專利名稱：：一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5融合和非融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5融合和非融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
：全世界每年約有500萬人死于腫瘤。早在20世紀(jì)70年代，folkman就提出，腫瘤生長(zhǎng)是血管依賴性的。血管的生長(zhǎng)有兩個(gè)明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長(zhǎng)階段到有血管的快速生長(zhǎng)階段。血管的生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，是促成上述轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。血管的生成主要依賴血管生成刺激因子和抑制因子的調(diào)節(jié)。在腫瘤治療領(lǐng)域抑制占主導(dǎo)地位的是直接殺傷腫瘤細(xì)胞的策略，即先進(jìn)行腫瘤切除手術(shù)或通過放療使原發(fā)瘤消退，再進(jìn)行放化療，以消除體內(nèi)殘留的癌細(xì)胞。這種策略的缺點(diǎn)是特異性不高，對(duì)病人的副作用太大，甚至有時(shí)治療手段可以加速病人的死亡，而且癌細(xì)胞反復(fù)暴露于化療下會(huì)產(chǎn)生抗藥性，嚴(yán)重影響治療效果，所以很多腫瘤專家的注意力從腫瘤細(xì)胞本身轉(zhuǎn)移到總體腫瘤組織，尤其是血管生成過程。以腫瘤組織的血管為耙目標(biāo)與直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞本身相比有兩個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)首先，由于許多固體瘤(或許還有某些白血病)是血管生成依賴的，因而這種方法不必為某種特定的腫瘤而制定特定的治療方案。其次，抗血管生成藥物只是阻止新生血管的生長(zhǎng)，不攻擊健康血管，理論上對(duì)正常血管無害并且不產(chǎn)生抗藥性。正常成年人體內(nèi)新生血管的生成處于相對(duì)靜息的狀態(tài)，只有0.01%左右的內(nèi)皮細(xì)胞處于分裂期，而腫瘤血管處于分裂周期的內(nèi)皮細(xì)胞比例要高出2一3個(gè)數(shù)量級(jí)，因此，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖對(duì)正常組織影響非常小。人纖維蛋白溶酶原是一種血管生成抑制因子，由790個(gè)氨基酸殘基組成，分子量92X103。它是一種含有5個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域和一個(gè)絲氨酸蛋白酶去的分泌性糖蛋白，每個(gè)環(huán)由76—80個(gè)氨基酸組成，K5環(huán)即其中的一個(gè)環(huán)，其分子量大小14大約為92kD。有人從荷瘤的小鼠尿液和血清中分離到血管抑素，它與人纖維蛋白溶酶原Kringle1-4區(qū)有高度的同源性。隨后有實(shí)驗(yàn)證明血管抑素能特異性的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，也可以抑制原發(fā)瘤以及轉(zhuǎn)移瘤組織中的血管生成1996年Cao等人比較了血管抑素中各個(gè)Kringle區(qū)的抗血管增生活性，發(fā)現(xiàn)每個(gè)獨(dú)立的ringle片段都能不同程度地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而且單獨(dú)的k5片段抗血管活性更強(qiáng)，它是目前所知道的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移最有效的纖維蛋白溶酶原片段。Kl，K2，K3具有抑制活性而k4具有低的抑制活性，Kl和k3的抑制活性又要強(qiáng)于k2。有意思的是，在研究K2-K3片段活性時(shí)，其活性要比K2強(qiáng)而弱于K3.當(dāng)把K2、K3同時(shí)作用于內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)其抑制活性明顯升高。纖維蛋白溶酶原不能自發(fā)地發(fā)揮作用，需要有纖溶酶原激活劑(PA)的激活。它們共同組成一個(gè)所謂的纖溶系統(tǒng)。體內(nèi)PA主要是組織型PA(tissue-typePA)簡(jiǎn)稱t-PA.此外還有尿激酶型PA(簡(jiǎn)稱u-PA),雙鏈u-PA，即為尿激酶(urokinase)。它們也都是糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶類。人t-PA，相對(duì)分子量為70X103，含527個(gè)殘基，分子由5個(gè)結(jié)構(gòu)域指形區(qū)，生長(zhǎng)因子區(qū)，兩個(gè)環(huán)餅區(qū)和一個(gè)絲氨酸蛋白酶區(qū)組成。纖維蛋白溶酶原經(jīng)PA，如t-PA作用，斷去部分肽鏈轉(zhuǎn)變成纖維蛋白溶酶。纖維蛋白溶酶專門斷裂血纖蛋白棒狀連接區(qū)中的肽鏈，此酶能通過水性通道進(jìn)入血纖蛋白凝塊內(nèi)部，以接近其中的棒狀連接區(qū)。編碼t-PA的基因已被克隆并在培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞中表達(dá)。重組DNA方法長(zhǎng)生的t-PA已在臨床上得到應(yīng)用。采用靜脈注射t-PA方法lh內(nèi)形成的冠狀動(dòng)脈血栓，可被溶開，明顯地提高心肌梗塞病人的存活率。完整的Kringle結(jié)構(gòu)對(duì)纖維蛋白原水解片段抗血管增生能力有重大影響。有研究證實(shí)破壞血管抑素Kringle環(huán)之間和環(huán)內(nèi)部的二硫鍵能顯著降低其抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。但是對(duì)K5的Kringle結(jié)構(gòu)研究則有不同的看法。用還原和垸基化處理的K5比K5本身具有更強(qiáng)的抗內(nèi)皮細(xì)胞增生能力。其原因可能是Kringle結(jié)構(gòu)"掩蓋"了K5中某些功能性基團(tuán)與內(nèi)皮細(xì)胞的有效作用。另外，K5還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，它可以使內(nèi)皮細(xì)胞分裂周期停止和促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡。K5是通過調(diào)節(jié)血管生成的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用的。