本發(fā)明屬于光學(xué)顯微測(cè)量、成像技術(shù)，特別是一種基于半環(huán)狀led照明的差分相襯顯微成像方法。

背景技術(shù)：

在生物醫(yī)學(xué)顯微成像領(lǐng)域，大部分活細(xì)胞和未染色的生物標(biāo)本都是無色透明的，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)各部份細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，當(dāng)光波通過時(shí)，波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化，但這種相位差人眼無法觀察。這就需要通過一些化學(xué)或者生物手段來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，從而使其在顯微鏡下可見。由于生物細(xì)胞內(nèi)部不同物質(zhì)對(duì)有色染料吸收的吸收率不同，故最終在顯微鏡下就可以看見生物細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和表現(xiàn)出不同的生物特性(龔志錦,詹熔洲.病理組織制片和染色技術(shù)[m].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1994)。但由于這種染色手段會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織的正常生理活動(dòng)造成影響，更有可能會(huì)殺死細(xì)胞。其中熒光標(biāo)記成像可以提高顯微成像的分辨率，但是同樣由于熒光蛋白劑進(jìn)入細(xì)胞之后會(huì)給細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)帶來影響，不利于細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間觀察(sarderp,nehoraia.deconvolutionmethodsfor3-dfluorescencemicroscopyimages[j].ieeesignalprocessingmagazine,2006,23(3):32-45)。

無標(biāo)記成像對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的活細(xì)胞觀察是一種有效的成像方式，其中最常見的成像模式是相差顯微成像與差分相襯顯微成像。1935年荷蘭科學(xué)家zernike利用相差顯微成像技術(shù)發(fā)明了相差顯微鏡，并將其用于觀察未染色標(biāo)本。相差顯微鏡利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?光強(qiáng)度)的差別，經(jīng)過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實(shí)現(xiàn)觀測(cè)。該顯微鏡主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片，有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ(波長(zhǎng))，如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)未染色細(xì)胞和生物組織的相位進(jìn)行觀察。

而差分相襯成像也是一種常見的顯微成像方法，類似于微分干涉顯微成像的成像效果。該成像方法利用非對(duì)稱照明，并采集每種非對(duì)稱照明圖案下對(duì)應(yīng)的多幅強(qiáng)度圖像，并計(jì)算得到差分相襯圖像。最終可使樣品的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，通常是一側(cè)亮，而另一側(cè)暗，類似大理石上的浮雕，這樣便人為地造成了待測(cè)樣品的三維立體感。2015年，田磊等人詳細(xì)的從理論上推導(dǎo)和解釋了基于led陣列的差分相襯顯微成像系統(tǒng)中的傳遞函數(shù)(tianl,wallerl.quantitativedifferentialphasecontrastimaginginanledarraymicroscope[j].opticsexpress,2015,23(9):11394-11403)，并且分析了在科勒照明(illumination)中圓形照明孔徑在不同的相干系數(shù)下差分相襯成像的傳遞函數(shù)響應(yīng)等問題，其中相干系數(shù)的定義為照明數(shù)值孔徑與物鏡數(shù)值孔徑之比，σ＝naill/naobj；當(dāng)σ≈0時(shí)成像系統(tǒng)為相干照明系統(tǒng)如圖1(a)所示，而當(dāng)σ≤1時(shí)成像系統(tǒng)為部分相干照明系統(tǒng)如圖1(b)所示。雖然該方法能夠?qū)崿F(xiàn)基于led陣列的差分相襯成像，但是基于傳統(tǒng)半圓形照明孔徑對(duì)差分相襯圖像中相位低頻成分的成像效果依舊有待提升，也為后續(xù)從差分相襯圖像中恢復(fù)相位帶來了困難。所以如何在保證差分相襯成像效果的前提下對(duì)圖像中相位的低頻進(jìn)行提升成為差分相襯成像技術(shù)對(duì)無標(biāo)記樣品觀察中的一個(gè)技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于半環(huán)狀led照明的差分相襯顯微成像方法，在保證差分相襯成像分辨率為兩倍物鏡成像分辨率的前提下，對(duì)相襯圖像中相位的低頻成分進(jìn)行提升；使最終的相襯圖像的凹凸感更強(qiáng)，提高了定量相位成像質(zhì)量和重構(gòu)結(jié)果，并且可高度兼容傳統(tǒng)顯微鏡結(jié)構(gòu)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為：一種基于半環(huán)狀led照明的差分相襯顯微成像方法，步驟如下：

