性疾病和皮膚疾病例如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、過敏性鼻炎、移植物對宿主反應(yīng)疾病、結(jié)膜炎、哮喘、ARDS、貝切特氏病、移植排斥反應(yīng)、uticaria、過敏性皮炎、斑形脫發(fā)(alopeciaareata)、硬皮病、疹病、濕疹、皮膚真菌病、痤瘡、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、川崎病、多發(fā)性硬化病、肺氣腫、囊性纖維化和慢性支氣管炎；e)治療子宮內(nèi)膜異位癥、子宮纖維瘤、功能性子宮出血和子宮內(nèi)膜增生；f)治療眼睛血管化例如血管病損傷視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管?。籫)治療心臟功能障礙；h)抑制免疫抑制疾病例如治療HIV感染；i)治療腎功能障礙；j)抑制內(nèi)分泌紊亂；k)抑制糖原異生功能障礙；
l)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如帕金森病癥或者導(dǎo)致認(rèn)知紊亂的神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如阿爾茨海默氏病或與聚谷酰胺相關(guān)的神經(jīng)性病癥；m)抑制神經(jīng)肌肉病，例如淀粉樣側(cè)索硬化(amylotropic lateralsclerosis)；n)治療脊髓性肌萎縮；o)治療其它能夠接受加強(qiáng)基因表達(dá)的狀況；p)增強(qiáng)基因治療。
因此本發(fā)明公開了式(I)化合物用作藥物以及用式(I)化合物制備治療一種或多種上述狀況的藥物。
式(I)化合物、其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽以及立體異構(gòu)體形式具有重要的診斷性能，因?yàn)樗鼈兛捎糜跈z測或鑒別生物樣品中的HDAC，包括檢測和測定標(biāo)記化合物和HDAC之間復(fù)合物的形成。
該檢測或鑒別方法可以使用用標(biāo)記試劑例如放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記的化合物。放射性同位素的實(shí)例包括125I、131I、3H和14C。酶通常通過與合適的底物結(jié)合而可被檢測到，從而又催化可檢測的反應(yīng)。其實(shí)例包括例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、堿性磷酸變位酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶，優(yōu)選辣根過氧化物酶。發(fā)光物質(zhì)包括例如魯米諾、魯米諾衍生物、蟲熒光素、水母發(fā)光蛋白和熒蟲素酶。
生物樣品可定義為身體組織或體液。體液的實(shí)例有腦脊髓液、血、血漿、血清、尿、痰液、唾液等。
鑒于它們有用的藥理學(xué)性質(zhì)，受試化合物可以配制成各種用于給藥目的的藥物劑型。
為了制備本發(fā)明的藥物組合物，用有效量的具體化合物以堿或酸加成鹽的形式作為活性成分，與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合形成緊密的混合物，該載體可以采取各種各樣的形式，取決于給藥所需的劑型。合乎需要的是這些藥物組合物采用適合的，優(yōu)選口服、直腸、經(jīng)皮、或者非腸道注射給藥的單位劑型。例如，在制備口服劑型組合物時(shí)，可以使用任何常用的藥物介質(zhì)，例如對于口服液體制劑如混懸液、糖漿劑、酏劑和溶液可以用水、二元醇、油類、醇類等；或者對于散劑、藥丸、膠囊劑和片劑可以用固體載體例如淀粉、糖、白陶土、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。
由于易于給藥，片劑和膠囊劑代表最有利的口服劑量單位劑型，在這種情況下顯然采用固體藥物載體。對于非腸道組合物，載體通常包括無菌水作為至少大部分，雖然也可以包括其它成分，例如用于助溶。例如可以制備其中載體包括生理鹽水溶液、葡萄糖溶液或生理鹽水與葡萄糖溶液混合物的注射用溶液。也可以制備注射用混懸液，在這種情況下使用合適的液體載體、懸浮劑等。在適合用于經(jīng)皮給藥的組合物中，載體任選包括滲透促進(jìn)劑和/或合適的潤濕劑，任選以較小的比例與任何天然的合適添加劑結(jié)合，該添加劑不會(huì)對皮膚產(chǎn)生明顯的有害效果。所述添加劑可以使促進(jìn)皮膚給藥和/或有助于制備所需組合物。這些組合物可以以各種方式給藥，例如透皮帖劑、spot-on或軟膏劑。
將上述藥物組合物配制成劑量單位劑型對于方便給藥和統(tǒng)一劑量非常有利。本說明書和權(quán)利要求書中所用的劑量單位劑型是指合適作為單位劑量的物理分散單元，每個(gè)單位含有通過計(jì)算能夠產(chǎn)生預(yù)期治療效果的預(yù)定量活性成分和所需的藥物載體。這種劑量單位劑型的實(shí)例有片劑(包括刻痕片劑和糖衣片劑)、膠囊劑、藥丸、粉末袋、糯米紙囊劑、注射用溶液或混懸液、茶匙量制劑、湯匙量制劑等，及其分開的復(fù)合體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易通過下文中提供的測定結(jié)果確定有效量。通常認(rèn)為治療有效量為0.05mg/kg體重至100mg/kg體重，特別是0.05mg/kg體重至10mg/kg體重。將所需要的劑量以2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多亞-劑量在全天中以適當(dāng)間隔給藥比較合適。所述小劑量可以被配制成單位劑量劑型，例如每單位劑量劑型含有5至500mg，特別是10mg至500mg活性成分。
作為本發(fā)明的另一方面，考慮了將HDAC-抑制劑與另一種抗癌藥劑結(jié)合，特別是用作藥物，更具體地說用于治療癌或相關(guān)疾病。
對于治療上述狀況，本發(fā)明化合物可以有利地與一種或多種其它藥物制劑，更具體地，與其它抗癌藥劑結(jié)合?？拱┧巹┑膶?shí)例有-鉑配位化合物，例如順鉑、卡鉑、oxalyplatin；-紫杉烷類化合物，例如紫杉醇或多西他賽；-拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，例如喜樹堿化合物如依立替康或托泊替康；
-拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，例如抗腫瘤鬼臼毒素衍生物如依托泊苷或替尼泊苷；-抗腫瘤長春花生物堿，如長春花堿、長春新堿或長春瑞賓；-抗腫瘤核苷衍生物，例如5-氟尿嘧啶、吉西他濱或卡培他濱；-烷化劑，例如氮芥或亞硝基脲如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀或洛莫司??；-抗腫瘤蒽環(huán)霉素衍生物，例如柔紅霉素、多柔比星、伊達(dá)比星、或米托蒽醌；-HER2抗體，例如曲妥單抗；-雌激素受體拮抗劑或選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，例如他莫西芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、faslodex或雷洛昔芬；-芳香酶抑制劑，例如依西美坦、阿納托唑、來曲唑和伏氯唑；-分化誘導(dǎo)試劑，例如類視黃醇、維生素D和視黃酸代謝阻滯劑(RAMBA)，例如異維生素A酸(accutane)；-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，例如氮雜胞苷；-激酶抑制劑，例如flavoperidol、甲磺酸伊馬替尼或gefitinib；-法呢基轉(zhuǎn)移酶(farnesyltransferase)抑制劑；或-其它HDAC抑制劑。
此處所用術(shù)語“鉑配位化合物”指任何抑制腫瘤細(xì)胞生長的鉑配位化合物，其提供離子形式的鉑。
術(shù)語“紫杉烷類化合物”指具有紫杉烷環(huán)系的一類化合物，與某些物種的紫杉(紅豆杉屬)提取物有關(guān)，或來源于該提取物。
