專利名稱：：針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的人源化抗體的制作方法針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的人源化抗體本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/US2004/039501"，國(guó)際申請(qǐng)日為2004年11月22日，中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?200480040951.6"，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段日期為2006年7月25日"，發(fā)明名稱為"針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的人源化抗體"的分案申請(qǐng)。對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)是提交于2003年5月20日，題為"GenerationandSelectionofProteinLibraryinSilico"的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/443,134的部分繼續(xù)申請(qǐng)，所述美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/443,134是提交于2002年5月20日的，題為"Structure-BasedSelectionAndAffinityMaturationofAntibodyLibrary"美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/153,159的部分繼續(xù)申請(qǐng)，也是提交于2002年5月20日的題為"GenerationAffinityMaturationofAntibodyLibraryinSilico"的申i青號(hào)10/153,176的部分繼續(xù)申請(qǐng)，上述兩者是在2002年4月17日提交的題為"Structure-basedconstructionofhumanantibodylibrary"的美國(guó)專禾U申請(qǐng)系列號(hào)10/125,687的部分繼續(xù)申請(qǐng)，所述美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)10/125,687要求在2001年4月17日提交的題為"Structure-basedconstructionofhumanantibodylibrary"的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/284,407的利益。將這些申請(qǐng)并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明提供針對(duì)人抗原的抗體和產(chǎn)生針對(duì)這些靶點(diǎn)的高親和力抗體的方法。更具體地，本發(fā)明提供針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的人源化或人抗體和產(chǎn)生這樣的抗-VEGF的抗體的方法。此外，本發(fā)明提供使用這些抗體及其衍生物來(lái)體外抑制血管發(fā)生的組合物，試劑盒和方法，所述組合物，試劑盒和方法用于診斷或治療與異常血管發(fā)生相關(guān)的疾病諸如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、與局部缺血-再灌注相關(guān)的腦水腫和損傷、皮質(zhì)局部缺血、卵巢增生和血管過(guò)多、子宮內(nèi)膜異位、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病(retinopaphy)，和其它的眼科血管源性疾病。血管發(fā)生涉及許多生理和病理過(guò)程。血管發(fā)生由多個(gè)步驟組成，其最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的增生和分化，并且形成管和腔(血管發(fā)生)。促進(jìn)血管發(fā)生的因子包括VEGF、aFGF、bFGF、TGF-a、TGF-卩、HGF、TNF-a、血管生成素、IL-8等，而抑制血管發(fā)生的因子包括血小板反應(yīng)蛋白(Good等.W加/.^c^/.5W.t/SA87:6624-6628(19%))，促乳素的N末端片段(Clapp等.五wfocn'"o/ogv，133:1292-1299(1993))，纖維蛋白溶酶原的三環(huán)5結(jié)構(gòu)域(Cao等.，J.Biol.Chem.,271:29461-29467(1996),制管張素(O'Reilly等.CW/,79:315-328(1994))和內(nèi)皮抑制素(O'Reilly等.Ce//,88'.277-285(1996))。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是與其在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體特異性作用從而促進(jìn)它們的血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子。已知血管發(fā)生在從在先存在的血管和/或循環(huán)內(nèi)皮干細(xì)胞中發(fā)展新的脈管系統(tǒng)中具有重要作用(Asahara等.，Science,275(5302):964-967，1997;Springer等.，Mol.Cell,2(5):549-558，1998;Folkman和Shing,J.Biol.Chem.，267:10931-10934，1992)。血管發(fā)生還在許多生理過(guò)程中具有重要作用，所述生理過(guò)程諸如胚胎發(fā)生、傷口愈合和月經(jīng)。更重要的是，血管發(fā)生還涉及病理狀態(tài)，所述病理狀態(tài)諸如腫瘤形成、轉(zhuǎn)移、糖尿病性視網(wǎng)膜病等。已知實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)需要腫瘤血管形成從而供應(yīng)氧和養(yǎng)分并且腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移通過(guò)來(lái)自腫瘤血管化的血管而發(fā)生。認(rèn)為VEGF是在腫瘤的這種血管化中的關(guān)鍵生血管因子。因此，預(yù)期腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移可以通過(guò)某些物質(zhì)中和VEGF的血管化活性而得到抑制。最近的研究(Burrows和Thorpe,Pharmacol.Ther.，64:155-174,1994;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:8996-卯00，1994)已經(jīng)使用了這樣策略來(lái)靶向?qū)嶓w腫瘤的脈管系統(tǒng)。耙向腫瘤的血管，而不是腫瘤細(xì)胞本身，具有一些優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠洳淮罂赡軐?dǎo)致抗性腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，并且被靶向的細(xì)胞易于到達(dá)。而且，血管的破壞導(dǎo)致抗腫瘤效果的擴(kuò)大，因?yàn)樵S多腫瘤細(xì)胞依賴于單一的血管來(lái)供應(yīng)它們的氧和養(yǎng)分。在幾乎一半的糖尿病患者中，糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)生是由糖尿病的其中一個(gè)并發(fā)癥引起的。認(rèn)為在糖尿病性視網(wǎng)膜病中的微細(xì)管的形成是由氧缺乏促進(jìn)的。這些微細(xì)管將遲早破裂出血從而形成瘢疤組織，導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離。年齡相關(guān)的斑(macular)退化是另一種眼病，其已經(jīng)被證實(shí)涉及視網(wǎng)膜的病理性血管化。因此，預(yù)期血管化的抑制可以預(yù)防視網(wǎng)膜病的發(fā)展。基于使用猴的實(shí)驗(yàn)，Miller等報(bào)道VEGF與增生性(vegetative)視網(wǎng)膜病的發(fā)展緊密相關(guān)(Miller等.Am.J.Pathol.145,574-584(1994))。為此，考慮將中和VEGF的血管化活性的物質(zhì)用于預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病和AMD(Lopez等.Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37:855-868(1996))。VEGF作為病理狀態(tài)中的血管發(fā)生的主要刺激物的認(rèn)識(shí)已經(jīng)導(dǎo)致阻斷VEGF活性的各種嘗試。己經(jīng)提議將抑制性抗-VEGF受體抗體，可溶性受體構(gòu)建體，反義策略，針對(duì)VEGF的RNA適體和低分子量的VEGF受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑用在VEGF信號(hào)傳導(dǎo)的干擾中(Siemdster等.，CancerMetastasisRev"17(2):241-248.,1998)。事實(shí)上，已經(jīng)顯示針對(duì)VEGF的單克隆抗體在小鼠中抑制人腫瘤異種移植物生長(zhǎng)和腹水形成(Kim等.，GrowthFactors7:53(1992);Nature362:841-844(1993);Asano等.,Hybridoma，17:185-90，(1998);Mesiano等.，Am.J.Pathol"153(4):1249-1256，(1998);Luo等.,CancerRes.;58(12):2594-2600,(1998);CancerRes"58(12):2652-2660,(1998);Borgstrom等.CancerRes.56:4032-4039(1996);Borgstrom等.，Prostate,35(1):1-10,(1998))。而且，己經(jīng)將使用抗-生血管分子，抗-VEGF抗體和VEGF拮抗劑的相同策略用在AMD和糖尿病性的視網(wǎng)膜病的實(shí)驗(yàn)性治療中(Adamis等.Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996))。對(duì)于這些治療性應(yīng)用而言，如果它們起初來(lái)自小鼠，通常通過(guò)人源化對(duì)抗體進(jìn)行改造以減少它們?cè)谥貜?fù)劑量中的毒性，并提高其它的特性諸如通過(guò)親和力成熟與靶分子的結(jié)合親和力(Winter和Milstein，Nature,349:293-299，(1991);Baca等，J.Biol.Chem.，272(16):10678-84，(1997);Presta，等".CancerRes"57:4593-4599，(1997);Chen等.(1999)J.Mol.Biol.293:865-881;和Ryan等.(1999)ToxicologicPathology,27(1):78-86)。盡管前述研究強(qiáng)調(diào)VEGF在實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)中的重要性和其作為腫瘤治療的靶標(biāo)的潛能，鑒定抑制VEGF-誘導(dǎo)的血管發(fā)生的另外的試劑將有利于擴(kuò)展治療選擇的數(shù)量。特異性抑制VEGF與其受體的結(jié)合的治療劑的發(fā)展代表更有效靶向血管發(fā)生的重要備選，其具有潛在改善的治療效果。發(fā)明概述本發(fā)明提供以需要的結(jié)構(gòu)和功能來(lái)改造蛋白質(zhì)，特別是以來(lái)自治療前景的理想特性改造抗體的革新方法，所述理想特性包括對(duì)靶抗原的高結(jié)合親和力，在體外和體內(nèi)有效抑制異常細(xì)胞增殖的能力，和最低的毒性或副作用。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于在計(jì)算機(jī)上(insilico)和在體外設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對(duì)人抗原的抗體的方法。在一些具體的實(shí)施方案中，提供設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的人源化抗體或完全的人抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供針對(duì)VEGF的單克隆抗體。具體而言，提供可以以高親和力結(jié)合人VEGF的人源化或人抗-VEGF單克隆抗體。優(yōu)選地，這些抗體可以在體外抑制內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF-誘導(dǎo)的增殖，并在體內(nèi)抑制VEGF-誘導(dǎo)的血管發(fā)生?？梢詫⑦@些抗體和它們的衍生物用在廣泛應(yīng)用中諸如診斷、預(yù)防和治療疾病諸如癌癥、AMD、糖尿病性視網(wǎng)膜病、和其它來(lái)自病理性血管發(fā)生的疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，以scFv，F(xiàn)ab，或抗體的其它形式，并在約4。C，25°C，37'C或42X:的溫度下進(jìn)行測(cè)量，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其解離常數(shù)Kd等于或低于0.2nM，任選地低于O.lnM，任選地低于0.08nM，任選地低于0.05nM，任選地低于0.01nM，或任選地低于0.005nM。優(yōu)選地，如果以scFv的形式存在，并且在35-37'C下測(cè)量，抗-VEGF抗體的Kj氐于1nM，任選地低于0.8nM，任選地低于0.5nM，任選地低于0.2nM，任選地低于0.1nM，任選地低于0.08nM，任選地低于0.05nM，任選地低于0.01nM，或任選地低于0.005nM。也是優(yōu)選地，如果以Fab的形式存在，并且在35-37。C的溫度下進(jìn)行測(cè)量，抗-VEGF抗體的Kd低于0.5nM，任選地低于0.2nM，任選地低于0.1nM，任選地低于0.08nM，任選地低于0.05nM，任選地低于0.01nM，或任選地低于0.005nM。在體外的內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF誘導(dǎo)的增殖的抑制中，當(dāng)以scFv，F(xiàn)ab或抗體的其它形式存在時(shí)，所述抗-VEGF抗體優(yōu)選地具有這樣的抑制50%細(xì)胞增殖的有效劑量ED50，所述有效劑量ED5o等于或低于10nM，任選地低于5nM，任選地低于1nM，任選地低于0.5nM，任選地低于0.1nM，6任選地低于0.05nM，或任選地低于0.01nM。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，并且所述單克隆抗體具有包括下列氨基酸序列的VrX1X2X3X4TQX5PSX6X7SX8X9X10GX11X12X13X14K15C^i6X17SX込19S20X21^22X23S24WYQQX25PGX26APX27X2SLX29YX3o2￡3i2￡32S33LX34Z35GVX36X37RFSGX3SX39SGTDFX^LTPai}G,LO:CnX^DX4sAX4fiYYCC)OX47X4)!X49XsnPX5,TFGX"GTKX53X54IK,其中將下劃線區(qū)域分別稱為Vl/CDR1,Vl/CDR2，和V!/CDR3，而將其余區(qū)域稱為構(gòu)架，并且其中X,是D，E或A;X2是I，或T;X3是V，E，K，R，Q，或T;X4是M，或L;Xs是S，或T，乂6是S，或T;X7是L，或V;Xg是A，或V;X9是S，或T;X1Q是P，V，L，A，或I;Xn是E，或D;X12是R，或T;&3是A，或VI;Xm是T，或A;X!5是T，S，或A;X!6是S，R，N，K，H，或Q;Xn是A，或S;X8是Q，或R;又19是S，D，A，或P;X20是S，G，R，T，或Y;X2i是T，N，S，D，或K;X22是Y,或D;又23是L，或I;X24是A，N，或T;X25是K，或I;X26是Q，K，T，或I;X27是R，K，Q，N，H，S，或E;X28是V，或L;X29是I，或V;X3o是F，A，G，D，或S;X31是A，或T;X32是S，或T;X33是N，S，R，或T;X34是A，H，或Q;X35是S，或G;X36是P，T;X37是S，N，D，G，或Y;X38是S，或T;X39是G，或R;X4Q是T，或A;X41是S，或R;X42是S，或R;X是P，或A;X44是E，或D;X45是F，V，或S;&6是V，T，I，A，或S;X47是Y，或S;X48是S，Y，或N;X49是S，或T;X50是T，V，A，P，K，G，S，或I;X51是W，或Y;X52是Q，或G;X53是V，或L;和X54是E，D，或A。這些優(yōu)選的VL序列可以組合以優(yōu)選的Vh序列或其它抗體的Vh，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以期望的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，所述單克隆抗體具有包括下列氨基酸序列的VuX'X^LTQPPS&SXsTPGQXsVTISCSGX^SNXoGX'nNX，iVX,，WYOOX，,PGX14APKX15LX16Y^17^〗8X19^GVPX20RX21SGSX22SX23TSASLAISGLX24SEDEADYYCX25X26^D^L2C27fiXYFGX2sGTX29LTVL,其中將下劃線的區(qū)域分別稱為VL/CDR1,VL/CDR2,和Vl/CDR3，而將其余的區(qū)域稱為構(gòu)架，并且其中X!是QL，或N;X2是PAF，或S;X3是V，或M;X4是A，或T;Xs是G，或A;X6是R，或S;X7是S，或T;X8是S，TY，或N;X9是I，或V;X1Q是S，或R;X是S，P，N，A，或T;Xu是N，T，或Y;Xu是L，或F;X4是T，或A;X!5是V，L或F;X,6是M，或I;Xn是G，T或.S;X,8是N，或D;X19是Q，或E;X2。是D，或E;X2!是F，或L;X22是K，或R;X23是G，或A;X24是Q，L或R;X25是A，或G;X26是A，S或T;X27是N，S或T;X28是T，或A;和X29是K，或Q。這些優(yōu)選的Vt序列可以組合以優(yōu)選的Vh序列或其它抗體的Vh，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其具有包括下列的氨基酸序列的V^DQRPSGVPDRFSDSKSGTSASLGISGLRSEDEADYTFCATWDDSLHGYVFGTGTKVTVL(SEQIDNo:54)。這些優(yōu)選的VL序列可以組合以優(yōu)選的Vh序列或其它抗體的VH，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其具有包括下列氨基酸序列的VH:草2QLVX3SGGGx^QPGGX5LRLX6c線s邁込込込^込!巡4,^QAPGKGX^WVG巡!7醒^9巡^;^函必4^5,26TX27SX28X29X3oSKX3"32X33YLQX34NSLRAEDTAVYYCA^5X22^IX^7SH^SYWX38QGTLVTVSS，其中按照Kabat命名法，分別將下劃線區(qū)域稱為CDR1，CDR2和CDR3，而將其余的區(qū)域稱為構(gòu)架，并且其中&是E，或Q;X2是V，或G;X3是Q，或E;X4是V，或L;Xs是S，或T;X6是ST，或R;X是A，或V;Xs是Y，或F;X9是T，D,N,S，或A;Xu)是F，或L;Xu是T,D,Y,A,S，或N;Xu是N，H，或S;Xu是Y，或F;Xm是M，L，I或V;X^是I，V，或L;X,6是L，或P;Xn是I，或V;X,s是Y，或N;X19是T，或N;X2o是E，或A;Xn是P,T，或S;X22是A，或V;X23是A，H，Q,P,D，或E;X24是D，或E;Xm是K，或T;X26是V,F，或L;X27是F，或I;X28是L，或R;乂29是0，或N;X3Q是T，或N;X^是S，或N;X32是T,Q,P，或K;X33是A,V，或P;X34是L，或M;X35是K，或R;X36是H，或Y;X37是S,R，或T;和X3g是G，或A。這些優(yōu)選的VH序列可以組合以優(yōu)選的Vl序列或其它抗體的Vl，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，并且其具有這樣的Vl，所述Vl包括逸自由SEQIDNos:2-54組成的組的氨基酸序列，更優(yōu)選地包括選自由SEQIDNo:14、SEQIDNo:26、SEQIDNo:28、SEQIDNo:36、SEQIDNo:37、SEQIDNo:44、SEQIDNo:47，和SEQIDNo:54組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的VL序列可以組合以優(yōu)選的Vh序列或其它抗體的Vh，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其具有這樣的VH，所述Vh包括迭自由SEQIDNos:57-110和SEQIDNos:285-310組成的組的氨基酸序列，優(yōu)選地包括選自由SEQIDNos:61-64，SEQIDNo:67，68，70，75，83，88，89，卯，91，92，93，94和96-110組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的VH序列可以組合以優(yōu)選的Vl序列或其它抗體的Vl，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在還有的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其在Vl區(qū)域中具有CDRl(Vi7CDRl)，所述CDRl包括選自由SEQIDNos:164-194組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的V^CDR1可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列，或組合以其它的重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其在VL區(qū)域中具有CDR2(VL/CDR2)，所述CDR2包括選自由SEQIDNOs:195-209組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的Vl/CDR2可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體結(jié)合人VEGF。在還有的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在VL區(qū)域中具有CDR3(VL/CDR3)，所述CDR3包括選自由SEQIDNOs:210-228組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的V^CDR3可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力結(jié)合人VEGF。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在VL區(qū)域中具有構(gòu)架區(qū)域(FR)CDR3(Vl/FR)，所述構(gòu)架區(qū)域(FR)CDR3包括選自由SEQIDNO:229-269組成的組的氨基酸序列，并且優(yōu)選地包括選自由SEQIDNO:232,235,237,251，255,263,和265組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的VL/FR可以組合以優(yōu)選的輕鏈的CDR區(qū)域，或其它輕鏈的CDR區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合于人VEGF的單克隆抗體，其在Vh區(qū)域中具有CDR1(Vh/CDR1)，所述CDRl包括GXiXzXs^XsXgGX^的氨基酸序列，其中X,是Y,或F;X2是D，N,T,S,或A;X3是F,或L;X4是T,D，S,Y,A,或N;Xs是H,N,或S,X6是Y,或F;X是M,L,I,或V。此外，所述單克隆抗體的VH/CDR1優(yōu)選地包括選自由SEQIDNOs:111-135組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的VH/CDR1可以組合以優(yōu)選的重鏈的其它區(qū)域或其它重鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的輕鏈的可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體結(jié)合人VEGF。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在VH區(qū)域中具有CDR2(VH/CDR2)，所述CDR2包括WX,NTX2X3GEX4TYX5X6X7FXgR的氨基酸序列，其中X,是I,或V;X2是Y，或N;X3是T,或N;X4是P,T,或S;X5是A,或V;Xs是A,Q,P,H,D，或E;X7是D，或E;和X8是K,或T所述單克隆抗體的VH/CDR2優(yōu)選地包括選自由SEQIDNOs:136-156組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的VH/CDR2可以組合以優(yōu)選的重鏈的其它區(qū)域或其它重鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的輕鏈的可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在VH區(qū)域中具有CDR3(VH/CDR3)，所述CDR3包括KYPX!YYGX2SHWYFDV的氨基酸序歹!j，其中Xi是Y，或H,iX2是R。優(yōu)選地，所述抗-VEGF抗體Vh/CDR3具有選自由SEQIDNOs:311-337組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的VH/CDR3可以組合以優(yōu)選的重鏈的其它區(qū)域或其它重鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的輕鏈的可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在VH區(qū)域中具有FR(Vh/FR)，所述FR包括以下氨基酸序列XiVQLVX2SGGGX3VQPGGX4LRLX5CAX6S/CDRlAVX7RQAPGKGLEWVG/CDR2/RXsTX9SX10DXuSKX12X13X14YLQX15NSLRAEDTAVYYCAyCDR3/WX16QGTLVTVSS,其中X,是E，或Q;X2是Q，或E;Xs是V，或L;X4是S,或T;Xs是S，T，或R;Xs是A，或V;X是I，或V;Xs是F，或V;X9是F，或I;Xk)是L，或R是Xh是T，或N;X!2是S，或N;X13是T，Q，或K;Xu是A，或V;X,s是M，或L;iX16是G，或A。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供特異性與人VEGF結(jié)合的單克隆抗體，其具有這樣的Vl和Vh対，所述Vl和Vh対迭自由下列組成的組SEQIDNO:1和70;SEQIDNO:1和67;SEQIDNO:1禾B75;SEQIDNO:1和83;SEQIDNO:14禾n55;SEQIDNO:l和101;SEQIDNO:1和100;SEQIDNO:14和102;SEQIDNO:1和103;SEQIDNO:1和104;SEQIDNO:1和105;SEQIDNO:36和100;SEQIDNO:26和100;SEQIDNO:28和100;SEQIDNO:37和100;SEQIDNO:44禾口100;SEQIDNO:54和100;和SEQIDNO:47和100，優(yōu)選地選自由下列組成的組:SEQIDNO:28和61;SEQIDNO:28和62;SEQIDNO:28和63;SEQIDNO:28禾口64;SEQIDNO:28和68;SEQIDNO:28和85;SEQIDNO:28和86;SEQIDNO:28和87;SEQIDNO:28和88;SEQIDNO:28和89;SEQIDNO:28和90;SEQIDNO:28和91;SEQIDNO:28和92;SEQIDNO:28禾口93;SEQIDNO:28和94;SEQIDNO:28和95;SEQIDNO:28和96;SEQIDNO:28和97;SEQIDNO:28和98;SEQIDNO:28和99;SEQIDNO:28和106;SEQIDNO:28和107;SEQIDNO:28和108;SEQIDNO:28和109;和SEQIDNO:28和110。以scFv,Fab或抗體的其它形式存在，并且在約4°C，25°C，37。C或42°C下測(cè)量時(shí)，由解離常數(shù)Kd所代表的上述抗體與人VEGF的結(jié)合親和力，是任選地低于100nM，任選地低于10nM，任選地低于8nM，任選地低于5nM，任選地低于1nM，任選地低于0.8nM，任選地低于0.5nM，任選地低于0.2函，任選地低于0.1nM，任選地低于0.08nM，任選地低于0.05nM，任選地低于0.01nM，或任選地低于0.005nM。本發(fā)明公開(kāi)的來(lái)自全長(zhǎng)VH和Vl，Vh/CDR，Vh/FR，Vl7CDR，Vl/FR的組合(例如，在圖1A和1B中提供的命中(hit)變體，和在圖1C和1D中顯示的氨基酸序列)的抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)；并且這些組合不包括在美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)09/056,160，公開(kāi)號(hào)2002/0032315中公開(kāi)的抗-VEGF抗體。12附圖簡(jiǎn)述圖1A顯示通過(guò)使用在計(jì)算機(jī)上的本發(fā)明方法來(lái)設(shè)計(jì)Vl命中変體的AA-PVP模式。圖IB顯示通過(guò)使用在計(jì)算機(jī)上的本發(fā)明方法來(lái)設(shè)計(jì)Vh命中変體的AA-PVP模式。圖1C顯示按照本發(fā)明的抗體的某些實(shí)施方案的全長(zhǎng)VL，Vl/CDR，和V:/FR的氨基酸序列。圖1D顯示按照本發(fā)明的抗體的某些實(shí)施方案的全長(zhǎng)VH，VH/CDR，和VH/FR的氨基酸序列。圖2A和2B顯示在25t:下使用BioCore生物傳感器進(jìn)行的人源化抗-VEGF抗體的一組變體的親和力分析。將以單鏈形式存在的抗體片段如下面所述進(jìn)行表達(dá)并進(jìn)行純化。當(dāng)純化的抗體于25r結(jié)合于固定在CM5生物芯片上的其抗原(VEGF)時(shí)，通過(guò)測(cè)量SPR單位(y-軸)對(duì)時(shí)間(x-軸)的變化來(lái)進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)K。。與Koff的比率來(lái)計(jì)算Kd值。還計(jì)算了對(duì)于每種變體抗體，變體Kd與hABl的Kd的比率。將Kon定義為被表示為抗體片段的濃度(以摩爾表示)和時(shí)間(以秒表示)的倍數(shù)(multiple)的倒數(shù)的締合速率常數(shù)；而將K。ff定義為被表示為時(shí)間(以秒表示)的倒數(shù)的解離速率常數(shù)；將Kd定義為解離常數(shù)，其是以摩爾濃度表示的Koff與K。。的比率。hABl包含SEQ1和SEQ55(如果以Fab形式存在，其將基本上是Fab-12，如在Chen等.(1999)J.Mol.Biol.293:865-881中所述)；hAB2包含SEQl和SEQ70;hAB3包含SEQ1和SEQ67;hAB4包含SEQ1和SEQ83;hAB5SEQ1和SEQ75;hAB9包含SEQ14和SEQ102;hAB10包含SEQ1和SEQ103;hABll包含SEQl和SEQ104;hAB12包含SEQl和SEQ105，分別作為Vl和VH。圖2C顯示在35"C下使用BioCore生物傳感器進(jìn)行的一組人源化抗-VEGF抗體的變體進(jìn)行的親和力分析。將以單鏈形式存在的抗體片段如下所述表達(dá)并進(jìn)行純化。當(dāng)純化的抗體于35"結(jié)合于固定在CM5生物芯片上的其抗原(VEGF)時(shí)，通過(guò)測(cè)量SPR單位(y-軸)對(duì)時(shí)間(x-軸)的變化來(lái)進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)K。n與K。ff的比率來(lái)計(jì)算Kd值。還計(jì)算了對(duì)于每種變體抗體，變體Kd與hAB1的Kd的比率。hAB1包含SEQ1和SEQ55(如果以Fab形式存在，其將基本上是Fab-12，如在Chen等.(1999)J.Mol.Biol.293:865-881中所述)；hAB7包含SEQl和SEQ101;hAB8包含SEQl和SEQ100;hAB13包含SEQl和SEQ56(如果以Fab的形式存在，其將是Y0317,如在Chen等.(1999)J.Mol.Biol.293:865-881中所述)；hAB14包含SEQ36和SEQ100;hAB15包含SEQ26和SEQ100;hAB16包含SEQ28和SEQ100;hAB35包含SEQ28和SEQ106;hAB36包含SEQ28和SEQ107;hAB37包含SEQ28和SEQ108;hAB38包含SEQ28和SEQ109;hAB39包含SEQ28和SEQllO，分別作為Vl和VH。圖3顯示使用BIAcore生物傳感器進(jìn)行的6種人源化抗-VEGF抗體的親和力分析。在測(cè)定前，將所述抗體于4'C，37°C，或42"C在lxPBS緩沖液中進(jìn)行溫育16小時(shí)。當(dāng)純化的抗體于25"C結(jié)合固定在CM5生物芯片上的其抗原(VEGF)時(shí)，通過(guò)測(cè)量SPR單位(y-軸)對(duì)時(shí)間(x-軸)的變化來(lái)進(jìn)行測(cè)量。使用1:1Langmuir結(jié)合模型來(lái)測(cè)定結(jié)合速率和脫離速率二者的變化，而通過(guò)K^與Kon的比率來(lái)測(cè)定KdS。如下分別列出Vl和Vh的組成hAB1包含SEQl和SEQ55;hAB2包含SEQl和SEQ70;hAB3包含SEQl和SEQ67;hAB7包含SEQl和SEQ101;hAB8包含SEQl和SEQ100;hAB13包含SEQl和SEQ56，分別作為VL和VH。圖4總結(jié)了在圖3中顯示的人源化抗-VEGF抗體的穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)。y-軸顯示在將純化的抗體如圖3所述在4°C，37'C和42匸溫育16小時(shí)后，在25°C使用BIAcore在結(jié)合固定的VEGF抗原方面保持活性的抗體的百分比。將在不同條件下的每種抗體的最大結(jié)合表示為在4C的結(jié)合的百分位數(shù)。圖5顯示使用如下所述的大腸桿菌CE.co/z')表達(dá)系統(tǒng)的人源化的抗-VEGF抗體的表達(dá)。通過(guò)應(yīng)用相同體積的來(lái)自相同級(jí)分的純化物質(zhì)，如通過(guò)SDS-PAGE/考馬斯藍(lán)染色來(lái)檢測(cè)所顯示，來(lái)評(píng)價(jià)每種抗體片段的表達(dá)水平。如下分別列出Vi^和VH的組成hABl包含SEQl和SEQ55;hAB35包含SEQ28和SEQ106;hAB36包含SEQ28和SEQ107;hAB37包含SEQ28和SEQ108;hAB38包含SEQ28和SEQ109;hAB39包含SEQ28和SEQllO，分別作為VL和VH。圖6顯示在如下所述的真核生物系統(tǒng)中的人源化抗-VEGF抗體的表達(dá)。通過(guò)應(yīng)用相同體積的來(lái)自相同級(jí)分的純化物質(zhì)，如通過(guò)SDS-PAGE/考馬斯藍(lán)染色檢測(cè)所顯示，來(lái)評(píng)價(jià)每種抗體片段的表達(dá)水平。如下分別列出VL和VH的組成hABl包含SEQl和SEQ55;hAB2包含SEQl和SEQ70;hAB3包含SEQ1和SEQ67;hAB5包含SEQ1禾QSEQ75;hAB7包含SEQ1禾BSEQ101;hAB8包含SEQ1和SEQ100;hAB13包含SEQ1和SEQ56，分別作為VL和VH。圖7舉例說(shuō)明用于在大腸桿菌中表達(dá)可溶性抗體片段的載體的圖譜。發(fā)明詳述本發(fā)明提供以需要的結(jié)構(gòu)和功能，來(lái)改造蛋白質(zhì)，特別是抗體的革新性方法。在一個(gè)方面，提供用于設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對(duì)人抗原的抗體。在一些具體的實(shí)施方案中，提供用于設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的人源化抗體或完全的人抗體的方法。在另一個(gè)方面，提供使用這些抗體及其衍生物來(lái)在體外抑制血管發(fā)生的組合物、試劑盒和方法，且所述組合物、試劑盒和方法用于診斷或治療與異常血管發(fā)生相關(guān)的疾病諸如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、與局部缺血-再灌注相關(guān)的腦水腫和損傷、皮質(zhì)局部缺血、卵巢增生和血管過(guò)多、子宮內(nèi)膜異位、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病(retinopaphy)、和其它的眼科血管源性疾病。