專利名稱：用于解吸電噴霧離子化的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
一般地本發(fā)明涉及離子化樣品材料中分析物的領域，更加具體地，涉及在大氣壓力下在環(huán)境或控制條件下離子化樣品材料中的分析物、通過化學分析識別被離子化的分析物和，如果需要，成像(imaging)被離子化的分析物的來源。
背景技術：
解吸離子化技術的發(fā)展可能提供了脆弱(fragile)非揮發(fā)化合物例如肽或碳水化合物的質譜分析中的第一次突破。等離子體解吸，作為第一類解吸離子化方法中的一種，由Macfarlane在二十世紀七十年代中期實現，并且被成功地用于精細的(delicate)生物化學物質例如毒素的離子化中。在等離子體解吸之后，出現了很多甚至更加成功的解吸離子化方法，包括二次離子質譜(SIMS)、液體二次離子質譜(LSIMS)、快速離子或原子轟擊離子化(FAB)和各種激光解吸技術?；|輔助激光解吸離子化(MALDI)，是激光解吸技術中的一種，和電噴霧離子化一起通過使實際上任何種類的生物化學物質分析變得可行而使生物分析質譜發(fā)生了徹底變化。MALDI仍舊是最廣泛使用的離子化方法之一，并且無疑是最廣泛使用的解吸離子化技術。
除了非揮發(fā)物質的分析以外，表面刻畫(surface profiling)也已變成解吸離子化方法的重要發(fā)展方向。目前，飛行時間二次離子質譜(TOF-SIMS)是表面科學中最通用的工具之一；現代的系統(tǒng)提供亞微米分辨率成像能力。雖然TOF-SIMS系統(tǒng)最初是優(yōu)化用于元素分析，然而自此開始它們也被優(yōu)化用于有機分析。最近已經使用MALDI實施分子成像，作為能夠提供關于在特別制備的組織中肽、蛋白質和其它生物分子的空間分布信息的軟離子化表面分析工具。
一般而言，在過去已經通過樣品的粒子或光子轟擊實現了解吸離子化(DI)，并且通過不同方法得到的質譜在一定程度上是類似的，雖然它們的實驗參數不同。等離子體解吸利用252Cf核素的高能(MeV范圍)裂變碎片。FAB實驗通常通過使用高能Xe原子束進行。SIMS或LSIMS方法通常使用10-35keV Cs+離子用于表面轟擊，雖然理論上可以使用任何種類的離子(包括多原子有機物質例如C60)。大簇沖擊(massivecluster impact)(MCI)離子化，是SIMS的一種極度柔和類型，使用高能、多電荷甘油簇離子作為能量原射線束。與其它SIMS方法不同，MCI可以得到豐富的多電荷離子，并且譜特征與其它解吸離子化方法相比更加類似于電噴霧的譜特征。也已經描述了一種低能類型的離子濺射實驗-化學濺射?；瘜W濺射是非常有效的實驗，其使用低能離子通過電子遷移或化學反應事件在表面釋放吸附的分子。激光解吸方法通常使用UV激光(例如N2激光)，但是最近IR激光，特別是-OH共振Er:YAG激光(λ＝2.94μm)得到廣泛應用。
為了增強已知解吸和離子化技術的離子化效率或者僅僅是為了使得某些物質的離子化變得可行，可以將樣品沉積到合適基質中的表面上。FAB和LSIMS需要樣品溶解在粘性的、高極性的非揮發(fā)液體例如硝基芐醇或甘油中。對于MALDI應用，樣品與基質化合物共結晶。(理論上單個的分析物分子被構建到基質化合物的晶格中。)MALDI基質在所用激光的波長吸收強烈，并且易于發(fā)生光化學分解，這通常涉及產生氣態(tài)小分子。
最近發(fā)現，某些表面例如活性炭或電化學蝕刻的硅可以直接用作激光解吸離子化(LDI)基底，因為這些表面本身(或它們上面的被吸附物)強烈地增強附著到它們上面的分子的LDI。這些LDI譜類似于MALDI譜，除了前者的情況缺少強基質峰和與常規(guī)MALDI相比對具有稍微更低分離子化合物的限制之外。
電噴霧質譜作為DI的備選方法發(fā)展起來，用于存在于溶液相中的非揮發(fā)、高極性化合物包括生物來源大分子的分析。電噴霧離子化(ESI)或者從溶液將早已存在的離子轉移到氣相中，或者在本體溶液(bulksolution)被精細地分散成高度帶電的液滴期間進行離子化。最終的氣體離子形成從這些多電荷液滴通過直接離子蒸發(fā)(低分子量離子的情況)或通過從液滴完全蒸發(fā)溶劑(大分子離子的情況)來進行。與其它DI方法相比ESI的一個主要優(yōu)點是ESI可以容易地與分離方法例如液相色譜或毛細管電泳聯用。另一個優(yōu)點是它比其它任何DI方法顯著柔和。ESI避免了需要干燥樣品或需要將樣品材料與基質共結晶。ESI更進一步的一個有利特征是從大分子樣品制造多電荷物種。這種現象使得大分子質譜可以使用實際上任何類型的質量分析器，包括四極濾質儀、四極離子捕集器、ICR和扇形磁場儀器。這種多電荷現象也具有缺點，特別是在分析混合物的時候，因為一種分析物的信號被分成多電荷狀態(tài)，這可能使圖譜解析變得復雜。與MALDI相比ESI最嚴重的缺點是該方法自動化的有限成功。雖然對于一個樣品平均的MALDI分析時間可能少于1秒，但對于ESI，對于單源系統(tǒng)，由于實施中的問題，每個分析可能實現的最短時間是20-40秒。