術(shù)語“拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑”用于指能夠改變真核細(xì)胞中DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的酶。它們對重要的細(xì)胞功能和細(xì)胞增生是很關(guān)鍵的。在真核細(xì)胞中有兩種類型的拓?fù)洚悩?gòu)酶，即I型和II型。拓?fù)洚悩?gòu)酶I是分子量約為100,000的單體酶。該酶結(jié)合于DNA并引起瞬時(shí)單鏈分離，使雙螺旋展開(或容許其展開)，隨后在從DNA鏈上脫離之前將裂縫重新封閉。拓?fù)洚悩?gòu)酶II具有類似的作用機(jī)理，包括誘導(dǎo)DNA鏈分離或形成自由基。
術(shù)語“喜樹堿類化合物”用于指與母體喜樹堿化合物有關(guān)或者源于該母體喜樹堿的化合物，它是來源于生長于中國的樹Camptothecinacuminata和生長于印度的樹Nothapodytes foetida的一種水不溶性生物堿。
術(shù)語“鬼臼毒素化合物”用于指與母體鬼臼毒素有關(guān)或源于該母體鬼臼毒素的化合物，它是從曼德拉草(mandrake)植物中提取得到的。
術(shù)語“抗腫瘤長春花生物堿”用于指與長春花屬植物(長春花)提取物有關(guān)或者來源于該提取物的化合物。
術(shù)語“烷化劑”包括各類化學(xué)物質(zhì)，它們具有在生理?xiàng)l件下能夠向生物重要大分子如DNA提供烷基的共同特征。對于大部分更重要的藥物例如氮芥和亞硝基脲，在配位化合物進(jìn)行降解反應(yīng)后，在體內(nèi)產(chǎn)生活性烷基化殘基，其中一些反應(yīng)是酶催反應(yīng)。烷化劑最重要的藥理作用是擾亂與細(xì)胞增生特別是DNA合成和細(xì)胞分裂有關(guān)的基礎(chǔ)機(jī)制。烷化劑妨礙快速增生組織中DNA的功能和完整性是它們的治療用途和它們的許多毒性的基礎(chǔ)。
術(shù)語“抗腫瘤蒽環(huán)霉素衍生物”包括從真菌Strep.peuticus var.caesius獲得的抗生素以及它們的衍生物，特征在于具有四環(huán)素環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)帶有通過配糖鍵相連的特殊糖六碳氨糖。
初期的乳腺癌中人表皮生長因子受體2蛋白(HER2)的擴(kuò)增已顯示與對某些患者較差的預(yù)斷有關(guān)。曲妥單抗是高度純化重組DNA-來源的人單克隆IgGl κ抗體，它能高親和力并且高選擇性地結(jié)合于胞外HER2受體區(qū)域。
許多乳腺癌具有雌激素受體，且這些腫瘤的生長可以被雌激素刺激。術(shù)語“雌激素受體拮抗劑”和“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”用于指結(jié)合于雌激素受體(ER)的雌甾二醇的競爭性抑制劑。當(dāng)結(jié)合到ER時(shí)，選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)受體的三維形狀發(fā)生改變，抑制其結(jié)合于DNA上的雌激素應(yīng)答單元(ERE)。
對于絕經(jīng)后的婦女，循環(huán)雌激素的主要來自于腎上腺和卵巢雄激素(雄烯二酮和睪甾酮)通過周圍組織的芳香酶轉(zhuǎn)化成雌激素(雌激素酮和雌甾二醇)。通過芳香酶抑制或滅活除去雌激素對于絕經(jīng)后的激素-依賴性乳腺癌患者是一種有效和選擇性的治療。
此處所用術(shù)語“抗雌激素藥劑”不僅包括雌激素受體拮抗劑和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，而且還包括上述芳香酶抑制劑。
術(shù)語“分化誘導(dǎo)試劑”包括以各種方式抑制細(xì)胞增生和誘導(dǎo)分化的化合物。已知維生素D和類視黃醇對調(diào)節(jié)各種正常和惡性細(xì)胞的生長和分化具有重要的作用。視黃酸代謝阻滯劑(RAMBA′s)通過抑制細(xì)胞色素P450-介導(dǎo)的視黃酸異化作用來提高內(nèi)源視黃酸水平。
DNA甲基化改變是人腫瘤形成中最常見的異常。選擇基因啟動(dòng)子的高度甲基化通常與相關(guān)基因的失活相關(guān)聯(lián)。術(shù)語“DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑”用于指通過藥理上抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和使腫瘤抑制基因表達(dá)再激活而起作用的化合物。
術(shù)語“激酶抑制劑”包括與細(xì)胞周期過程和程序細(xì)胞死亡(凋亡)相關(guān)的強(qiáng)激酶抑制劑。
術(shù)語“法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑”用于指被設(shè)計(jì)用于防止Ras和其它細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)法呢基化的化合物。已有顯示它們能夠影響惡性細(xì)胞增生和存活。
術(shù)語“其它HDAC抑制劑”包括但不局限于-短鏈脂肪酸，例如丁酸、4-苯基丁酸或丙戊酸(valproicacid)；-異羥肟酸，例如辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、二芳基異羥肟酸A-161906、雙環(huán)-芳基-N-羥基-羧酰胺、pyroxamide、CG-1521、PXO-101、磺酰胺異羥肟酸、LAQ-824、曲古抑菌素A(TSA)、oxamflatin、scriptaid、m-羧基肉桂酸二異羥肟酸、或trapoxin-異羥肟酸類似物；-環(huán)四肽，例如trapoxin、apidicin或縮酚肽(depsipeptide)；-苯甲酰胺類，例如MS-275、或C1-994，或者-depudecin。
對于治療癌癥，本發(fā)明化合物可以如上所述向患者給藥，并結(jié)合放射治療。
放射指電離輻射，特別是γ輻射，尤其是現(xiàn)在常用的線性加速器或者放射核放出的輻射。
腫瘤的放射核照射可以位于腫瘤外或腫瘤內(nèi)。
本發(fā)明還涉及抗癌藥劑與本發(fā)明HDAC抑制劑的復(fù)方藥。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的復(fù)方藥用于醫(yī)療例如抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的復(fù)方藥用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
本發(fā)明還涉及一種抑制受治療者腫瘤細(xì)胞生長的方法，包括給受治療者服用有效量的本發(fā)明的復(fù)方藥。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種通過給予有效量的本發(fā)明復(fù)方藥抑制細(xì)胞包括變形細(xì)胞異常生長的方法。
另一種藥物和HDAC抑制劑可以同時(shí)給藥(例如以分開的或者單位組合物的形式)或者以任意順序先后給藥。對于后者，兩個(gè)化合物在一定期間內(nèi)以一定的劑量和方式進(jìn)行給藥，以確保足以實(shí)現(xiàn)有益或協(xié)同效果?？梢岳斫猓瑑?yōu)選的給藥方法和順序以及復(fù)方藥各組分的各自劑量和服用方式取決于所給予的具體的另一種藥物和HDAC抑制劑、它們的給予途徑、受治療的具體腫瘤和受治療的具體宿主。給予的最佳方法和順序以及劑量和服藥方式可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過常規(guī)的方法參考此處所提供的信息很快地進(jìn)行確定。
在一個(gè)療程中，鉑配位化合物的給藥劑量較好地為1至500mg每平方米(mg/m2)體表面積，例如50至400mg/m2，具體地對于順氯氨鉑劑量為約75mg/m2，以及對于卡波鉑約為約300mg/m2。
在一個(gè)療程中，紫杉烷類化合物的給藥劑量較好地為50至400mg每平方米(mg/m2)體表面積，例如75至250mg/m2，具體地對于紫杉醇劑量約為175至250mg/m2，以及對于多西他賽約為75至150mg/m2。
在一個(gè)療程中，喜樹堿類化合物的給藥劑量較好地為0.1至400mg每平方米(mg/m2)體表面積，例如1至300mg/m2，具體地對于依立替康劑量約為100至350mg/m2，以及對于托泊替康約為1至2mg/m2。