K5可使血管壁細(xì)胞和和15視網(wǎng)膜中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子減少，還可使血管生成抑制因子色素表皮生長(zhǎng)因子增多，且存在劑量依賴關(guān)系。內(nèi)源性的血管生成刺激因子的下調(diào)和血管生成抑制因子的上調(diào)，引起血管生成平衡失調(diào)，可能是k5抑制血管活性的機(jī)制。因?yàn)镵5具有強(qiáng)的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生的活力，且它的氨基酸序列較短，被認(rèn)為在治療腫瘤疾病中有較大的應(yīng)用潛力。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)，根據(jù)已報(bào)道的K5的氨基酸殘基序列和大腸桿菌遺傳密碼的偏愛性，可人工合成纖維蛋白溶酶原K5全基因。運(yùn)用基因工程相關(guān)原理，K5基因在大腸桿菌中的表達(dá)是有可能實(shí)現(xiàn)的。但是實(shí)現(xiàn)K5的大批量生產(chǎn)會(huì)遇到一些難題，比如怎樣實(shí)現(xiàn)它的高效表達(dá)，怎樣實(shí)現(xiàn)其發(fā)酵條件的優(yōu)化以及K5的分離純化技術(shù)的優(yōu)化。K5基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)可為K5的活性機(jī)理研究和新型抗血管生成藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5融合和非融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法，進(jìn)行了目的序列擴(kuò)增，成功連接于載體并導(dǎo)入細(xì)胞，雙酶切鑒定確認(rèn)。小型發(fā)酵誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE鑒定確認(rèn)，Kringle5蛋白以包涵體形式存在。獲得腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子K(5)基因的克隆產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物及其工程菌。成功構(gòu)建pET28a(+)-K5基因的非融合表達(dá)載體。為K5基因在大腸桿菌中的非融合表達(dá)的研究奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明技術(shù)解決方案如下一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法，其特殊之處是包含以下步驟l]、ThioA/L15/7和E.coliPET32(載體)質(zhì)粒DNA的制備(1)質(zhì)粒提取試劑溶液I:每瓶約100毫升，含50認(rèn)ol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCL(PH8.0)，10mmol/LEDTA(PH8.0，)在6.895*104Pa滅菌15min，儲(chǔ)存于4。C;溶液Ih0.2mol/LNa0H(臨用前貯存液現(xiàn)用現(xiàn)配)1%SDS;溶液III:配成100ml含5mol/Lkac60ml冰醋酸，11.5ml，水28.5ml;溶液I，溶液III于150kg/cm2，滅菌20分鐘；以上試劑均為國產(chǎn)分析純；(2)操作在超凈工作臺(tái)中將2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基加入到容量為l5ml試管中，接入ThioA/L15/7單菌落，于37。C劇烈振搖下培養(yǎng)過夜，吸取l.5ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g離心30秒，吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥，剩余貯存于4"C。含有l(wèi)0Oug/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基在上述沉淀中加入100ul用冰預(yù)冷的溶液I，劇烈振蕩使沉淀完全分散；在加入20Oul新配制的溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混勻內(nèi)容物，將離心管置于冰上；在加入l50ul用冰預(yù)冷的溶液ni，蓋緊管口，溫和振蕩io秒，使溶液m在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后置于冰上5min，加入RNAase3ul，于60。C水浴20min,12000g離心5min，將上清轉(zhuǎn)入另一加入200ul苯酚和200ul24:1的氯仿/異戊醇溶液的離心管中，振蕩混合使雙鏈DNA沉淀，室溫下放置2min，在于12000g離心3min，吸取上清液于另一離心管中，用800ul純乙醇洗滌雙鏈DNA，搖勻，在冰箱冷凍區(qū)靜置兩小時(shí)，12000g離心5min,除去上清，貼壁緩慢加入70%冰預(yù)冷的乙醇，12000g離心5min，盡量除去上清放置于37。C烘箱烘干，用25ul無菌水重新溶解核酸，振蕩搖勻，取5ul做P/o瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余儲(chǔ)存于-2(TC;載體pET32a質(zhì)粒DNA制備同上；2]、目的基因Kringle5的PCR:(1)試劑引物序列上游引物5，GCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG3，NcoI25bp下游引物3，GGAATTCTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，EcoRI28bpTaq-DNApolyase是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有依賴于聚合作用的5'^3'外切核酸酶活性，最佳作用溫度為75'C—80'C，需要在低于最適溫度的條件下起始聚合反應(yīng)，以免引物從模板上解離，Taq-DNApolyase作用時(shí)需要Mg2+.由于引物模板雜交體的解鏈和退火溫度受二價(jià)陽離子的影響，需考慮擴(kuò)增反應(yīng)的最佳Mg2+濃度。