專利名稱：針對血管內(nèi)皮生長因子的人源化抗體的制作方法
針對血管內(nèi)皮生長因子的人源化抗體本申請是國際申請?zhí)枮椤癙CT/US2004/039501”，國際申請日為2004年11月22日， 中國申請?zhí)枮椤?00480040951. 6”，進(jìn)入中國國家階段日期為2006年7月25日”，發(fā)明名稱 為“針對血管內(nèi)皮生長因子的人源化抗體”的分案申請。對相關(guān)申請的交叉引用本申請是提交于2003 年 5 月 20 日，題為“Generation and Selection ofProtein Library in Silico”的美國申請?zhí)?0/443，134的部分繼續(xù)申請，所述美國申請?zhí)?10/443，134是提交于 2002年 5 月 20 日的，題為“Structure-BasedSelection And Affinity Maturation of Antibody Library”美國申請?zhí)?0/153，159的部分繼續(xù)申請，也是提交于 2002 ^ 5 ^ 20 H WH^J "Generation Affinity Maturation of Antibody Library in Silico”的申請?zhí)?0/153，176的部分繼續(xù)申請，上述兩者是在2002年4月17日提交的題 % "Structure-based construction of human antibody library，，白勺美國專禾串i青系歹lj 號10/125，687的部分繼續(xù)申請，所述美國專利申請系列號10/125，687要求在2001年4月 17 日提交的題為"Structure-based construction of humanantibody library，，的美國臨 時申請序列號60/284，407的利益。將這些申請并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明提供針對人抗原的抗體和產(chǎn)生針對這些靶點(diǎn)的高親和力抗體的方法。更具 體地，本發(fā)明提供針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的人源化或人抗體和產(chǎn)生這樣的抗-VEGF 的抗體的方法。此外，本發(fā)明提供使用這些抗體及其衍生物來體外抑制血管發(fā)生的組合物， 試劑盒和方法，所述組合物，試劑盒和方法用于診斷或治療與異常血管發(fā)生相關(guān)的疾病諸 如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、與局部缺血-再灌注相關(guān)的腦水腫和損傷、皮質(zhì)局部缺血、卵巢 增生和血管過多、子宮內(nèi)膜異位、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病(retinopaphy)，和其它的眼科 血管源性疾病。血管發(fā)生涉及許多生理和病理過程。血管發(fā)生由多個步驟組成，其最終導(dǎo)致內(nèi)皮 細(xì)胞的增生和分化，并且形成管和腔(血管發(fā)生)。促進(jìn)血管發(fā)生的因子包括VEGF、aFGF、 bFGF、TGF-a、TGF-0、HGF、TNF-a、血管生成素、IL_8等，而抑制血管發(fā)生的因子包括血 小板反應(yīng)蛋白(Good 等.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 :6624_6628 (1990))，促乳素的 N 末 端片段(Clapp等 Endocrinology, 133 1292-1299 (1993))，纖維蛋白溶酶原的三環(huán)5結(jié)構(gòu) 域(Cao 等 ，J. Biol. Chem.，271 :29461_29467 (1996)，制管張素(0' Reilly 等 Cell, 79 315-328(1994))和內(nèi)皮抑制素(0' Reilly 等 Cell，88 :277_285 (1996))。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)是與其在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體特異性作用從而 促進(jìn)它們的血管發(fā)生的生長因子。已知血管發(fā)生在從在先存在的血管和/或循環(huán)內(nèi)皮干 細(xì)胞中發(fā)展新的脈管系統(tǒng)中具有重要作用(Asahara等.，Science, 275 (5302) =964-967, 1997 ；Springer 等 ，Mol. Cell, 2(5) :549_558，1998 ；Folkman 和 Shing, J.Biol. Chem.， 267 10931-10934，1992)。血管發(fā)生還在許多生理過程中具有重要作用，所述生理過程諸如 胚胎發(fā)生、傷口愈合和月經(jīng)。更重要的是，血管發(fā)生還涉及病理狀態(tài)，所述病理狀態(tài)諸如腫 瘤形成、轉(zhuǎn)移、糖尿病性視網(wǎng)膜病等。已知實(shí)體腫瘤的生長需要腫瘤血管形成從而供應(yīng)氧和養(yǎng)分并且腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移通過來自腫瘤血管化的血管而發(fā)生。認(rèn)為VEGF是在腫瘤的這種 血管化中的關(guān)鍵生血管因子。因此，預(yù)期腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移可以通過某些物質(zhì)中和VEGF的 血管化活性而得到抑制。最近的研究(Burrows和Thorpe，Pharmacol. Ther. ,64 155-174， 1994 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 =8996-9000,1994)已經(jīng)使用了這樣策略來靶向?qū)嶓w腫 瘤的脈管系統(tǒng)。靶向腫瘤的血管，而不是腫瘤細(xì)胞本身，具有一些優(yōu)勢，因?yàn)槠洳淮罂赡軐?dǎo) 致抗性腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，并且被靶向的細(xì)胞易于到達(dá)。而且，血管的破壞導(dǎo)致抗腫瘤效果的 擴(kuò)大，因?yàn)樵S多腫瘤細(xì)胞依賴于單一的血管來供應(yīng)它們的氧和養(yǎng)分。在幾乎一半的糖尿病患者中，糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)生是由糖尿病的其中一個并 發(fā)癥引起的。認(rèn)為在糖尿病性視網(wǎng)膜病中的微細(xì)管的形成是由氧缺乏促進(jìn)的。這些微細(xì)管 將遲早破裂出血從而形成瘢疤組織，導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離。年齡相關(guān)的斑(macular)退化是另 一種眼病，其已經(jīng)被證實(shí)涉及視網(wǎng)膜的病理性血管化。因此，預(yù)期血管化的抑制可以預(yù)防視 網(wǎng)膜病的發(fā)展。基于使用猴的實(shí)驗(yàn)，Miller等報道VEGF與增生性(vegetative)視網(wǎng)膜病的 發(fā)展緊密相關(guān)(Miller等.Am. J. Pathol. 145，574-584 (1994))。為此，考慮將中和VEGF的 血管化活性的物質(zhì)用于預(yù)防或治療糖尿病性視網(wǎng)膜病和AMD (Lopez等.Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37 :855-868(1996))。VEGF作為病理狀態(tài)中的血管發(fā)生的主要刺激物的認(rèn)識已經(jīng)導(dǎo)致阻斷VEGF活性的 各種嘗試。已經(jīng)提議將抑制性抗-VEGF受體抗體，可溶性受體構(gòu)建體，反義策略，針對VEGF 的RNA適體和低分子量的VEGF受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑用在VEGF信號傳導(dǎo)的干擾 中(Siemeister 等 ，Cancer Metastasis Rev. , 17(2) :241_248.，1998)。事實(shí)上，已經(jīng) 顯示針對VEGF的單克隆抗體在小鼠中抑制人腫瘤異種移植物生長和腹水形成(Kim等.， Growth Factors 7 53(1992) ；Nature 362 841-844 (1993) ；Asano 等.，Hybridoma,17 185-90，(1998) ；Mesiano 等.，Am. J. Pathol. , 153(4) 1249-1256，(1998) ；Luo 等.，Cancer Res. ；58(12) =2594-2600, (1998) ；CancerRes. ,58(12) :2652_2660，(1998) ；Borgstrom 等.Cancer Res. 56 :4032_4039(1996) ；Borgstrom 等 ，Prostate，35(1) :1_10，(1998))。 而且，已經(jīng)將使用抗_生血管分子，抗-VEGF抗體和VEGF拮抗劑的相同策略用在AMD和糖 尿病性的視網(wǎng)膜病的實(shí)驗(yàn)性治療中(Adamis等 Arch. Ophthalmol. 114 :66_71 (1996))。對 于這些治療性應(yīng)用而言，如果它們起初來自小鼠，通常通過人源化對抗體進(jìn)行改造以減少 它們在重復(fù)劑量中的毒性，并提高其它的特性諸如通過親和力成熟與靶分子的結(jié)合親和 力(Winter 和 Milstein，Nature，349 :293-299，(1991) ；Baca 等，J. Biol. Chem.，272 (16) 10678-84，(1997) ；Presta,等 ，Cancer Res. ,57 :4593_4599，(1997) ；Chen 等 (1999) J. Mol.Biol. 293 :865-881 ；和 Ryan 等.(1999) Toxicologic Pathology, 27 (1) :78_86)。盡管前述研究強(qiáng)調(diào)VEGF在實(shí)體腫瘤生長中的重要性和其作為腫瘤治療的靶標(biāo)的 潛能，鑒定抑制VEGF-誘導(dǎo)的血管發(fā)生的另外的試劑將有利于擴(kuò)展治療選擇的數(shù)量。特異 性抑制VEGF與其受體的結(jié)合的治療劑的發(fā)展代表更有效靶向血管發(fā)生的重要備選，其具 有潛在改善的治療效果。發(fā)明概述本發(fā)明提供以需要的結(jié)構(gòu)和功能來改造蛋白質(zhì)，特別是以來自治療前景的理想特 性改造抗體的革新方法，所述理想特性包括對靶抗原的高結(jié)合親和力，在體外和體內(nèi)有效 抑制異常細(xì)胞增殖的能力，和最低的毒性或副作用。
在本發(fā)明的一個方面，提供用于在計(jì)算機(jī)上(in silico)和在體外設(shè)計(jì)和選擇具 有高親和力和特異性的針對人抗原的抗體的方法。在一些具體的實(shí)施方案中，提供設(shè)計(jì)和 選擇具有高親和力和特異性的針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的人源化抗體或完全的人抗 體。在本發(fā)明的另一個方面，提供針對VEGF的單克隆抗體。具體而言，提供可以以高 親和力結(jié)合人VEGF的人源化或人抗-VEGF單克隆抗體。優(yōu)選地，這些抗體可以在體外抑制 內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF-誘導(dǎo)的增殖，并在體內(nèi)抑制VEGF-誘導(dǎo)的血管發(fā)生?？梢詫⑦@些抗體和它 們的衍生物用在廣泛應(yīng)用中諸如診斷、預(yù)防和治療疾病諸如癌癥、AMD、糖尿病性視網(wǎng)膜病、 和其它來自病理性血管發(fā)生的疾病。在一個實(shí)施方案中，以scFv，F(xiàn)ab，或抗體的其它形式，并在約4°C，25°C，37°C或 42 V的溫度下進(jìn)行測量，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其解離常數(shù)Kd等于或低 于0. 2nM，任選地低于0. InM，任選地低于0. 08nM，任選地低于0. 05nM，任選地低于0. OlnM, 或任選地低于0. 005nM。優(yōu)選地，如果以scFv的形式存在，并且在35_37°C下測量，抗-VEGF抗體的Kd低于 InM,任選地低于0. 8nM，任選地低于0. 5nM，任選地低于0. 2nM，任選地低于0. InM,任選地低 于0. 08nM,任選地低于0. 05nM,任選地低于0. OlnM,或任選地低于0. 005nM。也是優(yōu)選地，如果以Fab的形式存在，并且在35_37°C的溫度下進(jìn)行測量，抗-VEGF 抗體的Kd低于0. 5nM，任選地低于0. 2nM，任選地低于0. InM,任選地低于0. 08nM,任選地低 于0. 05nM,任選地低于0. OlnM,或任選地低于0. 005nM。在體外的內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF誘導(dǎo)的增殖的抑制中，當(dāng)以scFv，F(xiàn)ab或抗體的其它形 式存在時，所述抗-VEGF抗體優(yōu)選地具有這樣的抑制50%細(xì)胞增殖的有效劑量ED5(I，所述有 效劑量ED5(1等于或低于10nM，任選地低于5nM，任選地低于InM，任選地低于0. 5nM,任選地 低于0. InM,任選地低于0. 05nM,或任選地低于0. OlnM。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，并且所述單克隆 抗體具有包括下列氨基酸序列的\XiXsXsXqTQXsPSXsXTSXsXgXioGXnXuXuXMlXKG 五 16 五么 22^23 么 24WYQQX25PGX26AP 0PX511FGX52GTKX53X54IK,其中將下劃線區(qū)域分別稱為VyCDRl，Vl/CDR2,和&/CDR3，而將其余區(qū)域稱為構(gòu) 架，并且其中Xi是0』或A成是I，或T ;X3是V，E，K，R，Q，或T ;X4是M，或L式是5，或T， X6 是 S，或 T ;X7 是 L，或 V ；X8 是 A，或 V ;X9 是 S，或 T ；X10 是 P，V，L，A，或 I ；是 E，或 D ；X12 是 R，或 T ；X13 是 A，或 VI ；X14 是 T，或 A ；X15 是 T，S，或 A ；X16 是 S，R，N，K，H，或 Q ；X17 是 A，或 S ；X18 是 Q，或 R ；X19 是 S，D，A，或 P ；X20 是 S，G，R，T，或 Y ；X21 是 T，N，S，D，或 K ；X22 是 Y，或 D ；X23 是 L，或 I ；X24 是 A，N，或 T ；X25 是 K，或 I ；X26 是 Q，K，T，或 I ；X27 是 R，K，Q，N，H，S，或 E ；X28 是 V，或 L ；X29 是 I，或 V ；X30 是 F，A，G，D，或 S ；X31 是 A，或 T ；X32 是 S，或 T ；X33 是 N, S， R，或 T ；X34 是 A，H，或 Q ；X35 是 S，或 G ；X36 是 P，T ；X37 是 S，N，D，G，或 Y ；X38 是 S，或 T ；X39 是 G，或 R ；X40 是 T，或 A ；X41 是 S，或 R ；X42 是 S，或 R ；X43 是 P，或 A ；X44 是 E，或 D ；X45 是 F，V，或 S ；X46 是 V，T，I，A，或 S ；X47 是 Y，或 S ；X48 是 S，Y，或 N ；X49 是 S，或 T ；X50 是 T，V，A，P，K，G， S，或 I ；X51 是 W，或 Y ；X52 是 Q，或 G ；X53 是 V，或 L ；和 X54 是 E，D，或 A。
這些優(yōu)選的\序列可以組合以優(yōu)選的Vh序列或其它抗體的VH，條件是這樣產(chǎn)生的 抗體以期望的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供與入VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，所述單克 隆抗體具有包括下列氨基酸序列的\X1 X.XXTQPPSX, SXJPGQXc VTI SCSGX7X0SNXnGX1 ^NX1, VX1。WYQQX, ,PGX1 ,APKX1 .LX1 .YX1 ,NX1。 X19RPSGVPX20RX21SGSX22SX23TSASLAISGLX24SEDEADYYCX25^6WDM^7GnFGX28GTX29LTVL,其中將下劃線的區(qū)域分別稱為⑶Rl，⑶R2，和⑶R3，而將其余的區(qū)域稱為 構(gòu)架，并且其中X1是QL，或N ；X2是PAF，或S ;X3是V，或M ;X4是A，或T ；X5是G，或A ;X6是 R，或 S ;X7 是 S，或 T ；X8 是 S，TY，或 N ;X9 是 I，或 V ；X10 是 S，或 R ；X11 是 S，P，N，A，或 T ；X12 是 N，T，或 Y ；X13 是 L，或 F ；X14 是 T，或 A ；X15 是 V，L 或 F ；X16 是 M，或 I ；X17 是 G，T 或 S ；X18 是 N，或 D ；X19 是 Q，或 E ；X20 是 D，或 E ；X21 是 F，或 L ；X22 是 K，或 R ；X23 是 G，或 A ；X24 是 Q，L 或 R ；X25 是 A，或 G ；X26 是 A，S 或 T ；X27 是 N，S 或 T ；X28 是 T，或 A ；和 X29 是 K，或 Q。這些優(yōu)選的\序列可以組合以優(yōu)選的Vh序列或其它抗體的Vh,條件是這樣產(chǎn)生的 抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其具有包括 下列的氨基酸序列的八QSALTQPPSVSGAPGQRVTISCTGRSSNIGAGHDVHWYQQLPGTAPKLLIYANDQRPSGVPDRFSDSKS GTSASLGISGLRSEDEADYFCATffDDSLHGYVFGTGTKVTVL(SEQ ID No 54)。這些優(yōu)選的\序列可以組合以優(yōu)選的Vh序列或其它抗體的VH，條件是這樣產(chǎn)生 的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其具有包 括下列氨基酸序列的Vh :X1X9QLVX,SGGGX,VQPGGX.LRLXKCAX,SGXbXqX1 nX,, X1 ,X1 ,GX1 ,NffX1 .RQAPGKGX, ,,EffVGffX1 ,NTX1
A^^c&II^A圣4EX25SRX26tx27sx28x29x3Qskx31x32x33ylqx34nslraedtavyycax35im36腿37型 yfdvwx38qgtlvtvss,其中按照Kabat命名法，分別將下劃線區(qū)域稱為⑶R1，⑶R2和⑶R3，而將其余的 區(qū)域稱為構(gòu)架，并且其中X1是E，或Q ;X2是V，或G ；X3是Q，或E ;X4是V，或L ;X5是S，或T ； X6 是 S T，或 R ;X7 是 A，或 V ;X8 是 Y，或 F ；X9 是 T，D，N，S，或 A ；X10 是 F，或 L ；X11 是 T，D，Y， A，S，或 N ；X12 是 N，H，或 S ；X13 是 Y，或 F ；X14 是 M，L，I 或 V ；X15 是 I，V，或 L ；X16 是 L，或 P ； X17 是 I，或 V ；X18 是 Y，或 N ；X19 是 T，或 N ；X20 是 E，或 A ；X21 是 P，T，或 S ；X22 是 A，或 V ；X23 是 A，H，Q，P，D，或 E ；X24 是 D，或 E ；X25 是 K，或 T ；X26 是 V，F(xiàn)，或 L ；X27 是 F，或 I ；X28 是 L，或 R ； X29 是 D，或 N ；X30 是 T，或 N ；X31 是 S，或 N ；X32 是 T，Q，P，或 K ；X33 是 A，V，或 P ；X34 是 L，或 M ； X35 是 K，或 R ；X36 是 H，或 Y ；X37 是 S，R，或 T ；和 X38 是 G，或 A。這些優(yōu)選的Vh序列可以組合以優(yōu)選的\序列或其它抗體的\，條件是這樣產(chǎn)生的 抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，并且其具有這樣的 Vl,所述\包括選自由SEQ ID Nos :2_54組成的組的氨基酸序列，更優(yōu)選地包括選自由SEQ ID No :14、seq ID No :26、seq ID No :28、seq ID No :36、seq ID No :37、seq ID No :44、 SEQ ID No :47 JPSEQ ID No :54組成的組的氨基酸序列。
這些優(yōu)選的\序列可以組合以優(yōu)選的Vh序列或其它抗體的VH，條件是這樣產(chǎn)生的 抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其具有這樣的VH，所 述Vh包括選自由SEQ ID Nos :57-110和SEQ IDNos :285_310組成的組的氨基酸序列，優(yōu)選 地包括選自由 SEQ IDNos :61-64，SEQ ID No :67，68，70，75，83，88，89，90，91，92，93，94 和 96-110組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的Vh序列可以組合以優(yōu)選的\序列或其它抗體的\，條件是這樣產(chǎn)生的 抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在還有的另一個實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其在八區(qū) 域中具有⑶Rl (AVtDRl)，所述⑶Rl包括選自由SEQ IDNos 164-194組成的組的氨基酸序 列。這些優(yōu)選的AVtDRl可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域， 和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列，或組合以其它的重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需 要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，提供與人VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其在\區(qū)域中具 有⑶R2 (Vl/⑶R2)，所述⑶R2包括選自由SEQ ID NOs 195-209組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的AVtDR2可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域， 和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體結(jié)合人 VEGF0在還有的另一個實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在\區(qū)域 中具有⑶R3 ⑶R3)，所述⑶R3包括選自由SEQ IDNOs =210-228組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的AVtDR3可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域， 和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的 親和力結(jié)合人VEGF。在另一個實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在\區(qū)域中具有 構(gòu)架區(qū)域(FR) CDR3(Vl/FR)，所述構(gòu)架區(qū)域(FR) CDR3包括選自由SEQ ID NO 229-269組成 的組的氨基酸序列，并且優(yōu)選地包括選自由SEQ ID NO :232，235，237，251，255，263，和265 組成的組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的可以組合以優(yōu)選的輕鏈的⑶R區(qū)域，或其它輕鏈的⑶R區(qū)域，和 優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親 和力與人VEGF結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合于人VEGF的單克隆抗體，其在Vh區(qū)域中具有 ⑶Rl (Vh/⑶Rl)，所述⑶Rl包括GX1X2X3X4X5X6GX7N的氨基酸序列，其中X1是Y，或F ；X2是D， N，T，S，或 A ；X3 是 F，或 L ;X4 是 T，D，S，Y，A，或 N ；X5 是 H，N，或 S，X6 是 Y，或 F ；X7 是 M，L， I，或 V。此外，所述單克隆抗體的Vh/⑶Rl優(yōu)選地包括選自由SEQ ID NOs :111_135組成的
組的氨基酸序列。這些優(yōu)選的Vh/⑶Rl可以組合以優(yōu)選的重鏈的其它區(qū)域或其它重鏈的其它區(qū)域， 和優(yōu)選的輕鏈的可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體結(jié)合人VEGF0在一個實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在Vh區(qū)域中具有 CDR2 (Vh/CDR2)，所述 CDR2 包括 WXiNTX2X3GEX4TYX5X6X7FX8R 的氨基酸序列，其中 X1 是 I，或 V ； X2 是 Y，或 N ;X3 是 T，或 N ；X4 是 P，T，或 S ;X5 是 A，或 V ；X6 是 A，Q，P，H，D，或 E ；X7 是 D，或 E ；和X8是K，或T所述單克隆抗體的Vh/CDR2優(yōu)選地包括選自由SEQ ID NOs 136-156組成的組的
氨基酸序列。這些優(yōu)選的Vh/⑶R2可以組合以優(yōu)選的重鏈的其它區(qū)域或其它重鏈的其它區(qū)域， 和優(yōu)選的輕鏈的可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要 的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在Vh區(qū)域中具有 CDR3 (Vh/CDR3)，所述CDR3包括KYPXJYG&SHWYFDV的氨基酸序列，其中X1是Y，或H，且X2 是Ro優(yōu)選地，所述抗-VEGF抗體Vh/CDR3具有選自由SEQ ID NOs :311-337組成的組的