雖然最近在質譜分析材料離子化方面有所進展，但是在這些技術更加廣泛的商業(yè)使用之路中仍然有一些問題沒有克服。例如，需要可以在一定環(huán)境中而不是在SIMS需要類型的真空中使用的低能解吸離子化方法。這樣的解吸離子化方法如果在大氣壓力和在環(huán)境(未加控制)條件下以及在更加受控的環(huán)境例如實驗室或生產設備的那些環(huán)境中能夠發(fā)揮作用，那么其將會滿足這種需要。還要求這樣的方法對樣品基本沒有破壞，快速提供準確的結果，能夠從多種表面來離子化和解吸樣品和避免需要用例如基質材料預處理樣品。此外，需要基于解吸離子化的檢驗足夠溫和以能夠用于動物組織、植物組織和生物材料，例如與藥物代謝物體內測試和農藥殘余物測試結合。還需要可以用于在大氣壓力在未加控制的和實驗室表面上快速、準確并且基本上非破壞性的確定痕量物質的法庭檢驗。在制造過程中包括藥物工業(yè)的制造過程中存在對準確、快速和最小化破壞性質量控制檢驗的需求。對對于體液例如血液、尿、血漿和唾液的組分進行的快速準確臨床檢驗，并且對對于已經進行制備分離技術例如凝膠色譜或配體結合處理的樣品進行的改進檢驗存在需求。對微生物和細菌的快速檢驗也存在需求。
發(fā)明概述本發(fā)明，一般稱為解吸電噴霧離子化(DESI)滿足這些以及其它需要。本發(fā)明的一個方面是解吸和離子化樣品中的分析物的方法，包括產生DESI-活性噴霧并引導該DESI-活性噴霧與樣品分析物接觸以解吸分析物。DESI-活性噴霧本文中定義為氣動輔助的流體液滴噴霧。DESI-活性噴霧可以例如通過電噴霧離子化裝置形成，其中氣體流動通過流體從其中流動的毛細管末端以產生該流體的帶電液滴，該帶電液滴解吸并離子化分析物以產生分析物離子?？蛇x擇的，在毛細管末端制造的流體液滴可以通過例如使用施加高電壓的金屬針而在與分析物接觸之前帶電。解吸的物質也可以通過向所述噴霧和表面施加相同的高電壓(通過在所述表面和反電極(例如質譜儀的入口)之間產生電勢差)而在解吸過程之后帶電以產生離子。所述噴霧可以包括大氣的中性分子、噴霧氣體(nebulizing gas)、氣體離子和帶電的或未帶電的流體液滴。已經顯示，噴霧和分析物的相互作用導致分析物的解吸和離子化以產生二次離子。所產生的(二次)離子可以進行分析以得到關于分析物的信息。例如，它們可以在質譜儀中進行質量分析?；蛘撸a生的離子可以通過離子遷移分離(IMS)，然后通過檢測所得離子流，通過對分離的物種進行質量分析，或者上述這兩種方法，在大氣壓力或減壓下進行分析。所產生的離子也可以通過其它已知的離子分析系統(tǒng)進行分析，例如火焰分光光度計。出人意料的，可用于這些分析的離子已經從存在于在導電和絕緣表面上的樣品中的分析物制造，和在大氣壓力在隨機的環(huán)境條件下，從活生物體表面以及在實驗室設定下制造。
在另一個方面，本發(fā)明是解吸和離子化分析物的裝置，包括產生DESI-活性噴霧并引導其與分析物接觸的機構。
在另一個方面，本發(fā)明包括分析如此離子化和解吸的離子。任選地，本發(fā)明還可以包括促進解吸離子收集的收集器，該收集器包括經調整適合用于移動離子到質譜儀大氣接口的管，有時稱為離子轉移管線。該離子轉移管線也可以與DESI-活性噴霧源結合，從而該DESI-活性噴霧源和該離子轉移管線作為單一的元件進行操作。
在另一個方面，本發(fā)明是一種構建可用于成像表面的數據庫的方法，所述方法包括如下步驟在多個位置使表面與DESI-活性噴霧接觸，分析如此制造的離子和使分析結果與解吸和離子化所述離子的位置聯系起來。本發(fā)明包括使用分析結果來產生存在于表面上的一種分析物或者多種分析物分布的圖像。此外，本發(fā)明包括用于產生結構中分析物分布的三維圖像的方法，包括依次消蝕所述結構的層并產生每個依次的層的圖像。
在另一個方面，本發(fā)明是完成分析物和反應物(reagent)之間反應的方法和裝置，包括使分析物與額外包括與所述分析物反應的反應物的DESI-活性噴霧接觸的步驟。
在另一個方面，本發(fā)明是一種用于在與DESI噴霧接觸期間支持分析物的樣品支架，該樣品支架包括在至少一個位置使用用于結合分析物或用于結合用于分析物的反應物的配體官能化改性的表面。
在另一個方面，本發(fā)明是一種樣品支持裝置，用于在DESI分析期間鄰近質量分析儀的毛細管接口定位用于該分析的樣品。所述樣品支持裝置通常是可調的，可以充分移動以使得相對于DESI噴霧可以掃描樣品以用于成像應用，以及可以調節(jié)用于支持一次性樣品載玻片或樣品支架。
在另一個方面，本發(fā)明是一種適合用于形成DESI-活性噴霧的流體，含有不含分析物的流體或流體混合物，并且任選地含有至少一種離子化促進劑，以及還任選地含有用于分析物的反應劑(reactant)。
在另一個方面，本發(fā)明是法庭(forensic)裝置，包括在大氣壓力使表面與DESI-活性噴霧在外界環(huán)境條件下接觸的裝置，顯示關于所得到的被解吸離子的信息的裝置，和比較所顯示的信息與關于分析物的對照信息的裝置。
概括而言，本發(fā)明提供了在大氣壓力下解吸和離子化分析物從而提供可用于得到關于分析物的信息的經解吸的二次離子(secondaryions)的方法。
附圖簡述從附圖以及本說明書可以更加清楚地理解本發(fā)明的前述以及其它目標。圖中的部件沒有按照比例繪制，而是將重點放在說明本發(fā)明的原理。