磷酸鹽緩沖液抑制Taq-DNApolyase活性，擴(kuò)增反應(yīng)通常在Tris緩沖液中進(jìn)行，該緩沖液在室溫下pH為8.3;(2)操作200ul離心管中加入10XBuffer5ul，dNTP4ul，引物P12ul，P22ul，模板質(zhì)粒2ul,Taq-DNApolyase0.5ul，無菌水34.5ul，使反應(yīng)體系總體積為50ul，最后用少量液體石蠟密封，在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)；PCR參數(shù)為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>取5ulPCR反應(yīng)產(chǎn)物和lulmarker進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定產(chǎn)物大小。3]、PCR產(chǎn)物的抽提純化(1)試劑TE(Ph二8.0):10腿ol/LTris-Hcl(PH=8.0)+lmmol/LEDTA(PH=8.0)(2)操作將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，加入TE(PH8.0)補(bǔ)足140ul，加入苯酚和24:1的氯仿/異戊醇溶液各70ul，振搖，于15000g離心10min，取上清并向其中加入24:1的氯仿/異戊醇溶液140ul，振搖，于15000g離心10min，取上清并向其中加入14ul3MNaAc及420ul(3倍體積)無水乙醇，在-70°C冰箱中靜置2小時(shí)，取出后于15000g離心15min。加入lml70%乙醇洗滌，于15000g離心15min，放入烘箱干燥，取5ul進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。4]、雙酶切PCR產(chǎn)物以及載體質(zhì)粒DNA:(1)試劑NcoI酶切位點(diǎn)5，..CTCATGG..3，3，..GGTACAC..5，熱失活性65。C，20minEcoRI酶切位點(diǎn)5，..GTAATTC..3，3，..CTTAAAG..3，熱失活性65°C，20min(2)操作向離心管中加入lOXBuffer2ul,0.1%BSA2ul，PCR產(chǎn)物14ul,NcoII.2ul,EcoRI0.8ul，總反應(yīng)體積為20ul，向離心管中加入lOXBuffer2ul，0.1%BSA2ul，載體質(zhì)粒DNA12ul，NcoII.2ul，EcoRI0.8ul，無菌水2ul，總反應(yīng)體積為20ul，將上述兩離心管于36°C士水浴過夜，將酶切產(chǎn)物全部進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳；5]、DNA凝膠回收(1)試劑DNA凝膠回收試劑盒包括DE-A:凝膠融化劑(含DNA保護(hù)劑)DE-B:高離液序列溶液(使大于lOObp的DNA片段選擇性的結(jié)合到DNA制備Wl:洗滌液W2:洗滌液洗脫液2.5mMTris-Hcl，Ph=8.5(2)操作首先紫外燈下切下含有目的DNA的凝膠，用紙巾吸干并切碎，腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子K(5)DNA凝膠重0.08g,載體DNA凝膠重0.llg，分別作為一個(gè)凝膠體積.分別向其中加入5個(gè)凝膠體積的DE-A溶液，混和均勻后于75'C加熱，間斷混合,直至凝膠完全融化.加入0.5個(gè)DE-A體積的DE-B溶液，混合均勻，由于腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子K(5)DNA分子量為300bp，向其中再加入異丙醇至終濃度為20%.分別吸取上述混合物，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，放置于2ml離心管中，于3600rpm離心1min,如有殘留，提速再離心1min，棄濾液。將制備管置回離心管，19加0.5mlWl溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。重復(fù)一次將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液,3600rpm離心30s，棄濾液。將制備管置回離心管，最高速離心lmin。將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25ul洗脫液，室溫靜置lmin。最高速離心lmin洗脫DNA，分別得到目的基因Kringle5的雙酶切片段和載體pET32a的雙酶切片段；6]、制備重組載體pET32/kringle5(1)試劑T4ligase可催化雙鏈DNA或RNA中的5'-磷酸和3，-羥基間形成磷酸二酯鍵，可連接兩個(gè)平末端，可修復(fù)dsDNA,dsRNA，RNA/DNA的缺刻。熱失活性65。C，10min，(2)操作10XBufferlul，Kringle5的雙酶切片段4ul，載體pET32a的雙酶切片段2ul，T4ligaselul,H202ul.總反應(yīng)體積為10ul.16'C恒溫過夜酶連;7]、感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)試劑0.2mol/LCacl2溶液0.1mol/LCaCl廠甘油溶液25%甘油+0.1MCaCl2(2)操作從37-C培養(yǎng)16-20小時(shí)的BL21新鮮平板上挑取一個(gè)直徑2-3mm的單菌落，轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有50ml培養(yǎng)基的1升燒瓶中，37°C300轉(zhuǎn)/min振蕩3小時(shí)，在超凈臺(tái)中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，繼續(xù)在冰上放置10分鐘。于4。C4000rpm離心10min回收細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘使殘留培養(yǎng)液流盡，用10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCacl2重懸沉淀，放置于冰上，于4。C4000rpm離心10min，倒出培養(yǎng)液，倒置1min，使殘留培養(yǎng)液流盡。每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2-甘油重懸每份細(xì)胞沉淀，將此溶液分成200ul/每管，若做轉(zhuǎn)化，直接使用，若保存，則每管中加入7ulDMS0(二甲基亞砜)，冰上放置15min，加7ulDMSO，直接放置于-7(TC冰箱中，或直接加水于-7(TC保存；208]、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化從-7(TC冰箱中取出一管200ul的感受態(tài)細(xì)胞BL21，手中握化放置到冰上，每管中加入2ml重組載體pET32/kringle5，輕輕旋轉(zhuǎn)，在冰上放置30mim，將管放到42。