在一個(gè)療程中，抗腫瘤鬼臼毒素衍生物的給藥劑量較好地為30至300mg每平方米(mg/m2)體表面積，例如50至250mg/m2，具體地對于依托泊苷劑量約為35至100mg/m2，以及對于替尼泊甙約為50至250mg/m2。
在一個(gè)療程中，抗腫瘤長春花生物堿的給藥劑量較好地為2至30mg每平方米(mg/m2)體表面積，具體地對于長春堿劑量約為3至12mg/m2，對于長春新堿劑量約為1至2mg/m2，以及對于長春瑞賓劑量約為10至30mg/m2。
在一個(gè)療程中，抗腫瘤核苷衍生物的給藥劑量較好地為200至2500mg每平方米(mg/m2)體表面積，例如700至1500mg/m2，具體地對于5-FU劑量約為200至500mg/m2，對于吉西他濱劑量約為800至1200mg/m2，以及對于卡倍他濱約為1000至250mg/m2。
在一個(gè)療程中，烷化劑例如氮芥或亞硝基脲的給藥劑量較好地為100至500mg每平方米(mg/m2)體表面積，例如120至200mg/m2，具體地對于環(huán)磷酰胺劑量約為100至500mg/m2，對于苯丁酸氮芥劑量約為0.1至0.2mg/kg，對于卡莫司汀劑量約為150至200mg/m2，以及對于洛莫司汀劑量約為100至150mg/m2。
在一個(gè)療程中，蒽環(huán)霉素類衍生物的給藥劑量較好地為10至75mg每平方米(mg/m2)體表面積，例如15至60mg/m2，具體地對于多柔比星劑量約為40至75mg/m2，對于柔紅霉素劑量約為25至45mg/m2，以及對于伊達(dá)比星(idarubicin)劑量約為10至15mg/m2。
在一個(gè)療程中，曲妥單抗的給藥劑量較好地為1至5mg每平方米(mg/m2)體表面積，特別是2至4mg/m2。
抗雌激素藥的給藥劑量較好的約為1至100mg每日，取決于具體的藥物和所治療的病癥。他莫西芬較好的口服劑量為5至50mg，優(yōu)選10至20mg，每天兩次，持續(xù)足夠的治療時(shí)間，以達(dá)到和維持治療效果。托瑞米芬較好的口服給藥劑量為約60mg，每天一次，持續(xù)足夠的治療時(shí)間，以達(dá)到和維持治療效果。阿納托唑較好的口服給藥劑量為約1mg，每天一次。屈洛昔芬較好的口服給藥劑量為約20至100mg，每天一次。雷洛昔芬較好的口服給藥劑量為約60mg，每天一次。依西美坦較好的口服給藥劑量為約25mg，每天一次。
每個(gè)療程可以給予這些劑量例如一次、兩次或更多次，其可以每隔7、14、21或者28天進(jìn)行重復(fù)給藥。
鑒于它們有價(jià)值的藥理性質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明的復(fù)方藥，即另一種藥物和HDAC抑制劑可以被配制成各種給藥目的的劑型。這些組分可以被單獨(dú)配制成各自的藥物組合物，或者配制成含有兩者組分的單一藥物組合物。
因此本發(fā)明也涉及含有另一種藥物和HDAC抑制劑以及一種或多種藥物載體的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及一種根據(jù)本發(fā)明的以包括一種抗癌藥劑和本發(fā)明HDAC抑制劑以及一種或多種藥物載體的藥物組合物形式的復(fù)方藥。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的復(fù)方藥在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物組合物的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明HDAC抑制劑作為第一活性成分以及一種抗癌藥劑作為第二活性成分的藥品，作為一種復(fù)方制劑以同時(shí)的、分開的或者先后使用的方式用于治療癌癥患者。
實(shí)驗(yàn)部分以示范為目的提供以下實(shí)施例。
“BSA”指牛血清白蛋白，“DCM”指二氯甲烷，“DIEA”指二異丙基乙胺，“DMF”指二甲基甲酰胺，“DMSO”指二甲基亞砜，“EtOAc”指乙酸乙酯，“Fmoc”指芴基甲氧基羰基，“Hepes”指4-(-2-羥乙基)-1-哌嗪-乙磺酸，“HOBT”指1-羥基-1H-苯并三唑，“MeOH”指甲醇，“PyBop”指苯并三唑-1-基-氧代-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸鹽，“PyBrOP”指溴代-三-吡咯烷-鏻-六氟磷酸鹽，“TEA”指三乙胺，“TFA”指三氟乙酸，“THF”指四氫呋喃，“ExtrelutTM”是Merck KgaA，Darmstadt，Germany的產(chǎn)品，是含有硅藻土的短柱子。
A.中間體的制備實(shí)施例A1a)中間體1的制備 中間體1將1-(苯基甲基)-哌嗪(0.068mol)的乙腈p.a.(135ml)溶液逐漸地加入到碳酸鉀(0.18mol)和2-(甲磺酰)-5-嘧啶羧酸乙酯(0.082mol)的乙腈p.a.(135ml)溶液中，將反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?5分鐘。然后，將該反應(yīng)混合物保持過夜。加入DCM(400ml)。再加入水(300ml)，并分出有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)溶劑。將殘留物(28g)通過硅膠柱層析(洗脫液DCM/MeOH 95/5)進(jìn)行純化。收集純品組分并蒸發(fā)溶劑。殘留物用乙腈進(jìn)行結(jié)晶，過濾并真空干燥，得15.1g中間體1。
b)中間體2的制備
中間體2將中間體1(0.03mol)與EtOH(250ml)的混合物以Pd/C 10％(2g)作為催化劑于50℃下進(jìn)行氫化。吸收H2(1當(dāng)量)后，過濾除去催化劑，濾液蒸發(fā)。將殘留物通過硅膠柱層析(洗脫液DCM/(MeOH/NH3)90/10)進(jìn)行純化。收集產(chǎn)物部分并蒸發(fā)溶劑，得6.8g(＞96％)中間體2。
c)中間體3的制備 中間體3在N2流下，將二甲基-氨基磺酰氯(0.0015mol)的DCM(1ml)溶液于5℃加入到溶于DCM(1ml)的中間體2(0.0012mol)與TEA(0.0017mol)的混合物中。將該混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。加入10％的碳酸鉀。將混合物用DCM萃取。分出有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過濾并蒸干溶劑。殘留物(0.69g)用乙醚提取。過濾沉淀并干燥，得0.64g(73％)中間體3，熔點(diǎn)193℃。
實(shí)施例A2中間體4的制備 中間體4在氮?dú)饬飨?，?-(甲磺?；?-5-嘧啶羧酸乙酯(0.0434mol)的乙腈(100ml)溶液于10℃滴加到4-哌啶甲胺(0.0868mol)和碳酸鉀(0.0434mol)的乙腈(200ml)溶液中。將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，倒出到冰水中，并用DCM萃取。分出有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)溶劑。將殘留物(14.18g)通過硅膠(20-45μm)柱層析(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH 90/10/1至80/20/2)進(jìn)行純化。收集純的部分并蒸發(fā)溶劑，得3.7g(32％)中間體4。
實(shí)施例A3
a)中間體5的制備 中間體5將溶于DCM(5ml)的中間體2(0.0002mol)、α-苯基苯乙酰氯(0.0003mol)和嗎啉甲基-PS-清除劑(供應(yīng)商N(yùn)ovabiochem目錄編號01-64-0171嗎啉甲基聚苯乙烯HL(200-400目)，2％二乙烯基苯)(0.150g)的混合物室溫?cái)嚢?0小時(shí)，然后加入三(2-氨基乙基)胺PS-清除劑(供應(yīng)商N(yùn)ovabiochem目錄編號01-64-0170三-(2-氨基甲基)-胺聚苯乙烯HL(200-400目)，1％二乙烯基苯)(0.150g)，并將該反應(yīng)混合物再攪拌4小時(shí)。過濾除去清除劑，用DCM洗滌，蒸發(fā)溶劑，得中間體5。
b)中間體6的制備 中間體6將溶于氫氧化鈉1N(1.5ml)的中間體5(0.0003mol)、THF(4ml)和MeOH(1ml)的混合物室溫?cái)嚢?天，然后將反應(yīng)混合物用HCl(1.5ml，1N)中和。將混合物通過ExtrelutTMNT(供應(yīng)商Merck)過濾，并在氮?dú)饬飨逻M(jìn)行干燥，得中間體6。