圖1示意性地給出用于產生并引導DESI-活性噴霧到樣品材料(分析物)以及用于收集和分析所得到的經解吸的離子的噴霧裝置；
圖2(a)示意性地給出包括制樣毛細管的噴霧裝置或桿；圖2(b)示意性地給出用于噴霧大樣品面積的噴霧裝置；圖3(a)給出識別在大氣壓力和環(huán)境條件下從皮手套表面解吸的RDX(一種炸藥)的DESI生成的譜圖；圖3(b)給出識別在大氣壓力和環(huán)境條件下從洗滌腈手套解吸的化學戰(zhàn)刺激劑殘留物的DESI生成的譜圖；圖4(a)給出識別植物種子中生物堿的DESI生成的譜圖；圖4(b)給出由跨越植物莖干的單一成像類型掃描產生的DESI生成的圖譜；圖4(c)給出由跨越西紅柿表面的單一成像類型掃描產生的DESI生成的圖譜；圖5給出人受測者中流血傷口的DESI生成的譜圖，并且確認期望的組分的存在；圖6(a-c)給出從表面解吸的典型的氨基酸和蛋白質的DESI生成的圖譜；圖7給出從固體表面離子化的牛細胞色素C的DESI生成的圖譜；圖8給出本發(fā)明在識別對映體組成中的用途；圖9(a-c)給出從藥片表面解吸的離子的DESI生成的圖譜；圖10給出證實在受試者皮膚上藥物代謝物存在的DESI譜圖；圖11給出通過本發(fā)明檢測尿中藥物和藥物代謝物；圖12(a-c)給出通過本發(fā)明的細菌指紋圖譜或制圖；和圖13給出根據本發(fā)明制造的裝置的另一種實施方案，適合用于以更加精細的細節(jié)成像樣品表面。
優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明涉及在大氣壓力或減壓在環(huán)境條件下離子化和解吸材料(分析物)的系統(tǒng)和方法。所述系統(tǒng)包括用于通過遞送液體液滴到噴霧氣體中產生DESI-活性噴霧的裝置。所述系統(tǒng)還包括引導所述DESI-活性噴霧到表面上的裝置。應該理解的是，在與表面接觸的點，所述DESI-活性噴霧可以包含帶電的或不帶電的液體液滴(或兩者都包括)、氣體離子、噴霧氣體分子和附近大氣的分子。所述氣動輔助的噴霧被引導到樣品材料表面，在那里其與一種或多種分析物(如果存在于樣品中的話)相互作用，并產生所述一種或多種分析物的經解吸的離子。所述經解吸的離子可以被引導到質量分析儀進行質量分析，引導到IMS裝置用于通過大小分離并測量所產生的電壓變化，引導到火焰分光光度計用于光譜分析，等等。
圖1示意性地說明了實踐本發(fā)明的系統(tǒng)10的一個實施方案。在該系統(tǒng)中噴霧11通過常規(guī)電噴霧裝置12產生。裝置12包括噴霧毛細管13，通過該毛細管13進料液體溶劑14。環(huán)繞噴霧器毛細管15形成環(huán)形空間，通過該環(huán)形空間噴霧氣體例如氮氣(N2)以高速被送入。在一個實施例中，液體是水/甲醇混合物，氣體是氮氣。由電源17通過金屬連接部件將高電壓施加到所述液體溶劑。快速流動噴霧氣體與離開毛細管13的液體相互作用的結果是形成含有液體液滴的DESI-活性噴霧11。DESI-活性噴霧11還可以包括中性大氣分子、噴霧氣體和氣體離子。雖然已經描述了電噴霧裝置12，但是能夠產生由噴霧氣體射流運載的液體液滴流的任何裝置都可以用于形成DESI-活性噴霧11。
噴霧11被引導到樣品材料21上，在該實施例中樣品材料21承載在表面22上。離開樣品的經解吸的離子25通過離子轉移管線24被收集起來并引入到質譜儀的大氣入口或接口23以進行分析，其中所述離子轉移管線24的位置與樣品足夠接近以收集經解吸的離子。表面22可以是可移動的平臺或者可以安裝在可以移動的平臺上，其中所述可以移動的平臺可以通過已知的驅動手段在x、y或z方向移動以在不同的區(qū)域解吸和離子化樣品21，有時用來生成樣品成分的分布圖或圖像。平臺的電勢和溫度也可以通過已知手段控制。在質譜儀中通常發(fā)現的任何大氣接口都適合用于本發(fā)明。使用典型的加熱毛細管大氣接口得到了良好的結果。使用通過由金屬或絕緣體制成的延伸的柔軟離子轉移管線取樣的大氣接口，也得到了良好的結果。
在DESI-活性噴霧11和樣品21之間發(fā)生的產生樣品離子的準確相互作用還沒有完全搞清楚，但是其看起來不僅僅涉及單一離子化機理。目前為止得到的數據使我們相信存在至少三種離子形成機理。一種機理涉及帶電納米微滴到表面上的“噴濺”，在該過程中表面上的分子被沖擊液滴拾取。該液滴拾取機理可能是在絕緣表面記載的DESI圖譜中看到的蛋白質的類似ESI的圖譜產生的原因。該機理的證據包括在這些圖譜中觀察到的電荷狀態(tài)分布與相同蛋白質通過常規(guī)ESI檢測的電荷狀態(tài)分布的強烈相似性。該機理的額外證據是酶/底物復合物的形成，其需要所述成分在溶液中一起度過最低時間段。第二機理可能涉及具有足夠動量傳遞以造成表面離子解吸的氣相離子和表面上的分子物種之間的電荷轉移。電荷轉移可能包括電子、質子或其它離子交換。該過程是從真空下離子/表面碰撞現象的研究得知的。水果表皮類胡蘿卜素或者金屬基底膽固醇的離子化可能是該機理的實例。該機理的證據是間接的。這些化合物在ESI的情況下并不離子化，這排除了液滴拾取機理，而結果與噴霧溶液的pH無關的事實又排除了第三種機理(見下面)。多種非揮發(fā)化合物(例如重萜類化合物、碳水化合物、肽)在顯著高于被噴霧溶劑沸點的表面溫度顯示出高離子化效率。在這些情況下由于Leifenfrost效應表面-液滴的直接接觸是不太可能的。在該溫度范圍所得到的質譜沒有顯示出SIMS的多電荷離子特征，這提供了第三機理的間接證據。