C水浴中慢慢振搖90s,快速轉(zhuǎn)至冰浴中冷卻2min，另取5ml小試管，每管加500ul未加抗生素的LB培養(yǎng)基，用水浴加溫至37"C,將上面已經(jīng)轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞BL21加入其中，放置于37'C搖床上220rpm以下溫浴45分鐘，使轉(zhuǎn)化了的BL21復(fù)蘇并且表達(dá)重組載體pET32/kringle5氨卞抗性標(biāo)記基因，將上述lml溫浴的培養(yǎng)液5000rpm離心5分鐘，吸去上面的500ul，下面的200ul用于鋪板，在超凈工作臺(tái)上，將此200ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到事先放于37'C烘箱中含有100ug/ml氨卞的LB瓊脂培養(yǎng)基上，平板倒置于37'C下培養(yǎng)14小時(shí)左右可出現(xiàn)菌落；9]、小型發(fā)酵及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(1)試劑誘導(dǎo)劑IPTG，0.1MTris-HCl(PH8.0)，lmg/ml溶菌酶SDS-PAGE的制備分離膠現(xiàn)配成5ml其中H201.434ml，30。/。丙烯酰胺2.166ml，1.5mol/LTris(Ph8.8)1.3ml，腦SDS0.05ml,10%(NH》2S2O80.05ml，TEMED(凝固劑)O.002ml.濃縮膠現(xiàn)配成2ml其中H201.434ml，30呢丙烯酰胺0.33ml，1.Omol/LTris(Ph6.5)0.25ml，10%SDS0.02ml，10%(NH4)2S2080.02ml，TEMED(凝固劑)O.002ml.(2)操作挑取上述轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)出的單菌落至含有7ml培養(yǎng)液的試管中，37°C300rpm振蕩過夜，吸取200ul培養(yǎng)物以1:30接種于含100ug/ml氨卞的LB培養(yǎng)基中，37°C300rpm振蕩3小時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為lmmol/ml，再于37°C300rpm振蕩3小時(shí)，取1.5mli秀導(dǎo)菌，離心收集菌體，用200ul0.1MTris-HC1艦O)重懸菌體并洗滌，于5000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入100ul0.lMTris-HCl(ra8.0)重懸菌體，再加入50ullmg/ml溶菌酶，于-7(TC冰箱放置半小時(shí)，37"C水浴521分鐘，再放入-7(TC冰箱5分鐘，反復(fù)凍融五次后，于12000rpm離心10分鐘，收集上清(為細(xì)胞質(zhì)部分)，沉淀為包涵體部分，上清與沉淀以及未加誘導(dǎo)的對(duì)照菌體分別做SDS-PAGE，染色，脫色，成像；10]、培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定挑取轉(zhuǎn)化后的BL21單菌落于2ml含有l(wèi)00ug/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基中，按照1.2.1提取質(zhì)粒，按照1.2.4進(jìn)行雙酶切后，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5非融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法，其特殊之處是包含以下步驟l]、根據(jù)K5基因全序列設(shè)計(jì)其編碼區(qū)的上下游引物，引物中設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基，上游引物為5，CATGCCATGGCAGCTCCCGGATGTAG3，下劃線部分為yVco/酶切位點(diǎn)，下游引物為5，CCCAAGCTTTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，下劃線部分為歷/7rfffl酶切位點(diǎn)，引物為上海生物工程有限公司合成。2]、K5基因的TD-PCR擴(kuò)增TD-PCR反應(yīng)體系Volume10XBuffer514d證(10mM)414MgCl2314引物各2模板(cDNA)0.5WTaq酶1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>3]、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳(1)制膠稱取0.40g的瓊脂糖，置專用三角瓶，加入50ml的蒸餾水，加熱至沸騰；待冷卻后，加入少許溴化乙錠貯存液，混勻后倒入事先插好梳子的電泳槽中，待其冷卻凝固后加入適量的電泳緩沖液，小心取出梳子。(加樣孔的一端靠近陰極。)小心操作，千萬不要讓溴化乙錠接觸自己或污染環(huán)境。(2)上樣用微量移液槍吸取10x的loadingbuffer3rt,置于標(biāo)簽紙背面，再吸取PCR產(chǎn)物6W，混勻之后加入到加樣孔中。在旁邊的加樣孔中加入DNAMarker做14cycks72。C7min延伸對(duì)照。注意槍頭不要戳破凝膠。(3)電泳接通電泳池的電源調(diào)節(jié)電壓至100v，待樣品完全進(jìn)入凝膠中調(diào)節(jié)電壓為80v進(jìn)行電泳。根據(jù)電泳檢測(cè)的需要，待溴酚藍(lán)指示劑泳至適當(dāng)位置后調(diào)小并切斷電源。(4)分析:在凝膠成像儀下觀察。4]、pET28a+質(zhì)粒DNA的小量制備(1)試劑溶液I:每瓶(100ml)含50rranol/L的葡萄糖，25mmol/L的Tris-HCL(PH8.0)10咖ol/LEDTA(pH8.0)，6.895X104Pa滅菌15分鐘后存儲(chǔ)于4°C，溶液II:0.2mmol/LNa0H，1%SDS.(現(xiàn)用現(xiàn)配)，溶液III:配成100ml含5mol/Lkac60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml，6.895X104Pa滅菌20分鐘后存儲(chǔ)于4°C。以上試劑均為國產(chǎn)分析純(2)操作在無菌操作臺(tái)中將3ml含有l(wèi)OOPg/mlAmp的LB培養(yǎng)基加入到容量為15ml的試管中，接入pET28a+菌液3014，于37"C激烈振蕩培養(yǎng)過夜。吸取1.5ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g離心30秒，吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥，剩余培養(yǎng)物貯存于4"C，在含有沉淀的試管中加入的溶液I(預(yù)冷)，劇烈振蕩使沉淀完全分散；再加入20(^l新配制的溶液n，蓋緊管口，快速顛倒5次，以混勻內(nèi)容物，將離心管置于冰上；再加入預(yù)冷的溶液in，蓋緊管口，溫和振蕩10秒使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻之后置于冰上5分鐘加入Rnase于6(TC水浴20分鐘，12000g離心5分鐘,將上清轉(zhuǎn)入另一加有20014苯酚和200W24:1的氯仿/異戊醇溶液的離心管中，振蕩混合是雙鏈DNA沉淀，室溫下放置2分鐘，在12000g離心3分鐘。