c)中間體7的制備 中間體7將溶于DCM/DMF(5ml)的中間體6(0.0003mol)、HOBT-6-羧酰胺甲基-PS-清除劑(0.200g；Novabiochem目錄編號01-640425)和N，N-二甲基-4-吡啶胺(0.00015mol)的混合物室溫?cái)嚢?5分鐘，然后加入N，N′-四甲基二(hanetetraylbis)-2-丙胺(0.070ml)，將反應(yīng)混合物振搖4小時(shí)。將樹脂用DCM洗滌3次，DMF洗滌3次，再用DCM洗滌3次和用DMF洗滌3次，最后用DCM洗滌6次。加入0-(四氫-2H-吡喃-2-基)-羥胺(0.00026mol)的DCM(5ml)溶液，將反應(yīng)混合物振搖20小時(shí)，然后加入PS連接的異氰酸甲酯(供應(yīng)商N(yùn)ovabiochem目錄編號01-64-0289異硫氰酸甲酯聚苯乙烯HL(200-400目)，2％二乙烯基苯)(0.150g)，并將混合物振搖4小時(shí)。過濾除去清除劑，用DCM洗滌2次，采用濾液，得中間體7。
B.最終化合物的制備實(shí)施例B1將N-Fmoc-羥胺-2-氯三苯甲基樹脂(Novabiochem，目錄編號01-64-0165)用50％的哌啶DMF溶液去保護(hù)(室溫，24小時(shí))。將樹脂用DCM和DMF洗滌幾次，并在DMF中進(jìn)行膨脹。一次性加入2當(dāng)量的酸1、PyBrOP和4當(dāng)量的DIEA。將混合物振蕩24小時(shí)，抽去液體，將樹脂用DCM和DMF洗滌幾次。樹脂在含有2當(dāng)量胺的DMF中進(jìn)行膨脹，室溫下振蕩24小時(shí)，抽去液體，將樹脂用DCM和DMF洗滌幾次。將樹脂于含有4當(dāng)量TEA的DMF中進(jìn)行膨脹，一次性加入芳基磺酰氯(2當(dāng)量)。將反應(yīng)物攪拌過夜，抽去液體，將樹脂用DCM和DMF洗滌。用5％的TFA的DCM溶液分離出最終產(chǎn)物，采用高效液相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行分析，在預(yù)先稱重的試管中蒸發(fā)。
1.基于樹脂的負(fù)荷作為示例目的的反應(yīng)路線如下。
實(shí)施例B2將N-Fmoc-羥胺-2-氯三苯甲基-樹脂(Novabiochem，目錄編號01-64-0165)用50％的哌啶DMF溶液去保護(hù)(室溫，24小時(shí))1。將樹脂用DCM和DMF洗滌2幾次，并在DMF中進(jìn)行膨脹。一次性加入2當(dāng)量的酸3，PyBrOP4和4當(dāng)量的DI EA。將混合物振蕩24小時(shí)，抽去液體，將樹脂用DCM和DMF洗滌幾次。將樹脂在含有2當(dāng)量胺的DMF中進(jìn)行膨脹，室溫下振蕩24小時(shí)，抽去液體，將樹脂用DCM和DMF洗滌。用5％的TFA的DCM溶液分離出最終產(chǎn)物，采用高效液相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行分析，并在預(yù)先稱重的試管中進(jìn)行蒸發(fā)。
1.在一個(gè)實(shí)施例中(化合物1)使用了羧酸甲硫醇4-甲氧基三苯甲基-樹脂(Novabiochem 01-64-0238)。
2.在一種情況下(化合物I)，在不同的洗滌步驟中也使用甲醇。
3.基于樹脂的負(fù)荷4.在一種情況下(化合物1)，用PyBOP代替PyBrOP。
實(shí)施例B3將N-Fmoc-羥胺-2-氯三苯甲基-樹脂(Novabiochem，01-64-0165)用50％的哌啶DMF溶液去保護(hù)(室溫，24小時(shí))1。將樹脂用DCM和DMF洗滌2幾次，并在DMF中進(jìn)行膨脹。一次性加入2當(dāng)量的酸3，PyBrOP4和4當(dāng)量的DIEA。將混合物振蕩24小時(shí)，抽去液體，將樹脂用DCM和DMF洗滌幾次。將樹脂在含有2當(dāng)量胺的DMF中進(jìn)行膨脹，室溫下振蕩24小時(shí)，抽去液體，將樹脂用DCM和DMF洗滌。將3當(dāng)量的酸，DIC以及DIEA與樹脂在室溫下振蕩過夜。將樹脂抽干液體，并用DCM和DMF洗滌。用5％的TFA的DCM溶液分離出最終產(chǎn)物，采用高效液相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行分析，并在預(yù)先稱重的試管中進(jìn)行蒸發(fā)。
實(shí)施例B4a)中間體8鈉鹽的制備 中間體8鈉鹽將乙醇(6ml)中的中間體3(0.0016mol)和氫氧化鈉(0.0033mol)混合物進(jìn)行攪拌并回流2小時(shí)，然后冷卻至室溫。將沉淀過濾，用乙醇洗滌，干燥，得到0.59g(＞100％)中間體8鈉鹽。
b)中間體9的制備 中間體9在氮?dú)饬飨?，將N’一(乙基碳化亞氨)-N，N’-二甲基-1，3-丙二胺、單鹽酸鹽(0.0021mol)逐步加入到DCM/DMF(10ml)中的中間體8鈉鹽(0.0016mol)、0-(四氫-2H-吡喃-2-基)-羥胺(0.0021mol)和1-羥基-1H-苯并三唑(0.0021mol)的混合物中，將混合物室溫?cái)嚢枰粋€(gè)周末。加入10％的碳酸鉀溶液。將混合物用DCM進(jìn)行萃取。分離有機(jī)層，干燥(硫酸鎂)，過濾，蒸干溶劑。殘留物(0.94克)用kromasil柱層析進(jìn)行純化(洗脫液DCM/甲醇/氫氧化銨97/3/0.1；15-40微米)。收集純餾分，蒸發(fā)溶劑，殘余物(0.45克，65％)用二乙醚提取。將沉淀過濾并干燥，得0.422g(61％)中間體9，熔點(diǎn)為183℃。
c)化合物2的制備
化合物2將0.5毫升的三氟乙酸加入至中間體9(0.0009mol)的甲醇溶液(10毫升)。室溫下攪拌混合物18小時(shí)。過濾沉淀物，用DCM洗滌，干燥。得到0.176克(59％)的化合物2，熔點(diǎn)大于260℃。
實(shí)施例B5中間體10的制備 中間體10將中間體2(0.0019mol)與磺酰胺(0.0021mol)在1，2-二甲氧基-乙烷(5ml)中的混合物攪拌并回流4天。加入水。過濾混合物，干燥，得0.51g(83％)中間體10，熔點(diǎn)為192℃。
如實(shí)施例[B4]所述類似地對中間體10進(jìn)行處理，得0.034g(13％)化合物3，熔點(diǎn)為212℃。
化合物3實(shí)施例B6中間體11的制備 中間體11在氮?dú)饬飨?，將二甲?氨基磺酰氯(0.007mol)的DCM(5ml)溶液于10℃下加入到中間體4(0.0057mol)和TEA(0.0085mol)的DCM(5ml)溶液中。將混合物攪拌過夜，然后倒入到冰水中并用DCM進(jìn)行萃取。分離有機(jī)相，用硫酸鎂進(jìn)行干燥，過濾，并蒸發(fā)溶劑。將殘留物用CH3CN/乙醚進(jìn)行結(jié)晶，濾出沉淀，干燥，得0.492g(24％)中間體11，熔點(diǎn)為142℃。
如實(shí)施例[B4]所述類似地對中間體11進(jìn)行處理，得0.7g(85％)化合物4，熔點(diǎn)為182℃。
化合物4實(shí)施例B7化合物5的制備 化合物5將中間體7(0.0003mol)與乙酸、三氟乙酸(5毫升，甲醇中為5％)的混合物室溫?cái)嚢?0小時(shí)，然后將混合物吹干，得到化合物5。
實(shí)施例B8中間體12的制備 中間體12將乙腈(20ml)中的中間體2(0.0025mol)，2-萘甲酰氯(0.003mol)和碳酸鉀(0.005mol)的混合物攪拌并回流過夜，然后冷卻至室溫，倒出至冰水中，用DCM萃取。分離有機(jī)相，用硫酸鎂進(jìn)行干燥，過濾，并蒸發(fā)溶劑。殘留物從乙醚中結(jié)晶，過濾出沉淀并干燥，得0.97g(100％)中間體12，熔點(diǎn)為140℃。如實(shí)施例[B4]所述類似地對中間體12進(jìn)行處理，得0.338g(86％)化合物6，熔點(diǎn)為130℃。
化合物6表F-1列出了根據(jù)上述實(shí)施例其中之一制備的化合物。在表格中使用了以下縮寫。Co.No.代表化合物號碼，Ex.[Bn°]代表與Bn°實(shí)施例所述相同的方法，C2HF3O2代表三氟乙酸鹽，一些化合物通過熔點(diǎn)進(jìn)行表征(mp.)，其它化合物以質(zhì)譜數(shù)據(jù)[MH+](ms.)進(jìn)行表征。