1.VEGF和針對(duì)VEGF的抗體VEGF是發(fā)育中的關(guān)鍵生血管因子，并且涉及通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)鼠單克隆抗體阻止VEGF-依賴性的細(xì)胞增殖并減緩體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)(KimKJ，LiB，WinerJ，ArmaniniM，GiIIettN，PhillipsHS，F(xiàn)erraraN(1993)Nature362，841-844)。通過(guò)使用噬菌體展示和脫離速率選擇(ChenY，WiesmannC，F(xiàn)uhG，LiB，Christinger鼎，McKayP，deVosAM(1999)JMolBiol293，865-88l)來(lái)對(duì)這種鼠抗體進(jìn)行人源化(PrestaChenH,O'ConnorSJ，ChisholmV,MengYG，Kru醒enL，WinklerM,FerraraN(1997)CancerRes.57，4593-4599;BacaM,PrestaO'ConnorSJ,WellsJA(1997)JBiolChem272，10678-10684)和親和力成熟化。報(bào)道了在VEGF和母體抗體之間形成的復(fù)合體的X-射線結(jié)構(gòu)(MullerYA,ChenY，Christinger匿，LiB，Cunningham,BC，LowmanHB，deVosAM(1998)Structure6，1153-1167。)，以及在VEGF和成熟的抗體之間形成的X-射線結(jié)構(gòu)(ChenY，WiesmannC,FuhQLiB，ChristingerHW，McKayP，deVosAM，LowmanHB(1999)J.MolBiol293,，865-881)。此外，美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/056,160，公開(kāi)號(hào)2002/0032315公開(kāi)了某些抗-VEGF抗體。將這些關(guān)于VEGF和抗-VEGF抗體的出版物的全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。本發(fā)明提供以高親和力和特異性結(jié)合人VEGF的新的抗-VEGF抗體。對(duì)這些抗-VEGF抗體進(jìn)行人源化，并且關(guān)于在結(jié)合親和力、穩(wěn)定性、表達(dá)效率中的一些重要特性進(jìn)行優(yōu)化，所述重要特性對(duì)于研究、診斷和治療應(yīng)用是理想的。當(dāng)以在約4'C、25°C、37'C或42"C測(cè)量的scFv，F(xiàn)ab,或抗體的其它形式存在時(shí)，由解離常數(shù)Kd所代表的本發(fā)明的選定的抗-VEGF抗體對(duì)于人VEGF的結(jié)合親和力，是任選地低于100nM,任選地低于10nM,任選地低于8nM,任選地低于8nM,任選地低于5nM，任選地低于1nM,任選地低于0.8nM,任選地低于0.5nM,任選地低于0.2nM,任選地低于O.lnM，任選地低于0.08nM,任選地低于0.05nM,任選地低于0.01nM,或任選地低于0.005nM。優(yōu)選地，如果以scFv的形式存在，并且在35-37"C的溫度測(cè)量，本發(fā)明的選定抗-VEGF抗體的Kd低于1nM，任選地低于0.8nM，任選地低于0.5nM，任選地低于0.2nM，任選地低于0.1nM，任選地低于0.08nM，任選地低于0.05nM，任選地低于0.01nM，或任選地低于0.005nM。也是優(yōu)選地，如果以Fab的形式存在，并且在35-37。C的溫度進(jìn)行測(cè)量，本發(fā)明的選定的抗-VEGF抗體的Kd低于0.5nM，任選地低于0.2nM，任選地低于0.1nM，任選地低于0.08nM，任選地低于0.05nM，任選地低于0.01nM，或任選地低于0.005nM。在體外的內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF-誘導(dǎo)的增殖的抑制中，當(dāng)以scFv、Fab或抗體的其它形式存在時(shí)，本發(fā)明的選定的抗-VEGF抗體優(yōu)選地具有這樣的EDso(抑制50%細(xì)胞增殖的有效劑量)，所述ED5Q等于或低于10nM，任選16地低于5nM，任選地低于1nM，任選地低于0.5nM，任選地低于0.1nM，任選地低于0.05nM，或任選地低于0.01nM。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有輕鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述輕鏈可變區(qū)包含下列氨基酸序列X〗X2X3X4TQX5PSX6X7SX8X9X!。GXuX!2XuX!4lX,5C2^込17巡l込19S2。X2!X22X23^24WYQQX25PGX26APX27X2sLX29Y^30Z3iX32X33LX34X35GVX36X37RPSGX38X39SGTDFX4QLTIX4iX42LQX43X44DX45AX4fiYYCQQX47^4s^4^5oEX5iIFGX52GTO:53X54IK^其中將下劃線區(qū)域分別稱為V:7CDRl,V!yCDR2，和Vl7CDR3，而將其余區(qū)域稱為構(gòu)架，并且其中指定為"X"的位置可以是下面列出的氨基酸Xj:D，E或AX2:I，或TX3:V，E，K，R，Q，或TX4:M，或LX5:S，或T，X6:S，或TX7:L，或VX8:A，或VX9:S，或TX10P，V，丄，A，或IX11:E，或DX12:R，或TX13A，或VIX14:T，或AX15:T，S，或AX16:S，R，N，K，H，或QX17:A，或SX18:Q，或RX19:S，D，A，或PX20:S，G，R，T，或YX21:T，N，S，D，或KX22:Y，或DX23:L，或IX24:A，N，或TX25:K，或IX26:Q，K，T，或IX27:R，K，Q，N，H，S，或EX28:V，或LX29:I，或VX30:F，A，G，D，或SX31A，或TX32:S，或TX33:N，S，R，或TX34:A，H，或QX35:S，或GX36:P，TX37:S，N，D，G，或YX38:S，或TX39:G，或RX40:T，或A:S，或RX42:S，或RX43:P，或AX44:E，或DX45:F，V，或SX46:V，T，I，A，或SX47:Y，或SX48:S，Y，或NX49:S，或TX50:T，V，A，P，K，G，S，或IX51:W，或YX52:Q，或GX53:V，或LX54:E，D，或A。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可以組合以優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，或組合以其它的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有輕鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述輕鏈可變區(qū)包括下列氨基酸序列XX2X3LTQPPSX4SX5TPGQX6VTISCS巡込s鵬巡io巡i巡i2WYQQXi3PGX"APKXHYX"肌sX'。RPSGVPX,一nRX"SGSX22SX23TSASLAISGLX24SED￡ADYYCX7《X,fiWDDSLX"GYVFGX28GTXQLTVL，其中將下劃線的區(qū)域分別稱為Vl/CDR1，Vl/CDR2，和Vl/CDR3，而將其余的區(qū)域稱為構(gòu)架，并且其中指定為"X"的位置可以是下面列出的氨基酸QL，或Nx2:PAF，或SX3:V，或Mx4:A，或Tx5:G，或Ax6:R，或SX7:S，或Tx8:S，TY，或Nx9:I，或VX10:S，或RX:S，P，N，A，X12:N，T,或YX13:L，或FX14:T，或A19X15rV，L或F，Xi6:M，或IG，T或SXi8:N，或DXi9:Q，或EX20:D，或EX21:F，或LX22:K，或RX23:G，或AX24:Q，L或RX25:A，或GX26:A，S或TX27:N，S或TX28:T，或AK，或Q。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可以組合以優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，或組合以其它重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有輕鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述輕鏈可變區(qū)包括下列氨基酸序列-QSALTQPPSVSGAPGQRVTISCTGRSSNIGAGHDVHWYQQLPGTAPKLLIYANKVTVL(SEQIDNO:54)，這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可以組合以重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，或組合以其它重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有重鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述重鏈可變區(qū)包括下列氨基酸序列XiX2QLVX3SGGGX4VQPGGX5LRLX6CAX7S邁sX^i込ii2^2^i3巡i4HWX,5RQAPGKGXwEWVG孤7腿^巡oX^m222^4^25,26TX"SX2sX29X30SKX3IX32X33YLQX34NSLRAEDTAVYYCAX"YPXwYYGX"SHWYFDVWXwQGTLVTVSS,其中按照Kabat命名法將下劃線區(qū)域分別稱為CDRl，CDR2，和CDR3，而將其余的區(qū)域稱為構(gòu)架，其中被指定為"X"的位置可以是下面列出的氨基酸.-x1:E,或QV，或GX3:Q，或Ex4:V，或Lx5:S，或Tx6-ST，或Rx7:A，或Vx8:Y，或Fx9:T，D,N,S，或AXio:F，或Lx11:T,D，Y,A，S，或NX12:N，H，或Sx13:Y，或FX14:M，L，I或Vx15:I，V，或LL，或PX17:I，或vXi8:Y，或NT，或NX20:E，或AX21:P,T，或SX22:A，或VX23:A,H，Q,P,D，或EX24:D，或EX25:K，或TX26:V,F，或LX27:F，或IX28:L,或RX29:D，或NX30:T，或NX31:S，或NX32:T,Q,P，或KX33:A,V，或PX34:L，或MX35:K，或RX36:H，或YX37:S,R，或TX38:G，或A。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有重鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述重鏈可變區(qū)包括下列氨基酸序列草2QLVX3SGGGX4VQPGGX5LRLX6CAX7S巡込込ioXii^込i-巡i4MWX!5RQAPGKGX'fiEWVGWX,7NTX，"，QGX7nX"TYX"X"X,iFX,;RRX,v;TX"SX，);X丄0SKX31X32X33YLQX34NSLRAEDTAVYYCA^2^2^i2^2￡2^2^22^^;^2^2WX48QGTLVTV，其中按照Kabat命名法，分別將下劃線區(qū)域稱為CDR1，CDR2，和CDR3，而將其余的區(qū)域稱為構(gòu)架，并且其中指定為"X"的位置可以是下面列出的氨基酸x1:E，或Qx2:V，或Gx3:Q，或EV，或Lx5:s，x6:ST，或Rx7:A，或Vx8:Y，或Fx9:T，D，N,S，或AXio:F，或Lx11:T，D,Y,A,S，或NX12:N，H，或SxI3:Y，或FX14:M，L，I或Vx15:I，V，或LL，或PXn:I，或VX!8:Y，或NX19:T，或NX20:E，或AX21:P，T，或SX22:A，或VX23:A，H,Q,P,D，或EX24:D，或EX25:K，或TX26:V，F(xiàn)，或LX27:F，或IX28:L，或RX29:D，或NX30:T，或Nx31:S，或NX32:T，Q，P，或KX33:A,V，或PX34:L，或Mx35-K，R或HX36:YAD或SX37:PRS或GX38:YH，或DX39:Y,或FX40:YNS，或HX41:G，或SX42:S，T,R,G或AX43:S,Y,C，或TX44:H,P,C，N,Q或SX45:W,Q，或CX46:F，或LX47:V,L或YX48:G或A。這些優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列或組合以其它的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗-VEGF抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包括下列其中之一的氨基酸序列SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10,SEQIDNO:ll，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15,SEQIDNO:16，SEQIDNO:17,SEQIDNO:18，SEQIDNO:19,SEQIDNO:20，SEQIDNO:21，SEQIDNO:22，SEQIDNO:23，SEQIDNO:24，SEQIDNO:25，SEQIDNO:27，SEQIDNO:29，SEQIDNO:30，SEQIDNO:31，SEQIDNO:32，SEQIDNO:33，SEQIDNO:34，SEQIDNO:35，SEQIDNO:38，SEQIDNO:39，SEQIDNO:40，SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:48，SEQIDNO:49，SEQIDNO:50，SEQIDNO:51，SEQIDNO:52，和SEQIDNO:53，另外優(yōu)選地SEQIDNO:14，SEQIDNO:26，SEQIDNO:28，SEQIDNO:36，SEQIDNO:37，SEQIDNO:44，SEQIDNO:47，或SEQIDNO:54D這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可以組合以優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列或組合以其它的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗-VEGF抗體，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括下列其中之一的氨基酸序列SEQIDNO:IDNO:57，SEQIDNO:IDNO:58，SEQIDNO:IDNO:59，SEQIDNO:IDNO:60，SEQIDNO:IDNO:65，SEQIDNO:IDNO:66，SEQIDNO:IDNO:69，SEQIDNO:IDNO:71，SEQIDNO:IDNO:72,SEQIDNO:IDNO:73，SEQIDNO:IDNO:74，SEQIDNO:76，SEQIDNO:77，SEQIDNO:78，SEQIDNO:79，SEQIDNO:80，SEQIDNO:81，SEQIDNO:82，SEQIDNO:84，SEQIDNO:85，SEQIDNO:86，SEQIDNO:87，另外優(yōu)選地SEQIDNO:61，或SEQIDNO:62，或SEQIDNO:63，或SEQIDNO:64，或SEQIDNO:67,或SEQIDNO:68，或SEQIDNO:70，或SEQIDNO:75，或SEQIDNO:83，SEQIDNO:88，或SEQIDNO:89，或SEQIDNO:卯，或SEQIDNO:91，或SEQIDNO:92，或SEQIDNO:93，或SEQIDNO:94，或SEQIDNO:95，SEQIDNO:96,SEQIDNO:97，SEQIDNO:98，或SEQIDNO:99，SEQIDNO:100，或SEQIDNO:101，或SEQIDNO:102，或SEQIDNO:103，或SEQIDNO:104,或SEQIDNO:105,或SEQIDNO:106，SEQIDNO:107，或SEQIDNO:108，或SEQIDNO:109，SEQIDNO:110;或SEQIDNOs:285-310之一。這些優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列或組合以其它的輕鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1區(qū)域的抗-VEGF抗體，所述CDR1區(qū)域包括下列其中之一的氨基酸序歹U:SEQIDNO:164,SEQIDNO:165,SEQIDNO:166，SEQIDNO:167，SEQIDNO:168,SEQIDNO:169，SEQDNO:170,SEQIDNO:171,SEQIDNO:172，SEQIDNO:173,SEQIDNO:174，SEQIDNO:175，SEQIDNO:176，SEQIDNO:177，SEQIDNO:178，SEQIDNO:179，SEQIDNO:180，SEQIDNO:181，SEQIDNO:182，SEQIDNO:183，SEQIDNO:184，SEQIDNO:lS5，SEQIDNO:186，SEQIDNO:187，SEQIDNO:188，SEQIDNO:189，SEQIDNO:190，SEQIDNO:191，SEQIDNO:192，SEQIDNO:193，和SEQIDNO:194。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDRl序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2區(qū)域的抗-VEGF抗體，所述CDR2區(qū)域包含下列其中之一的氨基酸序列SEQIDNO:195，SEQIDNO:196，SEQIDNO:197，SEQIDNO:198，SEQIDNO:199，SEQIDNO:200，SEQIDNO:201，SEQIDNO:202，SEQIDNO:203，SEQIDNO:204，SEQIDNO:205，SEQIDNO:206，SEQIDNO:207，SEQIDNO:208，和SEQIDNO:209。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體結(jié)合人VEGF。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3區(qū)域的抗-VEGF抗體，所述CDR3區(qū)域包括下列其中之一的氨基酸序列SEQIDNO:210，SEQIDNO:211，SEQIDNO:212，SEQIDNO:213，SEQIDNO:214,SEQIDNO:215，SEQIDNO:216，SEQIDNO:217，SEQIDNO:218，SEQIDNO:219，SEQIDNO:220，SEQIDNO:221，SEQIDNO:222，SEQIDNO:223，SEQIDNO:224，SEQIDNO:225，SEQIDNO:226，SEQIDNO:227，和SEQIDNO:228。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)域的抗-VEGF抗體，所述構(gòu)架區(qū)域包含下列其中之一的氨基酸序列SEQIDNO:229，SEQIDNO:230，SEQIDNO:231SEQIDNO:233，SEQIDNO:234，SEQIDNO:236，SEQIDNO:238，SEQIDNO:239，SEQIDNO:240，SEQIDNO:241，SEQIDNO:242，SEQIDNO:243，SEQIDNO:244，SEQIDNO:245，SEQIDNO:246，SEQIDNO:247，SEQIDNO:248，SEQIDNO:249，SEQIDNO:250，SEQIDNO:252，SEQIDNO:253，SEQIDNO:254，SEQIDNO:256，SEQIDNO:257，SEQIDNO:258，SEQIDNO:259，SEQIDNO:260，SEQIDNO:261，SEQIDNO:262，SEQIDNO:264，SEQIDNO:266，SEQIDNO:267，SEQIDNO:268，和SEQIDNO:269;另外，優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)域，所述構(gòu)架區(qū)域包含下列其中之一的氨基酸序列SEQIDNO:232,SEQIDNO:235,SEQIDNO:237,SEQIDNO:251,SEQIDNO:255,SEQIDNO:263，和SEQIDNO:265。這些優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)域序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈的CDR區(qū)域，或其它輕鏈的CDR區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列，或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1區(qū)域的抗-VEGF抗體，所述CDR1區(qū)域包括下列其中之一的氨基酸序列-G&X2X3X4XsX6GX7N，其中被指定為"X"的位置可以是下面列出的氨基Xr.Y,或FX2:D,N,T，S，或AX3:F,或LX4:T,D，S,Y,A，或NXs:H，N，或SX6:Y,或FX7:M,L,I,或V。另外，優(yōu)選地，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1區(qū)域包含下列其中之一的氨基酸序列SEQIDNO:lll，SEQIDNO:113，SEQIDNO:114，SEQIDNO:115，SEQIDNO:116，SEQIDNO:117，SEQIDNO:118，SEQIDNO:119，SEQIDNO:120，SEQIDNO:121，SEQIDNO:122，SEQIDNO:123，SEQIDNO:124，SEQIDNO:125'SEQIDNO:126，SEQIDNO:127，SEQIDNO:128'SEQIDNO:129，SEQIDNO:130，SEQIDNO:131，SEQIDNO:132，SEQIDNO:133，SEQIDNO:134，和SEQIDNO:135。這些優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR1序列可以組合以優(yōu)選的重鏈的其它區(qū)域或其它重鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體結(jié)合人VEGF。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2的抗-VEGF抗體，所述CDR2包括下列之一的氨基酸序列WXtNTX2X3GEX4TYX5X6X7FXsR，其中被指定為"X"的位置可以是下面列出的氨基酸X!:I,或VX2:Y，或NX3:T,或NX4:P，T，或SX5:A，或VX6:A,Q,P,H,D,或EX7:D,或EX8:K,或T另外，優(yōu)選地，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2包括下列其中之一的氨基酸序列SEQIDNO:136，SEQIDNO:137，SEQIDNO:138，SEQIDNO:139，SEQIDNO:140，SEQIDNO:141，SEQIDNO:142，SEQIDN:143，SEQIDNO:144，SEQIDNO:145，SEQIDNO:146，SEQIDNO:147，SEQIDNO:148，SEQIDNO:149，SEQIDNO:150，SEQIDNO:151，SEQIDNO:152，SEQIDNO:153，SEQIDNO:154，SEQIDNO:155，和SEQIDNO:156。這些優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列可以組合以優(yōu)選的重鏈或其它重鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力結(jié)合于人VEGF。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3的抗-VEGF抗體，所述CDR3包含氨基酸序列KYPXiYYGX^HWYFDV,其中被指定為"X"的位置可以是下面列出的氨基酸XrY，或H，和X^R。優(yōu)選地，所述抗-VEGF抗體具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3，所述CDR3具有SEQIDNOs:311-337的氨基酸序列，和下列序列hsrhyygsspqyfdvkygyyygsshwyfdvkyphyygashwyfdvkyphyyggchwyfdvkyphyyggshwyfdvkyphyyggynqyfdvkyphyygrshwyfdvkyphyygrsqwy:ldvkyphyysrtcqyfdvkyphyyssshwyfdvkypyfy"gsshwyfdvkypyyhgsshwyfdv'kypyyngsshwyfdvikypyynstshwyfdvkypyysgtshwyfdvkypyysgtshwyfdykypyyygrshwyfdvkypyyygsshwyfdvkypyyygssswyfdvkypytystshwyfdvkyrdfngsshwyfdvkysyyygsshwyfdvRARHYYGSSHCYFDIjRDSHYYGSSHQYFDIjkyphyygtshwyfdvkyphyygsshwyfdvkypyyygtshwyfdv.這些優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3序列可以組合以優(yōu)選的重鏈或其它重鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)域的抗-VEGF抗體，所述構(gòu)架區(qū)域包括下列其中之一的氨基酸序列R2/RX8TX9SX,oDX"SKX。X,3XmYLQX,5NSLRAEDTAVYYCA/CDR3/WX"QGTLVTVSS，其中被指定為"X"的位置可以是下面列出的氨基酸:X1:E，或QX2:Q，或EX3:V，或LX4:S，或TX5:S，T，或RX6:A，或VX7:I，或VX8:F，或VX9:F，或IX10:L，或RX:T，或NX12:S，或NX13:T，Q，或KX14:A，或VX15:M，或LX16:G，或A。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗-VEGF抗體，其包括下列Vl和VH對(duì)其中之一的氨基酸序列SEQIDNO:l和SEQIDNO:70;SEQIDNO:l禾口SEQIDNO:67;SEQIDNO:1和SEQIDNO:75;SEQIDNO:1和SEQIDNO:83;SEQIDNO:14和SEQIDNO:55;SEQIDNO:l和SEQIDNO:101;SEQIDNO:1和SEQIDNO:100;SEQIDNO:14和SEQIDNO:102;SEQIDNO:l和SEQIDNO:103;SEQIDNO:l和SEQIDNO:104;SEQIDNO:l和SEQIDNO:105;SEQIDNO:36和SEQIDNO:100;SEQIDNO:26和SEQIDNO:100;SEQIDNO:28和SEQIDNO:IOO;SEQIDNO:37和SEQIDNO:IOO;SEQIDNO:44和SEQIDNO:100;SEQIDNO:54和SEQIDNO:100;和SEQIDNO:47和SEQEDNO:100，另外優(yōu)選地SEQIDNO:28和SEQIDNO:61;SEQIDNO:28和SEQIDNO:62;SEQIDNO:28和SEQIDNO:63;SEQIDNO:28和SEQIDNO:64;SEQIDNO:28和SEQIDNO:68;SEQIDNO:28和SEQIDNO:85;SEQIDNO:28和SEQIDNO:86;SEQIDNO:28和SEQIDNO:87;SEQIDNO:28和SEQIDNO:88;SEQIDNO:28和SEQIDNO:89;SEQIDNO:28和SEQIDNO:90;SEQIDNO:28和SEQIDNO:91;SEQIDNO:28禾卩SEQIDNO:92;SEQIDNO:28禾卩SEQIDNO:93;SEQIDNO:28和SEQIDNO:94;SEQIDNO:28和SEQIDNO:95;SEQIDNO:28和SEQIDNO:96;SEQIDNO:28禾卩SEQIDNO:97;SEQIDNO:28和SEQIDNO:98;SEQIDNO:28和SEQIDNO:99;SEQIDNO:28和SEQIDNO:106;SEQIDNO:28禾tlSEQIDNO:107;SEQIDNO:28禾QSEQIDNO:108;SEQIDNO:28和SEQIDNO:109;和SEQIDNO:28和SEQIDNO:llO。本發(fā)明公開(kāi)的來(lái)自全長(zhǎng)VH和Vl，Vh/CDR，Vh/FR，Vl/CDR，Vl/FR的組合(例如，在圖IA和IB中提供的命中(hit)變體，和在圖IC和ID中顯示的氨基酸序列)的抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)；并且這些組合不包括在美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)09/056,160，公開(kāi)號(hào)2002/0032315中公開(kāi)的抗-VEGF抗體。2.設(shè)計(jì)和構(gòu)建人源化或完全的人抗-VEGF抗體的方法使用革新方法來(lái)設(shè)計(jì)本發(fā)明的抗體，所述方法包括在計(jì)算機(jī)上和在體外構(gòu)建和選擇蛋白質(zhì)文庫(kù)。下面描述所述方法的一些方面。更詳細(xì)的方法的描述出現(xiàn)在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/443,134，10/153,159，10/153,176，10/125,687，和60/284,407中，將它們?nèi)績(jī)?nèi)容并入本文作為參考。按照本發(fā)明，提供有效產(chǎn)生和篩選蛋白質(zhì)文庫(kù)得到具有理想生物學(xué)功能的優(yōu)化的蛋白質(zhì)的革新方法，所述生物學(xué)功能諸如針對(duì)生物學(xué)和治療上重要的靶分子的結(jié)合親和力。將所述方法用于通過(guò)產(chǎn)生具有提高的特性的蛋白質(zhì)的新變體來(lái)優(yōu)化蛋白質(zhì)。具體而言，將該方法用于設(shè)計(jì)文庫(kù)用于非人抗體的人源化，和優(yōu)化抗體的親和力和其它特性。以人或類人序列來(lái)產(chǎn)生抗體的氨基酸和核酸的新變體，同時(shí)它們的結(jié)合親和力、穩(wěn)定性和表達(dá)效率得到顯著提高。通過(guò)開(kāi)采所有的生物，尤其是人的蛋白質(zhì)序列的不斷擴(kuò)充的數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過(guò)使它們的特異性序列或它們的變體與功能提高諸如通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)而以高通量方式在計(jì)算機(jī)上實(shí)施本發(fā)明的方法。通過(guò)使用本發(fā)明的方法，可以基于極端多樣化的蛋白質(zhì)序列的計(jì)算機(jī)評(píng)價(jià)和在計(jì)算機(jī)上的功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)來(lái)構(gòu)建擴(kuò)充的和功能上有偏向(biased)的蛋白質(zhì)諸如抗體的文庫(kù)，并將其隨后通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選和體外或體內(nèi)選擇來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于設(shè)計(jì)和選擇具有理想的功能的蛋白質(zhì)的方法。所述方法基于在下文被稱為"前導(dǎo)序列"的前導(dǎo)蛋白質(zhì)的耙結(jié)構(gòu)/功能性基序或結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，通過(guò)在計(jì)算機(jī)上^w7/")的蛋白質(zhì)序列的選擇，優(yōu)選地，在計(jì)算機(jī)上來(lái)進(jìn)行。將所述前導(dǎo)序列用于搜索蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇取決于設(shè)計(jì)的基序的具體功能要求。例如，如果前導(dǎo)蛋白質(zhì)是酶并且靶基序包括酶的活性位點(diǎn)，使用各種搜索標(biāo)準(zhǔn)來(lái)產(chǎn)生命中的序列列表可以查詢特定起源、生物、物種或其組合的蛋白質(zhì)/肽的數(shù)據(jù)庫(kù)，所述命中的序列列表中的每個(gè)都可以取代前導(dǎo)蛋白質(zhì)中的靶基序?？梢詫㈩愃频姆椒ㄓ糜谠O(shè)計(jì)前導(dǎo)蛋白質(zhì)的其它基序或結(jié)構(gòu)域?？梢詫⒚總€(gè)個(gè)體基序/結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行組合以產(chǎn)生設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的文庫(kù)。此外，為了減少用于人應(yīng)用，諸如治療或診斷的設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的免疫原性，優(yōu)選地搜索人起源的蛋白質(zhì)或人源化蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)產(chǎn)生命中的序列列表，所述命中的序列列表尤其是針對(duì)來(lái)自前導(dǎo)蛋白質(zhì)的位點(diǎn)的基序，所述基序充當(dāng)前導(dǎo)蛋白質(zhì)的支架諸如抗體的構(gòu)架?？梢詫?duì)被設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的文庫(kù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)從而產(chǎn)生具有超過(guò)所述前導(dǎo)蛋白質(zhì)的提高的生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的特定方面，所述本發(fā)明的方法在設(shè)計(jì)抗體中來(lái)進(jìn)行，所述設(shè)計(jì)的抗體在序列上多樣然而在功能上彼此相關(guān)?；诒辉O(shè)計(jì)的抗體序列，可以構(gòu)建抗體的文庫(kù)從而以高通量方式，包括在非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)域(CDRs)和/或人源化構(gòu)架(FRs)中的多樣序列。可以針對(duì)廣泛多樣的靶分子來(lái)篩選這種抗體文庫(kù)的新的或提高的功能。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供基于前導(dǎo)抗體中的區(qū)域的氨基酸序列，在計(jì)算機(jī)上選擇抗體序列的方法，所述氨基酸序列在下文被稱為"前導(dǎo)序列"。將所述前導(dǎo)序列用于搜索蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇取決于被設(shè)計(jì)的基序的具體功能要求。例如為了設(shè)計(jì)用于治療性應(yīng)用的可變鏈的構(gòu)架區(qū)域，除了幾個(gè)結(jié)構(gòu)上關(guān)鍵的位點(diǎn)，應(yīng)該使用蛋白質(zhì)序列的集合，所述蛋白質(zhì)序列在進(jìn)化上相關(guān)，諸如完全人的免疫球蛋白序列和人種系免疫球蛋白序列。這將通過(guò)在這高度保守的區(qū)域(對(duì)于構(gòu)架區(qū)域)中盡可能少的引入外源突變體，通過(guò)保存序列的起源而減少免疫原性應(yīng)答。在另一方面，可以將多樣化的序列數(shù)據(jù)庫(kù)諸如genbank中的各種物種的免疫球蛋白序列或甚至不相關(guān)序列用于設(shè)計(jì)CDRs從而提高在這種高度可變區(qū)中與抗原的結(jié)合親和力。通過(guò)使用所述方法，可以構(gòu)建多樣的抗體序列的文庫(kù)，并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)在體外或在體內(nèi)來(lái)篩選具有改善或需要的功能的抗體的突變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VO的可變區(qū)的氨基酸序列；鑒定在前導(dǎo)抗體的CDRs中的氨基酸序列；選擇在前導(dǎo)抗體的VH或V^區(qū)域中的CDRs其中之一；提供在選定的CDR中包括至少3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是前導(dǎo)序列；將前導(dǎo)序列與多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；和從多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述肽片段與前導(dǎo)序列具有至少15%的序列同一性，所述選定的肽片段形成命中文庫(kù)。所述方法還包括下列步驟構(gòu)建包括編碼所述命中文庫(kù)的氨基酸序列的DNA片段的核酸文庫(kù)。任選地，所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建命中文庫(kù)的氨基酸位置(positional)變體圖譜；通過(guò)將氨基酸位置變體反向翻譯(back-translating)成它們相應(yīng)的遺傳密碼子而將命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜轉(zhuǎn)化成核酸位置變體圖譜;和通過(guò)以組合方式將核酸位置變體組合在一起而構(gòu)建DNA片段的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)。任選地，所述遺傳密碼子可以是這樣的密碼子，其優(yōu)選用于在細(xì)菌中的表達(dá)。