小心吸取上清液于另一離心管中，用80014純乙醇洗滌雙鏈DNA，70%的冰預(yù)冷的乙醇，12000g離心5min，盡量除去上清放置于37。C烘箱烘干，用2514無菌水重新溶解核酸，振蕩搖勻，取5!4做1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余儲(chǔ)存于-20'C;5]、雙酶切PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒DNA反應(yīng)體系:VolumeNocI1^1HindIII1)410XMBufferDNA或PCR產(chǎn)物歸l無菌水upto酶切溫度為37-C，時(shí)間為3.5h。6]、DNA片斷的瓊脂糖凝膠檢測(cè)以及膠回收。(1)試劑(DNA凝膠回收試劑盒)BufferDE-A:凝膠融化劑(含DNA保護(hù)劑)BufferDE-B:DNA結(jié)合溶液BufferWl:洗滌液BufferW2:脫鹽液(使用前按試劑瓶上指定體積加入無水乙醇)Eluent:2.5mMTris-HCl，PH8.5，DNA洗脫溶液(2)操作(2.1)首先在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用至今錫金凝膠表面液體。盡量減小凝膠體積，大體積的凝膠塊需切成小塊，以縮短步驟4中凝膠融化的時(shí)間。(2.2)稱量凝膠重量，以lmg^yl換算凝膠體積。根據(jù)凝膠濃度，按表所提供的參數(shù)加BufferDE-A:凝膠濃度BufferDE—A體積■1.0%3個(gè)凝膠體積本實(shí)驗(yàn)需要回收的是雙酶切pET28a+和K5片段，使用的膠都是0.8%，所以加人3個(gè)凝膠體積的BufferDE—A。(2.3)懸浮均勻后于75。C加熱，每隔2—3分鐘混合一次，直至凝膠塊完全融化(約6—8分鐘)。(2.4)按BufferDE—A體積的50%加入BufferDE—B混合均勻。當(dāng)回收的DNA片段小于500bp時(shí)，添加異丙醇，使異丙醇的終濃度為20%。(2.5)將DNA-pr印Tube置于2mlMicrofugeTube中，將步驟5中的混合液移入DNA-pr印Tube中，5500rpm離心1分鐘。(2.6)棄濾液，將DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入500ul已加無水乙醇的BufferWl，5500rpm離心1分鐘(2.7)棄濾液，將DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入700ul已加無水乙醇的BufferW2，5500rpm離心1分鐘，以同樣的方法再用700ulBufferW2洗滌一次。(2.8)將DNA-pr印Tube置于1.5ml離心管中，12000Xg離心1分鐘。(2.9)將DNA-pr印Tube置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在silica膜中央加入25—30ulEluent或去離子水，室溫靜置1分鐘。12000Xg離心1分鐘洗脫腿。7]、重組載體pET28a+/K5的制備反應(yīng)體系入下表Volume回收的pET28a+質(zhì)粒10Pi回收K5片段5W10XT4DNALigaseBuffer2Pi10XT4DNALigase1.514無菌水upto25Pi16卩保溫過夜，一2(TC保存?zhèn)溆茫?]、感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)試劑-(1.1)CaCl2溶液(冰冷)0.lmol/LCaCl2溶液，使用一次性濾器過濾除菌后，-4X:冰箱存儲(chǔ)備用，(1.2)0.lmol/ECaCl2甘油溶液25%的甘油+0.lMCaCL2。使用一次性濾器過濾除菌后，-4匸冰箱保存?zhèn)溆?2)操作(2.1)無菌條件下接種大腸桿菌BL21菌株單菌落入5mlLB液體培養(yǎng)基中，37r培養(yǎng)過夜。第二天，倒入250ml的LB液體培養(yǎng)基中，37〔振蕩3.5h-4,0h(600=0.40.6)，停止培養(yǎng)，(2.2)將培養(yǎng)液分裝到8個(gè)25ml預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上置5_10分鐘，然后4。C,8000rmp離心8min，(2.3)細(xì)胞沉淀用10ml冰冷的CaC12溶液重懸，4°C6000rmp離心5分鐘，(2.4))棄上清后，加入10ml冰冷的CaC12溶液重懸細(xì)胞，冰浴半小時(shí)后，4。C，6000rmp離心5分鐘，(2.5)棄上清后，加入2ml冰冷的CaC12溶液重懸細(xì)胞，按每管200ul量分裝于預(yù)冷的0.5ml離心管中，立即凍存于-75匸冰柜中備用，9]、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及保存(1)將10uL連接產(chǎn)物加到200uL感受態(tài)細(xì)胞懸液中，混勻，冰浴30-40分鐘，42'C水浴保溫90秒，立即置冰上l-2分鐘，然后轉(zhuǎn)移到加有抗生素氨芐的培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)照培養(yǎng)，(2)將轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基，進(jìn)行純化擴(kuò)增培養(yǎng)，37。C劇烈振搖過夜。吸取過夜搖床培養(yǎng)的培養(yǎng)物500ul加入1.5ml的離心管中，再加40%的甘油500ul混合均勻后于-20或-7(TC保藏，定期進(jìn)行活化重保藏，以防菌種退化或質(zhì)粒丟失。10]、重組質(zhì)粒的提取方法同前，11]、重組質(zhì)粒的PCR檢測(cè)27檢測(cè)觀察。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為進(jìn)行了目的序列擴(kuò)增，成功連接于載體并導(dǎo)入細(xì)胞，雙酶切鑒定確認(rèn)。小型發(fā)酵誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE鑒定確認(rèn)，Kringle5蛋白以包涵體形式存在。獲得腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子K(5)基因的克隆產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物及其工程菌。成功構(gòu)建pET28a(+)-K5基因的非融合表達(dá)載體。為K5基因在大腸桿菌中的非融合表達(dá)的研究奠定了基礎(chǔ)。圖1為纖維蛋白溶酶原結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法流程圖。