C.藥理學(xué)實(shí)施例通過組蛋白脫乙?；阁w外抑制實(shí)驗(yàn)(見實(shí)施例C.1)測定式(I)化合物對組蛋白脫乙酰酶活性的抑制作用。
通過細(xì)胞毒性或存活率比色分析測定，確定A2780腫瘤細(xì)胞上式(I)化合物細(xì)胞活性(Mosmann Tim，Journal of ImmunologicalMethods 6555-63，1983)(見實(shí)施例C.2)。
通過含水介質(zhì)中的動(dòng)態(tài)溶解性實(shí)驗(yàn)測定了逐步稀釋時(shí)化合物溶于含水溶液的能力(見實(shí)施例C.3)。
用單一含水緩沖溶劑連續(xù)三次稀釋化合物的DMSO母液。每次稀釋后通過濁度計(jì)測定稀釋后的濁度。
藥物的通透性反映了其從一種介質(zhì)轉(zhuǎn)移到或穿過另外一種介質(zhì)的能力。尤其是指藥物穿過腸膜到血流和/或從血流到靶位的能力。通透性可以通過形成濾膜固定的人工膜性磷脂雙層進(jìn)行測定(實(shí)施例C.4)。在濾膜固定的人工膜性磷脂雙層實(shí)驗(yàn)中，一個(gè)96孔微量滴定板與一個(gè)96孔過濾板形成一個(gè)“三明治”結(jié)構(gòu)，使每個(gè)復(fù)合孔都被分隔為兩個(gè)室，供體溶液處于底部，受體溶液處于頂部，其被一個(gè)125微米的微量過濾盤(濾孔為0.45微米)所分隔，并包被以2％(wt/v)二油?；字Ｄ憠A(dioleoylphosphatidyl-choline)的十二烷溶液。所處條件為，當(dāng)該系統(tǒng)與含水緩沖溶液接觸時(shí)將在過濾通道內(nèi)部形成多片狀雙分子層。化合物穿過該人工膜性系統(tǒng)的通透性以厘米/秒進(jìn)行測定。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱丝疾煸趦蓚€(gè)不同的pH值(4.0和7.4)的條件下，藥物穿過平行人工膜的能力?；衔锿ㄟ^紫外-光譜測定法在250-500nm的最佳波長下進(jìn)行檢測。
藥物代謝是指油溶性生物異源的或生物體內(nèi)生的物質(zhì)通過酶催反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性，水溶性的可排泄的代謝物的過程。藥物代謝的主要器官是肝臟。代謝產(chǎn)物通常比母體藥物活性低或者沒有活性。然而，一些代謝物活性增強(qiáng)或者出現(xiàn)毒性效果。因此藥物代謝可能包括“解毒”和“中毒”的過程。決定機(jī)體對藥物和化學(xué)制劑的應(yīng)付能力的一個(gè)主要酶系統(tǒng)是細(xì)胞色素P450單加氧酶，它是NADPH依賴性酶?；衔锏拇x穩(wěn)定性可以通過使用人體亞細(xì)胞組織進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)而測定(見實(shí)施例C.5)。在這里，化合物的代謝穩(wěn)定性通過化合物與微粒體共溫育15分鐘后代謝的藥物的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評價(jià)。化合物的量通過LC-MS分析進(jìn)行測定。
腫瘤抑制因子P53在應(yīng)答DNA受損時(shí)可以轉(zhuǎn)錄激活多種基因包括WAF1/CIP1基因。在正常細(xì)胞中而非轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的包括細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)了WAF1基因的21Kda產(chǎn)物，該產(chǎn)物表現(xiàn)為通用的CDK活性抑制劑。p21WAF1結(jié)合并抑制CDK的其中一個(gè)結(jié)果是阻斷CDK-依賴性磷酸化以及隨后Rb蛋白的失活，這在細(xì)胞周期過程中是至關(guān)重要的。因此由于細(xì)胞接觸HDAC抑制劑而誘導(dǎo)產(chǎn)生p21WAF1是一個(gè)有效的特異性指示劑，顯示細(xì)胞周期過程在G1和G2監(jiān)測點(diǎn)被阻滯。
化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生p21WAF1的能力可以通過p21WAF1酶聯(lián)免疫吸附測定(癌基因的WAF1 ELISA)進(jìn)行測量。p21WAF1實(shí)驗(yàn)是采用小鼠單克隆抗體以及兔多克隆抗體的“三明治”酶免疫測定。將人WAF1蛋白的特異抗體-兔多克隆抗體固定在試劑盒提供的塑料孔表面上。任何待檢測樣品中的p21WAF1將結(jié)合在俘獲抗體上。生物素化的檢測劑單克隆抗體也可以識(shí)別人p21WAF1蛋白，并能夠與已經(jīng)結(jié)合在俘獲抗體上的任何p21WAF1蛋白結(jié)合。隨后，檢測劑抗體與辣根過氧化物酶結(jié)合的鏈霉抗生物素(streptavidin)進(jìn)行結(jié)合。這個(gè)辣根過氧化物酶催化產(chǎn)色底物四甲聯(lián)苯胺由無色溶液向藍(lán)色溶液轉(zhuǎn)變(或者加入終止劑后轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色溶液)，顏色的強(qiáng)度與樣品中與板結(jié)合的p21WAF1蛋白的量成正比。帶色反應(yīng)產(chǎn)物可以通過分光光度計(jì)進(jìn)行定量。通過已知濃度p21WAF1蛋白(凍干的)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得定量數(shù)據(jù)(見實(shí)施例C1組蛋白脫乙酰酶抑制的體外測定方法將60微克/毫升的HeLa細(xì)胞核提取物(Biomol提供)與2×10-8M的放射性標(biāo)記的肽底物一起溫育。作為測定HDAC活性的底物，使用的是合成的肽即組蛋白H4的14-21氨基酸序列。底物在具有6-氨基己酸間隔區(qū)的氨基端進(jìn)行生物素化，羧基端通過酰胺基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，并且特異性的在16位賴氨酸進(jìn)行[3H]乙酰化。將底物(生物素-(6-氨基己酸)-甘氨酸-丙氨酸-([3H]-乙?；?賴氨酸-精氨酸-組氨酸-精氨酸-賴氨酸-纈氨酸-氨基))加入至含有25mM Hepes，1M蔗糖，0.1mg/ml BSA和0.01％TritonX-100的pH值為7.4的緩沖溶液中。30分鐘后，加入鹽酸和醋酸以終止脫乙?；磻?yīng)(兩者的終濃度分別為0.035mM和3.8mM)。終止反應(yīng)后，通過乙酸乙酯萃取游離態(tài)的3H醋酸鹽?；旌喜㈦x心后，等分量的上層(有機(jī)相)放射性通過β計(jì)數(shù)器測定。
每次實(shí)驗(yàn)需要平行設(shè)定對照組(含有HeLa細(xì)胞核提取物和DMSO，而不含化合物)，空白組(只含有DMSO而不含有HeLa細(xì)胞核提取物或化合物)以及樣品組(含有溶解在DMSO的化合物以及HeLa細(xì)胞核提取物)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，首先測試10-5M濃度時(shí)的化合物。當(dāng)在此濃度化合物顯示出活性時(shí)，制備在10-5-10-12M濃度范圍內(nèi)測試化合物的濃度-反應(yīng)曲線。在每個(gè)測試中，對照組和樣品組數(shù)值需要減去空白組數(shù)值。對照組代表100％的底物脫乙?；τ诿總€(gè)樣品，其放射性用對照組平均值的百分?jǐn)?shù)表示。在合適的情況下，通過對分級數(shù)據(jù)的概率值分析計(jì)算IC50(代謝物的減少量達(dá)到對照組50％所需的藥物濃度)。此后檢測化合物的活性用pIC50(IC50值的負(fù)對數(shù)值)表示。所有檢測的化合物在10-5M濃度時(shí)具有酶活性，21個(gè)化合物的pIC50≥5(見表格F2)實(shí)施例C.2化合物對A2780細(xì)胞的抗增生活性的測定將所有檢測的化合物溶解在DMSO中，然后用培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋。在細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)中DMSO的終濃度不得超過0.1％(v/v)。對照組含有A2780細(xì)胞以及DMSO但是無化合物，空白組含有DMSO但是無細(xì)胞。MTT溶解在磷酸緩沖液中，濃度為5mg/ml。配制甘氨酸緩沖液，其由0.1M甘氨酸和0.1M氯化鈉組成，并用1N的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10.5(所有的試劑均購自Merck)。