任選地，遺傳密碼子可以是這樣的密碼子，其可以減少選擇的大小從而使DNA片段的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)的多樣性在實(shí)驗(yàn)上可覆蓋的多樣性范圍內(nèi)，而無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)嘗試，例如，低于1x107，并且優(yōu)選地低于1x106。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VO的可變區(qū)的氨基酸序列；鑒定在前導(dǎo)抗體的CDRs和FRs中的氨基酸序列；選擇在前導(dǎo)抗體的VH或VL區(qū)域的CDRs其中之一；提供包括至少3個(gè)在選定的CDR中的連續(xù)的氨基酸殘基的第一氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是CDR前導(dǎo)序列；將CDR前導(dǎo)序列與多種CDR測(cè)試(tester)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；從多種CDR測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述肽片段與CDR前導(dǎo)序列具有至少15%的序列同一性，所述選定的肽片段形成CDR命中文庫(kù)；選擇在前導(dǎo)抗體的Vh或Vl區(qū)域中的FRs的其中之一；提供在選定的FR中包括至少3個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的第二氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是FR前導(dǎo)序列；將所述FR前導(dǎo)序列與多種FR測(cè)試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；并且從多種FR測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述肽片段與所述FR前導(dǎo)序列具有至少15%的序列同一性，所述選定的肽片段形成FR命中文庫(kù)；并且將CDR命中文庫(kù)和FR命中文庫(kù)進(jìn)行組合以形成命中文庫(kù)。按照所述方法，多種CDR測(cè)試蛋白質(zhì)序列可以包括人或非人抗體的氨基酸序列。此外，按照所述方法，多種FR測(cè)試蛋白質(zhì)序列可以包括人起源，優(yōu)選地人或人源化抗體(例如，在Vh或Vl中具有至少50%人序列，優(yōu)選地具有至少70%人序列，更優(yōu)選地具有至少90%人序列，并且最優(yōu)選地具有至少95%人序列的抗體)，更優(yōu)選地，完全的人抗體，并且最優(yōu)選地人種系抗體的氨基酸序列。此外，按照所述方法，將多種CDR測(cè)試蛋白質(zhì)序列中的至少一種與多種FR測(cè)試蛋白質(zhì)序列中區(qū)分開(kāi)。此外，按照所述方法，多種CDR測(cè)試蛋白質(zhì)序列是人或非人抗體序列并且多種FR測(cè)試蛋白質(zhì)序列是人抗體序列，優(yōu)選地人種系抗體序列。所述方法還包括下列步驟構(gòu)建包括編碼所述命中文庫(kù)的氨基酸序列的DNA片段的核酸文庫(kù)。任選地，所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建所述CDR命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜；通過(guò)將氨基酸位置變體反向翻譯(back-translating)成它們相應(yīng)的遺傳密碼子而將CDR命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜轉(zhuǎn)化成第一核酸位置變體圖譜；和通過(guò)以組合方式將核酸位置變體組合在一起而構(gòu)建DNA片段的簡(jiǎn)并CDR核酸文庫(kù)。任選地，所述遺傳密碼子可以是這樣的密碼子，其優(yōu)選用于在細(xì)菌中的表達(dá)。任選地，遺傳密碼子可以是這樣的密碼子，其可以減少選擇的大小從而使DNA片段的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)的多樣性在實(shí)驗(yàn)上可覆蓋的多樣性范圍內(nèi)，而無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)嘗試，例如，多樣性低于1x107，優(yōu)選地低于1x106。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(vh)或輕鏈(VO的可變區(qū)的氨基酸序列；鑒定前導(dǎo)抗體的FRs的氨基酸序列；選擇前導(dǎo)抗體的vh或vl區(qū)域中的FRs的其中之一；提供包括在選定的FR中至少3個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的第一氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是第一FR前導(dǎo)序列；將第一前導(dǎo)FR序列與多種FR測(cè)試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；和從多種FR測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述至少兩種肽片段與第一FR前導(dǎo)序列具有至少15%的序列同一性，所述選定的肽片段形成第一FR命中文庫(kù)。所述方法還可以包括下列步驟提供在不同于選定的FR的包括FR中至少3個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的第二氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是第二FR前導(dǎo)序列；將第二FR前導(dǎo)序列與多種FR測(cè)試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；和從多種FR測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述肽片段與所述第二FR序列具有至少15%的序列同一性，所述選定的肽片段形成第二FR命中文庫(kù)；并且將第一FR命中文庫(kù)和第二FR命中文庫(kù)進(jìn)行組合從而形成命中文庫(kù)。按照所述方法，前導(dǎo)CDR序列可以包括選定的CDR中至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。所述選定的CDR可以選自由所述前導(dǎo)抗體的VHCDR1，VhCDR2，VhCDR3，VlCDR1，VlCDR2，和VlCDR3組成的組。此外，按照所述方法，所述前導(dǎo)FR序列可以包括選定的FR中至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。所述選定的FR可以選自由所述前導(dǎo)抗體的VHFR1，VhFR2，VhFR3，VhFR4，VlFR1，VLFR2，VLFR3和VLFR4組成的組。所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建包括編碼命中文庫(kù)的氨基酸序列的DNA片段的核酸或簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供基于在前導(dǎo)抗體中的區(qū)域的氨基酸序列，艮卩，"前導(dǎo)序列"及其3D結(jié)構(gòu)，在計(jì)算機(jī)上選擇抗體序列的方法。將前導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)用于關(guān)于具有類似的3D結(jié)構(gòu)的片段對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索。將這些片段進(jìn)行比對(duì)從而產(chǎn)生序列圖譜，在下文將其稱為"前導(dǎo)序列圖譜"。將所述前導(dǎo)序列圖譜用于關(guān)于具有低序列同一性然而在結(jié)構(gòu)上類似的前導(dǎo)序列的遠(yuǎn)距離的同源物，對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索。通過(guò)使用所述方法，可以構(gòu)建多樣的抗體序列的文庫(kù)并且將其通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法在體外或在體內(nèi)篩選具有提高的或需要的功能的抗體的突變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VL)的可變區(qū)的氨基酸序列；鑒定前導(dǎo)抗體的CDRs中的氨基酸序列；選擇在前導(dǎo)抗體的VH或VL區(qū)域中的CDRs其中之一；提供包括選定的CDR中至少3個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是前導(dǎo)序列；提供所述前導(dǎo)序列的三維結(jié)構(gòu)；基于所述前導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜；將所述前導(dǎo)序列圖譜與多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；和從多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述肽片段與前導(dǎo)序列具有至少10%的序列同一性，所述選定的肽片段形成命中文庫(kù)。按照所述方法，前導(dǎo)序列的三維結(jié)構(gòu)可以是衍生自X-晶體學(xué)、核磁共振(NMR)光譜學(xué)或理論結(jié)構(gòu)建模的結(jié)構(gòu)。按照所述方法，構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜的步驟可以包括將所述前導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)與多種測(cè)試蛋白質(zhì)片段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較；確定前導(dǎo)序列和測(cè)試蛋白質(zhì)片段的主鏈構(gòu)象的均方根差；選擇主鏈構(gòu)象的均方根差小于5A，優(yōu)選地小于4A，更優(yōu)選地小于3A，和最優(yōu)選地小于2A的測(cè)試蛋白質(zhì)片段；并且將選定的測(cè)試蛋白質(zhì)片段與所述前導(dǎo)序列的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比以構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜。任選地，多種測(cè)試蛋白質(zhì)片段的結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。任選地，構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜的步驟可以包括將前導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)與多種測(cè)試蛋白質(zhì)片段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較；確定前導(dǎo)序列和測(cè)試蛋白質(zhì)片段的主鏈構(gòu)象的Z-得分(score);選擇具有高于2，優(yōu)選地高于3，更優(yōu)選地高于4并且最優(yōu)選地高于5的Z-得分的測(cè)試蛋白質(zhì)片段的片段；并且對(duì)選定的測(cè)試蛋白質(zhì)片段與前導(dǎo)序列的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比以構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜。任選地，構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜的步驟可以通過(guò)選自由CE，MAPS,MonteCarlo和3D聚簇算法組成的組的算法來(lái)進(jìn)行。所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建包括編碼命中文庫(kù)的氨基酸序列的DNA片段的核酸文庫(kù)。任選地，所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建所述命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜；通過(guò)將氨基酸位置變體反向翻譯為它們相應(yīng)的三核苷酸密碼子來(lái)將命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)楹怂嵛恢米凅w圖譜；和通過(guò)將核酸位置變體以組合方式組合在一起來(lái)構(gòu)建DNA片段的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供基于前導(dǎo)抗體的3D結(jié)構(gòu)來(lái)在計(jì)算機(jī)上選擇抗體序列的方法。將來(lái)自前導(dǎo)抗體的特定區(qū)域的前導(dǎo)序列或序列圖譜用于關(guān)于前導(dǎo)序列的遠(yuǎn)同源物進(jìn)行對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，所述前導(dǎo)序列的遠(yuǎn)同源物具有低序列同一性然而在結(jié)構(gòu)上類似。這些遠(yuǎn)同源物形成命中文庫(kù)。對(duì)命中文庫(kù)中的序列進(jìn)行關(guān)于它們與前導(dǎo)抗體的3D結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)相容性的評(píng)估，將所述3D結(jié)構(gòu)在下文稱為"前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板"。選擇在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板在結(jié)構(gòu)上相容的命中文庫(kù)中的序列，并將其在體外或在體內(nèi)，以實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行關(guān)于具有提高的或需要的功能的抗體突變體的篩選。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VL)的可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具有已知的被定義為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的三維結(jié)構(gòu)；鑒定在前導(dǎo)抗體的CDRs中的氨基酸序列；選擇前導(dǎo)抗體的VH或Vl區(qū)域的CDRs其中之一；提供包括選定的CDR中至少3個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是前導(dǎo)序列；將所述前導(dǎo)序列圖譜與多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；從多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述至少兩種肽片段與前導(dǎo)序列具有至少10%的序列同一性，所述選定的肽片段形成命中文庫(kù)；使用得分函數(shù)來(lái)確定命中文庫(kù)的成員在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板是否相容；和選擇命中文庫(kù)的成員，所述成員的評(píng)分等于或好于或等于前導(dǎo)序列。按照所述方法，得分函數(shù)是選自由靜電相互作用、范德華相互作用、靜電溶劑化能、溶劑可及的表面溶劑化能，和構(gòu)象熵組成的組的能量得分函數(shù)。任選地，所述得分函數(shù)是結(jié)合力場(chǎng)(forcefield)的函數(shù)，所述力場(chǎng)選自由Amber力場(chǎng)，Charmm力場(chǎng)，Discovercvff力場(chǎng)，ECEPP力場(chǎng)，GROMOS力場(chǎng)，OPLS力場(chǎng)，MMFF94力場(chǎng)，Tripos力場(chǎng)，MM3力場(chǎng)，Dreiding力場(chǎng)，UNRES力場(chǎng)和其它的基于常識(shí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)力場(chǎng)(均場(chǎng))和基于結(jié)構(gòu)的熱力勢(shì)函數(shù)組成的組。此外按照所述方法，選擇命中文庫(kù)的成員的步驟包括選擇這樣的命中文庫(kù)的成員，基于式AE總=Evdw+Ea十E角十E靜電+5溶辦匕計(jì)算，其與前導(dǎo)序列的總能量相比，具有更低或相同的總能量。此外，按照所述方法，選擇命中文庫(kù)的成員的步驟包括選擇這樣的命中文庫(kù)的成員，所述命中文庫(kù)的成員與前導(dǎo)序列的結(jié)合自由能相比，具有更低的結(jié)合自由能，所述結(jié)合自由能使用改進(jìn)的得分函數(shù)被計(jì)算為在結(jié)合的和未結(jié)合的狀態(tài)之間的差異-△Gb-AG薩+AGsol-TASSS其中△Gmm——AGele+AGvdw(1)AGsol=AGeie.soi+AGASA(2)所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建包括DNA片段的核酸文庫(kù)，所述DNA片段編碼所述命中文庫(kù)的氨基酸序列。任選地，所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建所述命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜；通過(guò)將氨基酸位置變體反向翻譯成它們相應(yīng)的三核苷酸密碼子來(lái)將命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)楹怂嵛恢米凅w圖譜；和通過(guò)將核酸位置變體以組合方式組合在一起來(lái)構(gòu)建DNA片段的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供基于以下總稱為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的前導(dǎo)抗體的3D結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)集合(ensemble)或多個(gè)抗體的結(jié)構(gòu)集合，在計(jì)算機(jī)上選擇抗體序列的方法。前導(dǎo)抗體特定區(qū)域的前導(dǎo)序列或序列圖譜被用于搜索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中前導(dǎo)序列的遠(yuǎn)(remote)同源物，其具有低序列同一性然而結(jié)構(gòu)類似。這些遠(yuǎn)同源物形成命中文庫(kù)?；谠谇皩?dǎo)序列每個(gè)位置上出現(xiàn)的氨基酸變體頻率，構(gòu)建命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜(AA-PVP)?；贏A-PVP,通過(guò)以組合的方式組合前導(dǎo)序列每個(gè)位置的氨基酸變體并且截止(CUtoff)或不截止低頻率變體來(lái)構(gòu)建命中變體文庫(kù)。將命中變體文庫(kù)的序列進(jìn)行它們與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的結(jié)構(gòu)相容性的評(píng)估。選擇命中文庫(kù)中與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板結(jié)構(gòu)相容的序列并用體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)篩選具有改善或所需功能的抗體變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包含以下步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VJ可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具有被定義為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的已知的三維結(jié)構(gòu)；鑒定前導(dǎo)抗體的CDRS中的氨基酸序列；選擇前導(dǎo)抗體Vh或Vl區(qū)中的CDRs之一；提供包含選定的CDRs中至少3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列，選定的氨基酸序列是前導(dǎo)序列；將前導(dǎo)序列與多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列比較；從多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有至少10%序列同一性的肽片段，'選定的肽片段形成命中文庫(kù)；基于在前導(dǎo)序列每個(gè)位置出現(xiàn)的氨基酸變體頻率，構(gòu)建命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜；組合命中文庫(kù)中的氨基酸變體以產(chǎn)生形成命中變體文庫(kù)的命中變體的組合；使用得分函數(shù)確定命中變體文庫(kù)的成員是否在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板相容；和選擇得分等于或好于前導(dǎo)序列的命中變體文庫(kù)成員。按照該方法，組合命中文庫(kù)中氨基酸變體的步驟包括選擇這樣的氨基酸變體，所述氨基酸變體具有比氨基酸截止發(fā)生的頻率的2%，優(yōu)選地5%，更優(yōu)選地8^倍(times)，和最優(yōu)選地10%更高的出現(xiàn)頻率，于是如果它們?cè)诮刂购髞G失則包括來(lái)自前導(dǎo)序列的一些氨基酸；和組合命中文庫(kù)中選定的氨基酸變體以產(chǎn)生形成命中變體文庫(kù)的命中變體的組合。按照所述方法，得分函數(shù)是選自由下列各項(xiàng)組成的組的能量得分函數(shù)-靜電相互作用，范德華相互作用，靜電溶劑化能，溶劑可及表面溶劑化能，和構(gòu)象熵。任選地，得分函數(shù)是結(jié)合選自由下列各項(xiàng)組成的組的力場(chǎng)的函數(shù)Amber力場(chǎng)，Charmm力場(chǎng)，Discovercvff力場(chǎng)，ECEPP力場(chǎng)，GROMOS力場(chǎng)，OPLS力場(chǎng)，MMFF94力場(chǎng)，Tripos力場(chǎng)，MM3力場(chǎng)，Dreiding力場(chǎng)，和UNRES力場(chǎng)，以及其它基于知識(shí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)力場(chǎng)(均場(chǎng))和基于結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)勢(shì)函數(shù)。所述方法還可以包含以下步驟構(gòu)建包含編碼命中變體文庫(kù)的選定成員的氨基酸序列的DNA片段的核酸文庫(kù)。任選地，所述方法還可以包含以下步驟將命中變體的選定成員劃分和解析成至少兩個(gè)命中變體子文庫(kù)；選擇命中變體子文庫(kù)；構(gòu)建選定的命中變體子文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜；通過(guò)將氨基酸位置變體反翻譯成它們相應(yīng)的三核苷酸密碼子，將選定的命中變體子文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜轉(zhuǎn)變成核酸位置變體圖譜；和通過(guò)以組合的方式組合核酸位置變體構(gòu)建DNA片段的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)。解析(parsing)命中變體文庫(kù)的步驟可包括隨機(jī)選擇10-30個(gè)得分等于或好于前導(dǎo)序列的命中變體文庫(kù)成員，所述選定的成員形成變體子文庫(kù)°任選地，解析命中變體文庫(kù)的步驟可以包括構(gòu)建命中變體文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜，得到命中變體圖譜；基于前導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)集合的Ox或C卩或重原子在特定距離截止值(8A-4.5A)范圍內(nèi)的接觸圖譜，將命中變體圖譜解析成子變體圖譜的片段。結(jié)構(gòu)模型或前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板在8A，優(yōu)選6A，更優(yōu)選5A，和最優(yōu)選4.5A的距離內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，該方法包含以下步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VO可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具有已知的三維結(jié)構(gòu)；提供一個(gè)或多個(gè)抗體的3D結(jié)構(gòu)，所述一個(gè)或多個(gè)抗體與前導(dǎo)抗體相比在Vh或Vl區(qū)具有不同的序列；通過(guò)組合前導(dǎo)抗體和一個(gè)或多個(gè)抗體的結(jié)構(gòu)形成結(jié)構(gòu)集合；將結(jié)構(gòu)集合定義為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板；鑒定前導(dǎo)抗體的CDRs中的氨基酸序列；選擇前導(dǎo)抗體VH或VL區(qū)中的CDRs之一；提供在選定的CDRs中包含至少3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是前導(dǎo)序列；將前導(dǎo)序列與多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列比較；從多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有至少10%序列同一性的肽片段，所述選定的肽片段形成命中文庫(kù)；基于在前導(dǎo)序列每個(gè)位置出現(xiàn)的氨基酸變體的頻率，構(gòu)建命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜；組合命中文庫(kù)中的氨基酸變體以產(chǎn)生形成命中變體文庫(kù)的命中變體的組合；使用得分函數(shù)確定命中變體文庫(kù)的成員是否在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板相容；和選擇得分等于或好于前導(dǎo)序列的命中變體文庫(kù)成員。在具體實(shí)施方案中，所述方法包含以下步驟a)提供前導(dǎo)抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VL)可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具有已知的三維結(jié)構(gòu)；b)鑒定前導(dǎo)抗體的CDRS中的氨基酸序列；C)選擇前導(dǎo)抗體VH或Vl區(qū)中的CDRs之一；d)提供包含選定CDRs中至少3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列，將選定氨基酸序列定義為前導(dǎo)序列；e)將前導(dǎo)序列與多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列比較；f)從多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有至少10%序列同一性的肽片段，選定肽片段形成命中文庫(kù)；g)基于在前導(dǎo)序列每個(gè)位置出現(xiàn)的氨基酸變體頻率，構(gòu)建命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜；h)組合命中文庫(kù)中的氨基酸變體以產(chǎn)生形成命中變體文庫(kù)的命中變體的組合；I)使用得分函數(shù)確定命中變體文庫(kù)的成員是否在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板相容；j)選擇得分等于或好于前導(dǎo)序列的命中變體文庫(kù)成員；k)構(gòu)建包含編碼命中變體文庫(kù)選定成員的氨基酸序列的DNA片段的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)；1)測(cè)定核酸文庫(kù)的多樣性，如果多樣性高于lxl06，重復(fù)步驟j)至1)直至核酸文庫(kù)的多樣性等于或低于lxlO6;m)將簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)中的DNA片段引入宿主生物體細(xì)胞；n)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA片段以使在宿主生物體細(xì)胞中產(chǎn)生含有命中文庫(kù)的氨基酸序列的重組抗體；o)選擇以高于1(^M"的親和力結(jié)合耙抗原的重組抗體；和p)如果未發(fā)現(xiàn)以高于10SM—1的親和力結(jié)合靶抗原的重組抗體，重復(fù)步驟e)至o)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法包含以下步驟a)提供前導(dǎo)抗體的重鏈(VH)或輕鏈(VL)可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具有已知的被定義為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的三維結(jié)構(gòu)；b)鑒定前導(dǎo)抗體的CDRs中的氨基酸序列；c)選擇前導(dǎo)抗體Vh或Vl區(qū)中的CDRs之一；d)提供包含選定的CDRs中至少3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列被定義為前導(dǎo)序列；e)通過(guò)用一個(gè)或多個(gè)不同的氨基酸殘基替代前導(dǎo)序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基突變前導(dǎo)序列，產(chǎn)生前導(dǎo)序列突變文庫(kù)；f)使用第一得分函數(shù)確定前導(dǎo)序列突變文庫(kù)的成員是否與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板在結(jié)構(gòu)上相容；g)選擇分?jǐn)?shù)等于或好于前導(dǎo)序列的前導(dǎo)序列突變體；h)將前導(dǎo)序列與多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列比較；I)從多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有至少10%序列同一性的肽片段，所述選定的肽片段形成命中文庫(kù)；j)基于在前導(dǎo)序列每個(gè)位置出現(xiàn)的氨基酸變體頻率，構(gòu)建命中文庫(kù)的氨基酸位置變體圖譜；k)組合命中文庫(kù)中的氨基酸變體以產(chǎn)生命中變體的組合；1)結(jié)合所述選定的前導(dǎo)序列突變體和命中變體的組合以產(chǎn)生命中變體文庫(kù)；m)使用第二得分函數(shù)確定命中變體文庫(kù)的成員是否在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板相容；n)選擇分?jǐn)?shù)等于或好于前導(dǎo)序列的命中變體文庫(kù)的成員；o)構(gòu)建包含編碼命中變體文庫(kù)的選定成員的氨基酸序列的DNA片段的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)；p)測(cè)定核酸文庫(kù)的多樣性，如果多樣性高于lx106，重復(fù)步驟n)至p)直至核酸文庫(kù)的多樣性等于或低于lxlO6;q)將簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)中的DNA片段引入宿主生物體的細(xì)胞；r)在宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA片段以使在宿主生物體細(xì)胞中產(chǎn)生包含命中文庫(kù)的氨基酸序列的重組抗體；s)選擇以高于10SM"的親和力結(jié)合靶抗原的重組抗體；和t)如果未發(fā)現(xiàn)以高于1(^M"的親和力結(jié)合靶抗原的重組抗體，重復(fù)步驟e)至s)。在本發(fā)明的另一方面，提供基于前導(dǎo)抗體構(gòu)建突變抗體文庫(kù)的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包含將包含前導(dǎo)抗體CDR區(qū)域中至少3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列作為輸入，所述氨基酸序列為前導(dǎo)序列；利用計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的邏輯比較前導(dǎo)序列和多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列；從多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有至少15%序列同一性的肽片段；和產(chǎn)生作為輸出的形成命中文庫(kù)的選定的肽片段。按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為介于5-100aa之間，更優(yōu)選介于6-80aa之間，最優(yōu)選介于8-50aa之間。按照上述方法中任何一種，通過(guò)使用Kabat標(biāo)準(zhǔn)或Chothia標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定CDRs中氨基酸序列的步驟。此外，按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列可包含來(lái)自前導(dǎo)抗體VH或Vl中特定區(qū)域，CDR1，CDR2或CDR3，或來(lái)自CDR和FRs的組合，如CDR1-FR2，F(xiàn)R2-CDR2-FR3，和全長(zhǎng)Vh或Vt序列的氨基酸序列。前導(dǎo)序列優(yōu)選包含選定的CDR中至少6個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，更優(yōu)選地選定CDR中至少7個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，最優(yōu)選選定CDR中所有氨基酸殘基。還按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列還可包含至少一個(gè)緊鄰選定CDR的氨基酸殘基。還按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列還可包含至少一個(gè)在選定CDR側(cè)翼的FRs。還按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列可另外包含一個(gè)或多個(gè)鄰近選定CDR的C-末端或N-末端的CDRs或FRs。還按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板可以是完全組裝前導(dǎo)抗體或前導(dǎo)抗體重鏈或輕鏈可變區(qū)(例如CDR，F(xiàn)R及其組合)的3D結(jié)構(gòu)。還按照上述方法中任何一種，多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列包括優(yōu)選地，抗體序列，更優(yōu)選人抗體序列，和最優(yōu)選人種系抗體序列(v-數(shù)據(jù)庫(kù))，特別是關(guān)于構(gòu)架區(qū)。還按照上述方法中任何一種，從NIH的genbank或Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)或關(guān)于抗體CDRs的Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列。還按照上述方法中任何一種，比較前導(dǎo)序列與多種測(cè)試蛋白質(zhì)序列的步驟是通過(guò)選自由BLAST,PSI-BLAST，圖譜HMM，和COBLATH組成的組的算法來(lái)實(shí)現(xiàn)。還按照上述方法中任何一種，命中文庫(kù)中選定肽片段與前導(dǎo)序列的序列同一性優(yōu)選地是至少25%，優(yōu)選地是至少35%，最優(yōu)選地是至少45%。