所設想的第三機理是中性物質從表面的揮發(fā)/解吸，然后是通過質子轉移或其它離子/分子反應進行的氣相離子化。當與1M NH3溶液一起噴霧時某些高堿性和揮發(fā)性生物堿(例如毒芹堿或毒芹瑟堿)增加的信號強度(與當使用0.1％乙酸時的信號強度相比)支持該機理。據信在大多數實驗中，所形成的質譜是由一種以上機理形成的；但是分析物的化學本質、電噴霧溶劑的組成和表面的物理/幾何特征可能決定導致離子形成的主要機理。
我們已經發(fā)現承載樣品的表面可以是導電的或絕緣的。樣品可以是液體或凍結形式。當從玻璃、金屬、聚合物、生物液體、紙、皮革、衣服、棉簽、皮膚、剖開的植物材料和植物表面以及植物和動物組織中的材料離子化和解吸物質時，DESI方法已經產生有用的結果。在實驗室設置中已經發(fā)現聚四氟乙烯(PTFE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和玻璃可用于承載干燥的樣品或液體樣品，這表明各種聚合物材料都是可以使用的，并且被涵蓋在后附權利要求的范圍內。應該理解的是，并不是在檢驗中用于承載樣品的所有有用材料都已經被完全表征。
因為其電特性以及因為其包括被容易地官能化以從復雜混合物例如生物流體中提取感興趣的分析物的酯，所以目前PMMA是令人高度感興趣的。雖然如下面所述已經發(fā)現DESI可以識別全血樣品中的組分，但是在使用DESI技術分析前當使經官能化以與感興趣的分析物結合的載玻片與樣品進行培養(yǎng)時，特定分析物的檢驗效率以及所得數據的質量都得到提高。樣品支架可以用任何有用的結合材料或配體包括aptamers、受體、外源凝集素(lectin)、核酸、抗體或抗體片段、螯合物等等進行官能化。單一的樣品載玻片板可以用多種不同的配體進行官能化以產生用于DESI方法檢測的位置陣列。類似地，DESI技術可以用于通過質譜離子化和分析早已被分離的分析物，所述分離例如通過TLC或凝膠色譜進行，從而避免需要從凝膠或薄層表面通過濕化學技術洗脫分析物。由DESI進行的電泳凝膠分析的效率可以得到改進，所述改進是通過利用吸取將已分離的分析物從凝膠轉移到更加剛性的表面并通過DESI分析該后者表面或者通過在分析期間或之前機械刮擦凝膠實現的。
在使用如上所述電噴霧裝置的簡單實驗中，將已知的用于承載特定樣品的絕緣表面與DESI-活性噴霧接觸。從接近該表面處收集的離子經質譜證實包括樣品的離子。在對該實驗的改進實驗中，使本發(fā)明的系統(tǒng)與已知含有特定分析物的液體接觸。從接近該液體表面處收集的離子經質譜證實包括已知樣品的離子。
如在上述實驗中那樣，從樣品制造的氣體離子可以被引導進入質譜儀進行分析。已經發(fā)現當通過ESI離子化時同樣提供譜圖的樣品材料，在通過DESI方法離子化時提供相似的譜圖。例如，溶菌酶的DESI譜圖被發(fā)現含有一系列的對應于不同數目的質子加成到分子上的多電荷離子。不但是一般的特征，而且甚至是觀察到的電荷狀態(tài)都與電噴霧離子化中觀察到的電荷狀態(tài)相似。
在一個實施方案中，在桿狀工具中柔軟的離子轉移管線與DESI-活性噴霧源組合。該桿/轉移管線組合可以采取多種形式，包括保持收集器管線25和DESI-活性系統(tǒng)10的取向基本上與圖1中示出的分開的部件的取向相同的布置。合適的桿31的一個實施方案示于圖2a中。所述桿31可包括DESI系統(tǒng)10和通過夾具33承載的毛細管離子收集管或離子轉移管線32。DESI-活性噴霧11被引導到樣品36的小面積或區(qū)域上，來自該小面積的解吸并離子化的分析物被離子轉移管線32拾取以轉移到質量分析器。這允許移動桿31以提供噴霧并解吸和離子化樣品36的不同區(qū)域。
雖然圖2a的桿適合于具有單一DESI系統(tǒng)10和單一收集毛細管的實施方案，但它們可以容易地調整為用于取樣相對大的表面例如衣箱和衣服的構造。圖2b給出了一個此類實施方案的示意性頂視圖，其中多個DESI系統(tǒng)10向寬的區(qū)域提供DESI-活性噴霧并且解吸和離子化的分析物被收集器37收集用于分析。
在圖1設備的典型實驗室操作中，樣品溶液(1-5μl)在PTFE表面沉降并干燥。甲醇-水(1∶1含1％乙酸或0.1％乙酸水溶液)在4kV電壓的影響下以0.1-15μl/min的流速被噴霧。噴霧氣體的標稱線速度設定為約350m/s。這些參數在下面提及圖1設備的幾個實施例中使用。
DESI方法與MALDI靈敏度的比較通過溶菌酶的檢驗進行，DESI分析使用Finnigan LTQ，MALDI使用Bruker Reflex III設備。使用這些具體設備，兩種技術的溶菌酶檢測極限都處于10-50pg的范圍。