氨基酸序列。這些優(yōu)選的Vh/⑶R3可以組合以優(yōu)選的重鏈的其它區(qū)域或其它重鏈的其它區(qū)域， 和優(yōu)選的輕鏈的可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以 需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，提供特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體，其在Vh區(qū)域中具有 FR(VH/FR)，所述FR包括以下氨基酸序列XJQLVXjGGGXsVQPGGXiRLXsCAXeS/CDRl/WXpQAPGKGLEWVG/CDI^/RXsTXgSX^DXuSK X12X13X14YLQX15NSLRAEDTAVYYCA/CDR3/WX16QGTLVTVSS，其中X1 是 E，或 Q ;X2 是 Q，或 E ;X3 是 V，或 L ;X4 是 S，或 T ；X5 是 S，T，或 R ；X6 是 A， 或 V ;x7 是 I，或 V ;x8 是 F，或 V ;X9 是 F，或 I ；Xltl 是 L，或 R 是 X11 是 T，或 N ；X12 是 S，或 N ；X13 是T，Q，或K ；X14是A，或V ；X15是M，或L ；且X16是G，或A。在一個實(shí)施方案中，提供特異性與人VEGF結(jié)合的單克隆抗體，其具有這樣的八和 Vh對，所述&和Vh對選自由下列組成的組SEQ ID N0:1和70;SEQ ID N0:1和67;SEQ ID N0:1 禾口 75;SEQ ID N0:1 禾口 83;SEQ ID NO : 14 禾口 55 ;SEQ ID NO : 1 禾口 101 ;SEQ ID NO 1 和 100 ； SEQ ID NO :14 禾口 102 ；SEQ ID NO :1 禾口 103 ； SEQ ID NO 1 禾口 104 ；SEQ ID NO :1 禾口 105 ；SEQ ID NO 36 禾口 100 ；SEQ ID NO 26 禾口 100 ；SEQ ID NO 28 禾口 100 ；SEQ ID NO 37 和 100 ；SEQ ID NO 44 和 100 ；SEQ ID NO 54 禾口 100 ；禾口 SEQ ID NO 47 禾口 100，優(yōu)選地選自由 下列組成的組SEQ ID NO :28禾口61 ；SEQ ID NO :28禾口62 ；SEQ ID NO :28禾口63 ；SEQ ID NO 28 禾口 64;SEQ ID NO :28 禾口 68 ;SEQ ID NO :28 禾口 85 ;SEQ ID NO :28 禾口 86 ;SEQ ID N0:28 禾口 87 ；SEQ ID NO 28 禾口 88 ；SEQ ID NO 28 禾口 89 ；SEQ ID NO 28 禾口 90 ；SEQ ID NO 28 禾口 91 ； SEQ ID NO 28 禾口 92 ；SEQ ID NO 28 禾口 93 ；SEQ ID NO 28 禾口 94 ；SEQ ID NO 28 禾口 95 ；SEQ ID NO :28 禾口 96 ;SEQ ID NO 28 禾口 97 ；SEQ ID NO 28 禾口 98 ；SEQ ID NO 28 禾口 99 ；SEQ ID NO 28 和 106 ；SEQ ID NO 28 和 107 ；SEQ ID NO 28 和 108 ；SEQ ID NO 28 和 109 ；和 SEQ ID NO 28 和 110。以scFv，F(xiàn)ab或抗體的其它形式存在，并且在約4°C，25°C，37°C或42°C下測量時，
8由解離常數(shù)Kd所代表的上述抗體與人VEGF的結(jié)合親和力，是任選地低于ΙΟΟηΜ，任選地低 于ΙΟηΜ，任選地低于8nM，任選地低于5nM，任選地低于InM，任選地低于0. 8nM，任選地低于 0. 5nM，任選地低于0. 2nM，任選地低于0. InM,任選地低于0. 08nM,任選地低于0. 05nM,任選 地低于0. OlnM,或任選地低于0. 005nM。本發(fā)明公開的來自全長V!^nVL，VH/CDR，VH/FR，VL/CDR，VL/FR的組合(例如，在圖IA 和IB中提供的命中(hit)變體，和在圖IC和ID中顯示的氨基酸序列)的抗體在本發(fā)明的 范圍內(nèi)；并且這些組合不包括在美國專利申請順序號09/056，160，公開號2002/0032315 中公開的抗-VEGF抗體。附圖
簡述圖IA顯示通過使用在計(jì)算機(jī)上的本發(fā)明方法來設(shè)計(jì)\命中變體的AA-PVP模式。圖IB顯示通過使用在計(jì)算機(jī)上的本發(fā)明方法來設(shè)計(jì)Vh命中變體的AA-PVP模式。圖IC顯示按照本發(fā)明的抗體的某些實(shí)施方案的全長\，VtDR，和八/FR的氨基酸 序列。圖ID顯示按照本發(fā)明的抗體的某些實(shí)施方案的全長VH，Vh/⑶R，和VH/FR的氨基酸 序列。圖2A和2B顯示在25°C下使用BioCore生物傳感器進(jìn)行的人源化抗-VEGF抗體的 一組變體的親和力分析。將以單鏈形式存在的抗體片段如下面所述進(jìn)行表達(dá)并進(jìn)行純化。 當(dāng)純化的抗體于25°C結(jié)合于固定在CM5生物芯片上的其抗原(VEGF)時，通過測量STO單 位(y_軸)對時間(χ-軸)的變化來進(jìn)行測量。通過1^與1(。 的比率來計(jì)算Kd值。還計(jì) 算了對于每種變體抗體，變體Kd與hAB 1的Kd的比率。將K。n定義為被表示為抗體片段的 濃度(以摩爾表示)和時間(以秒表示)的倍數(shù)(multiple)的倒數(shù)的締合速率常數(shù)；而將 K。ff定義為被表示為時間(以秒表示)的倒數(shù)的解離速率常數(shù)；將Kd定義為解離常數(shù)，其 是以摩爾濃度表示的K。ff與K。n的比率。hAB 1包含SEQl和SEQ55 (如果以Fab形式存在， 其將基本上是 Fab-12，如在 Chen 等.(1999) J. Mol. Biol. 293 :865_881 中所述)；hAB2 包含 SEQl 和 SEQ70 ；hAB3 包含 SEQl 和 SEQ67 ；hAB4 包含 SEQl 和 SEQ83 ；hAB5SEQl 和 SEQ75 ；hAB9 包含 SEQ14 和 SEQ102 ；hABlO 包含 SEQl 和 SEQ103 ；hAB 11 包含 SEQl 和 SEQ104 ；hAB12 包含 SEQl和SEQ105,分別作為Vl和VH。圖2C顯示在35°C下使用BioCore生物傳感器進(jìn)行的一組人源化抗-VEGF抗體 的變體進(jìn)行的親和力分析。將以單鏈形式存在的抗體片段如下所述表達(dá)并進(jìn)行純化。當(dāng) 純化的抗體于35°C結(jié)合于固定在CM5生物芯片上的其抗原(VEGF)時，通過測量STO單位 (y-軸)對時間(χ-軸)的變化來進(jìn)行測量。通過1^與1(。 的比率來計(jì)算Kd值。還計(jì)算了 對于每種變體抗體，變體Kd與hAB 1的Kd的比率。hAB 1包含SEQl和SEQ55 (如果以Fab 形式存在，其將基本上是Fab-12，如在Chen等.(1999) J. Mol. Biol. 293 :865_881中所述)； hAB7 包含 SEQl 和 SEQlOl ；hAB8 包含 SEQl 和 SEQlOO ；hAB 13 包含 SEQl 和 SEQ56 (如果以 Fab 的形式存在，其將是 Y0317，如在 Chen 等.(1999) J. Mol. Biol. 293 :865_881 中所述)；hAB14 包含 SEQ36 和 SEQlOO ；hAB15 包含 SEQ26 和 SEQlOO ；hAB16 包含 SEQ28 和 SEQlOO ；hAB35 包 含 SEQ28 和 SEQ106 ；hAB36 包含 SEQ28 和 SEQ107 ；hAB37 包含 SEQ28 和 SEQ108 ；hAB38 包含 SEQ28 和 SEQ109 ；hAB39 包含 SEQ28 和 SEQl 10，分別作為 \ 和 VH。圖3顯示使用BIAcore生物傳感器進(jìn)行的6種人源化抗-VEGF抗體的親和力分析。在測定前，將所述抗體于4°C，37°C，或42°C在IxPBS緩沖液中進(jìn)行溫育16小時。當(dāng)純化的 抗體于25°C結(jié)合固定在CM5生物芯片上的其抗原(VEGF)時，通過測量STO單位(y-軸)對 時間(χ-軸)的變化來進(jìn)行測量。使用1 1 Langmuir結(jié)合模型來測定結(jié)合速率和脫離 速率二者的變化，而通過1(。 與1( 的比率來測定Kds。如下分別列出的組成hAB 1 包含 SEQl 和 SEQ55 ；hAB2 包含 SEQl 和 SEQ70 ；hAB3 包含 SEQl 和 SEQ67 ；hAB7 包含 SEQl 和 SEQlOl ；hAB8 包含 SEQl 和 SEQ100 ；hAB 13 包含 SEQl 和 SEQ56,分別作為 Vl 和 VH。圖4總結(jié)了在圖3中顯示的人源化抗-VEGF抗體的穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)。y_軸顯示在將 純化的抗體如圖3所述在4°C，37°C和42°C溫育16小時后，在25°C使用BIAcore在結(jié)合固 定的VEGF抗原方面保持活性的抗體的百分比。將在不同條件下的每種抗體的最大結(jié)合表 示為在4°C的結(jié)合的百分位數(shù)。圖5顯示使用如下所述的大腸桿菌(E. coli)表達(dá)系統(tǒng)的人源化的抗-VEGF抗體 的表達(dá)。通過應(yīng)用相同體積的來自相同級分的純化物質(zhì)，如通過SDS-PAGE/考馬斯藍(lán)染色 來檢測所顯示，來評價每種抗體片段的表達(dá)水平。如下分別列出\和Vh的組成hABl包含 SEQl 和 SEQ55 ；hAB35 包含 SEQ28 和 SEQ106 ；hAB36 包含 SEQ28 和 SEQ107 ；hAB37 包含 SEQ28 和 SEQ108 ；hAB38 包含 SEQ28 和 SEQ109 ；hAB39 包含 SEQ28 和 SEQl 10，分別作為 \ 和 VH。圖6顯示在如下所述的真核生物系統(tǒng)中的人源化抗-VEGF抗體的表達(dá)。通過應(yīng)用 相同體積的來自相同級分的純化物質(zhì)，如通過SDS-PAGE/考馬斯藍(lán)染色檢測所顯示，來評 價每種抗體片段的表達(dá)水平。如下分別列出VL和VH的組成hABl包含SEQl和SEQ55 ；hAB2 包含 SEQl 和 SEQ70 ；hAB3 包含 SEQl 和 SEQ67 ；hAB5 包含 SEQl 和 SEQ75 ；hAB7 包含 SEQl 和 SEQlOl ；hAB8 包含 SEQl 和 SEQ100 ；hAB13 包含 SEQl 和 SEQ56,分別作為 Vl 和 VH。圖7舉例說明用于在大腸桿菌中表達(dá)可溶性抗體片段的載體的圖譜。發(fā)明詳述本發(fā)明提供以需要的結(jié)構(gòu)和功能，來改造蛋白質(zhì)，特別是抗體的革新性方法。在一 個方面，提供用于設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對人抗原的抗體。在一些具體的 實(shí)施方案中，提供用于設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 的人源化抗體或完全的人抗體的方法。在另一個方面，提供使用這些抗體及其衍生物來在 體外抑制血管發(fā)生的組合物、試劑盒和方法，且所述組合物、試劑盒和方法用于診斷或治療 與異常血管發(fā)生相關(guān)的疾病諸如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、與局部缺血_再灌注相關(guān)的腦水 腫和損傷、皮質(zhì)局部缺血、卵巢增生和血管過多、子宮內(nèi)膜異位、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病 (retinopaphy)、和其它的眼科血管源性疾病。1. VEGF和針對VEGF的抗體VEGF是發(fā)育中的關(guān)鍵生血管因子，并且涉及通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)體腫瘤的生 長。發(fā)現(xiàn)鼠單克隆抗體阻止VEGF-依賴性的細(xì)胞增殖并減緩體內(nèi)的腫瘤生長(Kim KJ, Li B,Winer J,Armanini M,Gillett N,Phillips HS,Ferrara N(1993)Nature 362,841-844)。 通過使用噬菌體展示和脫離速率選擇(ChenY，Wiesmann C, Fuh G, Li B, Christinger HW, McKay P, de VosAM(1999) J Mol Biol 293,865-881)來對這種鼠抗體進(jìn)行人源化(Presta LG,Chen H,0' Connor SJ,Chisholm V,Meng YG,Krummen L,Winkler Μ,Ferrara Ν(1997) Cancer Res. 57,4593-4599 ；Baca Μ, Presta LG, 0' Connor SJ, Wells JA(1997)J Biol Chem 272,10678-10684)和親和力成熟化。報道了在VEGF和母體抗體之間形成的復(fù)合體的 X-射線結(jié)構(gòu)(Muller YA, Chen Y, Christinger HW, Li B, Cunningham, BC, Lowman HB, de Vos AM(1998) Structure 6,1153-1167。)，以及在VEGF和成熟的抗體之間形成的X-射 豐勾(Chen Y, Wiesmann C, Fuh G, Li B, Christinger HW, McKay P, deVos AM, Lowman HB (1999) J. Mol Biol 293，，865-881)。此外，美國專利申請系列號09/056，160，公開號 2002/0032315公開了某些抗-VEGF抗體。將這些關(guān)于VEGF和抗-VEGF抗體的出版物的全 部內(nèi)容并入本文作為參考。本發(fā)明提供以高親和力和特異性結(jié)合人VEGF的新的抗-VEGF抗體。對這些 抗-VEGF抗體進(jìn)行人源化，并且關(guān)于在結(jié)合親和力、穩(wěn)定性、表達(dá)效率中的一些重要特性進(jìn) 行優(yōu)化，所述重要特性對于研究、診斷和治療應(yīng)用是理想的。當(dāng)以在約4°C、25°C、37°C或42°C測量的scFv，F(xiàn)ab，或抗體的其它形式存在時，由 解離常數(shù)Kd所代表的本發(fā)明的選定的抗-VEGF抗體對于人VEGF的結(jié)合親和力，是任選地低 于ΙΟΟηΜ，任選地低于ΙΟηΜ，任選地低于8nM，任選地低于8nM，任選地低于5nM，任選地低于 InM,任選地低于0. 8nM，任選地低于0. 5nM，任選地低于0. 2nM，任選地低于0. InM,任選地低 于0. 08nM,任選地低于0. 05nM,任選地低于0. OlnM,或任選地低于0. 005nM。優(yōu)選地，如果以scFv的形式存在，并且在35-37°C的溫度測量，本發(fā)明的選定 抗-VEGF抗體的Kd低于InM，任選地低于0. 8nM，任選地低于0. 5nM，任選地低于0. 2nM，任 選地低于0. InM,任選地低于0. 08nM,任選地低于0. 05nM,任選地低于0. OlnM,或任選地低 于 0. 005nM。也是優(yōu)選地，如果以Fab的形式存在，并且在35-37°C的溫度進(jìn)行測量，本發(fā)明的 選定的抗-VEGF抗體的Kd低于0. 5nM，任選地低于0. 2nM，任選地低于0. InM,任選地低于 0. 08nM，任選地低于0. 05nM,任選地低于0. OlnM,或任選地低于0. 005nM。在體外的內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF-誘導(dǎo)的增殖的抑制中，當(dāng)以ScFV、Fab或抗體的其它形 式存在時，本發(fā)明的選定的抗-VEGF抗體優(yōu)選地具有這樣的ED5tl(抑制50%細(xì)胞增殖的有 效劑量)，所述ED5tl等于或低于10nM，任選地低于5nM，任選地低于InM，任選地低于0. 5nM, 任選地低于0. InM，任選地低于0. 05nM，或任選地低于0. OlnM。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有輕鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述輕鏈可變區(qū)包 含下列氨基酸序列Xix2X3X4TQX5PSX6X7SX8X9X10GX11X12X13X14IX15G 五 I6 五 17_^18五191^20^21 么 MX23^24WYQQX25PGX26AP Xo7XoRLXoQYX^nX^1X^X^XX^X^t,GVX^X^7RFSGX^X^QSGTDFXj1nLTIXj11Xj1oLQX^Xj1j1DXj1 JVXj1fiYYCQQXj17Xj1JC1rX 0PX511FGX52GTKX53X54IK,其中將下劃線區(qū)域分別稱為VyCDRl，Vl/CDR2,和&/CDR3，而將其余區(qū)域稱為構(gòu) 架，并且其中指定為“X”的位置可以是下面列出的氨基酸=X1 :D，E或AX2:1，或 T
X3:V，E，K，R，Q，或 T
X4:M,或 L
X5:S，或 T，
X6:S，或 T
X7丄，或V
X8:A，或 V
X9 :s，或 T
XlOP, V, L，A，或 I
XnEjD
Xl2R，或T
Xl3AjVI
X14T，或A
Xl5T，S，或 A
Xl6S，R，N，K，H，或 Q
X17AjS
Xl8QjR
Xl9S，D，A，或 P
父20S，G，R，T，或 Y
父21T，N，S，D，或 K
父22Y，或D
父23L，或I
父24A，N，或 T
父25K，或I
父26Q，K，T，或 I
父27R, K, Q, N, H，S，或 E
父28VjL
父29I，或V
父30F，A，G，D，或 S
父31A，或T
父32S，或T
X33N，S，R，或 T
父34A，H，或 Q
父35S，或G
X36P, T
X37S，N，D，G，或 Y
X38S，或T
X39GjR
父40T，或A
X41S，或R
父42S，或R
父43P，或A
X44EjD
X45F，VjS
X46V, Τ, I，A，或 S
X47Y，或S
X48 :S，Y，或 NX49:S，或 TX5。T，V，A，P，K，G，S，或 IX51:W，或 YX52:Q，或 GX53X54:E，D，或 A。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可以組合以優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，或組合以其 它的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有輕鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述輕鏈可 變區(qū)包括下列氨基酸序列X1 X.XXTQPPSX, SXJPGQXc VTI SCSGX7X0SNXnGX1 ^NX1, VX1。WYQQX, ,PGX1 ,APKX1 .LX1 .YX1 ,NX1。 X19RPSGVPX20RX21SGSX22SX23TSASLAISGLX24SEDEADYYCX25^6WDM^7GnFGX28GTX29LTVL,其中將下劃線的區(qū)域分別稱為⑶Rl，vy⑶R2，和vy⑶R3，而將其余的區(qū)域稱為 構(gòu)架，并且其中指定為“X”的位置可以是下面列出的氨基酸X1:QL，或 NX2:PAF，或 SX3:V，或 MX4:A，或 TX5:G，或 AX6:R，或 SX7:S，或 TX8:S，TY，或 NX9:I，或 VX1。S，或 RX11 :S，P，N，A，或 TX12:N，T，或 YX13:L，或 FX14:T，或 AX15 :V，L 或 F，X16:M，或 IX17 :G，T 或 SX18:N，或 DX19=QjEX2。D，或 EX21X22:K，或 RX23:G，或 AX24 :Q，L 或 R
13
X25X26 :A，S 或 TX27 :N，S 或 TX28:T，或 AΧ29:Κ，或 Q。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可以組合以優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，或組合 以其它重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有輕鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述輕鏈可 變區(qū)包括下列氨基酸序列QSALTQPPSVSGAPGQRVTISCTGRSSNIGAGHDVHWYQQLPGTAPKLLIYANDQRPSGVPDRFSDSKS GTSASLGISGLRSEDEADYFCATffDDSLHGYVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO 54),這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可以組合以重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，或組合以其它 重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有重鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述重鏈可 變區(qū)包括下列氨基酸序列X1 X,QLVX,SGGGX,VQPGGX.LRLXXAX,SGXXX1 ,,X1, X1 ,X1 ,GX1 ,NffX1 .RQAPGKGX, .EffVGffX1 ,NTX1 A^^c&II^U^E^SRU^S^UWKXMUdLQXMNSLRAEDTAVYYCAUE^ne^SM YFDVffX38QGTLVTVSS,其中按照Kabat命名法將下劃線區(qū)域分別稱為⑶R1，⑶R2，和⑶R3，而將其余的區(qū) 域稱為構(gòu)架，其中被指定為“X”的位置可以是下面列出的氨基酸X1:E，或 QX2:V，或 GX3:Q，或 EX4:V，或 LX5:S，或 TX6:ST，或 RX7:A，或 VX8:Y，或 FX9 :T，D，N，S，或 AX10:F，或 LX11 :T，D，Y，A，S，或 NX12 :N，H，或 SX13=YjFX14:M，L，I 或 VX15:I，V，或 LX16:L，或 PX17:I，或 VX18=YjNX19=TjN
14
X20X21 :P,T,i^SX22:A，或 VX23 :A，H，Q，P，D，或 EX24:D，或 EX25 :K，或 TX26 :V, F，或 LX27 :F，或 IX28:L，或 RX29:D，或 NX30:T，或 NX31:S，或 NX32:T，Q，P，或 KX33 :A，VjPX34:L，或 MX35:K，或 RΧ36:Η，或 YX37:S，R，或 TX38:G，或 A。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供具有重鏈可變區(qū)的抗-VEGF抗體，所述重鏈可 變區(qū)包括下列氨基酸序列X1X9QLVX,SGGGX,VQPGGX.LRLXKCAX,SGXbXqX1 nX,, X1 ,X1 ,GX1 ,NffX1 .RQAPGKGX, ,,EffVGffX1 ,NTX1
8X192X202121X1X22X2 si^AEiasIil^^sTXsTSXssXsgXsoSKXMX^XMYLQXMNSLRAIiDTAVYYQVXggXggX^^gXgg^X虹
2yyy^Lwx48QGTLvw，其中按照Kabat命名法，分別將下劃線區(qū)域稱為⑶R1，⑶R2，和⑶R3，而將其余的 區(qū)域稱為構(gòu)架，并且其中指定為“X”的位置可以是下面列出的氨基酸Xi:E,或 Q
X2:V，或 G
X3:Q，或 E
X4:V，或 L
X5:s，或 T
X6:ST，或 R
X7:A，或 V
X8:Y，或 F
X9:T, D，N，S，或 A
XlO:F,或 L
Xll:T，D，Y，A，S，或 N
Xl2:N, H，或 S
Xl3:Y，或 F