還按照上述方法中任何一種，該方法另外包含下列步驟將核酸或簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)中的DNA片段引入宿主生物體細(xì)胞中；在宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA片段以使含有由核酸或簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)編碼的命中文庫(kù)的氨基酸序列的重組抗體在宿主生物體細(xì)胞中生產(chǎn)；和選擇以高于10SM—1，任選地107M"，任選地1()8M"1，任選地109m"，任選地2xl()9M"，任選地5乂109]\4-1，任選地lxl01QM"，任選地5xl01QM"，和任選地lxl()h]Vr1的親和力結(jié)合靶抗原的重組抗體。重組抗體可以是完全組裝的抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)v片段，或單鏈抗體。宿主生物包括能夠表達(dá)轉(zhuǎn)移的外源基因序列的任何生物或其細(xì)胞系，包括但不限于細(xì)菌，酵母，植物，昆蟲，和哺乳動(dòng)物。重組抗體可以是完全組裝的抗體，F(xiàn)ab片段，.Fv片段，或單鏈抗體。例如重組抗體可以在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)和在噬菌體顆粒的表面上展示。在噬菌體顆粒上展示的重組抗體可以是在vh和vl之間形成的雙鏈雜二聚體。通過(guò)在分別與Vh和V^鏈融合的兩條非抗體多肽鏈之間形成的雜二聚體可促進(jìn)VH和V:j連的雜二聚體化。例如，這兩個(gè)非抗體多肽可以分別來(lái)源于雜二聚體的受體GABABRl(GR1)和R2(GR2)。備選地，在噬菌體顆粒上展示的重組抗體可以是含有通過(guò)肽接頭連接的Vh和Vl的單鏈抗體。通過(guò)單鏈抗體與GR1的融合和噬菌體pIII衣殼蛋白與GR2的融合之間形成的雜二聚體可以促進(jìn)噬菌體顆粒表面上單鏈抗體的展示。篩選針對(duì)的靶抗原包括小分子和大分子如蛋白質(zhì)，肽，核酸和多糖。上述方法的任一種還可以包含下列步驟將核酸或簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)中的DNA片段引入宿主生物的細(xì)胞中；在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述DNA片段，從而在宿主生物細(xì)胞中產(chǎn)生含有命中文庫(kù)氨基酸序列的重組抗體；以及選擇以高于106M"的親和力結(jié)合耙抗原的重組抗體。選定的重組抗體與靶抗原的結(jié)合親和力任選地高于107M"，任選地高于1()SM"，任選地高于lxl(^M"，任選地高于2xl09M"，任選地高于5x109M'1，任選地高于8xl()9]Vr1，任選地高于lxl(TM'1，任選地高于2x10^M"，任選地高于5xl01QM"，任選地高于8xl01()M"，或任選地高于1x1011M"。選定的抗體與其抗原的結(jié)合親和力可以根據(jù)被測(cè)試的抗體的形式而變化。被測(cè)試的選定的抗體可以以包括Vh和VL的單鏈抗體(scFv)的形式存在，所述VH和VL通過(guò)使用本發(fā)明的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。任選地，被測(cè)試的選定的抗體可以以包括Vh和Vl的Fab的形式存在，所述Vh和Vi通過(guò)使用本發(fā)明的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)?？赡埽捎谄涓叩臉?gòu)象柔性和不穩(wěn)定性，與以Fab形式存在的選定的抗體相比，以scFv形式存在的選定的抗體的結(jié)合親和力可以低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，對(duì)于以scFv形式存在的選定的抗體，解離常數(shù)優(yōu)選地低于106M、任選地高于107M"，任選地高于1xl08M"，任選地高于2x108M"，任選地高于5x108M"，任選地高于8xlC^M-1,任選地高于lx109]^1，任選地高于2xl09M"，任選地高于5xl09]^1，任選地高于8xl09M"，任選地高于1xlO^lVT1,任選地高于5xl(^M"1，或任選地高于lxl()UM'1。選定的重組抗體與靶抗原的結(jié)合親和力也可以由解離常數(shù)Kd表示，所述解離常數(shù)Kd，例如通過(guò)使用儀器諸如BIAcore生物傳感器(見(jiàn)實(shí)施例)，在特定溫度(例如，4°C,25°C，35°C，37°C，或42'C)下，以在抗體和靶抗原之間的結(jié)合相互作用的動(dòng)力學(xué)研究來(lái)進(jìn)行測(cè)量。一般來(lái)說(shuō)，測(cè)量的Kd越低，抗體的親和力越高；對(duì)于相同的抗體而言，測(cè)量的溫度約高，測(cè)量得到的Kd越高。如果以scFv、Fab或抗體的其他形式存在，在約4。C，25°C，35°C，37°C，或42'C的溫度下測(cè)量，選定的抗體的Kd任選地低于lOOnM，任選地低于10nM，任選地低于8nM，任選地低于8nM，任選地低于5nM，任選地低于1nM，任選地低于0.8nM，任選地低于0.5nM，任選地低于0.2nM，任選地低于0.1nM，任選地低于0.08nM，任選地低于0.05nM,任選地低于0.01nM，或任選地低于0.005nM，按照上述實(shí)施方案的任一個(gè)，設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)(例如，抗體)可以在任何生物的細(xì)胞中合成或表達(dá)，所述生物包括，但不限于，細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物。具體類型的細(xì)胞包括但不限于果蠅(ZVwop/n7"me/m70ga他r)細(xì)胞，酉良酒酉孝母(toc/z,，caycere由'ae)和其它酵母，大腸桿菌(￡.co//)，枯草芽孢桿菌(&cf腸油/to)，SF9細(xì)胞，C129細(xì)胞，293細(xì)胞，脈孢菌(A^wmspora)，BHK，CHO，COS，和HeLa細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，Schwanoma細(xì)胞系，無(wú)限增殖的哺乳動(dòng)物骨髓和淋巴細(xì)胞系，Jurkat細(xì)胞，肥大細(xì)胞和其它內(nèi)分泌和外分泌細(xì)胞，和神經(jīng)元細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，所有類型的腫瘤細(xì)胞(特別是黑素瘤，骨髓性白血病，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸癌，腎癌，前列腺癌，胰腺癌和睪丸癌)，心肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞，'淋巴細(xì)胞(T-細(xì)胞和B-細(xì)胞)，肥大細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，血管內(nèi)膜細(xì)胞，肝細(xì)胞，白細(xì)胞，包括單核白細(xì)胞，干細(xì)胞如造血干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，皮膚干細(xì)胞，肺干細(xì)胞，腎千細(xì)胞，肝干細(xì)胞和肌干細(xì)胞，破骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和其它結(jié)締組織細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，黑素細(xì)胞，肝細(xì)胞，腎細(xì)胞，和脂肪細(xì)胞。優(yōu)選地，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在表達(dá)后純化或分離設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。純化方法的實(shí)例包括電泳，分子，免疫學(xué)和層析技術(shù)，包括離子交換，疏水，親和和反相HPLC層析法，和層析聚焦。所需純化的程度將取決于設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的應(yīng)用。在一些情形中，不需要純化。還按照上述實(shí)施方案中的任何一種，可以篩選設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的期望功能，優(yōu)選地生物學(xué)功能如它們與已知結(jié)合配偶體的結(jié)合，生理活性，穩(wěn)定性曲線(pH，熱，緩沖液條件)，底物特異性，免疫原性，毒性等。在使用基于細(xì)胞的測(cè)定的篩選中，基于改變的細(xì)胞表型，優(yōu)選以某一可檢測(cè)和/或可測(cè)量的方式，可以選擇設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。表型改變的實(shí)例包括但不限于，總物理變化如細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞生存力，與基質(zhì)或其它細(xì)胞的粘附、和細(xì)胞密度的變化；一種或多種RNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、激素、細(xì)胞因子或其它分子的表達(dá)變化；平衡狀態(tài)(即半衰期)或一種或多種RNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、或其它分子的變化；一種或多種RNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、或其它分子的定位的變化；一種或多種RNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，激素、細(xì)胞因子、受體、或其它分子的生物活性或比活性的變化；離子、細(xì)胞因子、激素、生長(zhǎng)因子、或其它分子的分泌的變化；細(xì)胞膜電勢(shì)、極化、完整性或轉(zhuǎn)運(yùn)的變化；病毒和細(xì)菌病原體的感染性、敏感性、潛伏期、粘附、和攝取的變化。按照上述實(shí)施方案中任何一種，可以合成或作為與標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽的融合蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)(例如抗體)。標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽可以用于設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的鑒定、分離、信號(hào)傳導(dǎo)、穩(wěn)定、柔性增加、降解增加、分泌增加、轉(zhuǎn)運(yùn)或胞內(nèi)保留或表達(dá)增加。本發(fā)明還提供分離編碼所述抗體的核酸；包括該核酸的載體，所述載體任選地與控制序列可操作地連接，所述控制序列由以所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞所識(shí)別；包括該載體的宿主細(xì)胞；產(chǎn)生所述抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，從而使核酸進(jìn)行表達(dá)，和任選地，從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述抗體。3.使用本發(fā)明的抗體的方法通過(guò)使用本發(fā)明方法設(shè)計(jì)的抗體可以用于診斷或治療處理各種疾病，包括但不限于，癌癥，自身免疫疾病如多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，I型糖尿病，和重癥肌無(wú)力，移植物抗宿主疾病，心血管疾病，病毒感染如HIV，肝炎病毒，和單純皰疹病毒，細(xì)菌感染，變態(tài)反應(yīng)，n型糖尿病，血液病如貧血癥。所述抗體也可以用作與診斷或治療部分連接的綴合物，或與化學(xué)治療劑或生物制劑聯(lián)合。本發(fā)明的抗體還可以用作親和力純化試劑。在該方法中，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，將所述抗體固定在固相如Sephadex樹脂或?yàn)V紙上。使固定的抗體與待純化的包含VEGF蛋白質(zhì)(或其片段)的樣品接觸，隨后用適合的溶劑來(lái)洗滌所述支持體，所述適合的溶劑將基本上去除樣品中所有的物質(zhì)，除了結(jié)合于固定的抗體的VEGF蛋白質(zhì)。最終，用另一種適合的溶劑，諸如甘氨酸緩沖液，pH5.0來(lái)洗滌所述支持體，所述溶劑將從抗體中釋放VEGF蛋白質(zhì)?？?VEGF抗體還可以用在對(duì)于VEGF蛋白質(zhì)的診斷測(cè)定中，例如在特異性細(xì)胞、組織或血清中檢測(cè)其表達(dá)。這些診斷方法可以用在癌癥診斷中。對(duì)于診斷應(yīng)用而言，可以以可檢測(cè)的部分來(lái)標(biāo)記所述抗體。例如，可以使用例如在CurrentProtocolsinImmunology,巻1禾Q2，Coligen等，Ed.Wiley-Interscience，NewYork,NewYork,Pubs.(1991)中所述的技術(shù)，以放射性同位素，諸如"S，14C，125I，3H，和1311來(lái)標(biāo)記所述抗體，并且使用閃爍計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)量放射性。所述抗體還可以綴合以熒光標(biāo)記諸如稀土元素螯合劑(例如，銪螯合劑)，熒光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹酰，麗斯胺，藻紅素和得克薩斯紅。例如，使用在上文的CurrentProtocolsinImmunology中公開(kāi)的技術(shù)，可以將熒光標(biāo)記綴合于所述抗體。使用熒光計(jì)可以對(duì)熒光進(jìn)行量化?？梢砸愿鞣N酶-底物標(biāo)記諸如在美國(guó)專利號(hào)4,275,149中公開(kāi)的那些，對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記。酶通常催化顯色底物的化學(xué)變化，所述顯色底物可以使用各種技術(shù)進(jìn)行測(cè)量。例如，所述酶可以催化底物的顏色變化，其可以通過(guò)分光光度法進(jìn)行測(cè)量。備選地，所述酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。在一種診斷應(yīng)用中，本發(fā)明提供確定VEGF蛋白質(zhì)存在的方法，所述方法包括將懷疑含有VEGF蛋白質(zhì)的樣品暴露于抗-VEGF抗體并且確定所述抗體與所述樣品的結(jié)合。對(duì)于該應(yīng)用而言，本發(fā)明提供包括所述抗體的試劑盒和使用所述抗體來(lái)檢測(cè)所述VEGF蛋白質(zhì)的說(shuō)明書。還可以配制本發(fā)明的抗體以用于通過(guò)各種各樣的給藥途徑進(jìn)行遞送。通過(guò)將具有需要純度的抗體與任選的生理接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，以凍干制劑或水溶液的形式來(lái)制備所述抗體的治療制劑以進(jìn)行貯存(Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980))。例如，所述抗體可以通過(guò)口服，局部，腸胃外，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，透皮，舌下，肌內(nèi)，直腸，透頰，鼻內(nèi)，經(jīng)吸入，陰道，眼內(nèi)，經(jīng)局部傳遞(例如通過(guò)導(dǎo)管或支架)，皮下，脂肪內(nèi)(intraadiposally)，關(guān)節(jié)內(nèi)，或鞘內(nèi)進(jìn)行施用或共同施用。根據(jù)所述疾病的類型和嚴(yán)重性，約1ng/kg到約50mg/kg(例如，0.1-20mg/kg，0.5-15mg/Kg，和1-10mg/kg)的抗體是施用于患者的起初候選劑量，無(wú)論，例如，是通過(guò)一次或多次單獨(dú)施用，還是通過(guò)持續(xù)輸注。根據(jù)上述提及的因素，典型的每日一次或每周一次的劑量范圍可以在約1pg/kg到約20mg/kg或更多的范圍內(nèi)。根據(jù)狀況，對(duì)于在數(shù)天或更多天內(nèi)的重復(fù)施用，重復(fù)所述治療直到發(fā)生疾病癥狀的所需的抑制。然而，其他的劑量給藥方案可以是有用的。這種治療的方法通過(guò)例如包括放射顯影腫瘤成像的常規(guī)技術(shù)和測(cè)定容易地進(jìn)行監(jiān)測(cè)?？梢詫⒈景l(fā)明的抗-VEGF抗體用于治療廣泛種類的適應(yīng)證，因?yàn)榭?VEGF抗體具有治療活性。這些適應(yīng)癥包括，但不限于再狹窄(例如，冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和大腦病變)，良性腫瘤，各種類型的癌癥諸如原發(fā)腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移，內(nèi)皮細(xì)胞的異常刺激(動(dòng)脈粥樣硬化)，由于外科手術(shù)造成的對(duì)身體組織的損傷，異常的傷口愈合，異常的血管發(fā)生，產(chǎn)生組織纖維化的疾病，肌肉變性，重復(fù)性運(yùn)動(dòng)疾病，未高度脈管化的組織的疾病，和與器官移植相關(guān)的增生反應(yīng)。良性腫瘤的實(shí)例包括，血管瘤，肝細(xì)胞腺瘤，多孔血管瘤，病灶性(focal)結(jié)節(jié)增生，聽(tīng)神經(jīng)瘤，神經(jīng)纖維瘤，膽小管腺瘤，膽小管cystanoma，纖維瘤，脂肪瘤，平滑肌瘤，間皮瘤，畸胎瘤，粘液瘤，結(jié)節(jié)狀的再生性增生，沙眼和化膿性肉芽腫(pyogenicgranulomas)。特定類型的癌癥包括，但不限于，白血病，乳腺癌，皮膚癌，骨癌，前列腺癌，肝癌，肺癌，腦癌，喉癌，膽囊癌，胰腺癌，直腸癌，甲狀旁腺癌，甲狀腺癌，腎上腺癌，神經(jīng)組織癌，頭頸癌，結(jié)腸癌，胃癌，支氣管癌，腎癌，基底細(xì)胞癌，潰爛性和乳頭狀類型的鱗狀細(xì)胞癌，轉(zhuǎn)移性皮膚癌，骨肉瘤，尤因肉瘤，veticulum細(xì)胞肉瘤，骨髓瘤，巨細(xì)胞腫瘤，小細(xì)胞肺腫瘤，膽石，胰島細(xì)胞腫瘤，原發(fā)性腦腫瘤，急性和慢性淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞腫瘤，毛細(xì)胞腫瘤，腺瘤，增生，髓樣癌，嗜鉻細(xì)胞瘤，粘膜neuronms，腸ganglioneuromas,增生性角膜神經(jīng)腫瘤，馬方綜合征體型(marfanoidhabitus)腫瘤，維爾姆斯瘤，精原細(xì)胞瘤，卵巢腫瘤，leiomyomater腫瘤，宮頸發(fā)育異常和原位癌，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，軟組織肉瘤，惡性的類癌瘤，局部皮膚病變，覃樣霉菌病，橫紋肌肉瘤，卡波西肉瘤，成骨的和其他肉瘤，惡性高鈣血癥，腎細(xì)胞腫瘤，紅細(xì)胞增多癥(polycythermiavera)，腺癌，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，白血病，淋巴瘤，惡性黑素瘤，表皮樣瘤癌癥，和其他的癌癥和肉瘤。與異常血管發(fā)生相關(guān)的疾病包括，但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、與局部缺血-再灌注相關(guān)的腦水腫和損傷、皮質(zhì)局部缺血、卵巢增生和血管過(guò)多、(多囊卵巢綜合癥)、子宮內(nèi)膜異位、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病，和其它的眼科血管源性疾病諸如早熟性視網(wǎng)膜病(晶狀體后纖維形成)、斑退化、角膜移植排異反應(yīng)、neuroscular青光眼和OsterWebber綜合癥。在具體的實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的抗-VEGF抗體用于治療年齡相關(guān)的斑退化(AMD)。視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成的實(shí)例包括，但不限于，貝斯特病、近視、視窩(opticpits)、施塔加特病、佩吉特病、靜脈閉塞、動(dòng)脈閉塞、鐮狀細(xì)胞貧血、類肉瘤、梅毒、假黃瘤elasticum肉樣瘤abostructive病、慢性眼色素炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、萊姆病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、早熟性視網(wǎng)膜病、伊爾斯病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、斑退化、Bechets病、導(dǎo)致視網(wǎng)膜炎或脈絡(luò)膜炎的感染、推定的眼組織胞漿菌病、扁平部睫狀體炎、慢性視網(wǎng)膜脫離、高粘滯性綜合癥、弓形體病、損傷和激光后并發(fā)癥、與rubesis相關(guān)的疾病(踝的新血管形成)和由纖維血管或纖維性組織的異常增生造成的疾病，包括所有形式的增生性玻璃體視網(wǎng)膜病。角膜新血管形成的實(shí)例包括，但不限于，流行性角結(jié)膜炎、維生素A缺陷、接觸透鏡過(guò)度磨損、異位角膜炎、上緣(superiorlimbic)角膜炎、翼狀胬肉角膜炎sicca、sjogrens、玫瑰痤瘡、phylectenulosis、糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟性視網(wǎng)膜病、角膜移植排異反應(yīng)、莫倫潰瘍、Terrien's緣退化、緣角質(zhì)分離、多動(dòng)脈炎、Wegener肉樣瘤病、鞏膜炎、periphigoid輻射狀角膜切開(kāi)術(shù)、新血管青光眼和晶狀體后纖維增生、梅毒、分枝桿菌感染、脂質(zhì)退化、化學(xué)燒傷、細(xì)菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動(dòng)物感染和卡波西肉瘤?？梢詫⒈景l(fā)明的抗-VEGF抗體與抗血管發(fā)生藥劑組合在一起使用以治療與異常血管發(fā)生相關(guān)的疾病?？寡馨l(fā)生的藥劑的實(shí)例包括，但不限于，視黃酸及其衍生物，2-甲氧基雌二醇，ANGIOSTATIN蛋白質(zhì)，ENDOSTATIN蛋白質(zhì)，蘇拉明，角鯊胺，金屬蛋白酶I的組織抑制劑，金屬蛋白酶-2的組織抑制劑，纖溶酶原激活物抑制劑-1，纖溶酶原激活物抑制劑-2，軟骨衍生的抑制劑，紫杉醇，血小板因子4，硫酸魚精蛋白(鯡精蛋白)，硫酸化的幾丁質(zhì)衍生物(制備自母蟹殼)，硫酸化的多糖肽聚糖復(fù)合物(sp-pg)，星形孢菌素，基質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)劑，包括例如，脯氨酸類似物((鈴蘭氨酸(LACA)，順式羥基脯氨酸，d,l-3,4-脫氫脯氨酸，thiaproline),a,a-二吡啶基，P-氨基丙腈富馬酸鹽，4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3h)-噁唑酮；甲氨蝶呤，米托蒽醌，肝素，干擾素，2巨球蛋白-血清，chimp-3，胰凝乳蛋白酶抑制劑，P-環(huán)糊精十四硫酸鹽，eponemycin;夫馬潔林，金硫丁二鈉，d-青霉胺(CDPT)，P-l-抗膠原酶-血清，口2-抗纖維蛋白溶酶，比生群，氯苯扎利二鈉，n-(2-羧苯基-4-chloroanthronilicacid二鈉或"CCA"，沙利度胺；angostatic類固醇，cargboxynaminolmidazole;金屬蛋白酶抑制劑諸如BB94。其它的抗血管發(fā)生藥劑包括抗體，諸如針對(duì)這些生血管生長(zhǎng)因子bFGF，aFGF，F(xiàn)GF-5，VEGF同工型，VEGF-C，HGF/SF和Ang-l/Ang-2的單克隆抗體。本發(fā)明的抗-VEGF抗體，優(yōu)選地具有與抗-VEGF抗體的治療協(xié)同作用的那些，可以與所述抗-VEGF抗體組合使用從而進(jìn)一步增加這兩種類型藥物的治療效果。治療劑的實(shí)例包括，但不限于，垸化劑，抗生素藥，抗代謝藥，激素藥，植物衍生藥和生物制劑。烷化劑的實(shí)例包括，但不限于，二氯乙胺(氮芥，例如，苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，氮芥，美法侖，尿嘧啶氮芥)，吖丙啶(例如，塞替派)，磺酸烷酮(例如，白消安)，亞硝基脲(例如，卡莫斯汀，洛莫斯汀，鏈佐星)，非經(jīng)典垸化劑(六甲蜜胺，達(dá)卡巴嗪，和丙卡巴肼)，鉑化合物(卡鉑和順鉑)。抗生素藥的實(shí)例包括，但不限于，蒽環(huán)霉素(例如，多柔比星，柔紅50霉素，表柔比星，伊達(dá)比星和蒽二酮(anthracenedione))，絲裂霉素C，博來(lái)霉素，放線菌素D，plicatomycin。抗代謝藥的實(shí)例包括，但不限于，氟尿嘧啶(5-FU)，氟尿苷(5-FUdR)，甲氨蝶呤，亞葉酸，羥基脲，硫鳥嘌呤(6-TG)，巰嘌呤(6-MP)，阿糖胞苷，噴司他丁，磷酸氟達(dá)拉濱，克拉曲濱(2-CDA)，天冬酰胺酶，甲磺酸伊馬替尼(或GLEEVAC⑧)，和吉西拉濱。這些激素藥的實(shí)例是合成雌激素(例如，二乙基己烯雌酚)，抗雌激素藥(例如，他莫昔芬，托瑞米芬，fluoxymesterol和雷洛昔芬)，抗雄激素藥(比拉魯胺，尼魯米特，氟他胺)，芳香酶抑制劑(例如，氨魯米特，阿那曲唑和四唑)，酮康唑，醋酸戈舍瑞林，亮丙立德，醋酸甲地孕酮和米非司酮。植物衍生的藥劑的實(shí)例包括，但不限于，長(zhǎng)春花生物堿(例如，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春地辛，長(zhǎng)春利定和長(zhǎng)春瑞濱)，鬼臼毒素(例如，依托泊甙(VP-16)和替尼泊苷(VM-26))，喜樹堿化合物(例如，20(S)喜樹堿，托泊替康，盧比替康，和伊立替康)，紫杉烷類(例如，紫杉醇和多西他賽)。生物制劑的實(shí)例包括，但不限于，免疫調(diào)劑蛋白質(zhì)諸如細(xì)胞因子，針對(duì)腫瘤抗原的單克隆抗體，腫瘤抑制基因，和癌癥疫苗?？梢耘c本發(fā)明的抗體組合使用的白介素的實(shí)例包括，但不限于，白介素2(IL-2)，和白介素4(IL-4)，白介素12(IL-12)?？梢耘c本發(fā)明的抗體組合使用的干擾素的實(shí)例包括，但不限于，干擾素a，干擾素b(成纖維細(xì)胞干擾素)和干擾素g(成纖維細(xì)胞干擾素)。這些細(xì)胞因子的實(shí)例包括，但不限于，紅細(xì)胞生成素(epoietina)，粒細(xì)胞-CSF(非格司亭)，和粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞-CSF(沙格司亭)。除了細(xì)胞因子，其他的免疫調(diào)節(jié)劑包括，但不限于卡介苗，左旋咪唑和奧曲肽。本發(fā)明的抗-VEGF抗體還可以與腫瘤壞死因子(TNF)或其突變蛋白組合使用在上述疾病或病癥的治療中。重復(fù)施用抗-VEGF抗體和TNF直到達(dá)到需要的臨床效果。在其中實(shí)體腫瘤見(jiàn)于四肢或其它位點(diǎn)的情形中，可以將所述抗體和/或TNF施用于分離的腫瘤或器官，所述其它位點(diǎn)易感于從一般循環(huán)中分離。在其它的實(shí)施方案中，將FGF或血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)拮抗劑，諸如抗-FGF或抗-PDGF中和抗體與抗-VEGF抗體組合施用于患者。用抗-VEGF抗體進(jìn)行的治療最好可以在傷口愈合的時(shí)期或需要的新血管化過(guò)程中暫停?？梢耘c本發(fā)明的抗-VEGF抗體組合使用的針對(duì)腫瘤抗原的單克隆抗體的實(shí)例包括，但不限于，HERCEPTIN(Trastruzumab)，RITUXAN(利妥昔單抗)，MYLOTARG⑧(吉姆單抗奧佐米星)，CAMPATH(阿侖單抗)，ZEVALIN)(替伊莫單抗(ibritumomabyiuxetan))，PANOREX(依決可單抗)，BEXXAR⑧(托西莫單抗)，ERBITUX⑧(西妥昔單抗),和AVASTIN(貝伐單抗)。所述腫瘤抑制基因的實(shí)例包括，但不限于，D尸CW，WF-7，iVF-2，朋，p53，^77，SiC4丄禾口SiC4厶癌癥疫苗的實(shí)例包括，但不限于，神經(jīng)節(jié)苷脂(GM2)，前列腺特異性抗原(PSA)，甲胎球蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)(由結(jié)腸癌和其它腺癌，例如，乳腺癌、肺癌、胃癌和胰腺癌產(chǎn)生)，黑素瘤相關(guān)抗原(MART-1，gp100，MAGE1,3酪氨酸酶)，乳頭瘤病毒E6和E7片段，自體腫瘤細(xì)胞和異源腫瘤細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞或部分/裂解物。可以將佐劑用于增大針對(duì)TAAs的免疫應(yīng)答。佐劑的實(shí)例包括，但不限于，卡介苗(BCG)，內(nèi)毒素脂多糖，匙孔血藍(lán)蛋白(GKLH)，白介素-2(IL-2)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和環(huán)磷酰胺，認(rèn)為當(dāng)以低劑量給藥時(shí)，會(huì)減少腫瘤誘導(dǎo)抑制的化療劑。實(shí)施例1.在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)用于人源化和親和力成熟的抗-VEGF抗體將在本發(fā)明中提供的方法用于設(shè)計(jì)非人抗體的人源化的文庫(kù)和優(yōu)化抗體的親和力和其它特性。以人或人樣序列來(lái)產(chǎn)生抗體的氨基酸和核酸的新變體，同時(shí)它們的結(jié)合親和力、穩(wěn)定性、表達(dá)得以顯著提高。通過(guò)開(kāi)采所有的生物，尤其是人的蛋白質(zhì)序列的不斷擴(kuò)充的數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過(guò)使它們的特異性序列或它們的變體與功能提高諸如通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性關(guān)聯(lián)，而以高通量方式在計(jì)算機(jī)上實(shí)施本發(fā)明的方法。通過(guò)使用本發(fā)明的方法，可以基于極端多樣化的蛋白質(zhì)序列和在計(jì)算機(jī)上的功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)評(píng)價(jià)來(lái)構(gòu)建擴(kuò)充的和功能上有偏向的抗體文庫(kù)，并將其隨后通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選和體外或體內(nèi)選擇來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)。通常，所述方法基于在下文被稱為"前導(dǎo)序列"的前導(dǎo)蛋白質(zhì)中的靶結(jié)構(gòu)/功能基序或結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，通過(guò)在計(jì)算機(jī)上的蛋白質(zhì)序列的選擇，在計(jì)算機(jī)上來(lái)進(jìn)行。將所述前導(dǎo)序列用于搜索蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇取決于設(shè)計(jì)的基序的具體功能要求。例如，如果前導(dǎo)蛋白質(zhì)是酶并且耙基序包括酶的活性位點(diǎn)，可以使用各種搜索標(biāo)準(zhǔn)來(lái)査詢特定起源、生物、物種或其組合的蛋白質(zhì)/肽的數(shù)據(jù)庫(kù)，產(chǎn)生命中序列的列表，所述命中序列的列表中的每個(gè)都可以取代前導(dǎo)蛋白質(zhì)中的靶基序?？梢詫㈩愃频姆椒ㄓ糜谠O(shè)計(jì)前導(dǎo)蛋白質(zhì)的其它基序或結(jié)構(gòu)域。可以將每個(gè)個(gè)體基序/結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行組合以產(chǎn)生被設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的文庫(kù)。此外，為了減少用于人應(yīng)用，諸如治療或診斷的被設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的免疫原性，優(yōu)選地搜索人起源的蛋白質(zhì)或人源化蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)產(chǎn)生命中的序列列表，所述命中的序列列表尤其是針對(duì)來(lái)自前導(dǎo)蛋白質(zhì)的位點(diǎn)的基序，其充當(dāng)前導(dǎo)蛋白質(zhì)的支架諸如抗體的構(gòu)架?？梢詫?duì)設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的文庫(kù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)從而產(chǎn)生具有超過(guò)所述前導(dǎo)蛋白質(zhì)的改善的生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。在本實(shí)施例中，將本發(fā)明方法用在設(shè)計(jì)抗-VEGF抗體中，所述抗-VEGF抗體在序列上多樣，然而在功能上彼此相關(guān)?；诒辉O(shè)計(jì)的抗體序列，對(duì)抗體文庫(kù)進(jìn)行構(gòu)建從而以高通量方式在非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)和/或人源化構(gòu)架(FRs)中包括多樣序列。為了改善的功能諸如結(jié)合親和力和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，針對(duì)人VEGF篩選這種抗體文庫(kù)。在設(shè)計(jì)所述抗-VEGF抗體中，基于前導(dǎo)抗-VEGF抗體中區(qū)域或基序的氨基酸序列，以下稱為"前導(dǎo)序列"，在計(jì)算機(jī)上選擇抗體序列。使用前導(dǎo)序列來(lái)搜索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇取決于設(shè)計(jì)的基序的特定功能要求。例如為了針對(duì)治療應(yīng)用設(shè)計(jì)可變鏈的構(gòu)架區(qū)，除了一些結(jié)構(gòu)關(guān)鍵位點(diǎn)以外，應(yīng)當(dāng)使用進(jìn)化上相關(guān)蛋白質(zhì)序列如完全人免疫球蛋白序列和人種系免疫球蛋白序列的集合。通過(guò)在該高度保守區(qū)域(對(duì)于構(gòu)架區(qū))引入盡可能少的外源突變體而保留序列來(lái)源，這將減小免疫原應(yīng)答。在另一方面，不同序列的數(shù)據(jù)庫(kù)如genbank中的各種物種的免疫球蛋白序列或甚至不相關(guān)序列可以用于設(shè)計(jì)CDRs以便改善該高變區(qū)中與抗原的結(jié)合親和力。通過(guò)使用該方法，構(gòu)建多樣的抗體序列的文庫(kù)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法在體外和/或體內(nèi)篩選具有改善的或需要的功能的抗體突變體。1)在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)抗-VEGF抗體文庫(kù)進(jìn)行親和力成熟鼠抗-VEGF抗體的可變重鏈區(qū)的氨基酸序列和構(gòu)架及CDRs的片段(下劃線和注解的)是EIOLVOSGPELKOPGETVRISCKASGYTFTNYGMNrVH/CDRDWVKOAPGKGLK麗GWINTYTGEPTYAADFKR(VH/CDR2)RFTFSLETSASTAYLQISNLKNDDTATYPCAKYPHYYGSSHWYFDVC，CDR3)WGAGTTVTVSS(SEQIDNO:283)該VH序列在下文被稱為"母體抗-VEGF抗體"。按照Kabat標(biāo)準(zhǔn)(KabatEA，Redi-MillerM，Perry固，GottesmanKS(1987)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest第4版，NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)來(lái)設(shè)計(jì)所述構(gòu)架和CDRs。使用計(jì)算機(jī)模塊進(jìn)化設(shè)計(jì)方法來(lái)靶向所述抗體的CDR和構(gòu)架區(qū)，所述設(shè)計(jì)方法如在美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)10/443,134，10/153,159，10/153,176，10/125,687,和60/284,407中所詳細(xì)描述，將其全部?jī)?nèi)容并入作為參考。使用鼠抗-VEGF抗體作為前導(dǎo)蛋白質(zhì)及其VHCDR3作為前導(dǎo)序列，通過(guò)下列方法構(gòu)建VHCDR3的數(shù)字式文庫(kù)。