對利血平、緩激肽和溶菌酶在DESI目前的發(fā)展狀態(tài)下測定了DESI的靈敏度，所有這三種物質都被沉積在PTFE表面上。存在于暴露于DESI-活性噴霧的區(qū)域，檢測極限(LOD’s)(對應于3∶1信噪比)分別是200pg、110pg和10pg。在這些實驗中，0.2μl樣品水溶液在表面上沉積并干燥得到1.1mm直徑的點。在這種情況下，取樣面積為～3mm2，完全包括沉積的點。噴霧液體是含0.1％乙酸的甲醇/水1∶1。其它條件示于表1中。
目前認為影響DESI離子化效率和譜特征的因素是噴霧條件(即噴霧的液體、其pH、施加的電壓和氣體流速)、噴霧對表面的沖擊角度和噴霧尖端到表面的距離。已發(fā)現總結于表1中的條件是有效的起始設定，其很大程度上與樣品材料(分析物)無關并且可以微調?？梢灶A見，技術人員將會發(fā)現可以用于各種DESI應用的多種設定。
表1記錄DESI譜圖的有用操作條件

如上所述，已經檢測了多種分析物，在多種表面上從簡單氨基酸到藥物分子到蛋白質。所述檢測證實DESI技術在多種表面包括陣列上使用干燥的或液體樣品進行研究、臨床化學、護理點(point-of-care)測試等方面的實用性。下面是使用DESI系統(tǒng)用于分析多種分析物的實施例。
實施例1DESI裝置和方法用于法庭和公共安全應用例如檢測環(huán)境(未加控制)表面上的炸藥和化學試劑的前景，在此由兩個實驗進行說明。在一個實驗中炸藥RDX從絕緣的鞣制皮革(豬)表面解吸，得到1ng/mm2RDX的負離子DESI譜(圖3(a))，使用乙腈(CAN)/甲醇(MeOH)/三氟乙酸(TFA)1∶1∶0.1％作為溶劑。譜圖中該炸藥的存在由串連MS(插圖)證實。
實施例2在第二實驗中，腈手套暴露于甲基膦酸二甲酯蒸汽(DMMP是化學武器刺激劑)不到一秒，然后進行洗滌和干燥，給出質譜，示于圖3(b)中，明確的顯示痕量DMMP的存在。使用乙腈(ACN)/甲醇(MeOH)/三氟乙酸(TFA)1∶1∶0.1％作為溶劑得到DMMP的正離子DESI譜圖。實施例1和2還表明DESI-活性噴霧包括可以與樣品反應的物質，其中所述物質以形成并解吸反應產物的可測量離子物種的方式與樣品進行反應。
實施例3毒芹(Conium maculatum)種子被剖開并在環(huán)境條件下放置于圖1中的裝置中。甲醇/水用于產生噴到種子上的DESI-活性噴霧，解吸的離子被轉移到離子捕集質譜儀。圖4(a)示出了得到的正DESI離子譜圖。在m/z126的信號對應于質子化的γ-毒芹瑟堿(coniceine)(分子量125)，這是一種存在于植物中的生物堿。DESI-活性噴霧和用于移動離子化和解吸的物質到質譜儀的桿狀離子收集管線被掃描穿過一段毒芹莖干。圖4(b)顯示了整個莖干橫截部分的m/z126的強度分布。DESI-活性噴霧還被掃描穿過一部分西紅柿表皮，所產生的離子化物質被收集并通過金屬的離子轉運管引入到離子捕集MS。所得到的譜圖示于圖4(c)中。
在實驗中通過使用合適的內標可以得到定量結果，其中樣品被預沉積到目標表面上；但是，在天然表面的分析中通過任何方法進行定量本質上都是困難的。對于刺穿的植物組織表面，用作內標的噴霧化合物產生半定量的結果(相對標準偏差值為～30％)。
實施例3的結果證明本發(fā)明在非破壞性檢測植物表面天然存在的有機物質中的用途。這些結果還證明本發(fā)明在獲得可以用于成像表面上的或生物分子中的物質分布的數據中的用途，典型實例是打開的種子。
實施例4新鮮制備的組織被放置在DESI-活性噴霧中，如圖1中所示出的那樣，使組織暴露于乙醇/水1∶1溶液的噴霧，得到圖5的譜圖。雖然該譜圖包括很多富產的離子，但是m/z162和m/z204的這些離子的MS/MS產物離子譜圖清楚地證明組織中肉堿和乙酰肉堿的存在。實施例4中公開的數據證明本發(fā)明在體液、組織等的分析中的用途。
實施例5測試了多種分析物，從簡單氨基酸到藥物分子到蛋白質，并且這些分析物存在于復雜程度不同的樣品中。一些代表性的DESI譜圖示于圖6(a-c)中。所觀察到的電荷狀態(tài)分布和峰的狹窄程度使得可以得出這樣的結論當分析物溶解在同樣的溶劑體系中并然后進行噴霧時，所檢測化合物的DESI譜圖非常類似于所記錄的ESI譜圖。
圖6(a)給出以10ng/cm2的平均表面濃度存在于PTFE表面上的肽-緩激肽的DESI質譜。甲醇/水被噴到表面上并且解吸的離子使用Thermo Finnigan LTQ質譜儀進行取樣。m/z531離子代表緩激肽的雙電荷分子離子，而m/z1061離子是單電荷分子離子。
圖6(b)給出從PTFE表面解吸的利血平離子的DESI譜圖，其中平均表面濃度是20ng/cm2。
圖6(c)給出從PTFE表面解吸的溶菌酶的DESI譜圖，其中平均表面濃度是50ng/cm2。具有1301、1431、1590和1789m/z比的離子是溶菌酶的+11、+10、+9和+8電荷狀態(tài)。
實施例6DESI用于識別生物化合物的潛在價值通過由胰蛋白酶消化的牛細胞色素C的質譜表現出來，示于圖7中。在該譜圖中觀察到超過60％的可能的胰蛋白酶片段，這使得通過數據庫檢索可以實施蛋白質的識別。圖7給出了通過圖1的裝置得到的牛細胞色素C的胰蛋白酶消化物(1mg/cm2)的正離子DESI譜圖。