X14 :M, L，I 或 VX15:I，V，或 LX16=LjPX17:I，或 VX18 :Υ,或 NΧ19:Τ，或 NX20X21 :P,T,i^SX22 :A,或 VX23 :A，H，Q，P，D，或 EX24:D，或 EX25 :K，或 TX26 :V, F，或 LX27 :F，或 IX28:L，或 RX29:D，或 NX3。T，或 NX31:S，或 NX32:T，Q，P，或 KX33:A，V，或 PX34:L，或 MX35 :K，R 或 HX36 YAD 或 SX37 PRS 或 GX38 =YH,或 DX39 :Υ,或 FX40:YNS，或 HX41 :G,或 SX42:S，T，R，G 或 AX43 :S，Y，C，或 TX44 :H, P，C，N，Q 或 SX45 :ff, Q，或 CX46 :F，或 LX47 :V，L 或 YX48:G 或 A。這些優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列或組合 以其它的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗-VEGF抗體，所 述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包括下列其中之一的氨基酸序列=SEQID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ IDNO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11，SEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 16,SEQ IDNO 17，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :19，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :21，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :23，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :25，SEQ IDNO :27，SEQID NO :29，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :31,SEQ ID NO 32,SEQ ID NO 33,SEQ ID NO 34,SEQ ID NO 35,SEQ ID NO 38,SEQID NO :39，SEQ ID NO :40，SEQ ID NO :41，SEQ ID NO :42，SEQ ID NO :43，SEQ ID NO :45，SEQ ID NO 46,SEQ ID NO 48,SEQ ID NO 49,SEQ ID NO 50,SEQ ID N0:51，SEQ ID N0:52，和 SEQ ID NO :53，另外優(yōu)選地 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ IDNO 36， SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 44, SEQ ID N0:47，或 SEQ IDNO 54。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域序列可以組合以優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列或組合以其它的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件 是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗-VEGF抗體， 所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括下列其中之一的氨基酸序列SEQ ID NO =ID NO 57, SEQ ID NO: ID NO :58, SEQ IDNO :ID NO -.59, SEQID NO :ID NO :60，SEQ ID NO :ID NO :65，SEQ ID NO ID NO :66, SEQID NO :ID NO :69，SEQ ID NO :ID NO -.71, SEQ ID NO :ID NO -J2, SEQID NO ID NO 73,SEQ ID NO :ID NO 74,SEQ ID NO 76,SEQ IDNO 77,SEQ ID NO 78,SEQ ID NO: 79，SEQ ID NO :80，SEQ ID NO :81，SEQ ID NO :82，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO :85，SEQ ID NO :86，SEQIDN0 :87，另外優(yōu)選地 SEQ ID N0:61，或 SEQ ID N0:62，或 SEQ ID N0:63，或 SEQ ID N0:64，或 SEQ ID N0:67，或 SEQ ID N0:68，或 SEQID N0:70，或 SEQ ID N0:75，或 SEQ ID NO :83, SEQ ID N0:88，或 SEQID N0:89，或 SEQ ID N0:90，或 SEQ ID N0:91，或 SEQ ID NO 92,或 SEQ ID NO :93，或 SEQ ID NO :94，或 SEQ ID NO :95，SEQ ID NO :96，SEQ ID NO 97，SEQ ID N0:98，或 SEQ ID NO -.99, SEQ ID NO: 100，或 SEQ ID NO: 101，或 SEQ ID NO: 102，或SEQ ID NO: 103，或SEQ IDNO : 104，或SEQ ID NO: 105，或SEQ ID NO : 106，SEQ ID N0:107，或SEQ ID N0:108，或SEQ ID NO 109,SEQ ID NO:110 ；或SEQ ID NOs :285_310之 一。這些優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列或組合以其它的輕鏈可 變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDRl區(qū)域的 抗-VEGF抗體，所述⑶Rl區(qū)域包括下列其中之一的氨基酸序列SEQ ID NO 164，SEQ ID NO 165,SEQ ID NO 166,SEQ ID NO 167,SEQ ID NO 168,SEQ ID NO 169,SEQ D NO 170, SEQ ID NO :171，SEQ ID NO :172，SEQ ID NO :173，SEQ ID NO :174，SEQ ID NO :175，SEQID NO 176,SEQ ID NO 177,SEQ ID NO 178,SEQ ID NO 179,SEQID NO 180,SEQ ID NO :181， SEQ ID NO :182，SEQ ID NO :183，SEQID NO :184，SEQ ID NO :185，SEQ ID NO :186，SEQ ID NO :187，SEQID NO :188，SEQ ID NO :189，SEQ ID NO :190，SEQ ID NO :191，SEQID NO :192， SEQ ID NO :193 JPSEQ ID N0:194。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶Rl序列可以組合以 優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它 重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2區(qū)域的 抗-VEGF抗體，所述⑶R2區(qū)域包含下列其中之一的氨基酸序列SEQ ID NO :195，SEQ ID NO 196, SEQ ID NO 197, SEQ ID NO 198, SEQ ID NO 199, SEQ ID NO 200, SEQ ID NO :201，SEQ ID NO :202，SEQ ID NO :203，SEQ ID NO :204，SEQ ID NO :205，SEQ ID NO :206，SEQID NO 207, SEQ ID NO :208 JPSEQ ID NO 209。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列可以組合 以優(yōu)選的輕鏈的其它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其 它重鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體結(jié)合人VEGF。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR3區(qū)域的 抗-VEGF抗體，所述⑶R3區(qū)域包括下列其中之一的氨基酸序列SEQ ID NO 210, SEQ ID NO :211,SEQ ID N0:212，SEQ IDNO :213,SEQ ID N0:214，SEQ ID N0:215，SEQ ID NO :216， SEQ ID NO :217,SEQ ID NO :218,SEQ ID NO :219,SEQ ID NO 220,SEQ ID NO :221,SEQ ID NO 222,SEQ ID NO 223,SEQ ID N0:224，SEQ ID NO :225，SEQID NO 226,SEQ ID NO :227， 和SEQ ID N0:228。這些優(yōu)選的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R3序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈的其 它區(qū)域，或其它輕鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列或組合以其它重鏈可變區(qū)序列， 條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)域的 抗-VEGF抗體，所述構(gòu)架區(qū)域包含下列其中之一的氨基酸序列SEQ ID NO 229, SEQ ID N0: 230，SEQ ID NO :231SEQ ID NO :233，SEQ IDNO :234，SEQ ID NO :236，SEQ ID NO :238，SEQ ID NO :239, SEQ IDNO :240，SEQ ID NO -.241, SEQ ID NO :242，SEQ ID NO -.243, SEQ IDNO 244，SEQ ID NO 245,SEQ ID NO 246,SEQ ID NO 247,SEQ IDNO 248,SEQ ID NO 249,SEQ ID NO :250, SEQ ID NO -.252, SEQ IDNO -.253, SEQ ID NO -.254, SEQ ID NO :256，SEQ ID NO 257，SEQ IDNO -.258, SEQ ID NO -.259, SEQ ID NO -.260, SEQ ID NO :261，SEQ IDNO -.262, SEQ ID NO :264, SEQ ID NO -.266, SEQ ID NO -.267, SEQ IDNO :268，禾口 SEQ ID NO 269 ；另夕卜，優(yōu) 選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)域，所述構(gòu)架區(qū)域包含下列其中之一的氨基酸序列SEQ ID NO :232，SEQID NO :235，SEQ ID NO :237，SEQ ID NO 251，SEQ ID NO :255，SEQ IDNO 263 JPSEQ ID NO 265。這些優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)域序列可以組合以優(yōu)選的輕鏈的 CDR區(qū)域，或其它輕鏈的CDR區(qū)域，和優(yōu)選的重鏈可變區(qū)序列，或組合以其它重鏈可變區(qū)序 列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶Rl區(qū)域的 抗-VEGF抗體，所述CDRl區(qū)域包括下列其中之一的氨基酸序列=GX1X2X3X4X5X6GX7N,其中被指 定為“X”的位置可以是下面列出的氨基酸X1:Y，或 FX2 :D，N，Τ，S，或 AX3:F，或 LX4 :T，D，S，Y，A，或 NΧ5:Η，Ν，或 SX6 Y，或 FX7:M，L，I，或 V。另外，優(yōu)選地，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶Rl區(qū)域包含下列其中之一的氨基酸序列SEQ ID NO :111，SEQ ID NO :113，SEQ ID NO :114，SEQ IDNO :115，SEQ ID NO :116，SEQ ID NO 117，SEQ ID NO 118, SEQ IDNO 119, SEQ ID NO 120, SEQ ID NO 121, SEQ ID NO 122, SEQ IDNO :123，SEQ ID NO :124，SEQ ID NO :125，SEQ ID NO :126，SEQ IDNO :127，SEQ ID NO 128，SEQ ID NO 129, SEQ ID NO 130, SEQ IDNO 131, SEQ ID NO 132, SEQ ID NO 133, SEQ ID NO :134，和SEQ IDNO :135。這些優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶Rl序列可以組合以優(yōu)選的 重鏈的其它區(qū)域或其它重鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變 區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體結(jié)合人VEGF。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R2的抗-VEGF抗 體，所述CDR2包括下列之一的氨基酸序列=WXiNTX2X3GEX4TYX5X6X7FX8R,其中被指定為“X”的 位置可以是下面列出的氨基酸X1:I，或 VX2 Y，或 NX3:T，或 NΧ4:Ρ，Τ，或 SX5 :Α,或 VX6:A，Q，P，H，D，或 EX7:D，或 EX8:K，或 T另外，優(yōu)選地，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R2包括下列其中之一的氨基酸序列SEQ ID NO 136, SEQ ID NO 137, SEQ ID NO 138，SEQ ID NO :139, SEQ ID NO : 140，SEQ ID NO: 141，SEQ ID NO -.142, SEQ ID N :143，SEQID NO :144，SEQ ID NO :145，SEQ ID NO :146，SEQ ID NO :147, SEQ IDNO :148，SEQ ID NO :149，SEQ ID NO :150，SEQ ID NO :151，SEQ ID NO 152，SEQ ID NO :153，SEQ ID NO :154，SEQ ID NO :155，和 SEQ ID NO :156。這些優(yōu)選的重 鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR2序列可以組合以優(yōu)選的重鏈或其它重鏈的其它區(qū)域，和優(yōu)選的輕鏈 可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變區(qū)序列，條件是這樣產(chǎn)生的抗體以需要的親和力結(jié)合于 人 VEGF。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R3的抗-VEGF抗體，所 述CDR3包含氨基酸序列KYPXJYG&SHWYFDV，其中被指定為〃 X"的位置可以是下面列出 的氨基酸=X1 :Y，或H，和X2 =R0優(yōu)選地，所述抗-VEGF抗體具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R3，所述⑶R3具有SEQ ID NOs :311-337的氨基酸序列，和下列序列HSRHYYGSSPQYFDVKYGYYYGSSHWYFDVKYPHYYGASHWYFDVKYPHYYGGCHWYFDVKYPHYYGGSHWYFDVKYPHYYGGYNQYFDVKYPHYYGRSHWYFDVKYPHYYGRSQffYLDVKYPHYYSRTCQYFDVKYPHYYSSSHWYFDVKYPYFYGSSHWYFDV
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KYPYYHGSSHWYFDVKYPYYNGSSHWYFDVKYPYYNSTSHWYFDVKYPYYSGTSHWYFDVKYPYYSGTSHWYFDYKYPYYYGRSHWYFDVKYPYYYGSSHWYFDVKYPYYYGSSSffYFDVKYPYYYSTSHWYFDVKYRDFNGSSHWYFDVKYSYYYGSSHWYFDVRARHYYGSSHCYFDLRDSHYYGSSHQYFDLKYPHYYGTSHWYFDVKYPHYYGSSHWYFDVKYPYYYGTSHWYFDV.這些優(yōu)選的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的⑶R3序列可以組合以優(yōu)選的重鏈或其它重鏈的其 它區(qū)域，和優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列或組合以其它輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，條件是這樣產(chǎn)生的 抗體以需要的親和力與人VEGF結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)域的 抗-VEGF抗體，所述構(gòu)架區(qū)域包括下列其中之一的氨基酸序列XJQLVXjGGGXsVQPGGXiRLXsCAXeS/CDRl/WXpQAPGKGLEWVG/CDI^/RXsTXgSXiQDXuSK X12X13X14YLQX15NSLRAEDTAVYYCA/CDR3/WX16QGTLVTVSS，其中被指定為
XiΕ,或Q
Q，或E
X3VjL
X4S，或T
S，TjR
XeAjV
X7I，或V
\F，或V
\F，或I
XlO:L，或 R
Xll:T，或 N
Xl2:S，或 N
Xl3:T, QjK
X14:Α，或 V
Xl5:Μ，或 L
X16:G，或 A。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供優(yōu)選地包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的 抗-VEGF抗體，其包括下列Vl和Vh對其中之一的氨基酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 70 ；SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 67 ；SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 75 ；SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 83 ；SEQ IDNO 14和 SEQ ID NO 55 ；SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO 101 ；SEQ IDNO :1 禾口 SEQ ID NO 100 ；SEQ ID NO: 14 禾口 SEQ ID NO 102 ； SEQ IDN0:lfPSEQ ID NO 103 ；SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO 104 ； SEQ IDNO :1 和 SEQ ID NO 105 ； SEQ ID NO 36 和 SEQ ID NO 100 ； SEQ IDNO :26 禾口 SEQ ID NO 100 ；SEQ ID N0:28 禾口 SEQ ID NO 100 ；SEQ IDNO :37 禾口 SEQ ID NO 100 ；SEQ ID NO :44 和 SEQ ID NO 100 ；SEQ IDNO :54 和 SEQ ID NO 100 ；和 SEQ ID NO 47 和 SEQ ID NO :100，另外優(yōu)選地:SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 61 ；SEQ ID NO 28 和 SEQ IDNO 62 ；SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 63 ；SEQ ID NO 28 和 SEQ IDNO 64 ；SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 68 ；SEQ ID NO :28 和 SEQ IDNO 85 ；SEQ ID NO :28 和 SEQ ID NO 86 ；SEQ ID NO 28 禾口 SEQ IDNO 87 ；SEQ ID NO 28 禾口 SEQ ID NO 88 ；SEQ ID NO 28 禾口 SEQ IDNO 89 ； SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 90 ；SEQ ID NO 28 和 SEQ IDNO 91 ；SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 92 ；SEQ ID NO 28 禾口 SEQ IDNO 93 ；SEQ ID NO 28 禾口 SEQ ID NO 94 ；SEQ ID NO 28 禾口 SEQ IDNO 95 ；SEQ ID NO :28 禾口 SEQID NO 96 ；SEQ ID NO :28 禾口 SEQ IDNO 97 ；SEQ ID NO 28和 SEQ ID NO 98 ；SEQ ID NO :28和 SEQ IDNO 99 ；SEQ ID NO :28和 SEQ ID NO 106 ；SEQ ID N0:28 禾口 SEQ IDNO 107 ；SEQ ID N0:28 禾口 SEQ ID NO 108 ；SEQ ID N0:28 禾口 SEQ IDNO 109 ；和 SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 110。本發(fā)明公開的來自全長VdnVL，VH/CDR，VH/FR，VL/CDR，VL/FR的組合(例如，在圖IA 和IB中提供的命中(hit)變體，和在圖IC和ID中顯示的氨基酸序列)的抗體在本發(fā)明的 范圍內(nèi)；并且這些組合不包括在美國專利申請順序號09/056，160，公開號2002/0032315 中公開的抗-VEGF抗體。2.設(shè)計(jì)和構(gòu)建人源化或完全的人抗-VEGF抗體的方法使用革新方法來設(shè)計(jì)本發(fā)明的抗體，所述方法包括在計(jì)算機(jī)上和在體外構(gòu)建和選 擇蛋白質(zhì)文庫。下面描述所述方法的一些方面。更詳細(xì)的方法的描述出現(xiàn)在美國專利申請 號10/443, 134，10/153，159，10/153，176，10/125，687，和 60/284，407 中，將它們?nèi)績?nèi)容 并入本文作為參考。按照本發(fā)明，提供有效產(chǎn)生和篩選蛋白質(zhì)文庫得到具有理想生物學(xué)功能的優(yōu)化的 蛋白質(zhì)的革新方法，所述生物學(xué)功能諸如針對生物學(xué)和治療上重要的靶分子的結(jié)合親和 力。將所述方法用于通過產(chǎn)生具有提高的特性的蛋白質(zhì)的新變體來優(yōu)化蛋白質(zhì)。具體而言， 將該方法用于設(shè)計(jì)文庫用于非人抗體的人源化，和優(yōu)化抗體的親和力和其它特性。以人或 類人序列來產(chǎn)生抗體的氨基酸和核酸的新變體，同時它們的結(jié)合親和力、穩(wěn)定性和表達(dá)效 率得到顯著提高。通過開采所有的生物，尤其是人的蛋白質(zhì)序列的不斷擴(kuò)充的數(shù)據(jù)庫，并通過使它 們的特異性序列或它們的變體與功能提高諸如通過實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性相關(guān) 聯(lián)而以高通量方式在計(jì)算機(jī)上實(shí)施本發(fā)明的方法。通過使用本發(fā)明的方法，可以基于極端 多樣化的蛋白質(zhì)序列的計(jì)算機(jī)評價和在計(jì)算機(jī)上的功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)來構(gòu)建擴(kuò)充的和功 能上有偏向(biased)的蛋白質(zhì)諸如抗體的文庫，并將其隨后通過實(shí)驗(yàn)篩選和體外或體內(nèi)選擇來進(jìn)行檢驗(yàn)。在本發(fā)明的一個方面，提供用于設(shè)計(jì)和選擇具有理想的功能的蛋白質(zhì)的方法。所 述方法基于在下文被稱為“前導(dǎo)序列”的前導(dǎo)蛋白質(zhì)的靶結(jié)構(gòu)/功能性基序或結(jié)構(gòu)域的氨 基酸序列，通過在計(jì)算機(jī)上(in silico)的蛋白質(zhì)序列的選擇，優(yōu)選地，在計(jì)算機(jī)上來進(jìn)行。 將所述前導(dǎo)序列用于搜索蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫的選擇取決于設(shè)計(jì)的基序的具體功 能要求。例如，如果前導(dǎo)蛋白質(zhì)是酶并且靶基序包括酶的活性位點(diǎn)，使用各種搜索標(biāo)準(zhǔn)來產(chǎn) 生命中的序列列表可以查詢特定起源、生物、物種或其組合的蛋白質(zhì)/肽的數(shù)據(jù)庫，所述命 中的序列列表中的每個都可以取代前導(dǎo)蛋白質(zhì)中的靶基序?？梢詫㈩愃频姆椒ㄓ糜谠O(shè)計(jì)前 導(dǎo)蛋白質(zhì)的其它基序或結(jié)構(gòu)域?？梢詫⒚總€個體基序/結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行組合以產(chǎn) 生設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的文庫。此外，為了減少用于人應(yīng)用，諸如治療或診斷的設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的免 疫原性，優(yōu)選地搜索人起源的蛋白質(zhì)或人源化蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫來產(chǎn)生命中的序列列表，所 述命中的序列列表尤其是針對來自前導(dǎo)蛋白質(zhì)的位點(diǎn)的基序，所述基序充當(dāng)前導(dǎo)蛋白質(zhì)的 支架諸如抗體的構(gòu)架?？梢詫Ρ辉O(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的文庫通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)從而產(chǎn)生具有超過 所述前導(dǎo)蛋白質(zhì)的提高的生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的特定方面，所述本發(fā)明的方法在設(shè)計(jì)抗體中來進(jìn)行，所述設(shè)計(jì)的抗體 在序列上多樣然而在功能上彼此相關(guān)?；诒辉O(shè)計(jì)的抗體序列，可以構(gòu)建抗體的文庫從而 以高通量方式，包括在非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)域(CDRs)和/或人源化構(gòu)架(FRs)中的多樣 序列?？梢葬槍V泛多樣的靶分子來篩選這種抗體文庫的新的或提高的功能。在本發(fā)明的另一個方面中，提供基于前導(dǎo)抗體中的區(qū)域的氨基酸序列，在計(jì)算機(jī) 上選擇抗體序列的方法，所述氨基酸序列在下文被稱為“前導(dǎo)序列”。將所述前導(dǎo)序列用于 搜索蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫的選擇取決于被設(shè)計(jì)的基序的具體功能要求。例如為 了設(shè)計(jì)用于治療性應(yīng)用的可變鏈的構(gòu)架區(qū)域，除了幾個結(jié)構(gòu)上關(guān)鍵的位點(diǎn)，應(yīng)該使用蛋白 質(zhì)序列的集合，所述蛋白質(zhì)序列在進(jìn)化上相關(guān)，諸如完全人的免疫球蛋白序列和人種系免 疫球蛋白序列。這將通過在這高度保守的區(qū)域(對于構(gòu)架區(qū)域)中盡可能少的引入外源突 變體，通過保存序列的起源而減少免疫原性應(yīng)答。在另一方面，可以將多樣化的序列數(shù)據(jù)庫 諸如genbank中的各種物種的免疫球蛋白序列或甚至不相關(guān)序列用于設(shè)計(jì)CDRs從而提高 在這種高度可變區(qū)中與抗原的結(jié)合親和力。通過使用所述方法，可以構(gòu)建多樣的抗體序列 的文庫，并且通過實(shí)驗(yàn)在體外或在體內(nèi)來篩選具有改善或需要的功能的抗體的突變體。在一個實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(Vh)或輕鏈 (Vl)的可變區(qū)的氨基酸序列；鑒定在前導(dǎo)抗體的CDRs中的氨基酸序列；選擇在前導(dǎo)抗體的 Vh或\區(qū)域中的CDRs其中之一；提供在選定的CDR中包括至少3個連續(xù)氨基酸殘基的氨基 酸序列，所述選定的氨基酸序列是前導(dǎo)序列；將前導(dǎo)序列與多種測試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較； 和從多種測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述肽片段與前導(dǎo)序列具有至少15%的 序列同一性，所述選定的肽片段形成命中文庫。所述方法還包括下列步驟構(gòu)建包括編碼所述命中文庫的氨基酸序列的DNA片段 的核酸文庫。