所述前導(dǎo)序列包括母體抗-VEGF抗體的VHCDR3和來(lái)自鄰近構(gòu)架區(qū)CAKYPHYYGSSHWYFDVWG的幾個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)從序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索和選擇針對(duì)VHCDR3的命中氨基酸序列來(lái)構(gòu)建命中文庫(kù)?；诿形膸?kù)，來(lái)構(gòu)建變體圖譜以列出在每個(gè)位點(diǎn)的所有的變體，并以一定的截止值來(lái)過(guò)濾它們從而減少得到的命中變體文庫(kù)的大小到在計(jì)算機(jī)或?qū)嶒?yàn)限制范圍內(nèi)。還構(gòu)建變體圖譜從而促進(jìn)i)對(duì)覆蓋適合度景觀(landscape)中的優(yōu)選區(qū)域的序列空間進(jìn)行取樣；ii)靶向優(yōu)選的肽的集合序列的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)的劃分和合成；iii)實(shí)驗(yàn)篩選所述抗體文庫(kù)的所需功能；和iv)以反饋分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以進(jìn)行進(jìn)一步設(shè)計(jì)和優(yōu)化。前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板獲自在VEGF和抗-VEGF抗體之間形成的復(fù)合體的可獲得的X-射線結(jié)構(gòu)。將VEGF和母體抗-VEGF抗體的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為IBJI，并且在VEGF和成熟的抗-VEGF抗體之間形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為1CZ8。以掃描序列的相對(duì)等級(jí)次序，來(lái)自1CZ8結(jié)構(gòu)模板的結(jié)果類似于來(lái)自1BJ1的那些。還可以使用抗-VEGF抗體的結(jié)構(gòu)模型。按照Kabat分笑由母體抗-VEGF抗體取得VhCDR3的前導(dǎo)序列，其中氨基酸殘基CAK和WG分別來(lái)自在N和C末端的VHCDR3序列的側(cè)翼的鄰近構(gòu)架區(qū)。只利用母體抗體的VhCDR3序列建立HMM用于搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。校準(zhǔn)利用單一前導(dǎo)序列或結(jié)構(gòu)集合序列建立的HMM并將其用于搜索Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(Johnson,G禾卩Wu,TT(2001)NucleicAcidsResearch,29,205-206)。列出在期望值或E-值以上的所有序列命中，并利用HAMMER2丄1軟件包進(jìn)行比對(duì)。在從命中列表中除去冗余序列后，前導(dǎo)HMM的其余命中序列形成命中文庫(kù)。利用每個(gè)位置上的變體圖譜建立AA-PVP表(氨基酸位置變體圖譜)，其給出了每種氨基酸殘基在每個(gè)位置上出現(xiàn)的數(shù)目。可以將變體圖譜進(jìn)行過(guò)濾以利用基于結(jié)構(gòu)的評(píng)分除去以某種截止值頻率或比它更小的頻率和/或組合變體重作圖(reprofiliiig)而發(fā)生的變體。來(lái)自序列庫(kù)的變體圖譜提供了信息數(shù)據(jù)以鑒定前導(dǎo)序列中的位置，其既可以是變化的也可以是固定的。所述位點(diǎn)可以分成三類i)在進(jìn)化過(guò)程中保守的結(jié)構(gòu)保守性位點(diǎn)。高頻殘基可以用來(lái)保持這些位置上靶基序的支架；ii)可變功能性熱點(diǎn)應(yīng)當(dāng)以集中的突變進(jìn)行靶向；iii)組合i)和ii)使靶支架穩(wěn)定化，同時(shí)提供功能性熱點(diǎn)上的可變性。一組來(lái)自功能變體的氨基酸應(yīng)當(dāng)按照它們?cè)谧凅w圖譜中的頻率包括在功能熱點(diǎn)上，因?yàn)樗鼈兪窃谶M(jìn)化上選擇或優(yōu)化的。而且，在每個(gè)位置上的變體都可以進(jìn)行過(guò)濾或區(qū)分優(yōu)先次序來(lái)包括其它可能有益的突變體或排除可能不需要的突變體以滿足計(jì)算機(jī)和實(shí)驗(yàn)的限制。盡管所述變體圖譜對(duì)每個(gè)位置上的優(yōu)選氨基酸殘基和以優(yōu)選次序排列的特定突變體是信息性的，未修飾的，它包括了大量的重組子。一些利用頻率截止值的過(guò)濾能夠可以減少組合序列，所述組合序列需要通過(guò)計(jì)算機(jī)篩選進(jìn)行評(píng)估或被實(shí)驗(yàn)文庫(kù)直接進(jìn)行靶向。應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)的評(píng)分來(lái)篩選命中文庫(kù)及其形成命中變體文庫(kù)的組合序列。母體抗-VEGF抗體的VHCDR3的側(cè)鏈在每個(gè)殘基位置上被來(lái)自命中變體文庫(kù)的相應(yīng)氨基酸變體的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體所取代。利用主鏈依賴型旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(kù)，通過(guò)使用程序SCWRL⑧(版本2.1)建立和優(yōu)化旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的構(gòu)象(BowerMJ，CohenFE，DunbrackRL(1997)JMB267，1268-82)。在存在和缺少抗原VEGF結(jié)構(gòu)的情況下，通過(guò)使用CONGEN[Bruccoleri和Karplus(1987)Biopolymers26:137-168]中的Amber94力場(chǎng)的100—200個(gè)步驟，通過(guò)搜索最優(yōu)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體和最小化能量完成評(píng)分。在有和/無(wú)VEGF抗原時(shí)基于計(jì)算得分的抗VEGF變體文庫(kù)的能量得分表明對(duì)于各種變體文庫(kù)來(lái)說(shuō)有大量的序列比母體序列具有更高的得分。可以使用一種包括側(cè)鏈熵、非極性溶劑化能和靜電溶劑化能的改進(jìn)的自定制得分函數(shù)(customscoringfunction)來(lái)校準(zhǔn)用于評(píng)分的簡(jiǎn)單函數(shù)。計(jì)算三種能量術(shù)語(yǔ)側(cè)鏈熵、非極性溶劑化能和靜電溶劑化能以及環(huán)的主鏈熵。如通過(guò)GEPOL93算法計(jì)算的，使非靜電溶劑化能與分子表面成比例，縮放比例常數(shù)為70cal/mol/A2(TunonI，SillaE,Pascual-AhuirJL(1992)ProtEng5,715-716)，利用在CONGEN中執(zhí)行的GEPOL(Pascual-AhuirJL,SillaE(1993)JComputChem11,1047-1060)命令。使用如在UHBD程序(DavisME，MaduraJD,LutyBA，McCammonJA(1991)ComputPhysCommun62,187-197)中進(jìn)行的有限差PB(FDPB)方法計(jì)算靜電溶劑化能。將聚焦法用于突變周圍區(qū)域。自動(dòng)方案產(chǎn)生三個(gè)格子粗糙的，精細(xì)的，和焦點(diǎn)格子。格子單位分別是1.5，0.5，和0.25埃。聚焦格子是跨越由突變殘基占有的笛卡兒體積的立方格子。精細(xì)格子是跨越整個(gè)蛋白質(zhì)或復(fù)合體體積的立方格子。粗糙格子是設(shè)定為每個(gè)軸中精細(xì)格子大約兩倍大小的立方格子，并覆蓋約8倍體積的精細(xì)格子。粗糙格子用于說(shuō)明長(zhǎng)范圍的溶劑效應(yīng)和設(shè)定精細(xì)格子的邊界條件。類似地，精細(xì)格子說(shuō)明蛋白質(zhì)內(nèi)部的靜電貢獻(xiàn)和設(shè)定焦點(diǎn)格子的邊界條件。焦點(diǎn)格子說(shuō)明由于突變導(dǎo)致的局部效應(yīng)的更細(xì)微的細(xì)節(jié)。將蛋白質(zhì)內(nèi)部和外部的介電常數(shù)分別設(shè)定為4和78。溫度設(shè)定為300開(kāi)爾文和離子強(qiáng)度設(shè)定為150mM。最大迭代設(shè)定為200。用統(tǒng)一的電介質(zhì)重復(fù)計(jì)算從而使內(nèi)部和外部電介質(zhì)設(shè)定為4，計(jì)算兩種能量之間的差異。后者計(jì)算代表由于將電荷帶到格子中導(dǎo)致的能量。定制評(píng)分函數(shù)或使用CONGEN中的Amber94力場(chǎng)加上來(lái)自本文所用UHBD中PB的溶劑化術(shù)語(yǔ)的分子力學(xué)能量類似于MM-PBSA或MM-GBSA。能量函數(shù)顯示與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更好的一致(SharpKA.(1998)Proteins33,39-48;NovotnyJ,BruccoleriRE,DavisM，SharpKA(1997)JMolBiol268,401-411)，特別是當(dāng)通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算的結(jié)構(gòu)整體(ensemble)用于提供更準(zhǔn)確的基于能量函數(shù)整體平均值對(duì)序列和它的變體評(píng)分的方法(KollmanPA,MassovaI，ReyesC,KuhnB,HuoSH,ChongLT，LeeM,LeeTS,DuanY,WangW,DoniniO,CieplakP,SrinivasanP，CaseDA,和CheathamTE(2000)Acc.ChemRes.33,889-897)。過(guò)濾來(lái)自如上所述的命中變體文庫(kù)的變體圖譜，以便減小潛在文庫(kù)大小而同時(shí)保持大多數(shù)優(yōu)選殘基?；谟欣?jǐn)?shù)和/或可能參與有利相互作用的殘基的存在選擇最佳序列的策略被用于鑒定一個(gè)或多個(gè)用于核酸文庫(kù)設(shè)計(jì)的氨基酸序列簇。如上所述，分別選擇對(duì)于VHCDR3，CDR2和CDR1的計(jì)算篩選的序列簇用于進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)測(cè)試。用單一簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)來(lái)靶向上述構(gòu)建的命中變體文庫(kù)。使用以最小的大小組合的具體生物的最佳密碼子，來(lái)構(gòu)建核酸序列圖譜。通過(guò)將堿基的混合物結(jié)合到每個(gè)簡(jiǎn)并位置中來(lái)合成簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)。作為合成的組合效應(yīng)的結(jié)果，這種簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)編碼擴(kuò)充的氨基酸文庫(kù)。VH和VL的每個(gè)位置的變體分別顯示在VH和VL氨基酸位置變體圖譜中。將Vh和/或VlCDR3，CDR2，和CDRl，F(xiàn)R123的詳細(xì)結(jié)果總結(jié)在抗-VEGFVH和VL表中。這些實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)使用本發(fā)明的方法，不僅可以用多樣序列和系統(tǒng)發(fā)生距離，還可以用與靶VEGF抗原結(jié)合的改善的結(jié)合親和力來(lái)選擇抗體。圖1A是對(duì)于使用上述方法設(shè)計(jì)的抗-VEGF抗體的VL的氨基酸位置變體圖譜(AA-PVP)。所述VL鏈的AA-PVP使用Baca等.(1997)JBiolChem272:10678-10684的人源化的V^SEQIDNO:l)作為參考序列。點(diǎn)表示與參考相同的氨基酸。將CDRs以粗體字母強(qiáng)調(diào)表示。圖IB是對(duì)于使用上述方法設(shè)計(jì)的抗-VEGF抗體的VH的氨基酸位置變體圖譜(AA-PVP)。所述Vh魅的AA-PVP使用Baca等.(1997)上文的人源化的VH(SEQIDNO:55)作為參考序列。點(diǎn)表示與參考相同的氨基酸。將CDRS以粗體字母強(qiáng)調(diào)表示。通過(guò)使用新的噬菌體展示系統(tǒng)，來(lái)檢驗(yàn)所述抗體文庫(kù)與抗原，VEGF，結(jié)合的能力，所述抗體文庫(kù)通過(guò)使用上述方法，基于母體抗-VEGF抗體的前導(dǎo)序列，在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行設(shè)計(jì)。2)產(chǎn)生抗-VEGF抗體文庫(kù)來(lái)進(jìn)行構(gòu)架優(yōu)化發(fā)現(xiàn)鼠單克隆抗體封閉VEGF-依賴型細(xì)胞增殖并且減慢體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)(KimKJ,LiB,WinerJ,ArmaniniM,GillettN,PhillipsHS,FerraraN(1993)Nature362，841-844)。在移植抗原-結(jié)合環(huán)后使用一些關(guān)鍵構(gòu)架位置上的隨機(jī)誘變，來(lái)對(duì)這種鼠抗體進(jìn)行人源化(PrestaLQChenH,0'ConnorSJ:ChisholmV,MengYG，KrummenL,WinklerM,FerraraN(1997)CancerRes.57,4593-4599;BacaM,PrestaO'ConnorSJ，WellsJA(1997)JBiolChem272,10678-10684)。典型地，在數(shù)輪定點(diǎn)誘變和選擇后，通過(guò)在某些預(yù)定的關(guān)鍵位置，以來(lái)自母體非人抗體的非人氨基酸置換人或保守(concensiis)人構(gòu)架，來(lái)產(chǎn)生人源化的抗體。通常，這些人源化抗體將以相對(duì)于其母體抗體的減少的親和力，結(jié)合于其母體抗體的同源抗原(對(duì)于人源化的抗-VEGF，相對(duì)于其母體鼠抗體，約6倍更弱，見(jiàn)BacaM,PrestaO'ConnorSJ,WellsJA(1997)JBiolChem272,10678-10684，并且對(duì)于人源化抗-VEGF的另一種形式，2倍更弱，見(jiàn)PrestaChenH,O'ConnorSJ,ChisholmV，MengYQKrummenL,WinklerM,FerraraN(1997)CancerRes.57，4593-4599;BacaM,PrestaO'ConnorSJ,WellsJA(1997)JBiolChem272，10678-10684)。通過(guò)使用CDRs中的親和力成熟來(lái)恢復(fù)這種結(jié)合親和力的損失(ChenY,WiesmannC,FuhQLiB,ChristingerHW，McKayP，deVosAM,LowmanHB(1999)J.MolBiol293,865-881)。使用所述的本發(fā)明方法，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的一些人源化的構(gòu)架，其在構(gòu)架優(yōu)化后，在結(jié)合親和力上數(shù)倍于(對(duì)于hAB2是3.3倍，對(duì)于hAB3是4倍并且對(duì)于hAB4是2倍)報(bào)道的人源化的抗-VEGF抗體序列(對(duì)于在文獻(xiàn)(PrestaChenH,O'ConnorSJ,ChisholmV,MengKru腿enL,WinklerM,FerraraN(1997)CancerRes.57，4593-4599)中報(bào)道的人源化的抗-VEGF抗體構(gòu)架，見(jiàn)圖2中的hABl)。因?yàn)閳?bào)道的人源化抗-VEGF抗體是~2倍弱于其相應(yīng)的鼠抗體，我們的人源化抗體(hAB2和hAB3)在人源化后與相應(yīng)的鼠抗體相比，應(yīng)該具有2倍更高的結(jié)合親和力。此外，通過(guò)相對(duì)于報(bào)道的人源化的抗體(hABl)，增加結(jié)合速率(K。n)或減小脫離速率(K。ff)，我們可以獲得這樣的改善(見(jiàn)圖2)。鼠抗-VEGF抗體的構(gòu)架frl23區(qū)的氨基酸序列是YLQISNLKNDDTATYFCA.'該序列在下文中稱作"鼠抗-VEGF抗體"的frl23，見(jiàn)PrestaLQChenH,O'ConnorSJ,ChisholmV，MengYQKrummenL,WinklerM,FerraraN(1997)CancerRes.57,4593-4599)。如果需要可以利用相同方法對(duì)相對(duì)恒定的構(gòu)架4進(jìn)行設(shè)計(jì)。按照Kabat標(biāo)準(zhǔn)對(duì)構(gòu)架和CDRs進(jìn)行指定(KabatEA,Redi-MillerM,Perry畫，GottesmanKS(1987)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest第4版，NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)，盡管也可以使用其它分類。另外，可以分別地對(duì)構(gòu)架FR1或FR2或FR3和FR4的單獨(dú)片段進(jìn)行設(shè)計(jì)并且如果需要將其粘在一起。利用本文所述的方法，通過(guò)設(shè)計(jì)每個(gè)片段或片段的組合可以同時(shí)設(shè)計(jì)CDRs和FRs的組合。所述CDRs與來(lái)自鼠抗-VEGF的SEQ283或利用本文所述方法設(shè)計(jì)的那些中的CDRs相同。不過(guò)，還可以設(shè)計(jì)不同的CDRs并且與設(shè)計(jì)的FR123文庫(kù)組合使用。利用基于鼠抗-VEGF抗體的VHFR123前導(dǎo)序列的人VH種系序列，生成命中文庫(kù)的變體圖譜并且通過(guò)利用一定的截止值進(jìn)行過(guò)濾。在每個(gè)位置上的變體都可以基于其與抗體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)相容性、利用總能量或其它評(píng)分項(xiàng)目進(jìn)行排序?；谄淇偰芰炕蛱禺愋哉郫B，發(fā)現(xiàn)一些參考氨基酸在某些位置上是有利的，盡管它們的出現(xiàn)頻率非常低。利用源于Kabat的人VH序列、基于鼠抗VEGF抗體的VHFR123前導(dǎo)序列可以生成和改進(jìn)命中文庫(kù)的變體圖譜。如果只使用抗體結(jié)構(gòu)的話，可以對(duì)經(jīng)過(guò)濾的變體圖譜作進(jìn)一步計(jì)算性篩選以反映結(jié)構(gòu)相容性的排序次序。盡管人相對(duì)非人序列在整個(gè)VH鏈的許多位置上不同，在其它人源化方法中使用的氨基酸文庫(kù)集中在移植的CDRs側(cè)翼的少許位置上的隨機(jī)化，而在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化文庫(kù)靶向VH和VL鏈上的各個(gè)位置，在那些位置上對(duì)于起始抗-VEGF抗體有少許突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種基序如構(gòu)架FRl,FR2,FR3和FR4或其組合如抗體的FR123可以利用模塊計(jì)算機(jī)進(jìn)化設(shè)計(jì)方法進(jìn)行靶向。已理解的是，對(duì)于每種基序或其組合只有有限數(shù)目的構(gòu)象(稱為正則結(jié)構(gòu))。抗體的這些結(jié)構(gòu)特征對(duì)于基于抗體結(jié)構(gòu)的廣泛分析，通過(guò)利用抗體各區(qū)上結(jié)構(gòu)化基序測(cè)試進(jìn)化序列設(shè)計(jì)提供了極好的系統(tǒng)。在不同的物種之間觀察到這些結(jié)構(gòu)和序列的保守性。事實(shí)上，抗體的支架，或免疫球蛋白折疊，是自然界中觀察到的最豐富的結(jié)構(gòu)之一，并且在各種抗體和相關(guān)分子之間高度保守。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還可以用來(lái)利用基于序列的方法或含有CDRs中誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化的結(jié)構(gòu)集合來(lái)設(shè)計(jì)抗體構(gòu)架。利用鼠抗-VEGF抗體構(gòu)架作為前導(dǎo)蛋白和其VHFR123作為前導(dǎo)序列，構(gòu)建VHFR123的數(shù)字式文庫(kù)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)利用VHFR123作為前導(dǎo)序列搜索和選擇命中氨基酸序列來(lái)構(gòu)建命中文庫(kù)。建立變體圖譜以便基于命中文庫(kù)在每個(gè)位置上列出所有變體，并且以一定截止值進(jìn)行過(guò)濾以便減小得到的命中變體文庫(kù)的大小在計(jì)算機(jī)或?qū)嶒?yàn)限制內(nèi)。還建立變體圖譜以便促進(jìn)i)覆蓋適合度景觀中優(yōu)選區(qū)域的序列空間的取樣；ii)靶向優(yōu)選的肽集合序列的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)的劃分和合成;iii)對(duì)抗體文庫(kù)實(shí)驗(yàn)篩選所需功能;和iv)以反饋分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果作進(jìn)一步設(shè)計(jì)和優(yōu)化。前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板獲自在VEGF和抗VEGF抗體之間形成的復(fù)合體的可獲得的X-射線結(jié)構(gòu)。將VEGF和母體抗-VEGF抗體的復(fù)合結(jié)構(gòu)命名為1BJ1，而在VEGF和成熟抗-VEGF抗體之間形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)命名為1CZ8。來(lái)自1CZ8結(jié)構(gòu)模板的結(jié)果與來(lái)自1BJ1的結(jié)果在所掃描序列的相對(duì)排列次序上相似。模型化的結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)集合或集合均值也可以用于篩選序列。VHFR123(SEQ283)的前導(dǎo)序列按照Kabat分類取自鼠抗-VEGF抗體。校準(zhǔn)利用單一前導(dǎo)序列建立的HMM并用于搜索源自Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(Johnson,G和Wu,TT(2001)NucleicAcidsResearch,29，205-206)的人重鏈種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)和/或人序列數(shù)據(jù)庫(kù)(包括人種系和人源化序列)。列出在期望值或E-值以上的所有序列命中并利用HAMMER2丄1軟件包進(jìn)行比對(duì)。在從命中列表中除去冗余序列后，前導(dǎo)HMM的其余命中序列形成命中文庫(kù)。來(lái)自人vh種系的命中序列與前導(dǎo)序列的序列同一性為40到68%，而來(lái)自源于Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(該數(shù)據(jù)庫(kù)被解析為frl23片段以便增加搜索的敏感性以及它們的相對(duì)排序)(如果包含人起源的免疫球蛋白序列則使用其它數(shù)據(jù)庫(kù))的人免疫球蛋白序列的命中序列的對(duì)應(yīng)序列同一性為-30到75%。通過(guò)禾U用程序TreeView1.6,5(http:〃taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html何以分析命中序列之間的進(jìn)化距離。AA-PVP表給出了每個(gè)位置上每種氨基酸殘基出現(xiàn)的數(shù)目。在來(lái)自人VH種系的命中序列與來(lái)自源于Kabat的人Vh序列的命中序列之間有一些差異來(lái)自在結(jié)構(gòu)上重要以穩(wěn)定靶抗體等的支架的氨基酸的非人起源的氨基酸。如果僅使用抗體結(jié)構(gòu)的話，可以進(jìn)一步在計(jì)算機(jī)上對(duì)這種過(guò)濾的變體圖譜進(jìn)行篩選從而反映結(jié)構(gòu)相容性的排列順序。簡(jiǎn)而言之，使用人起源的不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行構(gòu)架優(yōu)化將提供多樣的但是有效的氨基酸的選擇來(lái)進(jìn)行構(gòu)架優(yōu)化，包括以改善的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性的人源化。隨著我們?cè)陂_(kāi)發(fā)治療性抗體中知識(shí)的增加，越來(lái)越多的抗體序列數(shù)據(jù)被積累并且使用本發(fā)明指導(dǎo)我們的設(shè)計(jì)。不需要在前的假設(shè)來(lái)假定關(guān)鍵位置和與那些位置相關(guān)的氨基酸。因?yàn)槭褂帽景l(fā)明的方法自動(dòng)揭示了這種信息，因此隨著當(dāng)更多的數(shù)據(jù)被積累時(shí)它們?cè)跀?shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)的增加，其將更好地被限定?？梢允褂没诮Y(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)變體進(jìn)行重作圖或區(qū)分優(yōu)先次序來(lái)包括其他可能有利的突變體?；诮Y(jié)構(gòu)的能量評(píng)分提供了另一種方式來(lái)對(duì)命中變體文庫(kù)在每個(gè)位置的變體的出現(xiàn)進(jìn)行重新作圖，所述命中變體文庫(kù)起初基于選自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的序列的作圖進(jìn)行構(gòu)建。一些使用頻率截止值的過(guò)濾可以減少需要通過(guò)計(jì)算機(jī)篩選來(lái)評(píng)價(jià)或被實(shí)驗(yàn)文庫(kù)直接靶向的組合序列。即使對(duì)變體圖譜應(yīng)用了截止值，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選的最終序列中，仍舊有大量的組合序列需要進(jìn)行評(píng)分和評(píng)價(jià)。應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)的評(píng)分來(lái)篩選命中文庫(kù)及其形成命中變體文庫(kù)的組合序列。使用主鏈依賴型旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(kù)，通過(guò)使用程序SCWRL(版本2.1)，以在每個(gè)殘基位置上來(lái)自命中變體文庫(kù)的相應(yīng)氨基酸變體的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體來(lái)取代在1CZ8或1BJ1中的抗-VEGF抗體的VHFR123的側(cè)鏈(BowerMJ，CohenFE,DunbrackRL(1997)JMB267，1268-82)。在存在和缺乏抗原61VEGF的結(jié)構(gòu)的情況下，使用在CONGEN中[Bruccoleri和Karplus(1987)Biopolymers26:137-168]的Amber94力場(chǎng)，使用最優(yōu)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體和能量最低化對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化后，使用能量項(xiàng)目或它們與對(duì)于每個(gè)項(xiàng)目的標(biāo)度因子的組合來(lái)進(jìn)行評(píng)分。設(shè)計(jì)的構(gòu)架VHfrl23相對(duì)于鼠對(duì)照，與結(jié)構(gòu)具有良好的結(jié)構(gòu)相容性。利用設(shè)計(jì)序列與來(lái)自人種系或人源化構(gòu)架的那些的系統(tǒng)發(fā)生距離分析，也對(duì)如部分由其數(shù)據(jù)庫(kù)限定的構(gòu)架優(yōu)化的人樣特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)如上所述來(lái)自命中變體文庫(kù)的變體圖譜進(jìn)行過(guò)濾以便減小可能的文庫(kù)規(guī)模，同時(shí)在消除一定氨基酸之后和/或通過(guò)基于它們與結(jié)構(gòu)支架的相容性來(lái)篩選序列而保持大多數(shù)獲自命中變體文庫(kù)的優(yōu)選殘基，所述氨基酸具有比截止值低的出現(xiàn)率。以簡(jiǎn)并寡核苷酸靶向上面構(gòu)建的命中變體文庫(kù)。將上面構(gòu)建的簡(jiǎn)并核酸文庫(kù)克隆入噬菌體展示系統(tǒng)并基于噬菌體展示抗體與包被到96孔板上的固定VEGF的結(jié)合來(lái)選擇噬菌體展示抗體(ccFv)。將文庫(kù)置于噬菌體展示載體pABMD12中，其中抗-VEGF的Vh被所述文庠所替代。作為結(jié)果，Vl和多種由文庫(kù)生成的Vh將配対以形成抗-VEGF的功能性ccFv。隨后利用噬菌體展示文庫(kù)對(duì)于固定的VEGF蛋白抗原作進(jìn)一步淘洗(panning)。為了生成能夠覆蓋廣泛散布的簡(jiǎn)并性位置的文庫(kù)，在設(shè)計(jì)文庫(kù)的位點(diǎn)上以簡(jiǎn)并性位置合成多種重疊性簡(jiǎn)并DNA寡核苷酸。組裝方法由兩個(gè)PCR反應(yīng)，組裝PCR和擴(kuò)增PCR組成。設(shè)計(jì)組裝寡核苷酸，35-40鏈節(jié)，被15-20個(gè)堿基重疊，平均熔點(diǎn)溫度為大約6CTC。產(chǎn)生另外一對(duì)擴(kuò)增寡核苷酸引物(Amp93和Amp94)進(jìn)行設(shè)計(jì)產(chǎn)物的最后擴(kuò)增。因此，所述組裝PCR包括在最終總濃度為8jjM，dNTP0.8^iM,lxpfo緩沖液(Strategene)，和2.5單位的pfiiturbo(Strategene)中等量的組裝寡核苷酸引物。熱循環(huán)如下進(jìn)行94。Cx45"，58。Cx45",72。Cx45"進(jìn)行30個(gè)循環(huán)以及在72。C上進(jìn)行10分鐘的最后延伸。將PCR產(chǎn)物混合物稀釋10倍并且用作擴(kuò)增PCR的模板，其中所有試劑都保持相同，除了加入最終濃度為lpM的擴(kuò)增引物以外。熱循環(huán)如下進(jìn)行94°Cx45"，60°Cx45",72°Cx45"進(jìn)行30個(gè)循環(huán)以及在72。C上進(jìn)行20分鐘的最后延伸。將最終產(chǎn)物(VH文庫(kù))純化，用HindIII和Styl消化，并且最后亞克隆入載體pABMD12中以替換原始的鼠Vh。利用文庫(kù)電轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，其又通過(guò)輔助噬菌體K07(Amersham)擴(kuò)增和救獲(rescue)，隨后按照標(biāo)準(zhǔn)方法在3CTC下過(guò)夜生產(chǎn)文庫(kù)噬菌體。為了篩選上面實(shí)施例中所述構(gòu)建的文庫(kù)，將純化的同型二聚VEGF蛋白(Calbiochem)以指定濃度稀釋在包被緩沖液(0.05MNaHC03,pH9.6)中并于4"過(guò)夜固定在Maxisorb孑L(Nunc)上。隨后在將稀釋于PBS中的噬菌體文庫(kù)應(yīng)用在孔中于37'C溫育2小時(shí)之前，將經(jīng)包被的孔在5%奶中于37'C封閉1小時(shí)。溫育混合物還常規(guī)包含2%的奶以使非特異性結(jié)合最小化。在溫育結(jié)束時(shí)，洗滌孔并且隨后在感染TG1細(xì)胞之前通過(guò)1.4%的三乙胺洗脫結(jié)合的噬菌體，在所述感染之后由K07輔助噬菌體進(jìn)行拯救來(lái)擴(kuò)增。為了擴(kuò)增所述噬菌體，隨后在收獲噬菌體文庫(kù)之前在存在羧節(jié)青霉素和卡那霉素時(shí)將感染的和拯救的TG1細(xì)胞于3(TC過(guò)夜生長(zhǎng)。將擴(kuò)增的噬菌體用作輸入文庫(kù)進(jìn)行下一輪淘洗。同時(shí)，隨后對(duì)來(lái)自第5輪等的淘洗的單個(gè)克隆隨機(jī)取樣進(jìn)行噬菌體ELISA,其中將證實(shí)與固定VEGF的特異性結(jié)合，并且證明從第5輪到第7輪淘洗100%的陽(yáng)性。最后，從第5輪淘洗(P5)開(kāi)始，對(duì)在2xYT/羧芐青霉素(100pg/ml)/卡那霉素(70pg/ml)的平板上生長(zhǎng)的分離克隆取樣測(cè)序，以便確定針對(duì)設(shè)計(jì)的命中位置和命中序列。圖1C顯示選定的抗-VEGF抗體的全長(zhǎng)VrJ勺氨基酸序列(與Baca等(1997)JBiolChem272:10678-10684中人源化VL的氨基酸序列(SEQIDNO:1)，和Kim等(1993)Nature362:841-844中的小鼠抗-VEGF單克隆抗體的氨基酸序列(SEQIDNO:284)進(jìn)行比較)，VJCDR,和Vl/FR的氨基酸序列。圖ID顯示選定抗-VEGF抗體的全長(zhǎng)VH的氨基酸序列(與Baca等(1997)JBiolChem272:10678-10684中人源化VH的氨基酸序列(SEQIDNO:55)，Chen等(1999)J.Mol.Biol.293:865-881的奈和力成熟Vh的氨基酸序列(SEQIDNO:56)，以及Kim等(1993)Nature362:841-844中的小鼠抗-VEGF單克隆抗體的氨基酸序列(SEQIDNO:283)進(jìn)行比較)，Vl/CDR,Vh/CDR,和VH/FR。為了與其它方法生成的抗-VEGF抗體進(jìn)行直接比較的目的，本發(fā)明中公開(kāi)的人源化VL(SEQIDNO:l)與Chen等(1999)J.Mol.Biol.293:865-881中所述抗體Y0317的Vl相同；而本發(fā)明中公開(kāi)的VH(SEQIDNO:55)與Chen等(1999)，同上中所述的抗體Y0192的Vl相同。本發(fā)明中公開(kāi)的人源化和親和力成熟VH(SEQIDNO:56)與Chen等(1999)，同上中所述的抗體Y0317的Vh相同。逸定的伏化Vh枸架也與人源化Vh序列聚類在一起，與人神系Vh3家族的系統(tǒng)發(fā)生距離非常近，而鼠Vh構(gòu)架與優(yōu)化VH構(gòu)架和人種系非常遠(yuǎn)。命中序列相対于Vh的完整人免疫球蛋白所有組成成分的系統(tǒng)發(fā)育分析提示它們實(shí)際上與人種系家族III關(guān)系最近。這支持這樣的結(jié)論，即本發(fā)明的方法可以用于以優(yōu)化抗體的完整人或人樣序列設(shè)計(jì)優(yōu)化的構(gòu)架，這依賴于人樣序列和與結(jié)構(gòu)模板或來(lái)自集合結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)平均值的模板的相容性之間的很好平衡。利用我們所述的發(fā)明方法，我們發(fā)現(xiàn)多種重鏈(例如，SEQIDNO:70,SEQIDNO:67和SEQIDNO:75)人源化構(gòu)架在構(gòu)架優(yōu)化后具有比母體或參考抗-VEGF抗體序列(SEQIDNO:55)更高的結(jié)合親和力。這種改進(jìn)主要是來(lái)自由構(gòu)架人源化作用單獨(dú)帶來(lái)的結(jié)合速率(K。n)的較大提高和脫離速率(K。ff)的小的降低。圖2A顯示5種抗體，母體抗體(hABl)和利用BIAcore生物傳感器選自設(shè)計(jì)文庫(kù)的抗-VEGF抗體的優(yōu)化構(gòu)架(hAB2，hAB3，hAB5)的親和力數(shù)據(jù)。所述測(cè)量是通過(guò)測(cè)量當(dāng)純化的抗體結(jié)合其抗原(VEGF)時(shí)SPR單位(y-軸)對(duì)時(shí)間(x-軸)的變化而實(shí)施的，所述抗原(VEGF)于25。C固定于CM5生物芯片上。兩種人源化的構(gòu)架hAB2和hAB3在構(gòu)架優(yōu)化后在結(jié)合親和力(以單鏈形式)方面是文獻(xiàn)中報(bào)道的母體/參考抗-VEGF抗體序列(PrestaLQChenH,O'ConnorSJ，ChisholmV,MengYGKrummenL,WinklerM，F(xiàn)erraraN(1997)CancerRes,57,4593-4599)4倍，這兩種人源化抗體在人源化后應(yīng)當(dāng)具有2倍于對(duì)應(yīng)鼠抗體的結(jié)合親和力。2.候選抗體的選擇1)ccFv-雜二聚體巻曲螺旋穩(wěn)定化的抗體本發(fā)明提供一種新的策略以使VH和VL雜二聚體穩(wěn)定化。設(shè)計(jì)獨(dú)特的雜二聚體化序列對(duì)并且用來(lái)生成Fab樣的功能性人工Fv片段ccFv(US200030027247A1)。這種序列對(duì)特異性地形成巻曲-螺旋結(jié)構(gòu)并且介導(dǎo)GABAB-R1和GABAB-R2受體的功能性雜二聚體化作用。