實施例7對非共價絡合物和其它精密結構的可應用性由L-絲氨酸的DESI譜圖表示，其產生了該氨基酸的質子化的幻數八聚體。也可以保持酶/底物、酶/抑制劑或抗原/抗體的相互作用，例如噴到存在于PTFE表面上的溶菌酶上的乙?；鵦hitohexaose溶液產生了在m/z1944和2220的酶底物絡合物。在表面上的分析物和引入到噴霧溶液中的配體之間也可以生成特定絡合物。這有很多用途，包括其中原始存在于表面上的特定化合物的對映體組成(手性)得以測量的實驗。氣態(tài)的結合金屬陽離子的絡合物離子(其含有兩個對映體純的參比化合物分子和一個分析物分子)被形成、進行質量選擇并通過碰撞引發(fā)的解離(CID)被碎片化。對映體組成通過在動力學方法步驟中比較主要碎片離子的強度而測定。使用苯丙氨酸作為分析物，L-色氨酸作為參比，以及Cu(II)作為金屬中心，可以看到(圖8)在主要碎片離子強度比的自然對數和樣品中存在的L-苯丙氨酸的百分數之間存在線性關系(圖8)，這使得可以對未知對映體純度的丙氨酸樣品的手性進行定量確定。該特定實驗具有很寬的潛在應用領域，從考古(年代確定)到藥學應用(質量控制)到天體生物學。
實施例8DESI快速檢測大量樣品的能力通過直接從片劑分析藥物分子(氯雷他定)進行測試。Claritine(Schering-Plough)片劑的典型譜圖示于圖9(a)。在暴露于甲醇/水噴霧1秒后片劑的重量損失少于0.1mg，沒有可見的分析痕跡。示于圖9(b)和9(c)的色譜圖和得到的譜圖表明一個樣品的分析時間可以低至0.05秒。
實施例9在服用10mg非處方抗組胺藥氯雷他定(m/z383/385)后50分鐘將帶電的甲醇-水液滴流噴霧到受試者手指上。服用該抗組胺藥時非常小心以避免在受試者的手指上留下痕量的該藥物。如圖10所示，當物質被從受試者的手指離子化、收集在離子捕集器MS并進行測量時，在DESI譜圖中觀察到氯雷他定的存在。所述氯雷他定離子被認為是源自于服用的抗組胺藥的代謝物。還以這種方式對皮膚進行了測試以發(fā)現其它藥物分子和它們的代謝物以及食物組分的代謝物例如咖啡因、可可堿、薄荷醇等等。在受到控制較少的條件下在受試者皮膚上發(fā)現的物質包括脲、氨基酸、脂肪酸、尿酸、肌酸酐、葡萄糖和其它有機化合物。在該實施例中描述的數據表明了本發(fā)明用于體內藥物劑量監(jiān)測、藥物濫用測試等等的用途。
實施例10在另一個代謝物檢驗中，在受試者服用兩片Alka-Seltzer Plus Flu藥后40分鐘收集的一滴尿液被放置在表面上并受到帶電甲醇/水液滴流的作用。捕集所產生的離子并且通過質譜分析得到示于圖11中的譜圖。所述譜圖包括已知存在于藥中的右美沙芬的峰(272.76)，和右美沙芬的代謝產物O或N-去甲基右美沙芬的峰(257.64)。肌酸酐(尿液的一種常規(guī)成分)峰(114.41)也被識別出來。
實施例11本發(fā)明繪制或“指紋圖譜化”感興趣目標例如細菌的組分的用途通過如下方式得到證明在PTFE表面上干燥約1mg細菌細胞(在LB瓊脂上生長24小時)，然后將干燥的細胞置于帶電甲醇/水液滴流的作用之下。收集來自干燥細菌細胞的離子化的物質并在Thermo FinniganLTQ質譜儀中進行分析。如此制備了大腸桿菌(Escherchia coli)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的“指紋圖譜”并分別示于圖12a、12b和12c中。
將DESI應用到質譜的領域來自于如此簡單的制樣過程。實際上，相對于標準質譜方法，過程分析和其它高處理量實驗得到極大簡化，并且針對藥物的初步實驗表明可以達到20樣品/秒的分析速度。
MALDI和SIMS都可以用于成像生物材料，但是使用MALDI和SIMS的實驗是在真空中進行。大氣壓力基質輔助激光解吸離子化(AP-MALDI)和大氣壓力激光消蝕已被用于生物材料的非真空成像；但是在所有這兩種方法中，樣品相對于離子源被嚴格固定并且在實驗過程中不可接近和不能操縱。因為在環(huán)境條件下工作，所以DESI可被用于天然表面的分析，例如針對特定化合物成像植物或動物組織。這類應用的可能性由毒芹(Conium maculatum)葉片部分的DESI譜圖得到說明，示于實施例3中。圖4中m/z126處的峰是由于毒芹瑟堿，已知其存在于這種特定的植物種類中。原位成像的可能性通過使噴霧點掃描橫穿該植物莖干的橫截面而得到證實(圖4(b))。類似地，從西紅柿(lycopersicon esculentum)表皮收集的DESI譜圖也表明包括在m/z536處的番茄紅素的特征化合物的位置(圖4(c))。因為DESI在空氣中進行，所以其是明顯具有允許體內(in-vivo)取樣并在活的組織表面成像能力的第一種質譜技術，如關于實施例5所示出的那樣。
在圖13中示出的可選擇的實施方案在大多數DESI應用中都是適用的，但是特別可用于其中需要更加精細地細節(jié)化成像樣品表面或表面上物質分布的應用。如圖13中所示，使用基本上與圖1中所示相同的并具有相同附圖標記的噴霧裝置10將未帶電液體的噴霧液滴11在氣體中引導到樣品40的表面上。但是，沒有向液體毛細管施加電壓。不同的是，將針42靠近樣品表面40放置在尋求成像的位置并在針42和接地電極43之間施加電壓。針42上的電壓低于擊穿閾值，但是卻足以產生一個電場，其中該電場將在噴霧溶劑液滴即將與樣品表面40接觸之前使液滴帶電。所述來自噴霧器毛細管的帶電的噴霧液滴將接觸直接位于所述針之下的小面積的樣品表面，使得可以對表面進行細節(jié)化成像。樣品的移動使得可以形成圖像。