步驟一，對(duì)部分相干成像系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)進(jìn)行推導(dǎo)，利用弱物體近似，推導(dǎo)在部分相干照明成像系統(tǒng)中弱物體的光學(xué)傳遞函數(shù)表達(dá)式；

步驟二，計(jì)算半環(huán)狀led照明的差分相襯成像的相位傳遞函數(shù)，當(dāng)照明模式由圓形部分相干照明圖案退化為單個(gè)傾斜相干點(diǎn)光源，得到相干傾斜照明成像系統(tǒng)的相位傳遞函數(shù)，此時(shí)相干點(diǎn)光源分別內(nèi)切在物鏡光瞳的邊緣，再由傾斜相干點(diǎn)光源擴(kuò)展到半環(huán)狀離散相干點(diǎn)光源，即可推導(dǎo)出半環(huán)狀led照明模式下的相位傳遞函數(shù)；再利用差分相襯成像計(jì)算公式得到半環(huán)狀照明下差分相襯成像的相位傳遞函數(shù)；

步驟三，在led陣列上依次顯示兩個(gè)不同方向上的環(huán)狀照明圖案，并且產(chǎn)生同步觸發(fā)信號(hào)至相機(jī)，使相機(jī)采集對(duì)應(yīng)方向上半環(huán)狀圖案下的強(qiáng)度圖像；

步驟四，改變顯示的環(huán)狀照明圖案方向，并采集一系列強(qiáng)度圖像，即依次顯示左右、上下、左下右上及左上右下四個(gè)方向上的半環(huán)狀led照明圖案，并且依次產(chǎn)生同步觸發(fā)信號(hào)至相機(jī)，在不同方向上的環(huán)狀照明圖案對(duì)應(yīng)的觸發(fā)信號(hào)下，相機(jī)采集一系列強(qiáng)度圖像i1,i2,i3,i4...；

步驟五，由差分相襯成像計(jì)算公式即可計(jì)算出在不同方向下的差分相襯圖像和從而實(shí)現(xiàn)在上下左右及各個(gè)不同方向上實(shí)現(xiàn)差分相襯成像。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)：(1)離散半環(huán)狀照明僅需更少的led單元個(gè)數(shù)即可實(shí)現(xiàn)差分相襯相位成像，甚至可以不需要一整塊led陣列作為差分相襯成像的照明光源，既保證了成像質(zhì)量又降低了整個(gè)裝置的成本。(2)將半環(huán)狀照明引入顯微成像系統(tǒng)中，并且在成像系統(tǒng)中加入了聚光鏡，不僅提升了系統(tǒng)的光能利用率，而且使系統(tǒng)照明數(shù)值孔徑達(dá)0.95以上。(3)在整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)已經(jīng)確定和保證成像分辨率的前提下，可對(duì)差分相襯圖像中相位的低頻進(jìn)行提升，使差分相襯圖像的凹凸感更強(qiáng)，增強(qiáng)了圖像的成像質(zhì)量。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1是相干照明、部分相干照明、半圓形照明和離散半環(huán)狀照明成像系統(tǒng)的光源圖案示意圖。