每種雜二聚體序列對(duì)分別源自雜二聚體受體GABABR1和R2的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域。為了改造抗體Vh和Vl染二聚體的目的，將序列GR1和GR2的對(duì)分別融合到Vh和VL片段的羧基末端上。因而Vh和Vl，ccFv(巻曲螺旋Fv)的功能性配對(duì)，由GR1和GR2的特異性雜二聚化作用介導(dǎo)。表達(dá)具有分子量為35kDa的重組ccFv抗體片段。將抗-VEGF抗體的VH和VL序列克隆到表達(dá)兩種融合蛋白的載體中VH-GR1和VL-GR2-pIII融合蛋白中。表達(dá)的Vh-GR1和VL-GR2-pIII融合蛋白分泌入壁膜間隙中，在那里它們進(jìn)行雜二聚體化以通過(guò)巻曲-螺旋結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定的ccFv抗體。為了在絲狀噬菌體的表面上展示ccFv抗體，將上面的載體轉(zhuǎn)化入細(xì)菌TG1細(xì)胞中，用K07輔助噬菌體對(duì)其作進(jìn)一步超感染。2)銜接子(adaptor)介導(dǎo)的噬菌體展示系統(tǒng)在常規(guī)的噬菌體展示系統(tǒng)中，將目標(biāo)蛋白融合到噬菌體衣殼蛋白如pIII上以便在噬菌體的表面進(jìn)行展示。這種融合蛋白將與由輔助噬菌體如K07提供的野生型噬菌體蛋白一起組裝成噬菌體顆粒。將如US20030104355A1中所述的稱作銜接子定向的展示系統(tǒng)的新噬菌體展示系統(tǒng)用來(lái)將各種抗體片段展示于噬菌體表面。通常，抗體片段如單鏈可變片段由一對(duì)銜接子攜帶到噬菌體顆粒的表面上，所述一對(duì)銜接子特異性形成雜二聚體，一種融合以表達(dá)載體中的展示蛋白而另一種融合了輔助載體中的噬菌體衣殼蛋白。特別地，雜二聚體序列對(duì)GR1和GR2的每個(gè)分別源自雜二聚體的受體GABABR1和R2的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域。為了展示抗體片段的目的，將序列GR1在原核表達(dá)載體中融合到抗體片段的羧基末端上，而GR2則融合到噬菌體基因組殼體蛋白III的氨基末端上。所述雜二聚體通過(guò)一種序列對(duì)形成，所述序列對(duì)特異性形成巻曲-螺旋結(jié)構(gòu)并且在通過(guò)輔助噬菌體救獲攜帶表達(dá)載體的大腸桿菌之后介導(dǎo)抗體片段的功能性展示。3)候選抗體文庫(kù)的制備基于PCR組裝，利用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法制備候選抗體文庫(kù)的DNA。隨后將所述DNA進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶消化，純化，并且連接入如上所述適合的載體中。連接后，將DNA轉(zhuǎn)化入TG1細(xì)胞中。通過(guò)輔助噬菌體感染從TG1細(xì)胞中制備噬菌體。將感染的TG1細(xì)胞于3(TC過(guò)夜培養(yǎng)于2xYT/Amp/Kan中。通過(guò)PEG/NaCl由培養(yǎng)物上清液沉淀噬菌粒顆粒，并將其重懸于PBS中。4)候選抗體文庫(kù)的選擇使用候選抗體的噬菌體文庫(kù)相對(duì)于固定的VEGF進(jìn)行文庫(kù)選擇。純化的重組人VEGF165購(gòu)自Calbiochem(批號(hào)80054-994)。人VEGF的165個(gè)氨基酸殘基變體的糖基化的，二硫化物連接的同型二聚體具有42kD的表觀分子量(Burke等，Biochem.Biophys.Res.Co醒un.207:348(1995);Neufeld等，Prog.GrowthFactorRes.5:89(1994);Leung等，Science246:1306(1989))。通常，在結(jié)合的溫育期后，洗去未結(jié)合的噬菌體，洗脫結(jié)合的噬菌體并擴(kuò)增進(jìn)行下一輪淘洗。過(guò)去已經(jīng)舉例說(shuō)明了通常用于噬菌體展示的類寸以方法(Barbas等,Phagedisplay:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)。例如，首先將100pi的2嗎/ml純化人重組VEGF165的等分試樣固定到96孔板的每孔上。在PBS中以5%的牛奶進(jìn)行封閉后，將2%牛奶/PBS中的文庫(kù)噬菌體的等分試樣加入孔中并進(jìn)行溫育。隨后將含有溶液的噬菌體棄去，并洗滌孔。最后以lOOmM三乙胺洗脫結(jié)合的噬菌體，并將其加入到TG1培養(yǎng)物中進(jìn)行感染。隨后將由感染的TG1細(xì)胞制備的噬菌體用于下一輪淘洗。隨后通過(guò)對(duì)于VEGF抗原蛋白的ELISA確認(rèn)陽(yáng)性克隆，其中通過(guò)用針對(duì)噬菌體外殼蛋白pVm的HRP綴合的抗-M13抗體溫育來(lái)檢測(cè)結(jié)合到固定抗原上的噬菌體。使用底物ABTS[2,2'連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]進(jìn)行HRP活性的測(cè)量。對(duì)確認(rèn)為陽(yáng)性的那些克隆的DNA進(jìn)行測(cè)序。隨后將取樣的DNA序列翻譯成氨基酸序列。將選定的序列組合以生成新的變體。將選定的變體進(jìn)行表達(dá)以生產(chǎn)可溶性抗體片段進(jìn)行親和力評(píng)估。3.來(lái)自人PBLs的Vk和V,的擴(kuò)增從人外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)中提取總RNA，并用作第一鏈cDNA合成的模板，所述cDNA合成是通過(guò)利用寡-dT引物和反轉(zhuǎn)錄酶以標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的(第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自RocheAppliedScience)。通過(guò)PCR由單鏈cDNA擴(kuò)增抗體輕鏈可變基因。設(shè)計(jì)PCR引物并基于KabaV-基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行合成(表1)。為了擴(kuò)增Vk基因的全部6個(gè)亞家族，使用靶向40個(gè)種系人Vk基因5'末端的6種簡(jiǎn)并引物和靶向5種人Jk片段基因3，末端的3種簡(jiǎn)并引物。為了進(jìn)行V1基因全部IO個(gè)亞家族的PCR擴(kuò)增，使用靶向31個(gè)種系人Vi基因5;末端的8種簡(jiǎn)并引物和靶向4種Jl片段基因3'末端的2種簡(jiǎn)并引物。將PCR擴(kuò)增的Vk和VI基因進(jìn)一步克隆入噬菌粒載體中以生成噬菌體展示文庫(kù)，所述載體攜帶人源化抗-VEGF抗體VH。表l:Vk和Vl擴(kuò)增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>4.可溶性抗體片段的表達(dá)可以在原核(大腸桿菌)和真核(酵母)表達(dá)系統(tǒng)中生成以單鏈可變片段(scFv)形式存在的可溶性抗體片段用于生物物理分析的目的。scFv的構(gòu)建包括如在前研究所述的通過(guò)(G4S)3接頭連接的VH片段和VL片段((Barbas等,Phagedisplay:alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)。用于原核表達(dá)的表達(dá)載體例示于圖7中。制備感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞，例如，BL21,并用攜帶抗體片段的載體按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)《亍轉(zhuǎn)4fc(Sambrook，F(xiàn)ritsch禾口Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y"(l989);Antibodies:ALaboratory-Manual,ColdSpringHarbor-Laboratory,19M)。在適于蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這些條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且因此不在此詳述。利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法收獲表達(dá)的抗體并用于進(jìn)一步分析。使用購(gòu)自Invitrogen的Pichia表達(dá)試劑盒并按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書進(jìn)行酵母中的表達(dá)。所有的抗體都在C末端用HA-His6標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)記，并通過(guò)NTA和Superdex75柱進(jìn)行純化。為了測(cè)定抗體片段的純度和表達(dá)產(chǎn)率，通過(guò)SDS-PAGE凝膠分析20pl純化的蛋白質(zhì)，并通過(guò)用考馬斯亮藍(lán)R-250染色進(jìn)行顯影。5.選定的抗體片段的親和力分析利用BIAcoreBiosensorAssay測(cè)定抗體親和力。通過(guò)胺偶聯(lián)將VEGF蛋白(購(gòu)自Calbiochem)偶聯(lián)到CM-5生物傳感器芯片(ship)上。固定后，將具有200-1000反應(yīng)單位的VEGF的CM-5芯片在使用前保持于4°C。所有實(shí)驗(yàn)都在25。C或35。C上進(jìn)行。利用Biacore1000(BiacoreAB,Sweden)將PBS緩沖液中的每種樣品以20pl/min的流速注射到VEGF表面上，并在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)通過(guò)10^的甘氨酸-HCl，PH1.5將結(jié)合的抗體從芯片上去除。記錄每個(gè)傳感圖(sensorgrams)并相對(duì)于PBS基線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了測(cè)定抗體親和力，包括締合和解離速率常數(shù)，利用BIAevalvationversion3軟件通過(guò)擬合1:1Langmuir結(jié)合模型的結(jié)合曲線對(duì)傳感圖進(jìn)行分析。686.抗體片段穩(wěn)定性的評(píng)估為了評(píng)估所定義抗體片段的穩(wěn)定性，將PBS中的可溶性抗體分別在4°C,37°C,和42'C下進(jìn)行溫育?？贵w濃度為0.5或1pM。在指定的溫育時(shí)間后，將抗體溶液置于25。C下1小時(shí)，隨后在Biacorel000中直接注射到VEGF表面上。記錄抗體結(jié)合RU，并用于穩(wěn)定性分析。序列表<110>鐘蘋羽夕》a心凱文G*王馬克*赫斯荷李艷<120>針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的人源化抗體<130>26050-709.601<150>US60/284,407<151>2001-04-17<150>US10,125,687<151>2002-04-17<150>US10/153,176<151>2002-05-20<150>US10/443,134<151>2003-05-20<150>US10/723,434<151>2003-11-26<160>1563.1<210>1<211>107<212>PRT<213>人工序列<223>VL<400>1AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrlieThrCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysValLeulie354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>2<211>107<212>PRT<213>ArtificialSequence<220><223>VL<400>2AsplieGluLeuThrGinSerProSerSerLeuSerValSerAlaG!y151015AspArgVal丁hrlieSerCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProArgValLeulie354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProTyrArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro6S707580GluAspValAlaValTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>3<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>3AsplieGluLeuThrGinSerProSerSerLeuSerValThrProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProGinValLeulie354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinAla65707580GluAspPheAlaHeTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>4<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>4AsplieGluLeuThrGinSerProSerSerLeuSerValThrProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProGinLeuLeuHe354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerArgLeuGinAla65707580GluAspValAlaValTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp8S9095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>5<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>5AsplieGluM改ThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerLeuGlyIS1015GluArgValThrlieSerCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProHisLeuLeulie354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProTyrArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinAla6S707580GluAspPheAlaAlaTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys10010S<210>6<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>6AsplieValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaThrProGly151015GluArgValThrlieThrCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202S30LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgValLeulie354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro'65707580GluAspVaiAlaValTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>7<211>107<212>PRT<2。>人工序列<220><223>Vl_<400>7AsplieValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaThrProGly151015GluArgValThrlieSerCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProSerLeuLeuVal35鄰45TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGlySO5560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerArgLeuGinAla65707580GluAspPheAlalieTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp8S9095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>8<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400'>8AsplieValLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaThrProGly151015AspArgValThrlieSerCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProGinLeuLeulie354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinAla65707580GluAspValAlaThrTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>9<211>107<212>PRT<213i>人工序列<220><223>VL<400>9AsplieValLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaThrProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProHisLeuLeulie354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProTyrArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinAla65707580GluAspPheAlalieTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp85909SThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>10<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>10AsplieGluMetThrGinSerProSerSerLeuSerAteThrProGly151015AspArgVal丁hrlie丁hrCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr2D2530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProArgValLeulie35鄰45TyrPheThrSerSerLeuHfsSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerArgLeuGinPro65707580GluAspValAlaThrTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp8S9095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>11<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>11AsplieGluMetThrGinSerProSerSerLeuSerValThrProGly151015AspArgValThrlieThrCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProHisLeuLeulie354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerArgLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>12<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>'12AsplieGluLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaThrLeuGly151015GluArgValThrlieSerCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProHisValLeulie35鄰45TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerArgLeuGinAla65707580GluAspValAlaThrTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>13<211>107<212>P叮<213>人工序列<220><223>VL<■>13AsplieGluMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrlieThrCysSerAlaSerGinAspileSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgValLeuIle354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinAla65707S80GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValproTrp85909SThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>14<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>14AsplieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerAlaGly151015AspArgValThrlieSerCysSerAlaSerGinAsplieSerAsnTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProGinLeuLeulie354045TyrPheThrSerSerLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPhe丁hrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTyrSerThrValProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>15<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>15AsplieValMetThrGinSerProSerSerl_euSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieSerCysAsnAlaSerGinSerlieGlyThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProGinValLeulie354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProGlyArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerLysProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>16<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<柳>16AsplieVafMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieSerCysArgAlaSerGinSerlieSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProGinValLeulie354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrSerSerSerProTrp8S9095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>17<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>17AspHeValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerProGly15ID15GluArgAlaThrlieThrCysHisAlaSerGinSerlieGlyThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProHi'sValLeuIte354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580AspAspPheAlaValTyr丁yrCysGinGinTyrAsnSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluHeLys100105<210>18<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>18AsplieValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrHeThrCysHisAlaSerGinSerlieGlyThrTyr2D253DLeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProHisValLeuHe354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGlySO5560SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580AspAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>19<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>19AsplieValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysLysAlaSerGinSerlieGlyThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgValLeulie354045丁yrAspAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrSerSerThrProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>20<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>20AsplieLysMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieSerCysLysAlaSerGinSerlieGlySerTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProSerValLeulie354045TyrAlaAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrTyrSerGlyProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>21<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>21AsplieLysMetThrGinSerProSerSerLeu.SerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysAsnAlaSerGinSerlieSerThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProLysValLeulie354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerAlaProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>22<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>22AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieSerCysLysAlaSerGinSerlieGlySerTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgValLeulie354045TyrSerAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrHeSerSerLeuGinPro657075SOGluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerThrProTrp8S9095丁卜'rPheG!yG!yG!yThrb,'sVs!G!uI!eLys咖105<210>23<211>107<212>PRT<213>ArtificialSequence<220><223>VL<400>23AspHeValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieSerCysLysAlaSerGinSerlieGlyThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgValLeulie354045TyrAspAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGlySO55.60SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrTyrSerThrProTrp859095ThrPheGiyGiyGiyThrLysV'aiAialieLys100105<210>24<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>24AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieSerCysLysAlaSerGinSerlieGlyThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgValLeulie354045TyrSerAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrSerSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys10D105<210>25<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<鄰0>25AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysHisAlaSerGinSerlieSerSerTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProAsnVeilLeulie354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAspArgPheSerGly505560SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys10010S<210>26<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>26AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GJuArgAiaThrlieThrCysHisAiaSerGinSerlieSerThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgValLeulie354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIteSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerAlaProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>27<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>27AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysLysAlaSerGinSerIteSerThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProGinValLeulie354D45TyrAspAteSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerGiySerGiyThrAspPheThrLeuThrI!eSerSerLeuG!nPra65707580GluAspPheA(aVa(TyrTyrCysGinGinTyrAsnSerAlaPraTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>28<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>28AsplieValMetThrGinSerPraSerThrLeuSerAlaSerProGly151015.GluArgAlaThrlieThrCysAsnAlaSerGinSerlieGlySerTyr202S30LeuA!aTrpTyrG(nGinLysProGlyGinAlaPraLysValLeulie354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValPraSerArgPheSerGly505560SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPra65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlulieLys100105<210>29<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>29AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysAsnAlaSerGinSerlieGiyThrTyr202530LeuAla丁rpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProAsnLeuLeulie354045TyrAspAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProGlyArgPheSerGly505560SerArgSerGlyThrAspPheTTirLeuThrHeSerSerLeuGinPro65707580G!uAspPheA!aVa!TyrTyrCysGinGinTyrSerSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>30<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>30AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysAsnAlaSerGinSerlieGlyThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProAsnValLeulie354045TyrAspAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArgPheSerGly50S560SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrl"yrSerAlaProTrp8S9095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>31<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>31AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGlyIS10ISGluArgAlaThrlieThrCysAsnAlaSerGinSerlieSerThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgValLeulie354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>32<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