基于DESI的成像分辨率也可以通過使用掩模而得到改進，其中所述掩模物理地限制DESI-活性噴霧和樣品之間的接觸區(qū)域使得從精細限定的樣品表面區(qū)域收集解吸的離子。遮蔽(masking)也可以用于物理地將收集的離子限制為在樣品和質譜儀大氣壓力接口之間基本具有直線軌跡的那些離子。增加基于DESI的成像分辨率的可選擇的布置是使用在逼近樣品的平面和安置于樣品和DESI-活性噴霧源之間的格柵之間建立的電場。該電場被極化以對抗(resist)DESI-活性噴霧中離子或帶電液滴的流動。延長的導電元件，通常是導線，橫穿該電場，從而一端位于接近DESI-活性噴霧源的位置而另一端靠近表面上有興趣成像的區(qū)域。該導電元件帶電從而產生與其軸平行的隧道狀電場，其促進DESI-活性噴霧中離子和帶電液滴的通過。這些電場一起發(fā)揮作用將DESI-活性噴霧和所述表面之間的接觸限制到小的區(qū)域，與沒有物理遮掩所觀察到的相比所述小的區(qū)域具有相對高的DESI-活性噴霧組分濃度。
另一種有用的改進圖像分辨率的布置包括使表面與能量水平恰好低于離子化和解吸所需水平的DESI-活性噴霧接觸，同時通過例如能夠用非常小的加熱點掃描樣品的激光來增加足夠的能量以超過離子化和解吸相互作用閾值。
附圖的圖1示意性地并且以升高視角的橫截面圖給出了電噴霧裝置10，該電噴霧裝置10被發(fā)現可用于使液體表面與DESI-活性噴霧11接觸。在一個實施例中，甲醇水溶液(50％v/v)在5kV的電噴霧電壓被電噴霧到噴霧氣體中，并且所產生的DESI-活性噴霧11被引導與存在于PMMA表面上的含有緩激肽的液體樣品接觸。在該具體實施例中入射角(α)不超過45 °并且溶劑的體積流速是1-3μL/min。相對于Thermofinnigan LTQ質譜儀23的大氣入口，角β大約是10°。作為實踐中的有利方法，使用相對較低的入射角以避免與DESI-活性噴霧11接觸時液體樣品的過度破碎。
總而言之，使用DESI-活性噴霧的DESI系統(tǒng)可以用于與樣品發(fā)生相互作用，從而離子化并解吸樣品材料(不必是這種順序)并產生用于分析的經解吸的離子。經解吸的離子可以通過質譜儀或其它分析儀進行分析。所述DESI-活性噴霧可以在基本上是大氣壓力和在未加控制的環(huán)境中接觸樣品材料。樣品材料可以用導電或絕緣表面承載，或者可以是天然存在地結構的一部分，或者可以是液體或凍結的材料。例如，樣品可以被承載在普通的環(huán)境表面上例如衣服、行李、紙、家俱、室內裝飾物和工具?；蛘撸鰳悠房梢允瞧つw的一部分、毛發(fā)、生物組織、食物、室溫成分、水體、流體、廢水、死水、有毒液體和海水?；蛘?，所述樣品可以處于受到控制的環(huán)境中。所述樣品材料可以處于醫(yī)療研究、學術或工業(yè)設定中。所述樣品材料可以通過一種或多種配體、受體、外源凝集素、抗體、結合伙伴、螯合物等等結合到樣品載玻片以形成陣列。所述樣品材料可以是食物或食物成分。所述DESI-活性噴霧通常由水和水醇混合物組成。但是，所述噴霧還可以包括樣品材料的反應物，從而使樣品材料與DESI-活性噴霧接觸導致從樣品材料解吸的可檢測的離子，包括反應物和樣品的反應產物的離子。
所述DESI系統(tǒng)可以包括柔軟的轉移管線以轉移樣品離子進入質譜儀或其它分析儀器?？梢栽诙鄠€位置接觸樣品材料從而從樣品的不同部分提供離子地圖?？梢砸苿訕悠穼⒉煌膮^(qū)域暴露于DESI-活性噴霧。遮掩、電場遮掩(field masking)和其它方法可以用于將噴霧引導到特定的位置。從各種反應獲得的數據可以用于產生樣品中材料的組分分布的圖像或地圖(map)。
雖然已經對本發(fā)明的各種實施方案進行了描述，但對于本領域的技術人員來說在本發(fā)明的范圍內仍然存在更多的實施方案和實施方式。因此，本發(fā)明只受后附的權利要求及其等價物的限制。
權利要求
1.一種解吸和離子化樣品材料中的分析物的方法，包括將DESI-活性噴霧液滴引導到樣品材料的表面上以與所述表面發(fā)生相互作用并解吸所述分析物。
2.權利要求1的方法，其中與表面接觸的噴霧具有帶電的液滴。
3.權利要求1的方法，其中解吸的分析物在解吸之后帶上電。
4.權利要求2的方法，其中所述液滴在它們形成時帶上電。
5.權利要求1、2或3的方法，其中在基本上是大氣壓力的壓力下所述DESI-活性噴霧與樣品材料接觸。
6.權利要求1的方法，其中所述DESI-活性噴霧在外界環(huán)境條件下與樣品材料接觸。
7.權利要求1的方法，其中通過將液體引入噴霧氣體中產生所述DESI-活性噴霧液滴。
8.權利要求4的方法，其中所述DESI-活性噴霧液滴通過電噴霧裝置產生。
9.權利要求1、2、3或5的方法，其中所述液滴選自水、醇和它們的混合物。
10.權利要求8的方法，其中所述液體含有少量的離子化促進劑。
11.權利要求8的方法，其中所述液體含有樣品材料的反應物，從而使樣品材料與DESI-活性噴霧的接觸導致可檢測的解吸的分析物離子，所述分析物離子包括所述反應物和樣品材料的反應產物。