圖3為一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5非融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法流程圖。圖4為ThioA/L15/7和E.coliPET32a載體。圖5為蛋白Kringle5帶。圖6為片斷PCR擴(kuò)增電泳圖譜，其中CR產(chǎn)物，2為DNAMarker，3為PCR產(chǎn)物。圖7為質(zhì)粒中的目的片斷的PCR鑒定電泳圖譜，泳道1和泳道3是PCR產(chǎn)物，泳道2為DNAMarker，從上到下依次為2000bp,1000bp，750bp,500bp,250bp,100bp。具體實(shí)施例方式一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法(1.)目的構(gòu)建angiostatinK5cDNA表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入大腸桿菌中，提取后酶切鑒定。小型發(fā)酵誘導(dǎo)感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)K5基因，SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物K5。(2.)方法angiostatinK5cDNA在ThioA/L15/7菌株的質(zhì)粒中，質(zhì)粒提取后進(jìn)行目的序列PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物提純后雙酶切，然后將目的基因連接于載體pET32a，重組載體pET32a/kringle5導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，最終雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。小型發(fā)酵，用IPTG誘導(dǎo)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞BL21表達(dá)K5基因，溶菌酶破碎菌體后SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物K5蛋白。(3.)結(jié)果進(jìn)行了目的序列擴(kuò)增，成功連接于載體并導(dǎo)入細(xì)胞，雙酶切鑒定確認(rèn)。小型發(fā)酵誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE鑒定確認(rèn)，Kringle5蛋白以包涵體形式存在。(4.)結(jié)論獲得腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子K(5)基因的克隆產(chǎn)物，表達(dá)產(chǎn)物及其工程菌。1.1材料1.1.1菌株和質(zhì)粒菌株E.coliBL21載體pET32a質(zhì)粒目的基因-Kringle-5ofAngiostatin均由本實(shí)驗(yàn)中心保藏，提供。Kringle5蛋白序列CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQ隠AQEP臓SIFTPENPRAGLE證CRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQC1.1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10酵母提取物5克氯化鈉10克加水至1000毫升，150kg/cm2，滅菌20分鐘瓊脂培養(yǎng)基胰蛋白胨10克酵母提取物5克氯化鈉10克瓊脂粉15克加水至1000毫升，150kg/cm2，滅菌20分鐘1.1.3DNA凝膠回收試劑盒DNAgelextractionkit杭州維特潔生化技術(shù)有限公司1.1.4酶切與酶連接試劑NcoI&EcoRIT4ligase寶生物工程(大連)有限公司1.1.5儀器離心機(jī)GTL-16AL高速臺(tái)式離心機(jī)南京大學(xué)研制江蘇省興化市分析儀器廠生產(chǎn)離心機(jī)AvantiJ-25高速冷凍離心機(jī)Beckman公司生產(chǎn)PCR擴(kuò)增儀T-GmdientThermoblock德國Biometra公司生產(chǎn)凝膠成像系統(tǒng)1.2方法1.2.1ThioA/L15/7和E.coliPET32(載體)質(zhì)粒DNA的制備(1)質(zhì)粒提取試劑溶液I:每瓶約100毫升，含50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCL(PH8.0),10聽1/LEDTA(PH8.0，)在6.895*104Pa滅菌15min，儲(chǔ)存于4。C溶液II:0.2mol/LNa0H(臨用前貯存液現(xiàn)用現(xiàn)配)1%SDS溶液ni:配成100ml含5mol/Lkac60ml冰醋酸，11.5ml，水28.5ml溶液I，溶液III于150kg/cm2，滅菌20分鐘(以上試劑均為國產(chǎn)分析純)(2)操作在超凈工作臺(tái)中將2ml含有l(wèi)0Qug/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基加入到容量為15ml試管中，接入ThioA/L15/7單菌落，于37。C劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。吸取l.5ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g離心30秒，吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥，剩余貯存于4。C。含有l(wèi)00ug/ml氨卞抗生素的LBi肯養(yǎng)基在上述沉淀中加入100ul用冰預(yù)冷的溶液I，劇烈振蕩使沉淀完全分散；在加入20Oul新配制的溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混勻內(nèi)容物，將離心管置于冰上；在加入l50ul用冰預(yù)冷的溶液m，蓋緊管口，溫和振蕩l0秒，使溶液m在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后置于冰上5min，加入RNAase3ul，于60。C水浴20min，12000g離心5min，將上清轉(zhuǎn)入另一加入200ul苯酚和200ul24:1的氯仿/異戊醇溶液的離心管中，振蕩混合使雙鏈DNA沉淀，室溫下放置2min，在于12000g離心3min。小心吸取上清液于另一離心管中。用800ul純乙醇洗滌雙鏈DNA，搖勻，在冰箱冷凍區(qū)靜置兩小時(shí)，12000g離心5min，除去上清，貼壁緩慢加入70%冰預(yù)冷的乙醇，函Og離心5min，盡量除去上清放置于37'C烘箱烘干，用25ul無菌水重新溶解核酸，振蕩搖勻，取5ul做iy。