任選地，所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建命中文庫的氨基酸位置 (positional)變體圖譜；通過將氨基酸位置變體反向翻譯(back-translating)成它們相 應(yīng)的遺傳密碼子而將命中文庫的氨基酸位置變體圖譜轉(zhuǎn)化成核酸位置變體圖譜；和通過以組合方式將核酸位置變體組合在一起而構(gòu)建DNA片段的簡并核酸文庫。任選地，所述遺傳密碼子可以是這樣的密碼子，其優(yōu)選用于在細(xì)菌中的表達(dá)。任選 地，遺傳密碼子可以是這樣的密碼子，其可以減少選擇的大小從而使DNA片段的簡并核酸 文庫的多樣性在實(shí)驗(yàn)上可覆蓋的多樣性范圍內(nèi)，而無需過度的實(shí)驗(yàn)嘗試，例如，低于lxlO7， 并且優(yōu)選地低于lxlO6。在另一個實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(Vh)或輕鏈 (Vl)的可變區(qū)的氨基酸序列；鑒定在前導(dǎo)抗體的CDRs和FRs中的氨基酸序列；選擇在前導(dǎo) 抗體的Vh或\區(qū)域的CDRs其中之一；提供包括至少3個在選定的CDR中的連續(xù)的氨基酸殘 基的第一氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是CDR前導(dǎo)序列；將CDR前導(dǎo)序列與多種CDR 測試(tester)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；從多種CDR測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段， 所述肽片段與CDR前導(dǎo)序列具有至少15%的序列同一性，所述選定的肽片段形成CDR命中 文庫；選擇在前導(dǎo)抗體的Vh或\區(qū)域中的FRs的其中之一；提供在選定的FR中包括至少3 個連續(xù)的氨基酸殘基的第二氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是FR前導(dǎo)序列；將所述FR 前導(dǎo)序列與多種FR測試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；并且從多種FR測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少 兩種肽片段，所述肽片段與所述FR前導(dǎo)序列具有至少15%的序列同一性，所述選定的肽片 段形成FR命中文庫；并且將CDR命中文庫和FR命中文庫進(jìn)行組合以形成命中文庫。按照所述方法，多種CDR測試蛋白質(zhì)序列可以包括人或非人抗體的氨基酸序列。此外，按照所述方法，多種FR測試蛋白質(zhì)序列可以包括人起源，優(yōu)選地人或人源 化抗體(例如，在Vh或\中具有至少50%人序列，優(yōu)選地具有至少70%人序列，更優(yōu)選地 具有至少90 %人序列，并且最優(yōu)選地具有至少95 %人序列的抗體)，更優(yōu)選地，完全的人抗 體，并且最優(yōu)選地人種系抗體的氨基酸序列。此外，按照所述方法，將多種CDR測試蛋白質(zhì)序列中的至少一種與多種FR測試蛋 白質(zhì)序列中區(qū)分開。此外，按照所述方法，多種CDR測試蛋白質(zhì)序列是人或非人抗體序列并且多種FR 測試蛋白質(zhì)序列是人抗體序列，優(yōu)選地人種系抗體序列。所述方法還包括下列步驟構(gòu)建包括編碼所述命中文庫的氨基酸序列的DNA片段 的核酸文庫。任選地，所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建所述CDR命中文庫的氨基酸位置變 體圖譜；通過將氨基酸位置變體反向翻譯(back-translating)成它們相應(yīng)的遺傳密碼子 而將CDR命中文庫的氨基酸位置變體圖譜轉(zhuǎn)化成第一核酸位置變體圖譜；和通過以組合方 式將核酸位置變體組合在一起而構(gòu)建DNA片段的簡并CDR核酸文庫。任選地，所述遺傳密碼子可以是這樣的密碼子，其優(yōu)選用于在細(xì)菌中的表達(dá)。任選 地，遺傳密碼子可以是這樣的密碼子，其可以減少選擇的大小從而使DNA片段的簡并核酸 文庫的多樣性在實(shí)驗(yàn)上可覆蓋的多樣性范圍內(nèi)，而無需過度的實(shí)驗(yàn)嘗試，例如，多樣性低于 lxlO7，優(yōu)選地低于IxlO6。在另一個實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(Vh)或輕鏈 (Vl)的可變區(qū)的氨基酸序列；鑒定前導(dǎo)抗體的FRs的氨基酸序列；選擇前導(dǎo)抗體的Vh或八 區(qū)域中的FRs的其中之一；提供包括在選定的FR中至少3個連續(xù)的氨基酸殘基的第一氨基 酸序列，所述選定的氨基酸序列是第一 FR前導(dǎo)序列；將第一前導(dǎo)FR序列與多種FR測試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；和從多種FR測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述至少兩種肽 片段與第一 FR前導(dǎo)序列具有至少15%的序列同一性，所述選定的肽片段形成第一 FR命中文庫。所述方法還可以包括下列步驟提供在不同于選定的FR的包括FR中至少3個連 續(xù)的氨基酸殘基的第二氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是第二 FR前導(dǎo)序列；將第二 FR 前導(dǎo)序列與多種FR測試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；和從多種FR測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩 種肽片段，所述肽片段與所述第二 FR序列具有至少15%的序列同一性，所述選定的肽片段 形成第二FR命中文庫；并且將第一FR命中文庫和第二FR命中文庫進(jìn)行組合從而形成命中 文庫。按照所述方法，前導(dǎo)CDR序列可以包括選定的CDR中至少5個連續(xù)的氨基酸殘基。 所述選定的CDR可以選自由所述前導(dǎo)抗體的Vh CDR1，VhCDR2，Vh CDR3，VlCDRI，VLCDR2，和\ ⑶R3組成的組。此外，按照所述方法，所述前導(dǎo)FR序列可以包括選定的FR中至少5個連續(xù)的氨 基酸殘基。所述選定的FR可以選自由所述前導(dǎo)抗體的Vh FRl, VhFR2，VhFR3，VhFR4，VlFRI, VlFR2, VlFR3和八FR4組成的組。所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建包括編碼命中文庫的氨基酸序列的DNA片段 的核酸或簡并核酸文庫。在本發(fā)明的另一個方面，提供基于在前導(dǎo)抗體中的區(qū)域的氨基酸序列，S卩，“前導(dǎo) 序列”及其3D結(jié)構(gòu)，在計(jì)算機(jī)上選擇抗體序列的方法。將前導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)用于關(guān)于具有類 似的3D結(jié)構(gòu)的片段對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索。將這些片段進(jìn)行比對從而產(chǎn)生序列 圖譜，在下文將其稱為“前導(dǎo)序列圖譜”。將所述前導(dǎo)序列圖譜用于關(guān)于具有低序列同一性 然而在結(jié)構(gòu)上類似的前導(dǎo)序列的遠(yuǎn)距離的同源物，對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的搜索。通過 使用所述方法，可以構(gòu)建多樣的抗體序列的文庫并且將其通過實(shí)驗(yàn)方法在體外或在體內(nèi)篩 選具有提高的或需要的功能的抗體的突變體。在一個實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(Vh)或輕鏈 (Vl)的可變區(qū)的氨基酸序列；鑒定前導(dǎo)抗體的CDRs中的氨基酸序列；選擇在前導(dǎo)抗體的Vh 或八區(qū)域中的CDRs其中之一；提供包括選定的CDR中至少3個連續(xù)的氨基酸殘基的氨基 酸序列，所述選定的氨基酸序列是前導(dǎo)序列；提供所述前導(dǎo)序列的三維結(jié)構(gòu)；基于所述前 導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜；將所述前導(dǎo)序列圖譜與多種測試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較； 和從多種測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述肽片段與前導(dǎo)序列具有至少10%的 序列同一性，所述選定的肽片段形成命中文庫。按照所述方法，前導(dǎo)序列的三維結(jié)構(gòu)可以是衍生自X-晶體學(xué)、核磁共振(NMR)光 譜學(xué)或理論結(jié)構(gòu)建模的結(jié)構(gòu)。按照所述方法，構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜的步驟可以包括將所述前導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)與多 種測試蛋白質(zhì)片段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較；確定前導(dǎo)序列和測試蛋白質(zhì)片段的主鏈構(gòu)象的均方根 差；選擇主鏈構(gòu)象的均方根差小于5 A，優(yōu)選地小于4 A，更優(yōu)選地小于3 A，和最優(yōu)選地小 于2人的測試蛋白質(zhì)片段；并且將選定的測試蛋白質(zhì)片段與所述前導(dǎo)序列的氨基酸序列進(jìn) 行對比以構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜。任選地，多種測試蛋白質(zhì)片段的結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。
任選地，構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜的步驟可以包括將前導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)與多種測試蛋白 質(zhì)片段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較；確定前導(dǎo)序列和測試蛋白質(zhì)片段的主鏈構(gòu)象的Z-得分(score)； 選擇具有高于2，優(yōu)選地高于3，更優(yōu)選地高于4并且最優(yōu)選地高于5的Z-得分的測試蛋白 質(zhì)片段的片段；并且對選定的測試蛋白質(zhì)片段與前導(dǎo)序列的氨基酸序列進(jìn)行對比以構(gòu)建前 導(dǎo)序列圖譜。任選地，構(gòu)建前導(dǎo)序列圖譜的步驟可以通過選自由CE，MAPS, MonteCarlo和3D聚 簇算法組成的組的算法來進(jìn)行。所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建包括編碼命中文庫的氨基酸序列的DNA片段 的核酸文庫。任選地，所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建所述命中文庫的氨基酸位置變體圖 譜；通過將氨基酸位置變體反向翻譯為它們相應(yīng)的三核苷酸密碼子來將命中文庫的氨基酸 位置變體圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)楹怂嵛恢米凅w圖譜；和通過將核酸位置變體以組合方式組合在一起來 構(gòu)建DNA片段的簡并核酸文庫。在本發(fā)明的另一個方面，提供基于前導(dǎo)抗體的3D結(jié)構(gòu)來在計(jì)算機(jī)上選擇抗體序 列的方法。將來自前導(dǎo)抗體的特定區(qū)域的前導(dǎo)序列或序列圖譜用于關(guān)于前導(dǎo)序列的遠(yuǎn)同源 物進(jìn)行對蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的搜索，所述前導(dǎo)序列的遠(yuǎn)同源物具有低序列同一性然而在結(jié) 構(gòu)上類似。這些遠(yuǎn)同源物形成命中文庫。對命中文庫中的序列進(jìn)行關(guān)于它們與前導(dǎo)抗體的 3D結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)相容性的評估，將所述3D結(jié)構(gòu)在下文稱為“前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板”。選擇在結(jié)構(gòu)上 與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板在結(jié)構(gòu)上相容的命中文庫中的序列，并將其在體外或在體內(nèi)，以實(shí)驗(yàn)方法 進(jìn)行關(guān)于具有提高的或需要的功能的抗體突變體的篩選。在一個實(shí)施方案中，所述方法包括下列步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(Vh)或輕鏈 (Vl)的可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具有已知的被定義為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的三維結(jié) 構(gòu)；鑒定在前導(dǎo)抗體的⑶Rs中的氨基酸序列；選擇前導(dǎo)抗體的Vh或\區(qū)域的⑶Rs其中之 一；提供包括選定的CDR中至少3個連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列，所述選定的氨基酸 序列是前導(dǎo)序列；將所述前導(dǎo)序列圖譜與多種測試蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較；從多種測試蛋白 質(zhì)序列中選擇至少兩種肽片段，所述至少兩種肽片段與前導(dǎo)序列具有至少10%的序列同一 性，所述選定的肽片段形成命中文庫；使用得分函數(shù)來確定命中文庫的成員在結(jié)構(gòu)上與前 導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板是否相容；和選擇命中文庫的成員，所述成員的評分等于或好于或等于前導(dǎo)序 列。按照所述方法，得分函數(shù)是選自由靜電相互作用、范德華相互作用、靜電溶劑化 能、溶劑可及的表面溶劑化能，和構(gòu)象熵組成的組的能量得分函數(shù)。任選地，所述得分函數(shù)是結(jié)合力場(forcefield)的函數(shù)，所述力場選自由Amber 力場，Charmm 力場，Discover cvff 力場，ECEPP 力場，GROMOS 力場，OPLS 力場，MMFF94 力 場，Tripos力場，MM3力場，Dreiding力場，UNRES力場和其它的基于常識的統(tǒng)計(jì)學(xué)力場(均 場)和基于結(jié)構(gòu)的熱力勢函數(shù)組成的組。此外按照所述方法，選擇命中文庫的成員的步驟包括選擇這樣的命中文庫的成 員，基于式A En= E^+Ee+E.+E^^+E-g計(jì)算，其與前導(dǎo)序列的總能量相比，具有更低或 相同的總能量。此外，按照所述方法，選擇命中文庫的成員的步驟包括選擇這樣的命中文庫的成員，所述命中文庫的成員與前導(dǎo)序列的結(jié)合自由能相比，具有更低的結(jié)合自由能，所述結(jié)合 自由能使用改進(jìn)的得分函數(shù)被計(jì)算為在結(jié)合的和未結(jié)合的狀態(tài)之間的差異AGb= Δ Gmm+Δ Gsol-T Δ Sss其中Δ Gmm= Δ Gele+Δ Gvdw(I)AGsol= AGele_sol+AGASA(2)所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建包括DNA片段的核酸文庫，所述DNA片段編碼 所述命中文庫的氨基酸序列。任選地，所述方法還可以包括下列步驟構(gòu)建所述命中文庫的氨基酸位置變體圖 譜；通過將氨基酸位置變體反向翻譯成它們相應(yīng)的三核苷酸密碼子來將命中文庫的氨基酸 位置變體圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)楹怂嵛恢米凅w圖譜；和通過將核酸位置變體以組合方式組合在一起來 構(gòu)建DNA片段的簡并核酸文庫。在本發(fā)明的另一個方面，提供基于以下總稱為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的前導(dǎo)抗體的3D結(jié) 構(gòu)或結(jié)構(gòu)集合(ensemble)或多個抗體的結(jié)構(gòu)集合，在計(jì)算機(jī)上選擇抗體序列的方法。前 導(dǎo)抗體特定區(qū)域的前導(dǎo)序列或序列圖譜被用于搜索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中前導(dǎo)序列的遠(yuǎn) (remote)同源物，其具有低序列同一性然而結(jié)構(gòu)類似。這些遠(yuǎn)同源物形成命中文庫。基 于在前導(dǎo)序列每個位置上出現(xiàn)的氨基酸變體頻率，構(gòu)建命中文庫的氨基酸位置變體圖譜 (AA-PVP)?；贏A-PVP，通過以組合的方式組合前導(dǎo)序列每個位置的氨基酸變體并且截止 (cutoff)或不截止低頻率變體來構(gòu)建命中變體文庫。將命中變體文庫的序列進(jìn)行它們與前 導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的結(jié)構(gòu)相容性的評估。選擇命中文庫中與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板結(jié)構(gòu)相容的序列并用體 內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)篩選具有改善或所需功能的抗體變體。在一個實(shí)施方案中，該方法包含以下步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(Vh)或輕鏈 可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具有被定義為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的已知的三維結(jié)構(gòu)；鑒定 前導(dǎo)抗體的⑶Rs中的氨基酸序列；選擇前導(dǎo)抗體￥11或\區(qū)中的⑶Rs之一；提供包含選定 的CDRs中至少3個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列，選定的氨基酸序列是前導(dǎo)序列；將前導(dǎo) 序列與多種測試蛋白質(zhì)序列比較；從多種測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有 至少10%序列同一性的肽片段，選定的肽片段形成命中文庫；基于在前導(dǎo)序列每個位置出 現(xiàn)的氨基酸變體頻率，構(gòu)建命中文庫的氨基酸位置變體圖譜；組合命中文庫中的氨基酸變 體以產(chǎn)生形成命中變體文庫的命中變體的組合；使用得分函數(shù)確定命中變體文庫的成員是 否在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板相容；和選擇得分等于或好于前導(dǎo)序列的命中變體文庫成員。按照該方法，組合命中文庫中氨基酸變體的步驟包括選擇這樣的氨基酸變體，所 述氨基酸變體具有比氨基酸截止發(fā)生的頻率的2%，優(yōu)選地5%，更優(yōu)選地8%倍(times)， 和最優(yōu)選地10%更高的出現(xiàn)頻率，于是如果它們在截止后丟失則包括來自前導(dǎo)序列的一 些氨基酸；和組合命中文庫中選定的氨基酸變體以產(chǎn)生形成命中變體文庫的命中變體的組
I=I ο按照所述方法，得分函數(shù)是選自由下列各項(xiàng)組成的組的能量得分函數(shù)靜電相互 作用，范德華相互作用，靜電溶劑化能，溶劑可及表面溶劑化能，和構(gòu)象熵。任選地，得分函數(shù)是結(jié)合選自由下列各項(xiàng)組成的組的力場的函數(shù)=Amber力場， Charmm 力場，Di scover cvff 力場，ECEPP 力場，GROMOS 力場，OPLS 力場，MMFF94 力場，Tripos
26力場，匪3力場，Dreiding力場，和UNRES力場，以及其它基于知識的統(tǒng)計(jì)學(xué)力場(均場)和 基于結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)勢函數(shù)。所述方法還可以包含以下步驟構(gòu)建包含編碼命中變體文庫的選定成員的氨基酸 序列的DNA片段的核酸文庫。任選地，所述方法還可以包含以下步驟將命中變體的選定成員劃分和解析成至 少兩個命中變體子文庫；選擇命中變體子文庫；構(gòu)建選定的命中變體子文庫的氨基酸位置 變體圖譜；通過將氨基酸位置變體反翻譯成它們相應(yīng)的三核苷酸密碼子，將選定的命中變 體子文庫的氨基酸位置變體圖譜轉(zhuǎn)變成核酸位置變體圖譜；和通過以組合的方式組合核酸 位置變體構(gòu)建DNA片段的簡并核酸文庫。解析(parsing)命中變體文庫的步驟可包括隨機(jī)選擇10_30個得分等于或好于 前導(dǎo)序列的命中變體文庫成員，所述選定的成員形成變體子文庫。任選地，解析命中變體文庫的步驟可以包括構(gòu)建命中變體文庫的氨基酸位置變 體圖譜，得到命中變體圖譜；基于前導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)集合的Ca或Ci3或重原子在特定 距離截止值(8A-4.5A)范圍內(nèi)的接觸圖譜，將命中變體圖譜解析成子變體圖譜的片段。結(jié) 構(gòu)模型或前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板在8A，優(yōu)選6 A，更優(yōu)選5 A，和最優(yōu)選4.5 A的距離內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，該方法包含以下步驟提供前導(dǎo)抗體的重鏈(Vh)或輕鏈
可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具有已知的三維結(jié)構(gòu)；提供一個或多個抗體的3D結(jié) 構(gòu)，所述一個或多個抗體與前導(dǎo)抗體相比在Vh或\區(qū)具有不同的序列；通過組合前導(dǎo)抗體 和一個或多個抗體的結(jié)構(gòu)形成結(jié)構(gòu)集合；將結(jié)構(gòu)集合定義為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板；鑒定前導(dǎo)抗體 的CDRs中的氨基酸序列；選擇前導(dǎo)抗體Vh或\區(qū)中的CDRs之一；提供在選定的CDRs中 包含至少3個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列是前導(dǎo)序列；將前導(dǎo) 序列與多種測試蛋白質(zhì)序列比較；從多種測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有 至少10%序列同一性的肽片段，所述選定的肽片段形成命中文庫；基于在前導(dǎo)序列每個位 置出現(xiàn)的氨基酸變體的頻率，構(gòu)建命中文庫的氨基酸位置變體圖譜；組合命中文庫中的氨 基酸變體以產(chǎn)生形成命中變體文庫的命中變體的組合；使用得分函數(shù)確定命中變體文庫的 成員是否在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板相容；和選擇得分等于或好于前導(dǎo)序列的命中變體文庫 成員。在具體實(shí)施方案中，所述方法包含以下步驟a)提供前導(dǎo)抗體的重鏈(Vh)或輕鏈 (Vl)可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具有已知的三維結(jié)構(gòu)；b)鑒定前導(dǎo)抗體的CDRs中 的氨基酸序列；c)選擇前導(dǎo)抗體Vh或\區(qū)中的⑶Rs之一 ；d)提供包含選定⑶Rs中至少3 個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列，將選定氨基酸序列定義為前導(dǎo)序列；e)將前導(dǎo)序列與多 種測試蛋白質(zhì)序列比較；f)從多種測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有至少 10%序列同一性的肽片段，選定肽片段形成命中文庫；g)基于在前導(dǎo)序列每個位置出現(xiàn)的 氨基酸變體頻率，構(gòu)建命中文庫的氨基酸位置變體圖譜；h)組合命中文庫中的氨基酸變體 以產(chǎn)生形成命中變體文庫的命中變體的組合；I)使用得分函數(shù)確定命中變體文庫的成員 是否在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板相容；j)選擇得分等于或好于前導(dǎo)序列的命中變體文庫成 員；k)構(gòu)建包含編碼命中變體文庫選定成員的氨基酸序列的DNA片段的簡并核酸文庫；1) 測定核酸文庫的多樣性，如果多樣性高于lxlO6，重復(fù)步驟j)至1)直至核酸文庫的多樣性 等于或低于IxlO6 ；m)將簡并核酸文庫中的DNA片段引入宿主生物體細(xì)胞；η)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA片段以使在宿主生物體細(xì)胞中產(chǎn)生含有命中文庫的氨基酸序列的重組抗體； ο)選擇以高于IO6M4的親和力結(jié)合靶抗原的重組抗體；和ρ)如果未發(fā)現(xiàn)以高于IO6M4的親 和力結(jié)合靶抗原的重組抗體，重復(fù)步驟e)至O)。在另一個具體實(shí)施方案中，所述方法包含以下步驟a)提供前導(dǎo)抗體的重鏈(Vh)或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，所述前導(dǎo)抗體具 有已知的被定義為前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板的三維結(jié)構(gòu)；b)鑒定前導(dǎo)抗體的CDRs中的氨基酸序列；c) 選擇前導(dǎo)抗體Vh或\區(qū)中的⑶Rs之一 ；d)提供包含選定的⑶Rs中至少3個連續(xù)氨基酸 殘基的氨基酸序列，所述選定的氨基酸序列被定義為前導(dǎo)序列；e)通過用一個或多個不同 的氨基酸殘基替代前導(dǎo)序列的一個或多個氨基酸殘基突變前導(dǎo)序列，產(chǎn)生前導(dǎo)序列突變文 庫；f)使用第一得分函數(shù)確定前導(dǎo)序列突變文庫的成員是否與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板在結(jié)構(gòu)上相 容；g)選擇分?jǐn)?shù)等于或好于前導(dǎo)序列的前導(dǎo)序列突變體；h)將前導(dǎo)序列與多種測試蛋白質(zhì) 序列比較；I)從多種測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有至少10%序列同一 性的肽片段，所述選定的肽片段形成命中文庫；j)基于在前導(dǎo)序列每個位置出現(xiàn)的氨基酸 變體頻率，構(gòu)建命中文庫的氨基酸位置變體圖譜；k)組合命中文庫中的氨基酸變體以產(chǎn)生 命中變體的組合；1)結(jié)合所述選定的前導(dǎo)序列突變體和命中變體的組合以產(chǎn)生命中變體 文庫；m)使用第二得分函數(shù)確定命中變體文庫的成員是否在結(jié)構(gòu)上與前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板相容； η)選擇分?jǐn)?shù)等于或好于前導(dǎo)序列的命中變體文庫的成員；ο)構(gòu)建包含編碼命中變體文庫 的選定成員的氨基酸序列的DNA片段的簡并核酸文庫；ρ)測定核酸文庫的多樣性，如果多 樣性高于lxlO6，重復(fù)步驟η)至ρ)直至核酸文庫的多樣性等于或低于IxlO6 ；q)將簡并核 酸文庫中的DNA片段引入宿主生物體的細(xì)胞；r)在宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA片段以使在宿主生 物體細(xì)胞中產(chǎn)生包含命中文庫的氨基酸序列的重組抗體；s)選擇以高于IO6M-1的親和力結(jié) 合靶抗原的重組抗體；和t)如果未發(fā)現(xiàn)以高于IO6M-1的親和力結(jié)合靶抗原的重組抗體，重 復(fù)步驟e)至s)。在本發(fā)明的另一方面，提供基于前導(dǎo)抗體構(gòu)建突變抗體文庫的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的方 法。在一個實(shí)施方案中，該方法包含將包含前導(dǎo)抗體CDR區(qū)域中至少3個連續(xù)氨基酸 殘基的氨基酸序列作為輸入，所述氨基酸序列為前導(dǎo)序列；利用計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的邏輯比較 前導(dǎo)序列和多種測試蛋白質(zhì)序列；從多種測試蛋白質(zhì)序列中選擇至少兩種與前導(dǎo)序列具有 至少15%序列同一性的肽片段；和產(chǎn)生作為輸出的形成命中文庫的選定的肽片段。按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列的長度優(yōu)選為介于5-lOOaa之間，更優(yōu)選介 于6_80aa之間，最優(yōu)選介于8_50aa之間。按照上述方法中任何一種，通過使用Kabat標(biāo)準(zhǔn)或Chothia標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定⑶Rs中 氨基酸序列的步驟。此外，按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列可包含來自前導(dǎo)抗體Vh或Vl中特定區(qū) 域，CDRl，CDR2 或 CDR3,或來自 CDR 和 FRs 的組合，如 CDR1-FR2，F(xiàn)R2-CDR2-FR3，和全長 Vh 或\序列的氨基酸序列。前導(dǎo)序列優(yōu)選包含選定的CDR中至少6個連續(xù)氨基酸殘基，更優(yōu) 選地選定CDR中至少7個連續(xù)氨基酸殘基，最優(yōu)選選定CDR中所有氨基酸殘基。還按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列還可包含至少一個緊鄰選定⑶R的氨基酸 殘基。