12.權利要求6的方法，其中將反應物加入到所述液體中以產生所述樣品材料和所述反應物的反應產物的解吸的離子。
13.權利要求8的方法，其中所述樣品是生物材料并且所述反應物是與所述生物材料反應以形成所述化學反應的解吸的分析物離子的生物材料。
14.權利要求8的方法，其中離子被引入到所述液體中以與樣品材料發(fā)生相互作用并產生樣品材料和所述離子之間的絡合物的解吸的離子。
15.權利要求1的方法，其中所述DESI-活性噴霧被設置成在樣品上噴霧一個點并且掃描該點以提供代表樣品不同部分的解吸的離子。
16.權利要求15的方法，其中所述樣品和點相互相對移動以從樣品材料的不同位置產生樣品材料中分析物的離子并且所產生的離子與所述點的位置有關。
17.權利要求16的方法，其中所述點的位置被用于形成樣品上分析物離子的圖像。
18.權利要求15的方法，其中所述點通過遮掩設定。
19.權利要求15的方法，其中所述點通過向著樣品材料表面噴霧所述液體的移動的液滴來設定，并且所述液滴通過在所述點的位置向所述液滴施加帶電用電場而帶上電。
20.權利要求15的方法，其中所述點通過引導能量水平恰好低于樣品材料中分析物解吸和離子化所需水平的DESI-活性噴霧到樣品材料表面，并且在所述點增加足夠的能量以超過分析物解吸和離子化閾值而設定。
21.權利要求20的方法，其中所述能量通過激光提供。
22.權利要求1的方法，其中所述DESI-活性噴霧在受到控制的環(huán)境中接觸所述樣品材料。
23.權利要求1的方法，其中所述DESI-活性噴霧在未加控制的環(huán)境中接觸所述樣品材料。
24.權利要求1的方法，其中所述樣品位于固體或柔軟表面上。
25.權利要求1的方法，其中所述樣品是液體。
26.權利要求1的方法，其中所述樣品材料是凍結的。
27.權利要求1的方法，其中所述樣品材料承載在樣品載玻片上。
28.權利要求27的方法，其中所述樣品材料作為陣列布置在樣品載玻片上。
29.權利要求1或15的離子化和解吸樣品中分析物的方法，其中通過一種或多種配體、受體、外源凝集素、抗體、結合伙伴、螯合物等將一種或多種樣品結合到樣品載玻片上。
30.權利要求1的方法，其中所述樣品材料是生物來源。
31.權利要求1的方法，其中所述樣品材料是工業(yè)工件或藥物產品或成分。
32.權利要求1的方法，其中所述樣品材料選自食物或食物成分、毒素、藥物、炸藥、細菌或生物組織。
33.一種分析樣品材料的方法，其包括如權利要求1所述解吸和離子化分析物和然后收集和分析所述分析物離子。
34.權利要求33的方法，其中所述分析物離子通過質譜儀進行分析。
35.權利要求33的方法，其中所述分析物離子通過離子轉移管線從樣品材料附近轉移到質譜儀。
36.權利要求33的方法，包括在多個位置噴霧所述樣品材料并在每個位置對所述分析物離子進行質量分析。
37.權利要求36的方法，包括在每個位置使用質量分析以顯影樣品表面的分析物質量的分布圖像。
38.一種分析樣品材料的系統(tǒng)，包括產生DESI-活性噴霧并將其引導到樣品表面以與所述表面發(fā)生相互作用并產生樣品中分析物的離子的裝置；質量分析儀；和將所產生的離子從樣品材料轉移到質量分析儀的離子轉移管線。
39.權利要求38的系統(tǒng)，其中所述質量分析儀是質譜儀。
40.權利要求38的系統(tǒng)，其中所述DESI-活性噴霧通過電噴霧設備產生。
41.一種分析位于基底上的分析物的裝置，包括可被引導到基底的DESI-活性噴霧的源；和分析器，具有輸入口，該輸入口可被安置在距離基底足夠近的位置以收集DESI-活性噴霧產生的分析物的解吸的離子產物。
42.權利要求41的裝置，還包括與分析器輸入口連接的譜分析儀。
43.權利要求42的裝置，其中所述譜分析儀包括質譜儀。
44.權利要求41的裝置，其中所述DESI-活性噴霧源和所述分析器輸入口相互連接。
45.權利要求41的裝置，還包括支持所述基底的平臺。
46.權利要求45的裝置，其中所述基底保持在受控的溫度。
47.權利要求41的裝置，還包括與分析器輸入口連接的加熱器。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種解吸離子化的新方法和系統(tǒng)，并被用于離子化多種化合物包括存在于金屬、聚合物和無機表面上的肽和蛋白質。解吸電噴霧離子化(DESI)通過如下方式進行引導液體的帶電的液滴和/或離子到待分析的表面上。帶電離子在表面上的沖擊產生了起始就存在于表面上的物質的氣體離子。所得到的質譜與通常的ESI質譜相似，因為它們主要顯示分析物的單電荷的或多電荷的分子離子。DESI現象在導電和絕緣體表面的情況下，以及對于從非極性小分子例如番茄紅素、生物堿毒芹瑟堿和小藥物到極性化合物例如肽和蛋白質，都可以觀察到。噴霧的溶液中的變化可以用于選擇性地離子化特定的化合物，包括生物基質中的化合物。體內分析得到證實。
文檔編號H01J27/00GK101073137SQ200580010684
公開日2007年11月14日 申請日期2005年3月30日 優(yōu)先權日2004年3月30日
發(fā)明者Z·塔卡特斯, B·戈洛干, J·M·維塞曼, R·G·庫克斯 申請人:普渡研究基金會