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余儲(chǔ)存于-2(TC。載體pET32a質(zhì)粒DNA制備同上。1.2.2目的基因Kringle5的PCR:(1)試劑引物序列上游引物5，GCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG3，Ncol25bp下游引物3，GGAATTCTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，EcoRI28bpTaq-DNApolyase是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有依賴于聚合作用的5，+3，外切核酸酶活性。最佳作用溫度為75。C--80°C，需要在低于最適溫度的條件下起始聚合反應(yīng)，以免引物從模板上解離。Taq-DNApolyase作用時(shí)需要M^.由于引物模板雜交體的解鏈和退火溫度受二價(jià)陽離子的影響，需考慮擴(kuò)增反應(yīng)的最佳Mg2+濃度。磷酸鹽緩沖液抑制Taq-DNApolyase活性，擴(kuò)增反應(yīng)通常在Tris緩沖液中進(jìn)行，該緩沖液在室溫下pH為8.3。(2)操作200ul離心管中加入lOXBuffer5ul，dNTP4ul,引物P12ul，P22ul，模板質(zhì)粒2ul，Taq-DNApolyase0.5ul，無菌水34.5ul，使反應(yīng)體系總體積為50ul，最后用少量液體石蠟密封，在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。PCR參數(shù)為:95°C300s55°C120s72°C180s3130次循95°C30s55。C30s72°C60s，V95°C60s55°C120s72°C420s4°Cw取5ulPCR反應(yīng)產(chǎn)物和lulmarker進(jìn)行2。/。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定產(chǎn)物大小。1.2.3PCR產(chǎn)物的抽提純化(1)試劑TE(Ph=8.0):lOmmol/LTris-Hcl(PH二8.0)+lmmol/LEDTA(PH=8.0)(2)操作將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，加入TE(PH8.0)補(bǔ)足140ul。加入苯酚和24:1的氯仿/異戊醇溶液各70ul，振搖。于15000g離心10min。取上清并向其中加入24:1的氯仿/異戊醇溶液140ul，振搖。于15000g離心10min。取上清并向其中加入14ul3MNaAc及420ul(3倍體積)無水乙醇。在-70°C冰箱中靜置2小時(shí)。取出后于15000g離心15min。加入lml70%乙醇洗滌，于15000g離心15min。放入烘箱干燥。取5ul進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.2.4雙酶切PCR產(chǎn)物以及載體質(zhì)粒DNA:(1)試劑NcoI酶切位點(diǎn)5，..CTCATGG..3，3，..GGTACAC..5，熱失活性65。C，20minEcoRI酶切位點(diǎn)5，..G'AATTC..3，3，..CTTAAAG..3，熱失活性65。C，20min32向離心管中加入lOXBuffer2ul,0.1%BSA2ul，PCR產(chǎn)物14ul,NcoI1.2ul，EcoRI0.8ul，總反應(yīng)體積為20ul。向離心管中加入lOXBuffer2ul，0.1%BSA2ul，載體質(zhì)粒DNA12ul，NcoI1.2ul，EcoRI0.8ul,無菌水2ul，總反應(yīng)體積為20ul。將上述兩離心管于36°C土水浴過夜，將酶切產(chǎn)物全部進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。1.2.5DNA凝膠回收(1)試劑DNA凝膠回收試劑盒包括DE-A:凝膠融化劑(含DNA保護(hù)劑)DE-B:高離液序列溶液(使大于lOObp的DNA片段選擇性的結(jié)合到DNA制備膜上)Wl:洗滌液W2:洗滌液洗脫液2.5mMTris-Hcl，Ph二8.5(2)操作首先紫外燈下切下含有目的DNA的凝膠，用紙巾吸干并切碎，腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子K(5)DNA凝膠重O.08g，載體DNA凝膠重O.llg,分別作為一個(gè)凝膠體積.分別向其中加入5個(gè)凝膠體積的DE-A溶液，混和均勻后于75t加熱，間斷混合，直至凝膠完全融化.加入0.5個(gè)DE-A體積的DE-B溶液，混合均勻，由于腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子K(5)DNA分子量為300bp，向其中再加入異丙醇至終濃度為20%.分別吸取上述混合物，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，放置于2ml離心管中，于3600rpm離心lmin,如有殘留，提速再離心lmin，棄濾液。將制備管置回離心管，加0.5mlWl溶液,3600rpm離心30s，棄濾液。將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。重復(fù)一次將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。將制備管置回離心管，最高速離心lmin。將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25ul洗脫液，室溫靜置1min。最高速離心lmin洗脫DNA。分別得到目的基因Kringle5的雙酶切片段和載體pET32a的雙酶切片段。1.2.6制備重組載體pET32/kringle5(1)試劑T41igase可催化雙鏈DNA或RNA中的5，-磷酸和3，-羥基間形成磷酸二酯鍵，可連接兩個(gè)平末端，可修復(fù)dsDNA，dsRNA，RNA/DNA的缺亥lJ。熱失活性65。C，lOmin.(2)操作10XBufferlul，Kringle5的雙酶切片段4ul，載體pET32a的雙酶切片段2ul，T4ligaselul，H202ul.總反應(yīng)體積為10ul.16。C恒溫過夜酶連。1.2.7感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)試劑0.3mol/LCacL溶液0.1mol/LCaCl廠甘油溶液25%甘油+0.1MCaCl2(2)操作從37。C培養(yǎng)16-20小時(shí)的BL21新鮮平板上挑取一個(gè)直徑2-3咖的單菌落，轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有50ml培養(yǎng)基的1升燒瓶中，37°C300轉(zhuǎn)/min振蕩3小時(shí)。