還按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列還可包含至少一個在選定⑶R側(cè)翼的FRs。還按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)序列可另外包含一個或多個鄰近選定⑶R的 C-末端或N-末端的CDRs或FRs。還按照上述方法中任何一種，前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板可以是完全組裝前導(dǎo)抗體或前導(dǎo)抗體 重鏈或輕鏈可變區(qū)(例如⑶R，F(xiàn)R及其組合)的3D結(jié)構(gòu)。還按照上述方法中任何一種，多種測試蛋白質(zhì)序列包括優(yōu)選地，抗體序列，更優(yōu)選 人抗體序列，和最優(yōu)選人種系抗體序列(V-數(shù)據(jù)庫)，特別是關(guān)于構(gòu)架區(qū)。還按照上述方法中任何一種，從NIH的genbank或Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫或關(guān)于抗體 CDRs的Kabat數(shù)據(jù)庫中檢索多種測試蛋白質(zhì)序列。還按照上述方法中任何一種，比較前導(dǎo)序列與多種測試蛋白質(zhì)序列的步驟是通過 選自由BLAST，PSI-BLAST,圖譜匪，和C0BLATH組成的組的算法來實(shí)現(xiàn)。還按照上述方法中任何一種，命中文庫中選定肽片段與前導(dǎo)序列的序列同一性優(yōu) 選地是至少25 %，優(yōu)選地是至少35 %，最優(yōu)選地是至少45 %。還按照上述方法中任何一種，該方法另外包含下列步驟將核酸或簡并核酸文庫 中的DNA片段引入宿主生物體細(xì)胞中；在宿主細(xì)胞中表達(dá)DNA片段以使含有由核酸或簡并 核酸文庫編碼的命中文庫的氨基酸序列的重組抗體在宿主生物體細(xì)胞中生產(chǎn)；和選擇以高 于ΙΟΙ1，任選地ΙΟΙ1，任選地IO8M.1,任選地ΚΑΤ1，任選地ΖχΙ ΛΤ1，任選地δχΙ ΛΤ1，任選 地lxlCTM—1，任選地δχΙ ΓΜ—1，和任選地lxlO^M—1的親和力結(jié)合靶抗原的重組抗體。重組抗體可以是完全組裝的抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)v片段，或單鏈抗體。宿主生物包括能夠表達(dá)轉(zhuǎn)移的外源基因序列的任何生物或其細(xì)胞系，包括但不限 于細(xì)菌，酵母，植物，昆蟲，和哺乳動物。重組抗體可以是完全組裝的抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)v片段，或單鏈抗體。例如重組抗體 可以在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)和在噬菌體顆粒的表面上展示。在噬菌體顆粒上展示的重組抗體可 以是在Vh和\之間形成的雙鏈雜二聚體。通過在分別與Vh和\鏈融合的兩條非抗體多肽 鏈之間形成的雜二聚體可促進(jìn)Vh和Vj連的雜二聚體化。例如，這兩個非抗體多肽可以分別 來源于雜二聚體的受體GABAb Rl (GRl)和R2 (GR2)。備選地，在噬菌體顆粒上展示的重組抗體可以是含有通過肽接頭連接和八的 單鏈抗體。通過單鏈抗體與GRl的融合和噬菌體pill衣殼蛋白與GR2的融合之間形成的 雜二聚體可以促進(jìn)噬菌體顆粒表面上單鏈抗體的展示。篩選針對的靶抗原包括小分子和大分子如蛋白質(zhì)，肽，核酸和多糖。上述方法的任一種還可以包含下列步驟將核酸或簡并核酸文庫中的DNA片段 引入宿主生物的細(xì)胞中；在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述DNA片段，從而在宿主生物細(xì)胞中產(chǎn)生含 有命中文庫氨基酸序列的重組抗體；以及選擇以高于IO6M-1的親和力結(jié)合靶抗原的重組抗 體。選定的重組抗體與靶抗原的結(jié)合親和力任選地高于lOl1，任選地高于IO8M4,任 選地高于IxlO9M-1,任選地高于ZxlO9M-1,任選地高于δχΙΟ 1，任選地高于SxlOl1，任選地 高于IxIOkT1,任選地高于2x10"^，任選地高于δχΚΓΜ—1，任選地高于8x10"^，或任選地 高于 ΙχΙΟ11]^1。選定的抗體與其抗原的結(jié)合親和力可以根據(jù)被測試的抗體的形式而變化。被測試
29的選定的抗體可以以包括的單鏈抗體(scFv)的形式存在，所述Vh和\通過使用 本發(fā)明的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。任選地，被測試的選定的抗體可以以包括Vh和\的Fab的形式存 在，所述Vh和\通過使用本發(fā)明的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)?？赡?，由于其更高的構(gòu)象柔性和不穩(wěn)定 性，與以Fab形式存在的選定的抗體相比，以scFv形式存在的選定的抗體的結(jié)合親和力可 以低1-2個數(shù)量級。因此，對于以scFv形式存在的選定的抗體，解離常數(shù)優(yōu)選地低于IO6M-1, 任選地高于ΙΟΙ1，任選地高于IxlO8M-1,任選地高于ZxlO8M-1,任選地高于δχΙΟ 1，任選地 高于SxlO8M-1,任選地高于IxlO9M-1,任選地高于ZxlO9M-1,任選地高于SxIO9M1,任選地高于 SxlO9M-1,任選地高于Ix IOkT1,任選地高于δχΚΓΜ—1，或任選地高于ΙχΙΟ^Μ—1。選定的重組抗體與靶抗原的結(jié)合親和力也可以由解離常數(shù)Kd表示，所述解離常 數(shù)Kd，例如通過使用儀器諸如BIAcore生物傳感器(見實(shí)施例)，在特定溫度(例如，4°C， 251，351，371，或421)下，以在抗體和靶抗原之間的結(jié)合相互作用的動力學(xué)研究來進(jìn) 行測量。一般來說，測量的Kd越低，抗體的親和力越高；對于相同的抗體而言，測量的溫度 約高，測量得到的Kd越高。如果以SCFV、Fab或抗體的其他形式存在，在約4°C，25°C，35°C，37°C，或42°C的溫 度下測量，選定的抗體的Kd任選地低于ΙΟΟηΜ，任選地低于ΙΟηΜ，任選地低于8nM，任選地低 于8nM，任選地低于5nM，任選地低于InM，任選地低于0. 8nM，任選地低于0. 5nM，任選地低于 0. 2nM，任選地低于0. InM,任選地低于0. 08nM,任選地低于0. 05nM,任選地低于0. OlnM,或 任選地低于0. 005nM,按照上述實(shí)施方案的任一個，設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)(例如，抗體)可以在任何生物的細(xì) 胞中合成或表達(dá)，所述生物包括，但不限于，細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物。具體類型 的細(xì)胞包括但不限于果蠅(Drosophilamelanogaster)細(xì)胞，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和其它酵母，大腸桿菌(E. coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，SF9細(xì) 胞，C129細(xì)胞，293細(xì)胞，脈孢菌(Neurospora), BHK, CH0, C0S，和HeLa細(xì)胞，成纖維細(xì)胞， Schwanoma細(xì)胞系，無限增殖的哺乳動物骨髓和淋巴細(xì)胞系，Jurkat細(xì)胞，肥大細(xì)胞和其它 內(nèi)分泌和外分泌細(xì)胞，和神經(jīng)元細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，所有類型的腫瘤 細(xì)胞(特別是黑素瘤，骨髓性白血病，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸癌，腎癌，前列腺癌，胰腺 癌和睪丸癌)，心肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞，淋巴細(xì)胞(T-細(xì)胞和B-細(xì)胞)，肥大細(xì)胞，嗜 酸性粒細(xì)胞，血管內(nèi)膜細(xì)胞，肝細(xì)胞，白細(xì)胞，包括單核白細(xì)胞，干細(xì)胞如造血干細(xì)胞，神經(jīng) 干細(xì)胞，皮膚干細(xì)胞，肺干細(xì)胞，腎干細(xì)胞，肝干細(xì)胞和肌干細(xì)胞，破骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和其 它結(jié)締組織細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，黑素細(xì)胞，肝細(xì)胞，腎細(xì)胞，和脂肪細(xì)胞。優(yōu)選地，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法在表達(dá)后純化或分離設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。純 化方法的實(shí)例包括電泳，分子，免疫學(xué)和層析技術(shù)，包括離子交換，疏水，親和和反相HPLC 層析法，和層析聚焦。所需純化的程度將取決于設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的應(yīng)用。在一些情形中，不需 要純化。還按照上述實(shí)施方案中的任何一種，可以篩選設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的期望功能，優(yōu)選 地生物學(xué)功能如它們與已知結(jié)合配偶體的結(jié)合，生理活性，穩(wěn)定性曲線(pH，熱，緩沖液條 件)，底物特異性，免疫原性，毒性等。在使用基于細(xì)胞的測定的篩選中，基于改變的細(xì)胞表型，優(yōu)選以某一可檢測和/ 或可測量的方式，可以選擇設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。表型改變的實(shí)例包括但不限于，總物理變化如細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長、細(xì)胞生存力，與基質(zhì)或其它細(xì)胞的粘附、和細(xì)胞密度的變化；一種或多種 RNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、激素、細(xì)胞因子或其它分子的表達(dá)變化；平衡狀態(tài)(即半衰期)或一種 或多種RNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、或其它分子的變化；一種或多種RNAs、蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、或其它分子的定位的變化；一種或多種RNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，激素、細(xì) 胞因子、受體、或其它分子的生物活性或比活性的變化；離子、細(xì)胞因子、激素、生長因子、或 其它分子的分泌的變化；細(xì)胞膜電勢、極化、完整性或轉(zhuǎn)運(yùn)的變化；病毒和細(xì)菌病原體的感 染性、敏感性、潛伏期、粘附、和攝取的變化。按照上述實(shí)施方案中任何一種，可以合成或作為與標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽的融合蛋白表 達(dá)設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)(例如抗體)。標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽可以用于設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的鑒定、分離、信號傳 導(dǎo)、穩(wěn)定、柔性增加、降解增加、分泌增加、轉(zhuǎn)運(yùn)或胞內(nèi)保留或表達(dá)增加。本發(fā)明還提供分離編碼所述抗體的核酸；包括該核酸的載體，所述載體任選地 與控制序列可操作地連接，所述控制序列由以所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞所識別；包括該載 體的宿主細(xì)胞；產(chǎn)生所述抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，從而使核酸進(jìn)行表 達(dá)，和任選地，從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述抗體。3.使用本發(fā)明的抗體的方法通過使用本發(fā)明方法設(shè)計(jì)的抗體可以用于診斷或治療處理各種疾病，包括但不限 于，癌癥，自身免疫疾病如多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，I型糖尿病，和重 癥肌無力，移植物抗宿主疾病，心血管疾病，病毒感染如HIV，肝炎病毒，和單純皰疹病毒，細(xì) 菌感染，變態(tài)反應(yīng)，II型糖尿病，血液病如貧血癥。所述抗體也可以用作與診斷或治療部分連接的綴合物，或與化學(xué)治療劑或生物制 劑聯(lián)合。本發(fā)明的抗體還可以用作親和力純化試劑。在該方法中，使用本領(lǐng)域眾所周知的 方法，將所述抗體固定在固相如S印hadex樹脂或?yàn)V紙上。使固定的抗體與待純化的包含 VEGF蛋白質(zhì)(或其片段)的樣品接觸，隨后用適合的溶劑來洗滌所述支持體，所述適合的 溶劑將基本上去除樣品中所有的物質(zhì)，除了結(jié)合于固定的抗體的VEGF蛋白質(zhì)。最終，用另 一種適合的溶劑，諸如甘氨酸緩沖液，PH 5. 0來洗滌所述支持體，所述溶劑將從抗體中釋放 VEGF蛋白質(zhì)。抗-VEGF抗體還可以用在對于VEGF蛋白質(zhì)的診斷測定中，例如在特異性細(xì)胞、組 織或血清中檢測其表達(dá)。這些診斷方法可以用在癌癥診斷中。對于診斷應(yīng)用而言，可以以可檢測的部分來標(biāo)記所述抗體。例如，可以使用例如在 Current Protocols in Immunology,卷 1 禾口 2, Coligen 等，Ed. ffiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)中所述的技術(shù)，以放射性同位素，諸如35S，14C，125I，3H,和131I 來標(biāo)記所述抗體，并且使用閃爍計(jì)數(shù)來測量放射性。所述抗體還可以綴合以熒光標(biāo)記諸如稀土元素螯合劑(例如，銪螯合劑)，熒光素 及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹酰，麗斯胺，藻紅素和得克薩斯紅。例如，使用在上文的 Current Protocols in Immunology中公開的技術(shù)，可以將熒光標(biāo)記綴合于所述抗體。使用 熒光計(jì)可以對熒光進(jìn)行量化?？梢砸愿鞣N酶-底物標(biāo)記諸如在美國專利號4，275，149中公開的那些，對抗體進(jìn) 行標(biāo)記。酶通常催化顯色底物的化學(xué)變化，所述顯色底物可以使用各種技術(shù)進(jìn)行測量。例如，所述酶可以催化底物的顏色變化，其可以通過分光光度法進(jìn)行測量。備選地，所述酶可 以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。 在一種診斷應(yīng)用中，本發(fā)明提供確定VEGF蛋白質(zhì)存在的方法，所述方法包括將懷 疑含有VEGF蛋白質(zhì)的樣品暴露于抗-VEGF抗體并且確定所述抗體與所述樣品的結(jié)合。對 于該應(yīng)用而言，本發(fā)明提供包括所述抗體的試劑盒和使用所述抗體來檢測所述VEGF蛋白 質(zhì)的說明書。 還可以配制本發(fā)明的抗體以用于通過各種各樣的給藥途徑進(jìn)行遞送。通過將具有 需要純度的抗體與任選的生理接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，以凍干制劑或水溶液的 形式來制備所述抗體的治療制劑以進(jìn)行貯存(Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。例如，所述抗體可以通過口服，局部，腸胃外，腹膜內(nèi)， 靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，透皮，舌下，肌內(nèi)，直腸，透頰，鼻內(nèi)，經(jīng)吸入，陰道，眼內(nèi)，經(jīng)局部傳遞(例如 通過導(dǎo)管或支架)，皮下，脂肪內(nèi)(intraadiposally)，關(guān)節(jié)內(nèi)，或鞘內(nèi)進(jìn)行施用或共同施 用。根據(jù)所述疾病的類型和嚴(yán)重性，約1 μ g/kg到約50mg/kg(例如，0. l_20mg/kg， 0. 5-15mg/Kg，和l-10mg/kg)的抗體是施用于患者的起初候選劑量，無論，例如，是通過一 次或多次單獨(dú)施用，還是通過持續(xù)輸注。根據(jù)上述提及的因素，典型的每日一次或每周一次 的劑量范圍可以在約1 μ g/kg到約20mg/kg或更多的范圍內(nèi)。根據(jù)狀況，對于在數(shù)天或更 多天內(nèi)的重復(fù)施用，重復(fù)所述治療直到發(fā)生疾病癥狀的所需的抑制。然而，其他的劑量給藥 方案可以是有用的。這種治療的方法通過例如包括放射顯影腫瘤成像的常規(guī)技術(shù)和測定容 易地進(jìn)行監(jiān)測?？梢詫⒈景l(fā)明的抗-VEGF抗體用于治療廣泛種類的適應(yīng)證，因?yàn)榭?VEGF抗體具 有治療活性。這些適應(yīng)癥包括，但不限于再狹窄(例如，冠狀動脈、頸動脈和大腦病變)， 良性腫瘤，各種類型的癌癥諸如原發(fā)腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移，內(nèi)皮細(xì)胞的異常刺激(動脈粥樣硬 化)，由于外科手術(shù)造成的對身體組織的損傷，異常的傷口愈合，異常的血管發(fā)生，產(chǎn)生組織 纖維化的疾病，肌肉變性，重復(fù)性運(yùn)動疾病，未高度脈管化的組織的疾病，和與器官移植相 關(guān)的增生反應(yīng)。良性腫瘤的實(shí)例包括，血管瘤，肝細(xì)胞腺瘤，多孔血管瘤，病灶性(focal)結(jié)節(jié)增 生，聽神經(jīng)瘤，神經(jīng)纖維瘤，膽小管腺瘤，膽小管cystanoma，纖維瘤，脂肪瘤，平滑肌瘤，間皮 瘤，畸胎瘤，粘液瘤，結(jié)節(jié)狀的再生性增生，沙眼和化膿性肉芽腫(pyogenic granulomas)。特定類型的癌癥包括，但不限于，白血病，乳腺癌，皮膚癌，骨癌，前列腺癌，肝癌， 肺癌，腦癌，喉癌，膽囊癌，胰腺癌，直腸癌，甲狀旁腺癌，甲狀腺癌，腎上腺癌，神經(jīng)組織癌， 頭頸癌，結(jié)腸癌，胃癌，支氣管癌，腎癌，基底細(xì)胞癌，潰爛性和乳頭狀類型的鱗狀細(xì)胞癌， 轉(zhuǎn)移性皮膚癌，骨肉瘤，尤因肉瘤，veticulum細(xì)胞肉瘤，骨髓瘤，巨細(xì)胞腫瘤，小細(xì)胞肺腫 瘤，膽石，胰島細(xì)胞腫瘤，原發(fā)性腦腫瘤，急性和慢性淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞腫瘤，毛細(xì)胞腫瘤， 腺瘤，增生，髓樣癌，嗜鉻細(xì)胞瘤，粘膜neuronms，腸ganglioneuromas，增生性角膜神經(jīng) 腫瘤，馬方綜合征體型(marfanoid habitus)腫瘤，維爾姆斯瘤，精原細(xì)胞瘤，卵巢腫瘤， Ieiomyomater腫瘤，宮頸發(fā)育異常和原位癌，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，軟組織肉瘤， 惡性的類癌瘤，局部皮膚病變，覃樣霉菌病，橫紋肌肉瘤，卡波西肉瘤，成骨的和其他肉瘤， 惡性高鈣血癥，腎細(xì)胞腫瘤，紅細(xì)胞增多癥(polycythermia vera)，腺癌，多形性成膠質(zhì)細(xì)