圖2是基于半環(huán)狀led照明的差分相襯顯微成像的顯微鏡光路示意圖。

圖3為本發(fā)明基于半環(huán)狀led照明的差分相襯顯微成像方法的流程圖。

圖4為采用led照明的離散環(huán)狀照明和連續(xù)照明環(huán)狀差分相襯顯微成像相位傳遞函數(shù)的對(duì)比結(jié)果示意圖。

圖5為上下、左右、左上右下及左下右上方向上的半環(huán)狀照明圖案。

具體實(shí)施方式

如圖2所示，本發(fā)明是基于半環(huán)狀led照明的差分相襯顯微成像系統(tǒng)，該成像系統(tǒng)的實(shí)際硬件平臺(tái)包括led陣列、載物臺(tái)、聚光鏡、待測(cè)樣品、顯微物鏡、成像筒鏡、相機(jī)，本系統(tǒng)采用了環(huán)狀照明圖案并在光路中加入了聚光鏡。其中l(wèi)ed陣列放置在聚光鏡的前焦面位置，并且led陣列的中心處于顯微物鏡的光軸上，顯微物鏡的后焦面與成像筒鏡的前焦面重合，相機(jī)的成像平面放置在成像筒鏡的后焦面位置；成像時(shí)載物臺(tái)上的待測(cè)樣品調(diào)節(jié)到顯微物鏡的前焦面位置，構(gòu)成無窮遠(yuǎn)校正成像系統(tǒng)。半環(huán)狀照明圖案顯示在所述led陣列上，每個(gè)被點(diǎn)亮的led單元發(fā)出的光經(jīng)過聚光鏡匯聚變成部分相干光線照射在待測(cè)樣品上，該待測(cè)樣品被放置在載物臺(tái)上，光線透過待測(cè)樣品，經(jīng)過成像筒鏡匯聚后照射相機(jī)的成像平面，改變半環(huán)狀照明圖案的方向，產(chǎn)生同步觸發(fā)信號(hào)到相機(jī)并且采集一系列強(qiáng)度圖像。

為了滿足成像方法所需的最小頻域采樣率，所述的顯微物鏡數(shù)值孔徑為naobj，半環(huán)狀照明圖案上每個(gè)被點(diǎn)亮的led單元到led陣列中心的距離為l，且滿足其中f為聚光鏡的焦距，一般在10-20mm之間。顯微物鏡放大率為mag，相機(jī)像元尺寸為δxcam，照明光線的波長(zhǎng)為λ，且滿足本發(fā)明中為了滿足不同數(shù)值孔徑的顯微物鏡的需求，半環(huán)狀照明圖案半徑大小可通過重新編程的方法來改變大小，即滿足條件此時(shí)照明半環(huán)半徑大小始終與物鏡數(shù)值孔徑相匹配，如圖1(d)所示。

led陣列中包括若干個(gè)(至少261個(gè))led單元，它們等間隔排布形成一個(gè)二維陣列。其中每個(gè)led單元均為紅綠藍(lán)三色led單元，其典型波長(zhǎng)為紅光633nm、綠光525nm和藍(lán)光465nm。每個(gè)led單元之間中心間距d典型值1-4mm。led陣列并不需要進(jìn)行單獨(dú)加工，一般在市場(chǎng)上可直接購(gòu)置。表1給出了一個(gè)市面上可購(gòu)置的led陣列的產(chǎn)品參數(shù)。在此led陣列中，led單元共有32行、32列，一共1024個(gè)，每個(gè)led單元的亮度在2000cd/m2以上。

表1led陣列的物理參數(shù)

led陣列中每個(gè)led單元均可通過單獨(dú)點(diǎn)亮，點(diǎn)亮led單元的具體方法為現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)電路可以采用(但不限于)單片機(jī)、arm、或者可編程邏輯器件等現(xiàn)有技術(shù)即可實(shí)現(xiàn)，具體實(shí)現(xiàn)方法可參考相關(guān)文獻(xiàn)(如郭寶增,鄧淳苗：基于fpga的led顯示屏控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)[j].液晶與顯示,2010,25(3):424-428)。

結(jié)合圖3，本發(fā)明利用上述裝置實(shí)現(xiàn)的差分相襯成像方法包括以下五個(gè)步驟：

步驟一，對(duì)部分相干照明系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)進(jìn)行推導(dǎo)。在照明光源與顯微物鏡的光瞳函數(shù)是關(guān)于光軸對(duì)稱情況下，利用弱物體近似，推導(dǎo)在部分相干照明成像系統(tǒng)中弱物體的光學(xué)傳遞函數(shù)表達(dá)式。

具體實(shí)施過程為：在基于半環(huán)狀led照明的差分相襯成像裝置構(gòu)成的無窮遠(yuǎn)校正成像系統(tǒng)中，對(duì)于非相干照明來說相機(jī)所處的成像平面上所采集的強(qiáng)度圖像為

其中，r為空域中的二維變量，h(r)為成像系統(tǒng)的振幅點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，t(r)為物體的復(fù)振幅，iu(r)表示在光源面上所有點(diǎn)光源產(chǎn)生的強(qiáng)度的疊加。其中t(r)＝a(r)exp[iφ(r)]，a(r)為物體的吸收，φ(r)則為物體的相位。而對(duì)于相干成像系統(tǒng)來說光強(qiáng)圖像則可表示為

對(duì)于一個(gè)部分相干成像系統(tǒng)來說，通過引入弱物體近似，在相機(jī)的成像平面所采集的光強(qiáng)的傅里葉變換與成像系統(tǒng)之間的數(shù)學(xué)關(guān)系可表示為