>32AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysGinAlaSerGinSerlieSerThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProLysValLeulie354045TyrAspAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProGlyArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAiaVaiTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>33<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>33AsplieValMetT^GInSerProSerThrLeuSerAiaSerProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieSerThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProArgLeuLeulie354045TyrSerAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerArgSerGlyThrAspPhe丁hrLeuThrlieSerSerLeuGinPro557CT7580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>34<211>107、<1丄厶,「I、I<213>人工序列<220><223>VL<400>34AsplieValMetThrGinSerProSerThrLeuSerAlaSerProGly151015GluArgAlaThrlieThrCysSerAlaSerGinSerlieGlyThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProSerValLeulie354045TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProGlyArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinAla65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerAlaProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>35<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>35AsplieVa!MetThrG!nSerProSerThrLeuSerAiaSerProG!y'151015GluArgAlaThrlieThrCysSerAlaSerGinSerlieSerThrTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinAlaProGinValLeulie354045TyrAlaAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly505560SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinTyrTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys100105<210>36<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>36AlalieArgMetThrGinSerProSerSerValSerAlaSerValGly151015AspThrValThrlieAlaCysArgAlaSerGinAlalieArgAsnAsp202530LeuThrTrpTyrGinGinLysProGlyThrAlaProLysLeuLeulie354045TyrGiyAiaThrThrLeuGinSerGiyVaiProSerArgPheSerGiySO5560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerSerThrThrProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValAsplieLys100105<210>37<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>37AsplieValMetThrGinThrProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspThrValThrlieThrCysArgAlaSerArgAsplieArgAsnAsp202530LeuAlaTrp丁yrGinGinLysProGlyLysAlaProGluLeULeulie3S4045TyrAfaAlaSerSerLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro6570758099GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValAsplieLys咖105<210>38<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>38GlulieValLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerlieGly151015AspArgValAlalieThrCysArgAlaSerArgAsplieThrThrAsp202530LeuAlaTrpTyrGinGinlieProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrAlaAlaSerArgLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAteAlaTyrTyrCysGinGinSerTyrSer丁hrProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValAsplieLys100105<210>39人工序列<220><223>VL<4D0>39GlulieValLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArglieThrlieThrCysArgAlaSerArgAsplieArgAspAsp202S30LeuAla'TrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysValLeulie354045TyrAlaAlaSerSerLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysLeuGlulieLys100105<210>40<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VLGlulieValLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgVaiThrlieThrCysArgAiaSerG!nSerI!eSerThrTyr202530lieAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrAlaAlaSerSerLeuGinSerGlyValThrSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieArgSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>41<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>41GlulieValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinAlalieTyrAspTyr202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProAsnLeuLeulie354045TyrAlaAlaSerArgLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGiy'ThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValAsplieLys100105<210>42<211>107<212>PRJ<213>人工序歹ij<220><223>VL<400>42GluHeValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinAsplieArgLysAsp202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlylieAlaProLysValLeulie354045TyrAlaAlaSerThrLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyrSerProProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysLeuGlulieLys100105<210>43<211>107<212>P叮<213>人工序列<220><223>VL<400>43GlulieValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieSerThrTyr202530lieAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrAlaAlaSerSerLeuGinSerGlyValThrSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieArgSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>44<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>44GlulieValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspThrValThrlieAlaCysArgAlaSerArgAsplieArgAsnAsp202530LeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrAlaAlaSerArgLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560ThrGlySerGlyThrAspPheAlaLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspSerAlaSerTyrTyrCysGinGinSerTyrThrlieProTrp859095ThrPheGlyGinGlyThrLysLeuGlulieLys100105<210>45<211>107<212>PRT<213>人工序歹iJ<220><223>VL<400>45GluThrThrLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspThrlieThrI(eSerCysArgSerSerGinProlieThrAsnAsp202530LeuA!a丁rpTyrG!nG!nLysProG!yLysAlaPro.AsnLeuLeulie354045TyrAlaAlaSerArgLeuGinGlyGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyrSerThrProTrp8S9095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105<210>46<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>46LeuProValLeuThrGinProProSerAlaSerGlyThrProGlyGin151015ArgValThrlieSerCysSerGlySerThrSerAsnlieGlySerAsn2025-30ProValAsn丁rpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysLeuLeu354045lieTyrSerAsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgLeuSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieSerGlyLeuLeu65707580SerGluAspGiuAlaAsp丁yrT'/rCysA!aSerTrpAspAspSerLeu859095ThrGlyTyrValPheGlyThrGlyThrGinLeuThrValLeu100105110<210><211><212><213><220><223><400>(_euPro47110PRT人工序列VL47ValLeuThrGinProProSerAlaSerGlyThrProGlyGin51015ArgValThrlieSerCysSerGlySerTyrSerAsnlieGlySerAsn202530AlaValAsnTrpTyrGinGinLeuProGlyAlaAlaProLysValLeu354045MetTyrThrAsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGly丁hrSerAlaSerLeuAlalieSerGlyLeuArg65707580SerGluAspGluAlaAspTyrTyrCysAlaAlaTrpAspAspSerLeu8590'95AsnGlyTyrValPheGlyThrGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210>48<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<鄰0>48AsnPheMetLeuThrGinProProSerThrSerGlyThrProGlyGin151015ArgValThrHeSerCysSerGlySerThrSerAsnlieGlySerAsn202S30SerValThrTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysValLeu354045MetTyr丁hrAsnAsnGinArgProSerGlyValProGluArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieSerGlyLeuGin65707580SerGluAspGluAlaAspTyrTyrCysAlaAlaTrpAspAspSerLeu859095AsnGlyTyrValPheGlyThrGlyThrLysLeuThrValLeu10010S110<210>49<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<柳>49GinAlaValLeuThrGinProProSerAlaSerGlyThrProGlyGin151015SerValThrlieSerCysSerGlyThrThrSerAsnlieGlySerAsn202530SerValAsn丁rpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysValLeu354045lieTyrGlyAsnAspGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer505560GlySerArgSerAlaThrSerAlaSerLeuAlalieSerGlyLeuGin65707580SerGluAspGluAlaAspTyrTyrCysAlaAlaTrpAspAspSerLeu859095SerGlyTyrValPheGlyAlaGlyThrGinLeuThrValLeu100105110<210>50<211>110<212>PRT<213>.人工序列<220><223>VL<400>50GinProValLeuThrGinProProSerAlaSerAlaThrProGlyGin1510.15ArgValThrlieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlySerAsn202530ProValAsnTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysValLeu354045I!eTyrSerAsr'AsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieSerGlyLeuGin65707580SerGluAspGluAlaAspTyrTyrCysAlaAlaTrpAspAspSerLeu859095SerGlyTyrValPheGlyThrGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210><211><212><213><220><223><400>51110PRT人工序列VL51GinProValLeuThrGinProProSerAlaSerGlyThrProGlyGin151015ArgValThrlieSerCysSerGlySerSerSerAsnValGlyArgAsn202530ThrValAsn卞rpTyrGinGinPheProGlyThrAlaProLysPheLeu35鄰45MetTyrGlyAsnAspGluArgProSerGlyValProAspArgPheSer5055.60GlySerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieSerGlyLeuGin6S707580110SerGluAspGluAlaAspTyrTyrCysAlaThrTrpAspAspSerLeu859095AsnGiyTyrValPheGlyThrGlyThrGinLeu丁hrValLeu100105110<210>52<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>52GinProValLeuThrGinProProSerThrSerGlyThrProGlyGin151015ArgValThrlieSerCysSerGlySerSerSerAsnlieGlySerAsn202530SerValThrTrpTyrGinGinLeuProGlyThrAlaProLysValLeu354045MetTyrThrAsnAsnGinArgProSerGlyValProGluArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieSerGlyLeuGin65707580SerGluAspGluAlaAspTyrTyrCysAlaAlaTrpAspAspSerLeu8S9095SerGlyTyrValPheGlyThrGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210>53<211>110<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>53GinSerValLeuThrGinProProSerAlaSerGlyThrProGlyGin151015ArgValThrlieSerCysSerGlySerAsnSerAsnlieGlySerAsn202530AsnValTyrTrpTyrGinGinPheProGlyThrAlaProLysValLeu354045lieTyrGlyAsnAsnGinArgProSerGlyValProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuAlalieSerGlyLeuGin65707580SerGluAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyAlaTrpAspAspSerLeu8S9095AsnGlyTyrValPheGlyThrGlyThrLysLeuThrValLeu100105110<210>54<211>111<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<40O54GhSerAlaLeuThrGinProProSerValSerGlyAlaProGlyGin151015ArgValThrlieSerCysThrGlyArgSerSerAsnlieGlyAlaGly202530HisAspValHisTrpTyrGinGinLeuProGly丁hrAlaProLysLeu354045LeulieTyrAlaAsnAspGinArgProSerGlyValProAspArgPhe505560SerAspSerLysSerGlyThrSerAlaSerLeuGlylieSerGlyLeu65707580ArgSerGluAspGluAlaAspTyrPheCysAlaThrTrpAspAspSer8S9095LeuHisGlyTyrValPheGlyThrGlyThrLysValThrValLeu100105110<210>55<2JL1>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>55GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGlyIS1015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThfPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>55<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>56GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheThrHisTyr202S30GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580114LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys85909SAlaLys丁yrProTyr丁yrTyrGlyThrSerHisTrpTyrPheAspVal1D0105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>57<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>57GluGlyGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly1510ISSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr657075.80LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>58<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>58GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly1510ISSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsn丁hrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrlieSerLeuAspAsnSerLysSerGinAiaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys8S9095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisT卬TyrPheAspVal100105110TrpAlaGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>59<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>59GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015ThrLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysAsnThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer11S120<210>60<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>60GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuArgCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>61<211>123<212>PR丁<213>人工序列<220><223>VH<400>61GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015118SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheAspPheThrAsnTyr20'2530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>62<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>62GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAlaLeuAspHisPhe202530GlyLeuAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe.5055'60LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>63<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>63GluValGhLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGly丁yrAspPheTyrAsnTyr202S30GlylieAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaHisGluPhe505560ThrArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyr丁yrGlySerSerHis丁rpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>64<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>64GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrSerLeuAspHisTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>65<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>65G'uValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal35鄰45GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysAsnThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105U0TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>66<211>123<212>PRT<213>人工序列<22D><223>VH<400>66GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly1510ISSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr20-2530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe50S560LysArgArgPheThrlieSerLeuAspAsnSerLysSerThrValTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>67<2U>123<212>PRT<213>人工序列123<220><223>VH<40D;>67GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgVaJThrPheSerLeuAsp丁hrSerLysSer丁hrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys85909SAlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>68<211>123<212>PRT<213>人工序列<220>.<223>VH<400>68GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505S60LysArgArgValThrPheSerLeuAsnThrSerLysSerThrAfaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrp丁yrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>69<211>123<212>.PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>69GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly15ID15SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThi"PheThrAsnTyr20.2530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrpHeAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAteAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysAsnThrAlaTyr65707580LeuGhLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyr丁yrGlySerSerHisTipTyrPheAspVal1D0105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>70<211>123<212>PRT<2l3>人工序列<220><223>VH<400>70GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyr.AlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinM改AsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinG(yThrLeuValThrVafSerSer115120<210>71<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>71GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuThrCysAlaAlaSerGly'TyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal3S4045GfyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspAsnSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaQuAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal咖105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>72<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>72GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuThrCysAlaValSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202S30GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrlieSerArgAspThrSerLysAsnGinAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>73128<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>73GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015ThrLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPheSO5560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>74<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>74GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProG)yGly151015ThrLeuArgLeuThrCysAlaAlaSerGlyTyr丁hrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105U0TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<21D>75<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<柳>75GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015ThrLeuArgLeuThrCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr20'2530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>76<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>76GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015ThrLeuArgLeuThrCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPheSOS5'60LysArgArgValThrlieSerLeuAspThrSerLysSerThrValTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal10010S110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>77<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>77GinValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuThrCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe5055.60LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysSerLysAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>78<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<40D>78GinValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015ThrLeuArgLeuThrCysAlaValSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyAlaProThrTyrAlaAlaAspPheSO5560LysArgArgLeuThrPheSerLeuAspAsnSerLysAsnProProTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110133TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>79<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>79GinValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspAsnSerLysSerThrValTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>80<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>80GlnValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyValValG)nProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrlieSerLeuAspThrSerLysAsnThrAlaTyr65707580LeuGlnLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys85909SAlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>81<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>81GlnValGlnLeuValGlnSerGlyGlyG(yValValGinProG(yGly151015SerLeuArgLeuThrCysAlaAlaSerGiyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVaJ35404SGlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgValThrlieSerLeuAspThrSerLysSerGlnAlaTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys8S9095AlaLysTyrP"roHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>82<211>123<212>P叮<213>人工序列<220><223>VH<400>82GlnValfelnLeuValGlnSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuThrCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgValThrlieSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>83<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>83GinValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly1510ISSerLeuArgLeuThrCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045137GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe50SS60LysArgArgPheThrlieSerLeuAspThrSerLysSerGinAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr丁yrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSerUS120<210>84<211>123<212>PRT<213^人工序列<220><223>VH<400>84GinValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly1510ISThrLeuArgLeuThrCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysAsnThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAsp丁hrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProHisTyrTyrGlySerSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>85<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>85GluValGinLeuValGinSerGlyGlyValValGinProGlyGlySer151015LeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrHisTyrGly202530LeuAsnTrpLeuArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpValGly354045TrpValAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaAspGluPheLys505S60ArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyrLeu65707580GinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095LysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspValTrp100105110GlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>86<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>86GluValGinLeuVa(GinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheAsnPheThrHisTyr202530GlylieAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal3S4045GlyTrplieAsnThrAsnAsnGlyGluProThrTyrAlaGinAspPhe50S560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>87<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>87GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheAlaHisTyr202530GlyLeuAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrpValAsnThrTyrThrGlyGluSerThrTyrValProGluPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105〗10TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>88<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<■>88GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheAlaHisTyr202530GlyValAsnTrpLeuArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaHisAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>89<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>89GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015142SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheAlaSerPhe202530GlylieAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrpDeAsnThrTyrThrGlyGluSerThrTyrAlaGinAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110HpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer11S120-210>90:211>123:212>PRT:213>'人工序列:220>:223>VH4D0>9DSluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly51015_SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheAspHisPhe202530GlyHeAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrValAspGluPhe505560LysArgArgVal丁hrPheSer.LeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>91<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>91GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheAsnAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal354045GiyTrplieAsnThrTyrAsnGlyGluProThrTyrAlaProAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSerU5120<210>92<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>92GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheSerHisPhe202530GlylieAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaHisAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGhLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095iAlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal咖105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>93<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>93GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheSerHisPhe202530GlylieAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrValProGluPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>94<211>1.23<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>94GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGiyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheSerAsnTyr202530GlyLeuAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaGluGluPhe505560ThrArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115,120<210>95<211>123<212>PRT<213>人工序列147<220><223>VH<400>95GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheThrHisTyr202530GlyLeuAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaHisGluPhe505560ThrArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>96<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<鄉(xiāng)>96GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly1510ISSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAsnPheTyrHisTyr202530GlyValAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal354045GlyTrpValAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaGinGluPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>97<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>97GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAsnPheTyrSerTyr202530GlyLeuAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaGinGluPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys8S9095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>98<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>98GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrSerPheAspHisTyr202530GlyLeuAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal35404SGlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAspGluPhe505560ThrArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>99<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<鄰0>99GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGfnProGlyGlyIS1015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVai354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560ThrArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAteGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095LysTyrProTyr"TyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>100<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>100GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrplieArgGhAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505S60LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAiaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>101<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<柳>101GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>102<211>123<212>PRT<213>人工序列153<220><223>VH<4D0>102GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045G)yTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe50S560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>103<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>103GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVai3S4045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyThrSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>104<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>104GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly1510ISSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys85909SAlaLysTyrProHisTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>105<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>105GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGiy1510ISSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal35鄰45GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPhe505560LysArgArgPheThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys85909SAlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVai100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>106<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><2Z3>VH<400>106GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGlyIS1015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheThrHisPhe202530GiyLeuAsnTrplieArgGinAiaProGiyLysGlyProGluTrpVa!354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaGinAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110<21D>107<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>107GluValGinLeuValGinSerGly'GlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspLeuSerHisTyr202530GlyLeuAsnTrplieArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaProAspPhe505560ThrArgArgVaiThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>108<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>108GluValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyVa!Va!G!nPraG!yG!y151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAsnPheSerHisPhe20253DGlyLeuAsnTrpLeuArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal35404SGlyTrplieAsnThrTyrAsnGlyGluThrThrTyrAlaProAspPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>109<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH<400>109GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAsnPheSerHisPhe202530GlyLeuAsnTrpLeuArgGinAlaProGlyLysGlyProGluTrpVal354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaProGluPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>110<211>123<212>PRT<213>ArtificialSequence<220><223>VH《00>110GluValGinLeuValGinSerGlyGlyGlyValValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrAspPheThrHisPhe202530GlyLeuAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045GlyTrpValAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaHisGluPhe505560LysArgArgValThrPheSerLeuAspThrSerLysSerThrAlaTyr65707580LeuGinLeuAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysTyrProTyrTyrTyrGlyArgSerHisTrpTyrPheAspVal100105110TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>111<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>111GlyPheAspPheThrAsnTyrGlyMetAsn1510<210>112<211>10<212>PRT<21》人工序列<220><223>VH/CDR1<400>112GlyTyrThrPheThrAsnTyrGlyMetAsn1510<210>113<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>113GlyTyrSerLeuAspHisTyrGlyMetAsn1510<210>114<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>114GlyTyrAlaLeuAspHisPheGlyLeuAsn1510.<210>115<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>11SGlyTyrAspPheTyrAsnTyrGlylieAsn1510<210>116<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>116GlyTyrThrPheThrAsnTyrG,yMetAsn1510<210>117<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>117GlyTyrSerPheAspHisTyrGlyLeuAsn1510<210>118<211>10<212>PRT<213>人工序列<22D><223>VH/CDR1<400>118GlyTyrAspPheSerAsnTyrGlyLeuAsn1510<210>119<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>119GlyTyrAspPheSerHisPheGlylieAsn1510<210>120<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>120GlyTyrAspPheAlaHisTyrGlyValAsn1510<210>m<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>121GlyTyrAspPheAspHisPheGlylieAsn1510<210>122<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>122GlyTyrAspPheAsnAsnTyrGlyMetAsn1510<210>123<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>123GlyTyrAspPheAlaSerPheGlylieAsn1510<210>124<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><—223>VH/CDR1<■>124GlyPheAsnPheThrHisTyrGlylieAsn1510<210>125<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>12SGlyTyrAspPheAlaHisTyrGlyLeuAsn1510<210>126<211>10<212>PRT><223>VH/CDR1<400>126GlyTyrAsnPheTyrHisTyrGlyValAsn1510<210>127<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>127GlyTyrAspPheThrHisTyrGlyLeuAsn1510<210>128<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>128GlyTyrAsnPheTyrSerTyrGlyLeuAsn1510<210>129<211>.10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>129GlyTyrAspPheSerHisPheGlylieAsn1510<210>130<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>130GlyTyrThrPheThrHisTyrGlyLeuAsnIS10<210>131<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>131GlyTyrAspPheThrHisPheGlyLeuAsn1510<210>132<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>132GlyTyrAspLeuSerHisTyrGlyLeuAsn1510<210>133<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>133GlyTyrAsnPheSerHisPheGlyLeuAsn1510<210>134<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR11<400>134GlyTyrAsnPheSerHisPheGlyLeuAsn1510<210>135<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR1<400>135G!yTyrAspPheThrHisPheGiyLeuAsn1510<210>136<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>136TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaHisGluPheThr151015Arg<210>137<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<鄰0>137TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAlaAspPheThr151015Arg<210>138<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>138TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAspGluPheThr151015Arg<21D>139<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<■>139TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaGluGluPheThr151015Arg<210>140<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>140TrplieAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrValProGluPheLys151015Arg<210>141<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>141TrplieAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaHisAspPheLys151015Arg<210>142<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>142TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrValAspGluPheLys151015Arg<210>143<211'>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>143丁rplieAsnThrTyrAsnGlyGluProThrTyrAlaProAspPheLys151015Arg<210>144<211>17<212>PRJ<213>人工序列<220><223>VH/C眼<400>144TrplieAsnThrTyrThrGlyGluSerThrTyrAlaGinAspPheLys151015Arg<210>145<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>145TrplieAsnThrAsnAsnGlyGluProThrTyrAlaGinAspPheLys151015Arg<210>l鄰<211>17<212>PRT'<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>146TrpValAsnThrTyrThrGlyGluSerThrTyrValProGluPheLys151015Arg<210>147<211>17<212>PRT<213>.人工序列<220><223>VH/CDR2<4DD>147TrpValAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaGinGluPheLys151015Arg<210>148<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>148TrpValAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaGinGluPheLys151015Arg<210>149<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>149TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaGinGluPheLys151015Arg<210>150<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>150TrplieAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaHisAspPheLys151015Arg<210>151<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><2Z3>VH/CDR2<40D:>151TrpValAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrAlaAspGluPheLys151015Arg<210>152<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>152TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaGinAspPheLys1510ISArg<210>153<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>153TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaProAspPheThr151015<210><211>17<212>PRT<213>人工序列<223>VH/CDR2<鄉(xiāng)>154TrplieAsnThrTyrAsnGlyGluThrThrTyrAlaProAspPheLys151015Arg<210>155<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>155TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrT/rAlaProSuPheLysIS1015Arg<210>156<211>17、fcifc一■,、■<213>人工序列<223>VH/CDR2<柳>156TrpValAsnThrTyrThrGlyGluThrThrTyrA!aHisGluPheLys151015Arg權(quán)利要求1.特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含CDR1區(qū)，CDR2區(qū)和CDR3區(qū)，其中所述CDR1區(qū)為SEQIDNO182所示的氨基酸序列，所述CDR2區(qū)為SEQIDNO201所示的氨基酸序列，和所述CDR3區(qū)為SEQIDNO222所示氨基酸序列。2.權(quán)利要求1的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其由SEQIDNO:36所述的氨基酸序列組成。3.特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含CDR1區(qū)，CDR2區(qū)和CDR3區(qū)，其中所述CDR1區(qū)選自由SEQIDNO:120，121，122，131，132和134所示氨基酸序列組成的組，所述CDR2區(qū)選自由SEQIDNO:141，142，143，152，153，154和155所示氨基酸序列組成的組，和所述CDR3區(qū)為SEQIDNO:327所示的氨基酸序列。4.權(quán)利要求3的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其由選自SEQIDNO:88,90,91,106，107,108和109組成的組的氨基酸序列組成。5.特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其具有選自由下列各相組成的組的Vl和Vh対SEQIDNO:36和88，SEQIDNO:36和90，SEQIDNO:36和91，SEQIDNO:36和106，SEQIDNO:36和107，SEQIDNO:36和108，SEQIDNO:36和109。6.權(quán)利要求5的單克隆抗體，其中所述抗體是scFv。7.權(quán)利要求5的單克隆抗體，其中所述抗體是Fab。8.權(quán)利要求5的單克隆抗體，其中所述抗體是完整組裝的抗體。全文摘要本發(fā)明提供在計(jì)算機(jī)上和在體外設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對(duì)人抗原的抗體的方法。在一些具體實(shí)施方案中，提供設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的人源化或完全人抗體的方法。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供針對(duì)VEGF的單克隆抗體。具體而言，提供人源化或人抗-VEGF單克隆抗體，其具有以高親和力結(jié)合人VEGF，體外抑制VEGF-誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和體內(nèi)抑制VEGF-誘導(dǎo)的血管發(fā)生的能力?？梢詫⑦@些抗體及其衍生物用在廣泛應(yīng)用中，諸如診斷、預(yù)防和治療疾病諸如癌癥、AMD、糖尿病性視網(wǎng)膜病和其他來(lái)自病理性血管發(fā)生的疾病。文檔編號(hào)C40B40/10GK101602806SQ20091000614公開(kāi)日2009年12月16日申請(qǐng)日期2004年11月22日優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日發(fā)明者凱文·C·王,艷李,羅培志,鐘蘋羽,馬克·赫斯荷申請(qǐng)人:埃博馬可西斯公司