32胞瘤，白血病，淋巴瘤，惡性黑素瘤，表皮樣瘤癌癥，和其他的癌癥和肉瘤。與異常血管發(fā)生相關(guān)的疾病包括，但不限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、與局部缺血_再灌 注相關(guān)的腦水腫和損傷、皮質(zhì)局部缺血、卵巢增生和血管過多、(多囊卵巢綜合癥)、子宮內(nèi) 膜異位、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病，和其它的眼科血管源性疾病諸如早熟性視網(wǎng)膜病(晶 狀體后纖維形成)、斑退化、角膜移植排異反應(yīng)、neuroscular青光眼和Oster Webber綜 合癥。在具體的實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的抗-VEGF抗體用于治療年齡相關(guān)的斑退化 (AMD)。視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成的實(shí)例包括，但不限于，貝斯特病、近視、視窩(optic pits)、施塔加特病、佩吉特病、靜脈閉塞、動脈閉塞、鐮狀細(xì)胞貧血、類肉瘤、梅毒、假黃瘤 elasticum肉樣瘤abostructive病、慢性眼色素炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、萊姆病、系統(tǒng) 性紅斑狼瘡、早熟性視網(wǎng)膜病、伊爾斯病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、斑退化、Bechets病、導(dǎo)致視網(wǎng) 膜炎或脈絡(luò)膜炎的感染、推定的眼組織胞漿菌病、扁平部睫狀體炎、慢性視網(wǎng)膜脫離、高粘 滯性綜合癥、弓形體病、損傷和激光后并發(fā)癥、與rubesis相關(guān)的疾病(踝的新血管形成) 和由纖維血管或纖維性組織的異常增生造成的疾病，包括所有形式的增生性玻璃體視網(wǎng)膜 病。角膜新血管形成的實(shí)例包括，但不限于，流行性角結(jié)膜炎、維生素A缺陷、接觸 透鏡過度磨損、異位角膜炎、上緣(superior limbic)角膜炎、翼狀胬肉角膜炎sicca、 sjogrens、玫瑰痤瘡、phylectenulosis、糖尿病性視網(wǎng)膜病、早熟性視網(wǎng)膜病、角膜移植排 異反應(yīng)、莫倫潰瘍、Terrien' s緣退化、緣角質(zhì)分離、多動脈炎、Wegener肉樣瘤病、鞏膜炎、 periphigoid輻射狀角膜切開術(shù)、新血管青光眼和晶狀體后纖維增生、梅毒、分枝桿菌感染、 脂質(zhì)退化、化學(xué)燒傷、細(xì)菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動物感 染和卡波西肉瘤?？梢詫⒈景l(fā)明的抗-VEGF抗體與抗血管發(fā)生藥劑組合在一起使用以治療與異常 血管發(fā)生相關(guān)的疾病?？寡馨l(fā)生的藥劑的實(shí)例包括，但不限于，視黃酸及其衍生物，2-甲氧基雌二醇， ANGI0STATIN 蛋白質(zhì)，END0STATIN 蛋白質(zhì)，蘇拉明，角鯊胺，金屬蛋白酶I的組織抑制 劑，金屬蛋白酶_2的組織抑制劑，纖溶酶原激活物抑制劑-1，纖溶酶原激活物抑制劑_2， 軟骨衍生的抑制劑，紫杉醇，血小板因子4，硫酸魚精蛋白(鯡精蛋白)，硫酸化的幾丁質(zhì) 衍生物(制備自母蟹殼)，硫酸化的多糖肽聚糖復(fù)合物(sp-pg)，星形孢菌素，基質(zhì)代謝的 調(diào)節(jié)劑，包括例如，脯氨酸類似物((鈴蘭氨酸(LACA)，順式羥基脯氨酸，d，1-3，4-脫氫 脯氨酸，thiaproline), α , α-二吡啶基，β -氨基丙腈富馬酸鹽，4_丙基_5-(4_吡啶 基)-2(3h)_噁唑酮；甲氨蝶呤，米托蒽醌，肝素，干擾素，2巨球蛋白-血清，chimp-3，胰 凝乳蛋白酶抑制劑，β-環(huán)糊精十四硫酸鹽，印onemycin;夫馬潔林，金硫丁二鈉，d_青 霉胺(⑶ΡΤ)，β-1-抗膠原酶-血清，□ 2-抗纖維蛋白溶酶，比生群，氯苯扎利二鈉， η-(2-羧苯基-4-chloroanthronilic acid 二鈉或"CCA"，沙利度胺；angostatic 類固 醇，cargboxynaminolmidazole ；金屬蛋白酶抑制劑諸如BB94。其它的抗血管發(fā)生藥劑包括 抗體，諸如針對這些生血管生長因子bFGF，aFGF，F(xiàn)GF-5，VEGF同工型，VEGF-C, HGF/SF和 Ang-l/Ang-2的單克隆抗體。 本發(fā)明的抗-VEGF抗體，優(yōu)選地具有與抗-VEGF抗體的治療協(xié)同作用的那些，可以與所述抗-VEGF抗體組合使用從而進(jìn)一步增加這兩種類型藥物的治療效果。治療劑的實(shí)例 包括，但不限于，烷化劑，抗生素藥，抗代謝藥，激素藥，植物衍生藥和生物制劑。烷化劑的實(shí)例包括，但不限于，二氯乙胺(氮芥，例如，苯丁酸氮芥，環(huán)磷酰胺，異 環(huán)磷酰胺，氮芥，美法侖，尿嘧啶氮芥)，吖丙啶(例如，塞替派)，磺酸烷酮(例如，白消安)， 亞硝基脲(例如，卡莫斯汀，洛莫斯汀，鏈佐星)，非經(jīng)典烷化劑(六甲蜜胺，達(dá)卡巴嗪，和丙 卡巴胼)，鉬化合物(卡鉬和順鉬)?？股厮幍膶?shí)例包括，但不限于，蒽環(huán)霉素(例如，多柔比星，柔紅霉素，表 柔比星，伊達(dá)比星和蒽二酮(anthracenedione))，絲裂霉素C，博來霉素，放線菌素D， plicatomycin?？勾x藥的實(shí)例包括，但不限于，氟尿嘧啶(5-FU)，氟尿苷(5-FUdR)，甲氨蝶呤， 亞葉酸，羥基脲，硫鳥嘌呤(6-TG)，巰嘌呤(6-MP)，阿糖胞苷，噴司他丁，磷酸氟達(dá)拉濱，克 拉曲濱(2-CDA)，天冬酰胺酶，甲磺酸伊馬替尼(或GLEEVAC )，和吉西拉濱。這些激素藥的實(shí)例是合成雌激素(例如，二乙基己烯雌酚)，抗雌激素藥(例如，他 莫昔芬，托瑞米芬，fluoxymesterol和雷洛昔芬)，抗雄激素藥(比拉魯胺，尼魯米特，氟他 胺)，芳香酶抑制劑(例如，氨魯米特，阿那曲唑和四唑)，酮康唑，醋酸戈舍瑞林，亮丙立德， 醋酸甲地孕酮和米非司酮。植物衍生的藥劑的實(shí)例包括，但不限于，長春花生物堿(例如，長春新堿，長春 堿，長春地辛，長春利定和長春瑞濱)，鬼白毒素(例如，依托泊甙(VP-16)和替尼泊苷 (VM-26))，喜樹堿化合物(例如，20(S)喜樹堿，托泊替康，盧比替康，和伊立替康)，紫杉烷 類(例如，紫杉醇和多西他賽)。生物制劑的實(shí)例包括，但不限于，免疫調(diào)劑蛋白質(zhì)諸如細(xì)胞因子，針對腫瘤抗原的 單克隆抗體，腫瘤抑制基因，和癌癥疫苗?？梢耘c本發(fā)明的抗體組合使用的白介素的實(shí)例包 括，但不限于，白介素2(IL-2)，和白介素4(IL-4)，白介素12(IL-12)?？梢耘c本發(fā)明的抗體 組合使用的干擾素的實(shí)例包括，但不限于，干擾素a，干擾素b (成纖維細(xì)胞干擾素)和干擾 素g (成纖維細(xì)胞干擾素)。這些細(xì)胞因子的實(shí)例包括，但不限于，紅細(xì)胞生成素(印oietin a)，粒細(xì)胞-CSF (非格司亭)，和粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞-CSF (沙格司亭)。除了細(xì)胞因子，其他 的免疫調(diào)節(jié)劑包括，但不限于卡介苗，左旋咪唑和奧曲肽。本發(fā)明的抗-VEGF抗體還可以與腫瘤壞死因子(TNF)或其突變蛋白組合使用在上 述疾病或病癥的治療中。重復(fù)施用抗-VEGF抗體和TNF直到達(dá)到需要的臨床效果。在其中 實(shí)體腫瘤見于四肢或其它位點(diǎn)的情形中，可以將所述抗體和/或TNF施用于分離的腫瘤或 器官，所述其它位點(diǎn)易感于從一般循環(huán)中分離。在其它的實(shí)施方案中，將FGF或血小板衍生 的生長因子(PDGF)拮抗劑，諸如抗-FGF或抗-PDGF中和抗體與抗-VEGF抗體組合施用于 患者。用抗-VEGF抗體進(jìn)行的治療最好可以在傷口愈合的時期或需要的新血管化過程中暫 停?？梢耘c本發(fā)明的抗-VEGF抗體組合使用的針對腫瘤抗原的單克隆抗體的實(shí) 例包括，但不限于，HERCEPTIN (Trastruzumab)，RITUXAN (利妥昔單抗)， MYLOTARG (吉姆單抗奧佐米星)，CAMPATH (阿侖單抗)，ZEVALIN )(替
伊莫單抗(ibritumomab yiuxetan))，PANOREX (依決可單抗)，BEXXAR (托西 莫單抗)，ERBITUX (西妥昔單抗)，和AVASTIN (貝伐單抗)。
所述腫瘤抑制基因的實(shí)例包括，但不限于，DPC-4，NF-I，NF-2，RB, p53，WTl，BRCAL 禾口 BRCA2。癌癥疫苗的實(shí)例包括，但不限于，神經(jīng)節(jié)苷脂(GM2)，前列腺特異性抗原(PSA)，甲 胎球蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)(由結(jié)腸癌和其它腺癌，例如，乳腺癌、肺癌、胃癌和胰腺癌 產(chǎn)生)，黑素瘤相關(guān)抗原(MART-l，gp 100，MAGE 1，3酪氨酸酶)，乳頭瘤病毒E6和E7片段， 自體腫瘤細(xì)胞和異源腫瘤細(xì)胞的整個細(xì)胞或部分/裂解物?？梢詫⒆魟┯糜谠龃筢槍AAs的免疫應(yīng)答。佐劑的實(shí)例包括，但不限于，卡介苗 (BCG)，內(nèi)毒素脂多糖，匙孔血藍(lán)蛋白(GKLH)，白介素_2 (IL-2)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激 因子(GM-CSF)和環(huán)磷酰胺，認(rèn)為當(dāng)以低劑量給藥時，會減少腫瘤誘導(dǎo)抑制的化療劑。
實(shí)施例1.在i十算機(jī)卜.設(shè)i十用干人源仆JP親和力成孰的杭-VEGF杭體將在本發(fā)明中提供的方法用于設(shè)計(jì)非人抗體的人源化的文庫和優(yōu)化抗體的親和 力和其它特性。以人或人樣序列來產(chǎn)生抗體的氨基酸和核酸的新變體，同時它們的結(jié)合親 和力、穩(wěn)定性、表達(dá)得以顯著提高。通過開采所有的生物，尤其是人的蛋白質(zhì)序列的不斷擴(kuò)充的數(shù)據(jù)庫，并通過使它 們的特異性序列或它們的變體與功能提高諸如通過實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性關(guān)聯(lián)， 而以高通量方式在計(jì)算機(jī)上實(shí)施本發(fā)明的方法。通過使用本發(fā)明的方法，可以基于極端多 樣化的蛋白質(zhì)序列和在計(jì)算機(jī)上的功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)評價來構(gòu)建擴(kuò)充的和功能 上有偏向的抗體文庫，并將其隨后通過實(shí)驗(yàn)篩選和體外或體內(nèi)選擇來進(jìn)行檢驗(yàn)。通常，所述方法基于在下文被稱為“前導(dǎo)序列”的前導(dǎo)蛋白質(zhì)中的靶結(jié)構(gòu)/功能基 序或結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，通過在計(jì)算機(jī)上的蛋白質(zhì)序列的選擇，在計(jì)算機(jī)上來進(jìn)行。將所 述前導(dǎo)序列用于搜索蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫的選擇取決于設(shè)計(jì)的基序的具體功能要 求。例如，如果前導(dǎo)蛋白質(zhì)是酶并且靶基序包括酶的活性位點(diǎn)，可以使用各種搜索標(biāo)準(zhǔn)來查 詢特定起源、生物、物種或其組合的蛋白質(zhì)/肽的數(shù)據(jù)庫，產(chǎn)生命中序列的列表，所述命中 序列的列表中的每個都可以取代前導(dǎo)蛋白質(zhì)中的靶基序。可以將類似的方法用于設(shè)計(jì)前導(dǎo) 蛋白質(zhì)的其它基序或結(jié)構(gòu)域?？梢詫⒚總€個體基序/結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行組合以產(chǎn)生 被設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的文庫。此外，為了減少用于人應(yīng)用，諸如治療或診斷的被設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的 免疫原性，優(yōu)選地搜索人起源的蛋白質(zhì)或人源化蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫來產(chǎn)生命中的序列列表， 所述命中的序列列表尤其是針對來自前導(dǎo)蛋白質(zhì)的位點(diǎn)的基序，其充當(dāng)前導(dǎo)蛋白質(zhì)的支架 諸如抗體的構(gòu)架?？梢詫υO(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的文庫通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)從而產(chǎn)生具有超過所述前 導(dǎo)蛋白質(zhì)的改善的生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。在本實(shí)施例中，將本發(fā)明方法用在設(shè)計(jì)抗-VEGF抗體中，所述抗-VEGF抗體在序列 上多樣，然而在功能上彼此相關(guān)?；诒辉O(shè)計(jì)的抗體序列，對抗體文庫進(jìn)行構(gòu)建從而以高通 量方式在非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)和/或人源化構(gòu)架(FRs)中包括多樣序列。為了 改善的功能諸如結(jié)合親和力和藥物代謝動力學(xué)特性，針對人VEGF篩選這種抗體文庫。在設(shè)計(jì)所述抗-VEGF抗體中，基于前導(dǎo)抗-VEGF抗體中區(qū)域或基序的氨基酸序列， 以下稱為“前導(dǎo)序列”，在計(jì)算機(jī)上選擇抗體序列。使用前導(dǎo)序列來搜索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。 數(shù)據(jù)庫的選擇取決于設(shè)計(jì)的基序的特定功能要求。例如為了針對治療應(yīng)用設(shè)計(jì)可變鏈的構(gòu)架區(qū)，除了一些結(jié)構(gòu)關(guān)鍵位點(diǎn)以外，應(yīng)當(dāng)使用進(jìn)化上相關(guān)蛋白質(zhì)序列如完全人免疫球蛋 白序列和人種系免疫球蛋白序列的集合。通過在該高度保守區(qū)域(對于構(gòu)架區(qū))引入盡可 能少的外源突變體而保留序列來源，這將減小免疫原應(yīng)答。在另一方面，不同序列的數(shù)據(jù)庫 如genbank中的各種物種的免疫球蛋白序列或甚至不相關(guān)序列可以用于設(shè)計(jì)CDRs以便改 善該高變區(qū)中與抗原的結(jié)合親和力。通過使用該方法，構(gòu)建多樣的抗體序列的文庫，并通過 實(shí)驗(yàn)方法在體外和/或體內(nèi)篩選具有改善的或需要的功能的抗體突變體。1) 十纖hi^iftfr -VEGF秘f睡〒麵力縫鼠抗-VEGF抗體的可變重鏈區(qū)的氨基酸序列和構(gòu)架及CDRs的片段(下劃線和注 解的)是EIQLVQSGPELKQPGETVRISCKASGYTFTNYGMN(VH/CDR1)VVKQAPGKGLKffMGffINTYTGE PTYAADFKR(VH/CDR2)RFTFSLETSASTAYLQISNLKNDDTATYFCAKYPHYYGSSHffYFDV(VH/CDR3) WGAGTTVTVSS(SEQ IDNO 283)該Vh序列在下文被稱為“母體抗-VEGF抗體”。按照Kabat標(biāo)準(zhǔn)(KabatEA， Redi-Miller Μ,Perry HM,Gottesman KS (1987)Sequences of Proteins ofImmunological Interest 第 4 版，National Institutes of Health，Bethesda，MD)來設(shè)計(jì)所述構(gòu)架和 CDRs。使用計(jì)算機(jī)模塊進(jìn)化設(shè)計(jì)方法來靶向所述抗體的CDR和構(gòu)架區(qū)，所述設(shè)計(jì)方法如 在美國專利申請系列號 10/443，134，10/153，159，10/153，176，10/125，687，和 60/284，407 中所詳細(xì)描述，將其全部內(nèi)容并入作為參考。使用鼠抗-VEGF抗體作為前導(dǎo)蛋白質(zhì)及其Vh ⑶R3作為前導(dǎo)序列，通過下列方法構(gòu)建Vh⑶R3的數(shù)字式文庫。所述前導(dǎo)序列包括母體抗-VEGF抗體的Vh⑶R3和來自鄰近構(gòu)架區(qū) CAKYPHYYGSSHWYFDVffG的幾個氨基酸殘基。通過從序列數(shù)據(jù)庫中搜索和選擇針對Vh CDR3 的命中氨基酸序列來構(gòu)建命中文庫。基于命中文庫，來構(gòu)建變體圖譜以列出在每個位點(diǎn)的 所有的變體，并以一定的截止值來過濾它們從而減少得到的命中變體文庫的大小到在計(jì)算 機(jī)或?qū)嶒?yàn)限制范圍內(nèi)。還構(gòu)建變體圖譜從而促進(jìn)i)對覆蓋適合度景觀(landscape)中的 優(yōu)選區(qū)域的序列空間進(jìn)行取樣；ii)靶向優(yōu)選的肽的集合序列的簡并核酸文庫的劃分和合 成；iii)實(shí)驗(yàn)篩選所述抗體文庫的所需功能；和iv)以反饋分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以進(jìn)行進(jìn)一步設(shè) 計(jì)和優(yōu)化。前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板獲自在VEGF和抗-VEGF抗體之間形成的復(fù)合體的可獲得的X-射線 結(jié)構(gòu)。將VEGF和母體抗-VEGF抗體的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為IBJl，并且在VEGF和成熟的抗-VEGF 抗體之間形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為1CZ8。以掃描序列的相對等級次序，來自1CZ8結(jié)構(gòu)模板的結(jié) 果類似于來自IBJl的那些。還可以使用抗-VEGF抗體的結(jié)構(gòu)模型。按照Kabat分類由母體抗-VEGF抗體取得Vh⑶R3的前導(dǎo)序列，其中氨基酸殘基 CAK和WG分別來自在N和C末端的Vh CDR3序列的側(cè)翼的鄰近構(gòu)架區(qū)。只利用母體抗體的 Vh⑶R3序列建立HMM用于搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。校準(zhǔn)利用單一前導(dǎo)序列或結(jié)構(gòu)集合序列建立的HMM并將其用于搜索Kabat數(shù)據(jù) 庫(Johnson, G 和 Wu，TT (2001) Nucleic Acids Research，29，205-206)。列出在期望值或 E-值以上的所有序列命中，并利用HAMMER2. 1. 1軟件包進(jìn)行比對。在從命中列表中除去冗 余序列后，前導(dǎo)HMM的其余命中序列形成命中文庫。
利用每個位置上的變體圖譜建立AA-PVP表(氨基酸位置變體圖譜)，其給出了每 種氨基酸殘基在每個位置上出現(xiàn)的數(shù)目?？梢詫⒆凅w圖譜進(jìn)行過濾以利用基于結(jié)構(gòu)的評分除去以某種截止值頻率或比它 更小的頻率和/或組合變體重作圖(!^profiling)而發(fā)生的變體。來自序列庫的變體圖譜 提供了信息數(shù)據(jù)以鑒定前導(dǎo)序列中的位置，其既可以是變化的也可以是固定的。所述位點(diǎn) 可以分成三類i)在進(jìn)化過程中保守的結(jié)構(gòu)保守性位點(diǎn)。高頻殘基可以用來保持這些位置 上靶基序的支架；ii)可變功能性熱點(diǎn)應(yīng)當(dāng)以集中的突變進(jìn)行靶向；iii)組合i)和ii)使 靶支架穩(wěn)定化，同時提供功能性熱點(diǎn)上的可變性。一組來自功能變體的氨基酸應(yīng)當(dāng)按照它們在變體圖譜中的頻率包括在功能熱點(diǎn) 上，因?yàn)樗鼈兪窃谶M(jìn)化上選擇或優(yōu)化的。而且，在每個位置上的變體都可以進(jìn)行過濾或區(qū)分 優(yōu)先次序來包括其它可能有益的突變體或排除可能不需要的突變體以滿足計(jì)算機(jī)和實(shí)驗(yàn) 的限制。盡管所述變體圖譜對每個位置上的優(yōu)選氨基酸殘基和以優(yōu)選次序排列的特定突 變體是信息性的，未修飾的，它包括了大量的重組子。一些利用頻率截止值的過濾能夠可以 減少組合序列，所述組合序列需要通過計(jì)算機(jī)篩選進(jìn)行評估或被實(shí)驗(yàn)文庫直接進(jìn)行靶向。應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)的評分來篩選命中文庫及其形成命中變體文庫的組合序列。母體 抗-VEGF抗體的Vh CDR3的側(cè)鏈在每個殘基位置上被來自命中變體文庫的相應(yīng)氨基酸變 體的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體所取代。利用主鏈依賴型旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫，通過使用程序SCWRJL (版 本 2. 1)建立和優(yōu)化旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的構(gòu)象(Bower MJ, Cohen FE, Dunbrack RL (1997) JMB 267， 1268-82)。在存在和缺少抗原VEGF結(jié)構(gòu)的情況下，通過使用CONGEN[Bruccoleri和 Karplus (1987) Biopolymers 26 137-168]中的 Amber94 力場的 100-200 個步驟，通過搜索 最優(yōu)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體和最小化能量完成評分。在有和/無VEGF抗原時基于計(jì)算得分的抗VEGF 變體文庫的能量得分表明對于各種變體文庫來說有大量的序列比母體序列具有更高的得 分。可以使用一種包括側(cè)鏈熵、非極性溶劑化能和靜電溶劑化能的改進(jìn)的自定制得分 函數(shù)(custom scoring function)來校準(zhǔn)用于評分的簡單函數(shù)。計(jì)算三種能量術(shù)語側(cè)鏈 熵、非極性溶劑化能和靜電溶劑化能以及環(huán)的主鏈熵。如通過GEP0L93算法計(jì)算的，使非靜電溶劑化能與分子表面成比例，縮放比例常 數(shù)為 70cal/mol/A2 (Tunon I，Silla Ε, Pascual-Ahuir JL(1992)Prot Eng 5,715-716), 利用在 CONGEN 中執(zhí)行的 GEPOL(Pascual-AhuirJL，Silla E(1993) J Comput Chem 11， 1047-1060)命令。使用如在UHBD 程序(Davis ME, Madura JD, Luty ΒΑ, McCammon JA (1991) Comput Phys Commun 62，187-197)中進(jìn)行的有限差PB(FDPB)方法計(jì)算靜電溶劑化能。將聚焦法用 于突變周圍區(qū)域。自動方案產(chǎn)生三個格子粗糙的，精細(xì)的，和焦點(diǎn)格子。格子單位分別是 1.5，0.5，和0.25埃。聚焦格子是跨越由突變殘基占有的笛卡兒體積的立方格子。精細(xì)格 子是跨越整個蛋白質(zhì)或復(fù)合體體積的立方格子。粗糙格子是設(shè)定為每個軸中精細(xì)格子大約 兩倍大小的立方格子，并覆蓋約8倍體積的精細(xì)格子。粗糙格子用于說明長范圍的溶劑效 應(yīng)和設(shè)定精細(xì)格子的邊界條件。類似地，精細(xì)格子說明蛋白質(zhì)內(nèi)部的靜電貢獻(xiàn)和設(shè)定焦點(diǎn)格子的邊界條件。焦點(diǎn)格子說明由于突變導(dǎo)致的局部效應(yīng)的更細(xì)微的細(xì)節(jié)。將蛋白質(zhì)內(nèi)部 和外部的介電常數(shù)分別設(shè)定為4和78。溫度設(shè)定為300開爾文和離子強(qiáng)度設(shè)定為150mM。 最大迭代設(shè)定為200。用統(tǒng)一的電介質(zhì)重復(fù)計(jì)算從而使內(nèi)部和外部電介質(zhì)設(shè)定為4，計(jì)算兩 種能量之間的差異。后者計(jì)算代表由于將電荷帶到格子中導(dǎo)致的能量。定制評分函數(shù)或使用CONGEN中的Amber94力場加上來自本文所用UHBD中PB的 溶劑化術(shù)語的分子力學(xué)能量類似于MM-PBSA或MM-GBSA。能量函數(shù)顯示與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更好的 —至文(Sharp ΚΑ. (1998)Proteins 33,39-48 ；Novotny J, Bruccoleri RE, Davis Μ, Sharp KA(1997) JMol Biol 268，401-411)，特別是當(dāng)通過分子動力學(xué)計(jì)算的結(jié)構(gòu)整體(ensemble) 用于提供更準(zhǔn)確的基于能量函數(shù)整體平均值對序列和它的變體評分的方法(Kollman PA, Massova I, Reyes C, Kuhn B, Huo SH, Chong LT, Lee M, Lee TS, Duan Y, Wang W, Donini O,Cieplak P,Srinivasan P,Case DA, ^P Cheatham TE(2000)Acc. Chem Res. 33，889-897)。過濾來自如上所述的命中變體文庫的變體圖譜，以便減小潛在文庫大小而同時保 持大多數(shù)優(yōu)選殘基?；谟欣?jǐn)?shù)和/或可能參與有利相互作用的殘基的存在選擇最佳序 列的策略被用于鑒定一個或多個用于核酸文庫設(shè)計(jì)的氨基酸序列簇。如上所述，分別選擇 對于Vh⑶R3，⑶R2和⑶Rl的計(jì)算篩選的序列簇用于進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)測試。用單一簡并核酸文庫來靶向上述構(gòu)建的命中變體文庫。使用以最小的大小組合的 具體生物的最佳密碼子，來構(gòu)建核酸序列圖譜。通過將堿基的混合物結(jié)合到每個簡并位置 中來合成簡并核酸文庫。作為合成的組合效應(yīng)的結(jié)果，這種簡并核酸文庫編碼擴(kuò)充的氨基 酸文庫。Vh和Vl的每個位置的變體分別顯示在VH和VL氨基酸位置變體圖譜中。將Vh和/ 或Vl⑶R3，CDR2，和CDR1，F(xiàn)R123的詳細(xì)結(jié)果總結(jié)在抗-VEGF VH和VL表中。這些實(shí)驗(yàn)證明， 通過使用本發(fā)明的方法，不僅可以用多樣序列和系統(tǒng)發(fā)生距離，還可以用與靶VEGF抗原結(jié) 合的改善的結(jié)合親和力來選擇抗體。圖IA是對于使用上述方法設(shè)計(jì)的抗-VEGF抗體的\的氨基酸位置變體圖譜 (AA-PVP)。所述 Vl 鏈的 AA-PVP 使用 Baca 等.(1997) J BiolChem 272 10678-10684 的人 源化的VJSEQ ID NO :1)作為參考序列。點(diǎn)表示與參考相同的氨基酸。將CDRs以粗體字 母強(qiáng)調(diào)表示。圖IB是對于使用上述方法設(shè)計(jì)的抗-VEGF抗體的氨基酸位置變體圖譜 (AA-PVP)。所述Vh鏈的AA-PVP使用Baca等.(1997)上文的人源化的Vh (SEQ ID NO 55) 作為參考序列。點(diǎn)表示與參考相同的氨基酸。將CDRs以粗體字母強(qiáng)調(diào)表示。通過使用新的噬菌體展示系統(tǒng)，來檢驗(yàn)所述抗體文庫與抗原，VEGF，結(jié)合的能力， 所述抗體文庫通過使用上述方法，基于母體抗-VEGF抗體的前導(dǎo)序列，在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行設(shè) 計(jì)。2)產(chǎn)生抗-VEGF抗體文庫來進(jìn)行構(gòu)架優(yōu)化發(fā)現(xiàn)鼠單克隆抗體封閉VEGF-依賴型細(xì)胞增殖并且減慢體內(nèi)腫瘤生長(Kim KJ,Li B,Winer J,Armanini M,Gillett N,Phillips HS,Ferrara N(1993)Nature 362,841-844)。 在移植抗原_結(jié)合環(huán)后使用一些關(guān)鍵構(gòu)架位置上的隨機(jī)誘變，來對這種鼠抗體進(jìn)行人源化 (Presta LG,Chen H,0' ConnorSJ,Chisholm V, Meng YG,Krummen L, Winkler Μ,Ferrara N(1997)Cancer Res. 57，4593-4599 ；Baca Μ, Presta LG, 0' Connor SJ, Wells JA(1997)