人卵巢癌細(xì)胞A2780(Dr.T.C.Hamilton[Fox Chase CancerCentre，Pennsylvania，USA]贈(zèng))的培養(yǎng)基為RPMI 1640培養(yǎng)基并補(bǔ)充以2mM的L-谷氨酸，50ug/ml艮他霉素以及10％的胎牛血清。細(xì)胞按常規(guī)方法在37℃含有5％CO2濕潤空氣中保持單層生長。每星期將細(xì)胞進(jìn)行一次傳代，使用胰蛋白酶/EDTA溶液，分裂比例為1∶40。所有的培養(yǎng)基以及補(bǔ)充物均購自Life Technologies。通過Gen-探針衣原體組織培養(yǎng)試劑盒(BioMérieux提供)測定，細(xì)胞沒有被衣原體污染。
將細(xì)胞接種在NUNCTM96孔培養(yǎng)板上(Life Technologies提供)，過夜使細(xì)胞貼附在板上。用于鋪板的密度為1500細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總體積為200微升。細(xì)胞貼附在板上后，換培養(yǎng)基，加入藥物和/或溶劑至終體積為200微升。溫育4天后，培養(yǎng)基用200微升新鮮培養(yǎng)基更換，以MTT法測定細(xì)胞密度以及存活率。向每孔加入25微升的MTT溶液，將細(xì)胞在37℃進(jìn)一步溫育2小時(shí)。小心吸去培養(yǎng)基，加入25微升的甘氨酸的緩沖液后再加入100微升的DMSO，溶解藍(lán)色的MTT-甲產(chǎn)物。將微測試板在微板振蕩器上振蕩10分鐘，用Emax96孔板分光光度計(jì)(Sopachem提供)在540納米波長下測定吸光度。在實(shí)驗(yàn)中，每種實(shí)驗(yàn)條件下的結(jié)果均為三個(gè)重復(fù)孔的平均值。作為最初的篩選，化合物在10-6M的單個(gè)固定濃度下進(jìn)行測定，對于有活性的化合物重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以得到完整的濃度-反應(yīng)曲線。對于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)，必須平行設(shè)定對照組(不含有藥物)和空白組(不含有細(xì)胞或藥物)。對照組和樣品組數(shù)值需要減去空白組數(shù)值。對于每一個(gè)樣品，細(xì)胞生長的平均值(吸光度單位)可以表示為對照組細(xì)胞生長平均值的百分?jǐn)?shù)。在合適的情況下，通過對分級數(shù)據(jù)的概率值分析(Finey，D.J.，ProbitAnalyses，2ndEd.Chapter 10，Graded Responses，CambridgeUniversity Press，Cambridge 1962)計(jì)算IC50(細(xì)胞生長減少量達(dá)到對照組50％所需的藥物濃度)。以下檢測化合物的活性用pIC50(IC50值的負(fù)對數(shù)值)表示。大部分檢測的化合物在10-6M濃度時(shí)具有細(xì)胞活性，9個(gè)化合物的pIC50≥5(見表格F-2)實(shí)施例C.3水性培養(yǎng)基中的動(dòng)態(tài)溶解性在第一步稀釋過程中，將10μl活性化合物溶解于DMSO的濃縮母液(5mM)加入到100μlpH值為7.4的磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液中，混合均勻。在第二步稀釋過程中，進(jìn)一步將第一步稀釋液的等分量(20μl)分散到100μlpH值為7.4的磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液中，并混合均勻。最后，在第三步稀釋過程中，取20μl第二步樣品，進(jìn)一步稀釋到100μlpH值為7.4的磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液中，混合均勻。所有的稀釋步驟均在96孔板上進(jìn)行操作。最后一步稀釋結(jié)束后，立即用濁度計(jì)測定三個(gè)連續(xù)稀釋步驟的濁度。每個(gè)化合物同時(shí)稀釋三份，以消除偶然誤差。通過濁度測定結(jié)果，進(jìn)行評分并歸入三類。具有高溶解性的化合物為3分，此類化合物在一次稀釋時(shí)為澄清溶液。具有中等溶解性的化合物為2分，此類化合物在第一次稀釋時(shí)渾濁，第二次稀釋后澄清。具有低溶解性的化合物為1分，此類化合物第一次和第二次稀釋后均渾濁。對9個(gè)化合物的溶解度進(jìn)行了測定，其中7個(gè)為3分，2個(gè)為1分(見表F-2)實(shí)施例C.4平行人工膜通透性分析將母液樣品(10μl濃度為5mM的母液溶解于100％的DMSO中的等分量)稀釋至含有2毫升pH值為4或者7.4的含水緩沖系統(tǒng)(PSR4系統(tǒng)溶液濃度(pION))的深孔板或者預(yù)混合板中。
在樣品溶液加入到參比板之前，首先將150微升的緩沖液加入到孔中，測定空白的紫外吸收。然后棄去緩沖液，將該板作為參比板使用。所有的測定均在抗紫外板中進(jìn)行(Costar或Greiner提供)。
在參比板的空白測定后，將150μl稀釋樣品加入到參比板，200μl稀釋液加入到供體板1。受體過濾板1(Millipore提供，型號MAIP N45)包被以4μl人工膜形成性溶液(含0.1％的2，6-二-叔丁基-4-甲基苯酚的1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿的十二烷溶液)，置于供體板的上方形成“三明治”結(jié)構(gòu)。將緩沖液(200μl)分散到上方受體孔中，用蓋子蓋住三明治結(jié)構(gòu)，在暗處室溫儲(chǔ)存18小時(shí)。
向孔中加入150μl緩沖液，然后進(jìn)行受體過濾板2的空白紫外測定。受體濾過板2的空白測定后，棄去緩沖液，將150μl受體溶液從受體過濾板1轉(zhuǎn)移到受體板2中，然后從“三明治”結(jié)構(gòu)中除去受體過濾板1。在對供體板2進(jìn)行空白測定后(如上)，將150μl供體溶液從供體板1中轉(zhuǎn)移到供體板2中。對供體板2，受體板2以及參比板進(jìn)行紫外光譜掃描(使用SpectraMAX 190)。通過PSR4p命令軟件(command software)處理所有的光譜數(shù)據(jù)并計(jì)算化合物的通透性。所有的化合物均重復(fù)測定三次。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用卡馬西平、灰黃霉素、無環(huán)鳥苷、阿替洛爾、速尿和氯噻嗪作為標(biāo)準(zhǔn)，給化合物評分并分為三類低通透性(平均效應(yīng)＜0.5×10-6cm/s，分?jǐn)?shù)為1分)，中等通透性(1×10-6cm/s＞平均效應(yīng)≥0.5×10-6cm/s，分?jǐn)?shù)為2分)或者高通透性(平均效應(yīng)≥0.5×10-6cm/s，分?jǐn)?shù)為3分)。兩個(gè)化合物在測量的一個(gè)pH值下分?jǐn)?shù)為1分。
實(shí)施例C.5代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)根據(jù)Gorrod等的方法(Xenobiotica 5453-462，1975)，將組織機(jī)械勻漿后離心分離，制備亞細(xì)胞組織。以冰冷的0.1M的Tris-HCl緩沖液(pH值為7.4)沖洗肝臟組織以洗去過多的血。將組織吸干，稱重，并用手術(shù)剪將組織粗略剪碎。然后加入三倍體積的冰冷的0.1M的磷酸鹽(Tris-HCl)緩沖液(pH值為7.4)，用配備有Teflon杵的Potter-S(Braun，意大利)或者Sorvall 0mni-Mix勻漿器進(jìn)行勻漿，共7次，每次10秒鐘。在兩種情形中，在整個(gè)勻漿過程中，試管均需要置于冰中。
使用Sorvall離心機(jī)或者Beckman超速離心機(jī)于4℃離心組織勻漿，離心力為9000xg，離心時(shí)間為20分鐘。收集上清液，置于-80℃進(jìn)行保存，命名為“S9”。