其中表示傅里葉變換，u表示在頻域極坐標(biāo)系中的二維變量，δ表示單位沖激函數(shù)。上式中的第一項(xiàng)表示背景光強(qiáng)，即透射光線總能量，其達(dá)表示為：

b＝∫∫s(u')|p(u')|²du'

其中，s(u)為在聚光鏡的前焦面上的光源分布，p(u)為顯微物鏡的光瞳函數(shù)，其絕對(duì)值可表達(dá)為

其中ρp為顯微物鏡光瞳的歸一化截止頻率。而后面兩項(xiàng)分別表示系統(tǒng)的吸收分量和相位分量，其中ha(u)和a(u)分別表示系統(tǒng)的振幅傳遞函數(shù)和物體振幅的傅里葉變換，hp(u)和φ(u)表示系統(tǒng)的相位傳遞函數(shù)和物體相位的傅里葉變換。對(duì)樣品吸收成分的頻率響應(yīng)可以用振幅傳遞函數(shù)表示為：

ha(u)＝-[∫∫s(u')p^*(u')p(u'+u)du'+∫∫s(u')p^*(u')p(u'-u)du']

而對(duì)相位成分的頻率響應(yīng)則可表達(dá)為相位傳遞函數(shù)：

hp(u)＝i[∫∫s(u')p^*(u')p(u'+u)du'-∫∫s(u')p^*(u')p(u'-u)du']

以上公式即為引入弱物體近似后的成像系統(tǒng)振幅與相位的傳遞函數(shù)，上述u'為頻域中臨時(shí)積分變量。

步驟二，計(jì)算半環(huán)狀led照明的差分相襯成像的相位傳遞函數(shù)。當(dāng)照明模式由圓形部分相干照明圖案退化為單個(gè)傾斜相干點(diǎn)光源，可得到相干傾斜照明成像系統(tǒng)的相位傳遞函數(shù)，此時(shí)相干點(diǎn)光源分別內(nèi)切在物鏡光瞳的邊緣。再由傾斜相干點(diǎn)光源擴(kuò)展到半環(huán)狀離散相干點(diǎn)光源，即可推導(dǎo)出半環(huán)狀led照明模式下的相位傳遞函數(shù)；再利用差分相襯成像計(jì)算公式可得到半環(huán)狀照明下差分相襯成像的相位傳遞函數(shù)。

具體實(shí)施過程為：如果光源分布s(u)為非軸對(duì)稱函數(shù)，在led陣列所處的光源面引入一個(gè)傾斜相干點(diǎn)光源，其光源分布s(u)為

s(u)＝δ(u-ρs)

其中δ表示單位沖激函數(shù)，ρs為點(diǎn)光源到光源中心的頻率歸一化距離。將s(u)代入相位傳遞函數(shù)中，即可得到在在聚焦位置處對(duì)非對(duì)稱點(diǎn)光源的相位傳遞函數(shù)為：

hp(u)＝p(u+ρs)-p(u-ρs)

此時(shí)傾斜相干點(diǎn)光源是內(nèi)切于顯微物鏡光瞳，故有|ρs|＝|ρp|，其中ρp為物鏡光瞳空間截止歸一化頻率。利用相干模式分解理論，半環(huán)狀led照明圖案可被分解為許多傾斜干點(diǎn)光源，其光學(xué)傳遞函數(shù)可以被當(dāng)成是每一個(gè)傾斜相干點(diǎn)光源的非相干疊加。最終顯示在led陣列上的半環(huán)狀光源s(u)表示為：

其中n為被點(diǎn)亮的led數(shù)量，且半環(huán)狀照明圖案上的每個(gè)點(diǎn)光源的空間頻率等于物鏡光瞳的空間頻率，即|ρs|＝|ρp|。最終可以推導(dǎo)出半環(huán)狀led照明模式下的相位傳遞函數(shù)：

通過計(jì)算不同方向的光源分布s(u)下的強(qiáng)度，并且利用差分相襯成像計(jì)算公式：

其中i1和i2分別表示兩個(gè)半徑相同方向相反的半環(huán)狀光源所采集的光強(qiáng)。最終可以消去強(qiáng)度圖像中的吸收項(xiàng)，即ha(u)＝0，得到基于半環(huán)狀led照明的差分相襯成像的相位傳遞函數(shù)為：