38J Biol Chem272，10678-10684)。典型地，在數(shù)輪定點(diǎn)誘變和選擇后，通過在某些預(yù)定的關(guān) 鍵位置，以來自母體非人抗體的非人氨基酸置換人或保守(concensus)人構(gòu)架，來產(chǎn)生人 源化的抗體。通常，這些人源化抗體將以相對于其母體抗體的減少的親和力，結(jié)合于其母體 抗體的同源抗原(對于人源化的抗-VEGF，相對于其母體鼠抗體，約6倍更弱，見Baca M, Presta LG, 0' ConnorSJ,ffells JA (1997) J Biol Chem 272，10678-10684，并且對于人源化 抗-VEGF 的另一種形式，2 倍更弱，見 Presta LG, Chen H, O' Connor SJ, Chisholm V,Meng YG, Krummen L, Winkler Μ, Ferrara N(1997)Cancer Res. 57,4593-4599 ；Baca Μ, Presta LG, O' Connor SJ, Wells JA(1997) J BiolChem 272，10678_10684)。通過使用 CDRs 中的 親和力成熟來恢復(fù)這種結(jié)合親和力的損失(Chen Y,Wiesmann C,Fuh G，Li B,Christinger HW McKay P, de Vos AM, Lowman HB(1999) J. Mol Biol 293,865-881)。使用所述的本發(fā)明方法，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣的一些人源化的構(gòu)架，其在構(gòu)架優(yōu)化 后，在結(jié)合親和力上數(shù)倍于(對于hAB2是3. 3倍，對于hAB3是4倍并且對于hAB4是2倍) 報道的人源化的抗-VEGF抗體序列(對于在文獻(xiàn)(Presta LG, Chen H，O' Connor SJ, Chisholm V,Meng YG,Krummen L,Winkler Μ,Ferrara N(1997)Cancer Res. 57，4593-4599) 中報道的人源化的抗-VEGF抗體構(gòu)架，見圖2中的hABl)。因?yàn)閳蟮赖娜嗽椿?VEGF抗 體是 2倍弱于其相應(yīng)的鼠抗體，我們的人源化抗體(hAB2和hAB3)在人源化后與相應(yīng)的 鼠抗體相比，應(yīng)該具有 2倍更高的結(jié)合親和力。此外，通過相對于報道的人源化的抗體 (hABl)，增加結(jié)合速率(K。n)或減小脫離速率(K。ff)，我們可以獲得這樣的改善(見圖2)。鼠抗-VEGF抗體的構(gòu)架frl23區(qū)的氨基酸序列是EIQLVQSGPELKQPGETVRISCKASWVKQAPGKGLKWMGRFTFSLETSASTAYLQISNLKNDDTATYFC A.該序列在下文中稱作“鼠抗-VEGF抗體”的frl23，見Presta LG, Chen H， O' Connor SJ, Chisholm V, Meng YG, Krummen L, Winkler Μ, Ferrara N(1997)Cancer Res. 57,4593-4599)。如果需要可以利用相同方法對相對恒定的構(gòu)架4進(jìn)行設(shè)計(jì)。按照 Kabat 標(biāo)準(zhǔn)對構(gòu)架和 CDRs 進(jìn)行指定(Kabat EA，Redi-MiIler M，Perry HM, Gottesman KS(1987)Sequences of Proteins ofImmunological Interest 第 4 版，National Institutes of Health，Bethesda，MD)，盡管也可以使用其它分類。另外，可以分別地對構(gòu) 架FRl或FR2或FR3和FR4的單獨(dú)片段進(jìn)行設(shè)計(jì)并且如果需要將其粘在一起。利用本文所 述的方法，通過設(shè)計(jì)每個片段或片段的組合可以同時設(shè)計(jì)⑶Rs和FRs的組合。所述⑶Rs與 來自鼠抗-VEGF的SEQ283或利用本文所述方法設(shè)計(jì)的那些中的CDRs相同。不過，還可以設(shè) 計(jì)不同的⑶Rs并且與設(shè)計(jì)的FR123文庫組合使用。利用基于鼠抗-VEGF抗體的Vh FR123前 導(dǎo)序列的人Vh種系序列，生成命中文庫的變體圖譜并且通過利用一定的截止值進(jìn)行過濾。 在每個位置上的變體都可以基于其與抗體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)相容性、利用總能量或其它評分項(xiàng)目 進(jìn)行排序?；谄淇偰芰炕蛱禺愋哉郫B，發(fā)現(xiàn)一些參考氨基酸在某些位置上是有利的，盡管 它們的出現(xiàn)頻率非常低。利用源于Kabat的人VH序列、基于鼠抗VEGF抗體的Vh FR123前 導(dǎo)序列可以生成和改進(jìn)命中文庫的變體圖譜。如果只使用抗體結(jié)構(gòu)的話，可以對經(jīng)過濾的 變體圖譜作進(jìn)一步計(jì)算性篩選以反映結(jié)構(gòu)相容性的排序次序。盡管人相對非人序列在整個 Vh鏈的許多位置上不同，在其它人源化方法中使用的氨基酸文庫集中在移植的CDRs側(cè)翼的 少許位置上的隨機(jī)化，而在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化文庫靶向VH和VL鏈上的各個位置，在那些位置上對于起始抗-VEGF抗體有少許突變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種基序如構(gòu)架FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4或其組合如抗體的 FR123可以利用模塊計(jì)算機(jī)進(jìn)化設(shè)計(jì)方法進(jìn)行靶向。已理解的是，對于每種基序或其組合 只有有限數(shù)目的構(gòu)象(稱為正則結(jié)構(gòu))?？贵w的這些結(jié)構(gòu)特征對于基于抗體結(jié)構(gòu)的廣泛分 析，通過利用抗體各區(qū)上結(jié)構(gòu)化基序測試進(jìn)化序列設(shè)計(jì)提供了極好的系統(tǒng)。在不同的物種 之間觀察到這些結(jié)構(gòu)和序列的保守性。事實(shí)上，抗體的支架，或免疫球蛋白折疊，是自然界 中觀察到的最豐富的結(jié)構(gòu)之一，并且在各種抗體和相關(guān)分子之間高度保守。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還可以用來利用基于序列的方法或含有CDRs中誘 導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化的結(jié)構(gòu)集合來設(shè)計(jì)抗體構(gòu)架。利用鼠抗-VEGF抗體構(gòu)架作為前導(dǎo)蛋白和其 VhFR123作為前導(dǎo)序列，構(gòu)建VhFR123的數(shù)字式文庫。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過利用Vh FR123作為前導(dǎo)序列搜索和選擇命中氨基酸序 列來構(gòu)建命中文庫。建立變體圖譜以便基于命中文庫在每個位置上列出所有變體，并且以 一定截止值進(jìn)行過濾以便減小得到的命中變體文庫的大小在計(jì)算機(jī)或?qū)嶒?yàn)限制內(nèi)。還建立 變體圖譜以便促進(jìn)i)覆蓋適合度景觀中優(yōu)選區(qū)域的序列空間的取樣；ii)靶向優(yōu)選的肽集 合序列的簡并核酸文庫的劃分和合成；iii)對抗體文庫實(shí)驗(yàn)篩選所需功能；和iv)以反饋 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果作進(jìn)一步設(shè)計(jì)和優(yōu)化。前導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板獲自在VEGF和抗VEGF抗體之間形成的復(fù)合體的可獲得的X-射線 結(jié)構(gòu)。將VEGF和母體抗-VEGF抗體的復(fù)合結(jié)構(gòu)命名為IBJl，而在VEGF和成熟抗-VEGF抗 體之間形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)命名為1CZ8。來自1CZ8結(jié)構(gòu)模板的結(jié)果與來自IBJl的結(jié)果在所 掃描序列的相對排列次序上相似。模型化的結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)集合或集合均值也可以用于篩選序 列。VhFR123(SEQ283)的前導(dǎo)序列按照Kabat分類取自鼠抗-VEGF抗體。校準(zhǔn)利用單一前導(dǎo) 序列建立的HMM并用于搜索源自Kabat數(shù)據(jù)庫(Johnson，G和Wu，TT (2001) Nucleic Acids Research, 29, 205-206)的人重鏈種系序列數(shù)據(jù)庫和/或人序列數(shù)據(jù)庫(包括人種系和人源 化序列)。列出在期望值或E-值以上的所有序列命中并利用HAMMER 2. 1. 1軟件包進(jìn)行比 對。在從命中列表中除去冗余序列后，前導(dǎo)HMM的其余命中序列形成命中文庫。來自人Vh 種系的命中序列與前導(dǎo)序列的序列同一性為40到68%，而來自源于Kabat數(shù)據(jù)庫(該數(shù)據(jù) 庫被解析為frl23片段以便增加搜索的敏感性以及它們的相對排序)(如果包含人起源的 免疫球蛋白序列則使用其它數(shù)據(jù)庫)的人免疫球蛋白序列的命中序列的對應(yīng)序列同一性 為 30 至Ij 75%。通過禾[I用禾呈序 TreeView 1. 6. 5 (http //taxonomy. zooIory. Rla. ac. uk/ rod/rod, html)可以分析命中序列之間的進(jìn)化距離。AA-PVP表給出了每個位置上每種氨基酸殘基出現(xiàn)的數(shù)目。在來自人VH種系的命 中序列與來自源于Kabat的人Vh序列的命中序列之間有一些差異來自在結(jié)構(gòu)上重要以穩(wěn) 定靶抗體等的支架的氨基酸的非人起源的氨基酸。如果僅使用抗體結(jié)構(gòu)的話，可以進(jìn)一步 在計(jì)算機(jī)上對這種過濾的變體圖譜進(jìn)行篩選從而反映結(jié)構(gòu)相容性的排列順序。簡而言之， 使用人起源的不同的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行構(gòu)架優(yōu)化將提供多樣的但是有效的氨基酸的選擇來進(jìn)行 構(gòu)架優(yōu)化，包括以改善的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性的人源化。隨著我們在開發(fā)治療性抗體中知 識的增加，越來越多的抗體序列數(shù)據(jù)被積累并且使用本發(fā)明指導(dǎo)我們的設(shè)計(jì)。不需要在前 的假設(shè)來假定關(guān)鍵位置和與那些位置相關(guān)的氨基酸。因?yàn)槭褂帽景l(fā)明的方法自動揭示了這 種信息，因此隨著當(dāng)更多的數(shù)據(jù)被積累時它們在數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)的增加，其將更好地被限定?？梢允褂没诮Y(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)，對變體進(jìn)行重作圖或區(qū)分優(yōu)先次序來包括其他可能有利的突變 體?；诮Y(jié)構(gòu)的能量評分提供了另一種方式來對命中變體文庫在每個位置的變體的出現(xiàn)進(jìn) 行重新作圖，所述命中變體文庫起初基于選自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的序列的作圖進(jìn)行構(gòu)建。一些 使用頻率截止值的過濾可以減少需要通過計(jì)算機(jī)篩選來評價或被實(shí)驗(yàn)文庫直接靶向的組 合序列。即使對變體圖譜應(yīng)用了截止值，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選的最終序列中，仍舊有大量的組合 序列需要進(jìn)行評分和評價。應(yīng)用基于結(jié)構(gòu)的評分來篩選命中文庫及其形成命中變體文庫的組合序列。使用 主鏈依賴型旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫，通過使用程序SCWRJL (版本2.1)，以在每個殘基位置上 來自命中變體文庫的相應(yīng)氨基酸變體的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體來取代在1CZ8或IBJl中的抗-VEGF 抗體的 VHFR123 的側(cè)鏈(BowerMJ，Cohen FE, Dunbrack RL (1997) JMB 267，1268-82)。在 存在和缺乏抗原VEGF的結(jié)構(gòu)的情況下，使用在CONGEN中[Bruccoleri和Karplus (1987) Biopolymers 26 :137_168]的Amber94力場，使用最優(yōu)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體和能量最低化對結(jié)構(gòu)進(jìn) 行優(yōu)化后，使用能量項(xiàng)目或它們與對于每個項(xiàng)目的標(biāo)度因子的組合來進(jìn)行評分。設(shè)計(jì)的構(gòu)架VH frl23相對于鼠對照，與結(jié)構(gòu)具有良好的結(jié)構(gòu)相容性。利用設(shè)計(jì)序 列與來自人種系或人源化構(gòu)架的那些的系統(tǒng)發(fā)生距離分析，也對如部分由其數(shù)據(jù)庫限定的 構(gòu)架優(yōu)化的人樣特征進(jìn)行評價。對如上所述來自命中變體文庫的變體圖譜進(jìn)行過濾以便減小可能的文庫規(guī)模，同 時在消除一定氨基酸之后和/或通過基于它們與結(jié)構(gòu)支架的相容性來篩選序列而保持大 多數(shù)獲自命中變體文庫的優(yōu)選殘基，所述氨基酸具有比截止值低的出現(xiàn)率。以簡并寡核苷酸靶向上面構(gòu)建的命中變體文庫。將上面構(gòu)建的簡并核酸文庫克隆 入噬菌體展示系統(tǒng)并基于噬菌體展示抗體與包被到96孔板上的固定VEGF的結(jié)合來選擇噬 菌體展示抗體(ccFv)。將文庫置于噬菌體展示載體PABMD12中，其中抗-VEGF 被所述 文庫所替代。作為結(jié)果，Vl和多種由文庫生成的Vh將配對以形成抗-VEGF的功能性ccFv。 隨后利用噬菌體展示文庫對于固定的VEGF蛋白抗原作進(jìn)一步淘洗(panning)。為了生成能夠覆蓋廣泛散布的簡并性位置的文庫，在設(shè)計(jì)文庫的位點(diǎn)上以簡并性 位置合成多種重疊性簡并DNA寡核苷酸。組裝方法由兩個PCR反應(yīng)，組裝PCR和擴(kuò)增PCR組 成。設(shè)計(jì)組裝寡核苷酸，35-40鏈節(jié)，被15-20個堿基重疊，平均熔點(diǎn)溫度為大約60°C。產(chǎn) 生另外一對擴(kuò)增寡核苷酸引物(Amp93和Amp94)進(jìn)行設(shè)計(jì)產(chǎn)物的最后擴(kuò)增。因此，所述組 裝PCR包括在最終總濃度為8 μ M，dNTP 0. 8 μ M，Ixpfu緩沖液(Strategene)，和2. 5單 位的pfu turbo (Strategene)中等量的組裝寡核苷酸引物。熱循環(huán)如下進(jìn)行94°C x45"， 58°C x45〃 ,72°C x45〃進(jìn)行30個循環(huán)以及在72°C上進(jìn)行10分鐘的最后延伸。將PCR產(chǎn)物 混合物稀釋10倍并且用作擴(kuò)增PCR的模板，其中所有試劑都保持相同，除了加入最終濃度 為ΙμΜ的擴(kuò)增引物以外。熱循環(huán)如下進(jìn)行94°C χ45" ,60 °C χ45"，72°Cx45"進(jìn)行30個 循環(huán)以及在72°C上進(jìn)行20分鐘的最后延伸。將最終產(chǎn)物(VH文庫)純化，用HindIII和 StyI消化，并且最后亞克隆入載體PABMD12中以替換原始的鼠VH。利用文庫電轉(zhuǎn)化TGl感 受態(tài)細(xì)胞，其又通過輔助噬菌體K07(Amersham)擴(kuò)增和救獲(rescue)，隨后按照標(biāo)準(zhǔn)方法 在30°C下過夜生產(chǎn)文庫噬菌體。為了篩選上面實(shí)施例中所述構(gòu)建的文庫，將純化的同型二聚VEGF蛋白 (Calbiochem)以指定濃度稀釋在包被緩沖液(0. 05M NaHCO3,pH 9.6)中并于4°C過夜固定在Maxisorb孔(Nunc)上。隨后在將稀釋于PBS中的噬菌體文庫應(yīng)用在孔中于37°C溫育2 小時之前，將經(jīng)包被的孔在5%奶中于37°C封閉1小時。溫育混合物還常規(guī)包含2%的奶以 使非特異性結(jié)合最小化。在溫育結(jié)束時，洗滌孔并且隨后在感染TGl細(xì)胞之前通過1. 4%的 三乙胺洗脫結(jié)合的噬菌體，在所述感染之后由K07輔助噬菌體進(jìn)行拯救來擴(kuò)增。為了擴(kuò)增 所述噬菌體，隨后在收獲噬菌體文庫之前在存在羧芐青霉素和卡那霉素時將感染的和拯救 的TGl細(xì)胞于30°C過夜生長。將擴(kuò)增的噬菌體用作輸入文庫進(jìn)行下一輪淘洗。同時，隨后 對來自第5輪等的淘洗的單個克隆隨機(jī)取樣進(jìn)行噬菌體ELISA，其中將證實(shí)與固定VEGF的 特異性結(jié)合，并且證明從第5輪到第7輪淘洗100%的陽性。最后，從第5輪淘洗(P5)開 始，對在2xYT/羧芐青霉素(100yg/ml)/卡那霉素(70yg/ml)的平板上生長的分離克隆 取樣測序，以便確定針對設(shè)計(jì)的命中位置和命中序列。圖IC顯示選定的抗-VEGF抗體的全長VJ勺氨基酸序列(與Baca等(1997) J Biol Chem 272 10678-10684 中人源化 Vl 的氨基酸序列(SEQ IDNO 1)，和 Kim 等(1993) Nature 362 841-844中的小鼠抗-VEGF單克隆抗體的氨基酸序列(SEQ ID NO 284)進(jìn)行比較)， VyCDR，和的氨基酸序列。圖ID顯示選定抗-VEGF抗體的全長Vh的氨基酸序列(與Baca等(1997) J Biol Chem 272 10678-10684 中人源化 Vh 的氨基酸序列(SEQ IDNO 55)，Chen 等(1999) J. Mol. Biol. 293 =865-881的親和力成熟Vh的氨基酸序列(SEQ ID NO 56)，以及Kim等(1993) Nature 362 :841_844中的小鼠抗-VEGF單克隆抗體的氨基酸序列(SEQ ID NO 283)進(jìn)行 比較)，Vl/CDR，Vh/CDR，和 Vh/FR。為了與其它方法生成的抗-VEGF抗體進(jìn)行直接比較的目的，本發(fā)明中公開的人源 化 Vl (SEQ ID NO 1)與 Chen 等(1999) J. Mol. Biol. 293 :865_881 中所述抗體 Y0317 的 Vl 相 同；而本發(fā)明中公開的Vh(SEQ IDNO 55)與Chen等(1999)，同上中所述的抗體Y0192的\ 相同。本發(fā)明中公開的人源化和親和力成熟VH(SEQ ID NO 56)與Chen等(1999)，同上中 所述的抗體Y0317的Vh相同。選定的優(yōu)化Vh構(gòu)架也與人源化Vh序列聚類在一起，與人種系Vh3家族的系統(tǒng)發(fā)生 距離非常近，而鼠Vh構(gòu)架與優(yōu)化Vh構(gòu)架和人種系非常遠(yuǎn)。命中序列相對于Vh的完整人免 疫球蛋白所有組成成分的系統(tǒng)發(fā)育分析提示它們實(shí)際上與人種系家族III關(guān)系最近。這支持這樣的結(jié)論，即本發(fā)明的方法可以用于以優(yōu)化抗體的完整人或人樣序列設(shè) 計(jì)優(yōu)化的構(gòu)架，這依賴于人樣序列和與結(jié)構(gòu)模板或來自集合結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)平均值的模板的相 容性之間的很好平衡。利用我們所述的發(fā)明方法，我們發(fā)現(xiàn)多種重鏈(例如，SEQ ID NO :70，SEQ ID NO 67和SEQ ID NO 75)人源化構(gòu)架在構(gòu)架優(yōu)化后具有比母體或參考抗-VEGF抗體序列(SEQ ID NO 55)更高的結(jié)合親和力。這種改進(jìn)主要是來自由構(gòu)架人源化作用單獨(dú)帶來的結(jié)合速 率(κ。η)的較大提高和脫離速率(K。ff)的小的降低。圖2A顯示5種抗體，母體抗體(hABl) 和利用BIAcore生物傳感器選自設(shè)計(jì)文庫的抗-VEGF抗體的優(yōu)化構(gòu)架(hAB2，hAB3, hAB5) 的親和力數(shù)據(jù)。所述測量是通過測量當(dāng)純化的抗體結(jié)合其抗原(VEGF)時Sra單位(y-軸) 對時間(χ-軸)的變化而實(shí)施的，所述抗原(VEGF)于25°C固定于CM5生物芯片上。兩種人 源化的構(gòu)架hAB2和hAB3在構(gòu)架優(yōu)化后在結(jié)合親和力(以單鏈形式)方面是文獻(xiàn)中報道的 母體 / 參考抗-VEGF 抗體序列(Presta LG，Chen H, 0' Connor SJ, Chisholm V, Meng YG,Krummen L, Winkler Μ, Ferrara N(1997)Cancer Res. 57,4593-4599) 4 倍，這兩種人源 化抗體在人源化后應(yīng)當(dāng)具有 2倍于對應(yīng)鼠抗體的結(jié)合親和力。2.候選抗體的選擇1) ccFv-雜二聚體卷曲螺旋穩(wěn)定化的抗體本發(fā)明提供一種新的策略以使Vh和\雜二聚體穩(wěn)定化。設(shè)計(jì)獨(dú)特的雜二聚體化 序列對并且用來生成Fab樣的功能性人工Fv片段ccFv (US200030027247A1)。這種序列對 特異性地形成卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)并且介導(dǎo)GABAb-RI和GABAb-R2受體的功能性雜二聚體化作 用。每種雜二聚體序列對分別源自雜二聚體受體GABAb Rl和R2的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。為了 改造抗體Vh和\雜二聚體的目的，將序列GRl和GR2的對分別融合到Vh和\片段的羧基 末端上。因而Vh和\，ccFv (卷曲螺旋Fv)的功能性配對，由GRl和GR2的特異性雜二聚化 作用介導(dǎo)。表達(dá)具有分子量為35kDa的重組ccFv抗體片段。將抗-VEGF抗體的Vh和八序列克隆到表達(dá)兩種融合蛋白的載體中Vh-GRI和 VL-GR2-pIII融合蛋白中。表達(dá)的Vh-GRI和Vl_GR2_pIII融合蛋白分泌入壁膜間隙中，在那 里它們進(jìn)行雜二聚體化以通過卷曲_螺旋結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定的ccFv抗體。為了在絲狀噬菌 體的表面上展示ccFv抗體，將上面的載體轉(zhuǎn)化入細(xì)菌TGl細(xì)胞中，用K07輔助噬菌體對其
作進(jìn)一步超感染。2)銜梓子(adaptor)介導(dǎo)的噬菌體展示系統(tǒng)在常規(guī)的噬菌體展示系統(tǒng)中，將目標(biāo)蛋白融合到噬菌體衣殼蛋白如pill上以便 在噬菌體的表面進(jìn)行展示。這種融合蛋白將與由輔助噬菌體如K07提供的野生型噬菌體蛋 白一起組裝成噬菌體顆粒。將如US20030104355A1中所述的稱作銜接子定向的展示系統(tǒng)的 新噬菌體展示系統(tǒng)用來將各種抗體片段展示于噬菌體表面。通常，抗體片段如單鏈可變片 段由一對銜接子攜帶到噬菌體顆粒的表面上，所述一對銜接子特異性形成雜二聚體，一種 融合以表達(dá)載體中的展示蛋白而另一種融合了輔助載體中的噬菌體衣殼蛋白。特別地，雜 二聚體序列對GRl和GR2的每個分別源自雜二聚體的受體GABAb RI和R2的卷曲螺旋結(jié)構(gòu) 域。為了展示抗體片段的目的，將序列GRl在原核表達(dá)載體中融合到抗體片段的羧基末端 上，而GR2則融合到噬菌體基因組殼體蛋白III的氨基末端上。所述雜二聚體通過一種序 列對形成，所述序列對特異性形成卷曲_螺旋結(jié)構(gòu)并且在通過輔助噬菌體救獲攜帶表達(dá)載 體的大腸桿菌之后介導(dǎo)抗體片段的功能性展示。3)候選抗體文庫的制備基于PCR組裝，利用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法制備候選抗體文庫的DNA。隨后將所述DNA進(jìn) 行限制性核酸內(nèi)切酶消化，純化，并且連接入如上所述適合的載體中。連接后，將DNA轉(zhuǎn)化 入TGl細(xì)胞中。通過輔助噬菌體感染從TGl細(xì)胞中制備噬菌體。將感染的TGl細(xì)胞于30°C 過夜培養(yǎng)于2xYT/Amp/Kan中。通過PEG/NaCl由培養(yǎng)物上清液沉淀噬菌粒顆粒，并將其重 懸于PBS中。4)候誅抗體t庫的誅雇使用候選抗體的噬菌體文庫相對于固定的VEGF進(jìn)行文庫選擇。純化的重組人 VEGFI65購自Calbiochem(批號=80054-994)。人VEGF的165個氨基酸殘基變體的糖基 化的，二硫化物連接的同型二聚體具有42kD的表觀分子量(Burke等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 207 :348 (1995) ；Neufeld φ, Prog. Growth Factor Res. 5 89(1994) ；Leung
43等，Science 246:1306(1989))。通常，在結(jié)合的溫育期后，洗去未結(jié)合的噬菌體，洗脫結(jié) 合的噬菌體并擴(kuò)增進(jìn)行下一輪淘洗。過去已經(jīng)舉例說明了通常用于噬菌體展示的類似方 ..法(Barbas 等’ Phage display -.a laboratory manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001)。例如，首先將100 μ 1的2 μ g/ml純化人重組VEGFI65的等分試樣固定到96孔板 的每孔上。在PBS中以5%的牛奶進(jìn)行封閉后，將2%牛奶/PBS中的文庫噬菌體的等分試 樣加入孔中并進(jìn)行溫育。隨后將含有溶液的噬菌體棄去，并洗滌孔。最后以IOOmM三乙胺 洗脫結(jié)合的噬菌體，并將其加入到TGl培養(yǎng)物中進(jìn)行感染。隨后將由感染的TGI細(xì)胞制備 的噬菌體用于下一輪淘洗。隨后通過對于VEGF抗原蛋白的ELISA確認(rèn)陽性克隆，其中通過 用針對噬菌體外殼蛋白PVIII的HRP綴合的抗-M13抗體溫育來檢測結(jié)合到固定抗原上的 噬菌體。使用底物ABTS[2，2'連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]進(jìn)行HRP活性 的測量。對確認(rèn)為陽性的那些克隆的DNA進(jìn)行測序。隨后將取樣的DNA序列翻譯成氨基酸 序列。將選定的序列組合以生成新的變體。將選定的變體進(jìn)行表達(dá)以生產(chǎn)可溶性抗體片段 進(jìn)行親和力評估。3.來自人PBLs的Vk和V1的擴(kuò)增從人外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)中提取總RNA，并用作第一鏈cDNA合成的模板，所述 cDNA合成是通過利用寡-dT引物和反轉(zhuǎn)錄酶以標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的(第一鏈cDNA合成試劑盒 購自Roche Applied Science)。通過PCR由單鏈cDNA擴(kuò)增抗體輕鏈可變基因。設(shè)計(jì)PCR 引物并基于Kaba V-基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行合成(表1)。為了擴(kuò)增Vk基因的全部6個亞家族，使 用靶向40個種系人Vk基因5’末端的6種簡并引物和靶向5種人Jk片段基因3’末端的3 種簡并引物。為了進(jìn)行Vl基因全部10個亞家族的PCR擴(kuò)增，使用靶向31個種系人Vl基 因5’末端的8種簡并引物和靶向4種Jl片段基因3’末端的2種簡并引物。將PCR擴(kuò)增 的Vk和Vl基因進(jìn)一步克隆入噬菌粒載體中以生成噬菌體展示文庫，所述載體攜帶人源化 抗-VEGF抗體VH。表1 Vk和Vl擴(kuò)增的引物