使用Beckman超速離心機(jī)于4℃對“S9”進(jìn)行進(jìn)一步離心，離心力為100000xg，離心時(shí)間為60分鐘。小心吸取上清液，等分后命名為“細(xì)胞溶膠”。將沉淀重新懸浮在pH值為7.4的0.1M磷酸鹽緩沖液中，終體積為每0.5克原組織重量1毫升緩沖液，并命名為“微粒體”。
將所有的亞細(xì)胞成分分別等分后，立即至于液氮中冷凍，并在使用前于-80℃保藏。
對于待測樣品，溫育混合物包括0.1M的PBS，5uM的化合物，1mg/ml的微粒體以及NADPH生成系統(tǒng)(0.8mM 6萄糖-6-磷酸，0.8mM的氯化鎂以及0.8單位的萄糖-6-磷酸脫氫酶)。對照樣品包含同樣的材料，但是用熱滅活的微粒體(95℃加熱10分鐘)代替上述微粒體。對照樣品中化合物的回收率始終為100％。
將混合物在37℃預(yù)溫育5分鐘。在0分鐘時(shí)加入0.8mM的NADP，開始反應(yīng)(t＝0)，將樣品溫育15分鐘(t＝15)。加入2倍體積的DMSO以終止反應(yīng)。然后將樣品以900×g離心10分鐘，將上清液在室溫下保存不超過24小時(shí)后進(jìn)行分析。所有的溫育均平行進(jìn)行兩次。對上清液進(jìn)行LC-MS分析。在Xterra MS C18柱上洗脫樣品(50×4.6mm，粒徑為5μm，Waters，美國)。本實(shí)驗(yàn)中使用了Alliance2790HPLC系統(tǒng)(Waters，美國提供)，用緩沖液A、溶液B、C以2.4ml/min的流速進(jìn)行洗脫。緩沖液A25mM醋酸銨的水/乙腈(95/5)溶液(pH5.2)，溶液B為乙腈，溶液C為甲醇。梯度設(shè)定將有機(jī)相濃度從0％-50％溶液B和50％溶液C(5分鐘)，線性增加到100％溶液B(1分鐘)，并使有機(jī)相濃度繼續(xù)保持恒定1.5分鐘。樣品總注射體積為25微升。
裝備Quattro(Micromass，Manchester，英國提供)三重四極質(zhì)譜儀，以及ESI源作為檢測器。離子源以及去溶劑化溫度分別設(shè)定為120和350℃，氮?dú)庾鳛殪F化劑以及干燥氣體，以正掃描模式獲得數(shù)據(jù)(單離子反應(yīng))，錐形電壓設(shè)定為10伏，滯留時(shí)間為1秒鐘。
代謝穩(wěn)定性可以表達(dá)為與活性微粒體共溫育15分鐘后化合物代謝的百分?jǐn)?shù)(E(act))(％代謝＝100％-(15min時(shí)E(act)的總離子流(TIC)/0min時(shí)E(act)的TIC)×100)。代謝低于20％的化合物定義為高代謝穩(wěn)定。代謝在20-70％之間的化合物定義為中等代謝穩(wěn)定，代謝高于70％的化合物定義為低代謝穩(wěn)定。進(jìn)行所用代謝穩(wěn)定性篩選實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須同時(shí)包括3個(gè)參比化合物。維拉帕米用作低代謝穩(wěn)定性的化合物(代謝百分?jǐn)?shù)為73％)，西沙比利用作中等代謝穩(wěn)定性的化合物(代謝百分?jǐn)?shù)為45％)，丙醇用作中等至高代謝穩(wěn)定性的化合物(代謝百分?jǐn)?shù)為25％)。這些參比化合物可以驗(yàn)證代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
對實(shí)驗(yàn)中一個(gè)化合物進(jìn)行了測試，其代謝百分?jǐn)?shù)低于20％。
實(shí)施例C.6p21誘導(dǎo)能力以下實(shí)驗(yàn)方案適用于測定人A2780卵巢癌細(xì)胞中P21蛋白的表達(dá)水平。在96微孔板上接種A2780細(xì)胞(細(xì)胞濃度為20000個(gè)細(xì)胞/180μl)，培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基并補(bǔ)充以2mM的L-谷氨酸、50ug/ml艮他霉素以及10％的胎牛血清。在細(xì)胞消化的24小時(shí)前，加入化合物使終濃度為10-5，10-6，10-7以及10-8M。將所有檢測的化合物溶解在DMSO中，并用培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步稀釋。加入化合物24小時(shí)后，從細(xì)胞移去上清液，用200μl的冰冷PBS洗滌細(xì)胞，吸去孔內(nèi)液體，加入30μl消化緩沖液(含有50mM Tris-HCl(pH 7.6)，150mM氯化鈉，1％Nonidet P40以及10％的甘油)。將培養(yǎng)板于-70℃溫育過夜。
將合適數(shù)目的微量滴定孔從箔袋中移去，置于空的孔固定器中。制備洗滌緩沖液(20倍洗板濃度100毫升20倍濃度濃縮的PBS溶液和表面活性劑，含有2％的氯乙酰胺)的工作液(1倍濃度)。將凍干p21WAF標(biāo)準(zhǔn)液溶解在蒸餾水中，并進(jìn)一步以樣品稀釋液進(jìn)行稀釋(試劑盒中提供)。樣品通過用樣品稀釋液稀釋(1∶4)而進(jìn)行配制。將樣品(100μl)和p21WAF標(biāo)準(zhǔn)品(100μl)注入適當(dāng)?shù)目字?，在室溫下溫?小時(shí)。以1倍的清洗緩沖液將孔洗滌3次，向每孔中加入100μl的檢測抗體試劑(生物素化的p21WAF1單克隆抗體溶液)。在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，以1倍的洗滌緩沖液將孔洗滌3次。將400倍濃度的結(jié)合物(過氧化物酶-鏈霉抗生物素結(jié)合物400倍濃度的濃溶液)稀釋，并向每孔中加入100微升1倍濃度的溶液，室溫下溫育30分鐘，以1倍濃度的洗滌緩沖液將孔洗滌3次，再用蒸餾水洗滌1次。將底物溶液(產(chǎn)色底物)(100μl)加入孔中，將孔室溫下避光培養(yǎng)30分鐘，按照以前底物溶液加入的順序向每個(gè)孔中加入終止液。使用分光光度板閱讀器測定每孔的吸光度，工作波長為雙波長450/595納米。
對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，必須平行設(shè)定對照組(不含有藥物)以及空白組(不含有細(xì)胞或藥物)。對照組和樣品組數(shù)值需要減去空白組數(shù)值。對于每個(gè)樣品，化合物對p21WAF1的誘導(dǎo)作用強(qiáng)度(吸光度單位)可以表示為對照組p21WAF1數(shù)值的百分?jǐn)?shù)。誘導(dǎo)的百分?jǐn)?shù)高于130％為顯著誘導(dǎo)。對三個(gè)化合物進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)測定，其中有兩個(gè)化合物顯示出顯著誘導(dǎo)作用。
表F-2表F2列出了化合物在實(shí)施例C.1、C.2和C.3中的測定結(jié)果。
D.組合物實(shí)施例包膜片劑片劑核心制備將100g式(I)化合物，570g乳糖以及200g淀粉的混合物充分混合，然后用5g十二烷基硫酸鈉和10g聚乙烯-吡咯烷酮的水(200ml)溶液進(jìn)行濕潤。將濕潤的粉末混合物過篩，干燥，再過篩。然后加入100g微晶纖維素和15g氫化植物油。將整個(gè)混合物混合均勻，壓片，得到10000片，每片含有10mg式(I)化合物。
包膜向10g甲基纖維素的變性乙醇(75ml)溶液中加入5g乙基纖維素的二氯甲烷(150ml)溶液。然后加入75ml二氯甲烷和2.5毫升1，2，3-丙三醇。熔解10克聚乙二醇，將其溶解在75ml二氯甲烷中。將后者加入到前者溶液中，然后加入2.5g十八烷酸鎂，5g聚乙烯-吡咯烷酮和30ml毫升濃的顏料懸浮液，將上述混合物混勻，將片劑核心在包膜設(shè)備中用所得混合物進(jìn)行包膜。
權(quán)利要求