為了滿足成像方法所需的最小頻域采樣率，所采用的顯微物鏡數(shù)值孔徑為naobj，其放大倍率為mag，相機(jī)像元尺寸為δxcam，這幾者之間滿足當(dāng)使用不同數(shù)控孔徑的顯微物鏡時(shí)，通過對(duì)led陣列重新編程改變環(huán)狀照明圖案使其重新內(nèi)切與顯微物鏡光瞳，滿足條件此時(shí)照明半環(huán)半徑大小始終與物鏡數(shù)值孔徑相匹配，即可實(shí)現(xiàn)適用于不同數(shù)值孔徑的顯微物鏡的半環(huán)狀可編程照明。

如圖4所示，通過推導(dǎo)半環(huán)狀led照明與傳統(tǒng)的半圓形照明的差分相襯成像的二維相位傳遞函數(shù)，選取一組低頻與高頻剖線進(jìn)行對(duì)比，其中圖4中只推導(dǎo)了在上下兩個(gè)方向上的相位傳遞函數(shù)。低頻歸一化頻率值選取0.12naobj，高頻歸一化頻率值選取1.7naobj，這兩組照明方式的相干系數(shù)均為0.99，所以基于這兩種照明方式的成像系統(tǒng)相位傳遞函數(shù)的最大截止頻率均能拓展到2倍物鏡數(shù)值孔徑分辨率。盡管離散半環(huán)狀的相位傳遞函數(shù)為階躍狀，但其在低頻處的頻率響應(yīng)明顯大于半圓形照明方式，如圖4中階躍狀點(diǎn)畫線所示。在高頻處兩種照明方式的頻率響應(yīng)是比較接近的，所以由對(duì)比結(jié)果可以看出基于半環(huán)狀led照明的差分相襯成像系統(tǒng)的相位傳遞函數(shù)不僅可以保證成像分辨率可拓展至2倍物鏡數(shù)值孔徑分辨率，還可以提升差分相襯成像中的低頻響應(yīng)，使最終的差分相襯圖像使最終的相襯圖像的凹凸感更強(qiáng)，成像效果更明顯。

步驟三，顯示離散半環(huán)狀照明圖像，并采集強(qiáng)度圖像。

具體實(shí)施過程為：在led陣列上依次顯示兩個(gè)不同方向上的環(huán)狀照明圖案，并且產(chǎn)生同步觸發(fā)信號(hào)至相機(jī)，使相機(jī)采集對(duì)應(yīng)方向上半環(huán)狀圖案下的強(qiáng)度圖像。

步驟四，改變顯示的環(huán)狀照明圖案方向，并采集一系列強(qiáng)度圖像。

具體實(shí)施過程為：依次顯示左右、上下、左下右上及左上右下四個(gè)方向上的半環(huán)狀led照明圖案，如圖5所示，并且依次產(chǎn)生同步觸發(fā)信號(hào)至相機(jī)。在不同方向上的環(huán)狀照明圖案對(duì)應(yīng)的觸發(fā)信號(hào)下，相機(jī)采集一系列強(qiáng)度圖像i1,i2,i3,i4...；

步驟五，由差分相襯成像計(jì)算公式即可計(jì)算出在不同方向下的差分相襯圖像和從而實(shí)現(xiàn)在上下左右及各個(gè)不同方向上實(shí)現(xiàn)差分相襯成像。

最終通過對(duì)比本發(fā)明所提出的基于半環(huán)狀led照明模式與連續(xù)半環(huán)狀照明模式和傳統(tǒng)的半圓形照明圖案的相位傳遞函數(shù)的二維與一維數(shù)據(jù)，可以看出本發(fā)明所提出的差分相襯成像方法的相位傳遞函數(shù)在高頻處的響應(yīng)與連續(xù)半環(huán)狀情況是接近的，且比半圓狀的響應(yīng)要高。在低頻處的相位傳遞函數(shù)響應(yīng)遠(yuǎn)比傳統(tǒng)的半圓形差分相襯照明的響應(yīng)大，說明了基于半環(huán)狀led照明的差分相襯相位成像方法不僅保證了成像分辨率，而且在低頻和高頻的響應(yīng)對(duì)比傳統(tǒng)的差分相襯成像方法均有所提高。本發(fā)明不僅減少了所使用的led單元個(gè)數(shù)，降低照明光源的成本，還增強(qiáng)了差分相襯圖像中的低頻成分，提升了成像質(zhì)量。