4.可溶性抗體片段的表達(dá)可以在原核(大腸桿菌)和真核(酵母)表達(dá)系統(tǒng)中生成以單鏈可變片段(scFv) 形式存在的可溶性抗體片段用于生物物理分析的目的。scFv的構(gòu)建包括如在前研究所述 的通過(G4S)3 接頭連接的 VH 片段和 VL 片段((Barbas 等，Phage display :a laboratory manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001) 用于原核表達(dá)的表達(dá)載體例示于 圖7中。制備感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞，例如，BL21，并用攜帶抗體片段的載體按照本領(lǐng)域已知的方 法進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Sambrook，F(xiàn)ritsch 禾口 Maniatis，Molecular Cloning :ALaboratory Manual， 第二片反，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N. Y.，(1989) ；Antibodies :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。在適于蛋白表達(dá)的條件下 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這些條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且因此不在此詳述。利用本領(lǐng)域已 知的常規(guī)方法收獲表達(dá)的抗體并用于進(jìn)一步分析。使用購自Irwitrogen的Pichia表達(dá)試 劑盒并按照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行酵母中的表達(dá)。所有的抗體都在C末端用HA-His6標(biāo)志物 進(jìn)行標(biāo)記，并通過NTA和Superdex 75柱進(jìn)行純化。為了測定抗體片段的純度和表達(dá)產(chǎn)率， 通過SDS-PAGE凝膠分析20 μ 1純化的蛋白質(zhì)，并通過用考馬斯亮藍(lán)R-250染色進(jìn)行顯影。5.選定的抗體片段的親和力分析利用BIAcore Biosensor Assay測定抗體親和力。通過胺偶聯(lián)將VEGF蛋白(購自 Calbiochem)偶聯(lián)到CM-5生物傳感器芯片(ship)上。固定后，將具有200-1000反應(yīng)單位的 VEGF的CM-5芯片在使用前保持于4°C。所有實(shí)驗(yàn)都在25°C或35°C上進(jìn)行。利用Biacore 1000 (Biacore AB, Sweden)將PBS緩沖液中的每種樣品以20 μ 1/min的流速注射到VEGF表 面上，并在每個循環(huán)結(jié)束時通過10 μ 1的甘氨酸-HC1，PH 1. 5將結(jié)合的抗體從芯片上去除。 記錄每個傳感圖(sensorgrams)并相對于PBS基線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了測定抗體親和力，包
45括締合和解離速率常數(shù)，利用BIAevalvation version 3軟件通過擬合1 ILangmuir結(jié) 合模型的結(jié)合曲線對傳感圖進(jìn)行分析。6.抗體片段穩(wěn)定性的評估為了評估所定義抗體片段的穩(wěn)定性，將PBS中的可溶性抗體分別在4°C，37°C，和 42°C下進(jìn)行溫育?？贵w濃度為0. 5 μ M或1 μ M。在指定的溫育時間后，將抗體溶液置于25°C 下1小時，隨后在Biacore 1000中直接注射到VEGF表面上。記錄抗體結(jié)合RU，并用于穩(wěn)定 性分析。序列表<110> 鐘蘋羽羅培志凱文C·王馬克·赫斯荷李艷<120>針對血管內(nèi)皮生長因子的人源化抗體<130>26050-709.601<150>US 60/284,407<151>2001-04-17<150>US 10/125, 687<151>2002-04-17<150>US 10/153， 176<151>2002-05-20<150>US 10/443， 134<151>2003-05-20<150>US 10/723, 434<151>2003-11-26<160>156<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>VL<400>1Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser15 10Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala2025Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15
Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr 30
Lys Ala Pro Lys Val Leu lie
<213>人工序列0688]<220>0689]<223>VL0690]<400>70691]Asp IleValMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaThrProGly0692]1510150693]Glu ArgValThrIleSerCysSerAlaSerGlnAsplieSerAsnTyr0694]2025300695]Leu AsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProSerLeuLeuVal0696]3540450697]Tyr PheThrSerSerLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly0698]5055600699]Ser GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerArgLeuGlnAla0700]657075800701]Glu AspPheAlaIleTyrTyrCysGlnGlnTyrSerThrValProTrp0702]8590950703]Thr PheGly GlnGlyThrLys ValGlulieLys0704]1001050705]<210>80706]<211>1070707]<212>PRT0708]<213>人工序列0709]<220>0710]<223>VL0711]<400>80712]Asp IleValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaThrProGly0713]1510150714]Asp ArgValThrIleSerCysSerAlaSerGlnAsplieSerAsnTyr0715]2025300716]Leu AsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProGlnLeuLeulie0717]3540450718]Tyr PheThrSerSerLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly0719]5055600720]Ser GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGlnAla0721]657075800722]Glu AspValAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrSerThrValProTrp0723]8590950724]Thr PheGlyGlnGlyThrLys ValGlulieLys0725]100105頁
0726]<210>90727]<211>1070728]<212>PRT0729]<213>人工序列0730]<220>0731]<223>VL0732]<400>90733]Asp lie ValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaThrProGly0734]1510150735]Glu Arg AlaThrIleThrCysSerAlaSerGlnAsplieSerAsnTyr0736]2025300737]Leu Asn TrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProHisLeuLeulie0738]3540450739]Tyr Phe ThrSerSerLeuHisSerGlyValProTyrArgPheSerGly0740]5055600741]Ser Gly SerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGlnAla0742]657075800743]Glu Asp PheAlaIleTyrTyrCysGlnGlnTyrSerThrValProTrp0744]8590950745]Thr Phe Gly GlnGlyThrLysValGlulieLys0746]1001050747]<210>100748]<211>1070749]<212>PRT0750]<213>人工序列0751]<220>0752]<223>VL0753]<400>100754]Asp lie GluMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaThrProGly0755]1510150756]Asp Arg ValThrIleThrCysSerAlaSerGlnAsplieSerAsnTyr0757]2025300758]Leu Asn TrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProArgValLeulie0759]3540450760]Tyr Phe ThrSerSerLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly0761]5055600762]Ser Gly SerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerArgLeuGlnPro0763]657075800764]Glu Asp ValAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrSerThrValProTrp0765]8590950766]Thr Phe Gly GlnGlyThrLys ValGlulieLys0767]1001050768]<210>110769]<211>1070770]<212>PRT0771]<213>人工序列0772]<220>0773]<223>VL0774]<400>110775]Asp lie Glu MetThrGlnSer ProSerSerLeuSerValThrProGly0776]1 510150777]Asp Arg Val ThrIleThrCys SerAlaSerGlnAsplieSerAsnTyr0778]2025300779]Leu Asn Trp TyrGlnGlnLys ProGlyLysAlaProHisLeuLeulie0780]3540450781]Tyr Phe Thr SerSerLeuHis SerGlyValProAspArgPheSerGly0782]5055600783]Ser Gly Ser GlyThrAspPhe ThrLeuThrlieSerArgLeuGlnPro0784]65 7075800785]Glu Asp Phe AlaThrTyrTyr CysGlnGlnTyrSerThrValProTrp0786]8590950787]Thr Phe Gly GlnGlyThrLys ValGlulieLys0788]1001050789]<210>120790]<211>1070791]<212>PRT0792]<213>人工序列0793]<220>0794]<223>VL0795]<400>120796]Asp lie Glu LeuThrGlnSer ProSerSerLeuSerAlaThrLeuGly0797]1 510150798]Glu Arg Val ThrIleSerCys SerAlaSerGlnAsplieSerAsnTyr0799]2025300800]Leu Asn Trp TyrGlnGlnLys ProGlyLysAlaProHisValLeulie0801]3540450802]Tyr Phe Thr SerSerLeuHis SerGlyValProSerArgPheSerGly0803]505560
52
<400>18
AspIleValMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerProGly
151015
GluArgAlaThrlieThrCysHisAlaSerGlnSerlieGlyThrTyr
202530
LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProHisValLeulie
354045
TyrGlyAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly
505560
SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGlnPro
65707580
AspAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnTyrAsnSerThrProTrp
859095
ThrPheGly GlyGlyThrLys ValGlulieLys
100105
<210>19
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VL
<400>19
AspIleValMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerProGly
151015
GluArgAlaThrlieThrCysLysAlaSerGlnSerlieGlyThrTyr
202530
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354045
TyrAspAlaSerAsnLeuAlaSerGlyValProAsnArgPheSerGly
505560
SerArgSerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGlnPro
65707580
GluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnTyrSerSerThrProTyr
859095
ThrPheGly GlyGlyThrLys ValGlulieLys
100105
<210>20
<211>107
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Gln
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Gly
Tyr
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1510
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<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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Gly Tyr Asn Phe Ser His Phe Gly Leu Asn
1510
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<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH/CDR1 <400>135
Gly Tyr Asp Phe Thr His Phe Gly Leu Asn
1510
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<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>VH/CDR2 <400>136
Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala His Glu Phe Thr
151015
Arg
<210>137 <211>17 <212>PRT <213>人工序列 <220>
<223>VH/CDR2 <400>137[3222]Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Thr151015Arg<210>138<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>138Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Glu Phe Thr151015Arg<210>139<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>139Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Thr151015Arg<210>140<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>140Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Val Pro Glu Phe Lys151015Arg<210>141<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2
115[3261]<400>141Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Asp Phe Lys151015Arg<210>142<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>142Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Glu Phe Lys151015Arg<210>143<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>143Trp lie Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Pro Asp Phe Lys151015Arg<210>144<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>144Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Gln Asp Phe Lys151015Arg<210>145<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
116[3300]<223>VH/CDR2<400>145Trp lie Asn Thr Asn Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe Lys151015Arg<210>146<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>146Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Val Pro Glu Phe Lys151015Arg<210>147<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>147Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Gln Glu Phe Lys151015Arg<210>148<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>148Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Gln Glu Phe Lys151015Arg<210>149<211>17<212>PRT<213>人工序列[3340]<223>VH/CDR2<400>149Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Glu Phe Lys151015Arg<210>150<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>150Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Asp Phe Lys151015Arg<210>151<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>151Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Glu Phe Lys151015Arg<210>152<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>152Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe Lys151015Arg<210>153<211>17<212>PRT
118[3378]<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>153Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Pro Asp Phe Thr151015Arg<210>154<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>154Trp lie Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Pro Asp Phe Lys151015Arg<210>155<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>155Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Pro Glu Phe Lys151015Arg<210>156<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH/CDR2<400>156Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Glu Phe Lys151015Arg
權(quán)利要求
特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其由SEQ IDNO28的氨基酸序列組成。
2.特異性結(jié)合人VEGF的單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其由SEQIDN0:106的氨基酸 序列組成。
3.特異性結(jié)合人VEGF且具有輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，其中所述輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域包括分別由SEQ ID NO 172, SEQ ID N0:195和SEQ IDNO :212的氨基酸序列組成的CDR1， CDR2 和 CDR3 區(qū)。
4.特異性結(jié)合人VEGF且具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，其中所述重鏈可變結(jié)構(gòu) 域包括分別由SEQ ID NO 131, SEQ ID N0:152和SEQ IDNO :327的氨基酸序列組成的CDR1， CDR2 和 CDR3 區(qū)。
5.特異性結(jié)合人VEGF且具有VL的單克隆抗體，其中所述VL包括分別由SEQID NO 170，SEQ ID NO : 195 禾口 SEQ ID NO 214 的氨基酸序列組成的 CDR1, CDR2 和 CDR3 區(qū)。
6.特異性結(jié)合人VEGF且具有VL的單克隆抗體，其中所述VL包括分別由SEQID NO 182，SEQ ID NO 201 和 SEQ ID NO 222 的氨基酸序列組成的 CDR1, CDR2 和 CDR3 區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明提供在計(jì)算機(jī)上和在體外設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對人抗原的抗體的方法。在一些具體實(shí)施方案中，提供設(shè)計(jì)和選擇具有高親和力和特異性的針對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的人源化或完全人抗體的方法。在本發(fā)明的另一個方面，提供針對VEGF的單克隆抗體。具體而言，提供人源化或人抗-VEGF單克隆抗體，其具有以高親和力結(jié)合人VEGF，體外抑制VEGF-誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和體內(nèi)抑制VEGF-誘導(dǎo)的血管發(fā)生的能力?？梢詫⑦@些抗體及其衍生物用在廣泛應(yīng)用中，諸如診斷、預(yù)防和治療疾病諸如癌癥、AMD、糖尿病性視網(wǎng)膜病和其他來自病理性血管發(fā)生的疾病。
文檔編號C07K16/00GK101899113SQ20091026214
公開日2010年12月1日 申請日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者凱文·C·王, 李艷, 羅培志, 鐘蘋羽, 馬克·赫斯荷 申請人:埃博馬可西斯公司