1.一種式(I)化合物， 其N-氧化物形式、藥學(xué)上可接受的加成鹽及其立體化學(xué)異構(gòu)體形式，其中n為0、1、2或3，且當(dāng)n為0時(shí)，為直接的鍵；每個(gè)Q為氮或者 每個(gè)X為氮或者 每個(gè)Y為氮或者 每個(gè)Z為氮或者 R1為C(O)NR5R6、-N(H)C(O)R7、-C(O)-C1-6鏈烷二基SR7、-NR8C(O)N(OH)R7、-NR8C(O)C1-6鏈烷二基SR7、-NR8C(O)C＝N(OH)R7或者另一個(gè)Zn-螯合基團(tuán)，其中R5和R6各自獨(dú)立地選自氫、羥基、C1-6烷基、羥基C1-6烷基、氨基C1-6烷基或氨基芳基；R7獨(dú)立地選自氫、C1-6烷基、C1-6烷基羰基、芳基C1-6烷基、C1-6烷基吡嗪基、吡啶環(huán)酮、吡咯烷環(huán)酮或甲基咪唑基；R8獨(dú)立地選自氫或C1-6烷基；R2為氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、二(C1-6烷基)氨基、羥基氨基或者萘磺?；拎夯籖3為氫、C1-6烷基、芳基C2-6烯二基、呋喃羰基、萘基羰基、-C(O)苯基R9、C1-6烷基氨基羰基、氨基磺?；?、芳基氨基磺?；?、氨基磺酰基氨基、二(C1-6烷基)氨基磺?；被?、芳基氨基磺?；被?、氨基磺?；被鵆1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基磺?；被鵆1-6烷基、芳基氨基磺?；被鵆1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-12烷基磺酰基、二(C1-6烷基)氨基磺?；?、三鹵C1-6烷基磺?；⒍?芳基)C1-6烷基羰基、苯硫基C1-6烷基羰基、吡啶基羰基或者芳基C1-6烷基羰基，其中各個(gè)R9獨(dú)立地選自苯基；被一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)獨(dú)立地選自鹵素、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羥基C1-4烷基、羥基C1-4烷氧基、氨基C1-4烷氧基、二(C1-4烷基)氨基C1-4烷氧基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、羥基C1-4烷基哌嗪基C1-4烷基、C1-4烷氧基哌啶基C1-4烷基、羥基C1-4烷氧基C1-4烷基哌嗪基、C1-4烷基哌嗪基C1-4烷基、二(羥基C1-4烷基)氨基C1-4烷基、吡咯烷基C1-4烷氧基、嗎啉基C1-4烷氧基、或者嗎啉基C1-4烷基的取代基取代的苯基；苯硫基；或者被二(C1-4烷基)氨基C1-4烷氧基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、吡咯烷基C1-4烷氧基、C1-4烷基哌嗪基C1-4烷基、二(羥基C1-4烷基)氨基C1-4烷基或嗎啉基C1-4烷氧基取代的苯硫基；R4為氫、羥基、氨基、羥基C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、芳基C1-6烷基、氨基羰基、羥基羰基、氨基C1-6烷基、氨基羰基C1-6烷基、羥基羰基C1-6烷基、羥基氨基羰基、C1-6烷氧基羰基、C1-6烷基氨基C1-6烷基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；當(dāng)R3和R4在同一個(gè)碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成下式的二價(jià)基團(tuán)-C(O)-NH-CH2-NR10- (a-1)其中R10為氫或芳基；當(dāng)R3和R4在相鄰的碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成下式的二價(jià)基團(tuán)＝CH-CH＝CH-CH＝(b-1)；以上的芳基為苯基，或者被一個(gè)或者多個(gè)各自獨(dú)立地選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、氰基或羥基羰基的取代基取代的苯基。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1為C(O)NR5R6、-C(O)-C1-6鏈烷二基SR7、-NR8C(O)N(OH)R7、-NR8C(O)C1-6鏈烷二基SR7、-NR8C(O)C＝N(OH)R7或者另一個(gè)Zn-螯合基團(tuán)，其中R5和R6各自獨(dú)立地選自氫、羥基、羥基C1-6烷基或氨基C1-6烷基；R2為氫、鹵素、羥基、氨基、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基或二(C1-6烷基)氨基；R3為氫、C1-6烷基、芳基C2-6烯二基、呋喃羰基、萘基羰基、-C(O)苯基R9、C1-6烷基氨基羰基、氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、氨基磺?；被⒍?C1-6烷基)氨基磺?；被?、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-12烷基磺?；?、二(C1-6烷基)氨基磺?；蛘哌拎せ驶?，其中各個(gè)R9獨(dú)立地選自苯基；被一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)獨(dú)立地選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基的取代基取代的苯基；或苯硫基；和R4為氫、羥基、氨基、羥基C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、芳基C1-6烷基、氨基羰基、氨基C1-6烷基、C1-6烷基氨基C1-6烷基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基。
3.權(quán)利要求1所述的化合物，其中n為0或1；每個(gè)Q為 R1為-C(O)NH(OH)或-NHC(O)C1-6鏈烷二基SH；R2為氫或硝基；R3為C1-6烷基、芳基C2-6烯二基、呋喃羰基、萘基羰基、C1-6烷基氨基羰基、氨基磺?；⒍?C1-6烷基)氨基磺?；被鵆1-6烷基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-12烷基磺?；⒍?C1-6烷基)氨基磺?；?、三鹵代C1-6烷基磺酰基、二(芳基)C1-6烷基羰基、苯硫基C1-6烷基羰基、吡啶基羰基或者芳基C1-6烷基羰基；R4為氫；當(dāng)R3和R4在同一個(gè)碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成式(a-1)的二價(jià)基團(tuán)，其中R10為芳基；或當(dāng)R3和R4在相鄰的碳原子上時(shí)，R3和R4一起可以形成式(b-1)的二價(jià)基團(tuán)。
4.權(quán)利要求1和3所述的化合物，其中n為1；每個(gè)Q為 每個(gè)Z為氮；R1為-C(O)NH(OH)；R2為氫；R3為萘基羰基、C1-12烷基磺?；蚨?芳基)C1-6烷基羰基；和R4為氫。
5.權(quán)利要求1、3和4所述化合物，該化合物選自18號、5號和24號化合物
6.一種藥物組合物，其包括藥學(xué)上可接受的載體和作為活性成分的治療有效量的權(quán)利要求1至5所述的化合物。
7.一種制備權(quán)利要求6的藥物組合物的方法，其中將該藥學(xué)上可接受的載體與權(quán)利要求1至5所述的化合物進(jìn)行均質(zhì)混合。
8.權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述的化合物，該化合物用作藥物。
9.權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述化合物的應(yīng)用，該化合物用于制備治療增生疾病的藥物。
10.一種制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，其特征在于將式(II)中間體與合適的酸例如三氟乙酸進(jìn)行反應(yīng)，得到式(I-a)異羥肟酸，其中R1為-C(O)NH(OH)，
11.一種檢測或鑒定生物樣品中HDAC的方法，其包括檢測或測定權(quán)利要求1所定義的標(biāo)記化合物與HDAC之間的絡(luò)合物的形成。
12.一種抗癌藥劑與權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)的HDAC抑制劑的組合物。
全文摘要
本發(fā)明包括式(I)的新化合物，其中n、R
文檔編號A61K31/497GK1642551SQ03805833
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月13日
發(fā)明者K·范埃梅倫, M·G·C·費(fèi)爾東克, S·F·A·范布蘭德特, P·R·安日博, L·梅爾佩爾, A·B·戴亞特金 申請人:詹森藥業(yè)有限公司