在超凈臺(tái)中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，繼續(xù)在冰上放置10分鐘。于4°C4000rpm離心10min回收細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘使殘留培養(yǎng)液流盡。用10ml用冰預(yù)冷的O.1mol/LCacl2重懸沉淀，放置于冰上，于4。C4000rpm離心10min，倒出培養(yǎng)液，倒置1min，使殘留培養(yǎng)液流盡。每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2-甘油重懸每份細(xì)胞沉淀，將此溶液分成200ul/每管。若做轉(zhuǎn)化，直接使用，若保存，則每管中加入7ulDMS0(二甲基亞砜)，冰上放置15min，加7ulDMSO，直接放置于-7(TC冰箱中，或直接加水于-7(TC保存。1.2.8感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化從-7(TC冰箱中取出一管200ul的感受態(tài)細(xì)胞BL21，手中握化放置到冰上。每管中加入2ml重組載體pET32/kringle5，輕輕旋轉(zhuǎn)，在冰上放置30mim。將管放到42t水浴中慢慢振搖90s,快速轉(zhuǎn)至冰浴中冷卻2min。另取5ml小試管，每管加500ul未加抗生素的LB培養(yǎng)基，用水浴加溫至37°C。將上面已經(jīng)轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞BL21加入其中，放置于37'C搖床上220rpm以下溫浴45分鐘，使轉(zhuǎn)化了的BL21復(fù)蘇并且表達(dá)重組載體pET32/kringle5氨卞抗性標(biāo)記基因。將上述lml溫浴的培養(yǎng)液5000rpm離心5分鐘，吸去上面的500ul，下面的200ul用于鋪板，在超凈工作臺(tái)上，將此200ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到事先放于37。C烘箱中含有100ug/ml氨卞的LB瓊脂培養(yǎng)基上，平板倒置于37。C下培養(yǎng)14小時(shí)左右可出現(xiàn)菌落。1.2.9小型發(fā)酵及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(1)試劑誘導(dǎo)劑IPTG，0.lMTris-HCl(PH8.0)，lmg/ml溶菌酶SDS-PAGE的制備分離膠現(xiàn)配成5ml其中H201.434ml，3(m丙烯酰胺2.166ml，1.5mol/LTris(Ph8.8)1.3ml，10%SDS0.05ml，10%(NH4)2S2080.05ml，TEMED(凝固劑)O.002ml.濃縮膠現(xiàn)配成2ml其中H201.434ml，3(F。丙烯酰胺0.33ml，1.Omol/LTris(Ph6.5)0.25ml，10%SDS0.02ml，10%(NH4)2S2080.02ml，TEMED(凝固劑)O.002ml.(2)操作挑取上述轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)出的單菌落至含有7ml培養(yǎng)液的試管中，37°C300rpm振蕩過夜。吸取200ul培養(yǎng)物以1:30接種于含lOOug/ml氨卞的LB培養(yǎng)基中，37°C300rpm振蕩3小時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG,使其終濃度為lmmol/ml，再于37°C300rpm振蕩3小時(shí)。取1.5ml誘導(dǎo)菌，離心收集菌體，用200ul0.1MTris-HCl(PH8.O)重懸菌體并洗滌，于5000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入lOOul0.1MTris-HC1(PH8.0)重懸菌體，再加入50ullmg/ml溶菌酶，于-7(TC冰箱放置半小時(shí)，37"C水浴5分鐘，再放入-7(TC冰箱5分鐘，反復(fù)凍融五次后，于12000rpm離心10分鐘，收集上清(為細(xì)胞質(zhì)部分)，沉淀為包涵體分，上清與沉淀以及未加誘導(dǎo)的對(duì)照菌體分別做SDS-PAGE，染色，脫色，成像。凝膠電泳鑒定挑取轉(zhuǎn)化后的BL21單菌落于2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基中，按照1.2.1提取質(zhì)粒，按照1.2.4進(jìn)行雙酶切后,2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果獲得ThioA/L15/7和E.coliPET32a(載體)質(zhì)粒DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外燈下分別觀察到三條亮帶。圖2為載體目的基因Kringle5的PCR后，取5ulPCR反應(yīng)產(chǎn)物和lulmarker進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外燈下觀察到PCR反應(yīng)產(chǎn)物的亮帶與marker的第四條帶平齊，約為300bp，與資料數(shù)據(jù)相符。PCR產(chǎn)物的抽提純化后，取5111進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在紫外燈下觀察到一條亮帶，與marker的第四條帶平齊，為目的提純產(chǎn)物。見圖2雙酶切后將酶切產(chǎn)物全部進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。在紫外燈下觀察，載體雙酶切后為一條很亮的約為5000bp的條帶；目的基因雙酶切后為一條約為300bp的亮帶。圖2DNA凝膠回收，分別得到目的基因Kringle5的雙酶切片段和載體pET32a的雙酶切片段.酶連后得到重組載體pET32/kringle5。制備感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，37'C下培養(yǎng)過夜。共涂四個(gè)平板，平均長(zhǎng)出菌落6-8個(gè)，挑取8個(gè)單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。選取3管培養(yǎng)物進(jìn)行小型發(fā)酵。誘導(dǎo)表達(dá)后，收集破碎菌體，上清與沉淀以及未加誘導(dǎo)的對(duì)照菌體分別做SDS-PAGE,染色，脫色，成像?？汕逦闯龀恋碇杏幸粭l蛋白帶，與marker的第四條帶平齊，與資料中Kringle5蛋白數(shù)據(jù)相符，確認(rèn)為Kringle5蛋白。而在上清中和未加誘導(dǎo)的對(duì)照中則沒有該帶，從而確認(rèn)Kringle5蛋白以包涵體形式存在。圖3血管抑素及其各個(gè)Kringle已經(jīng)在多種系統(tǒng)中表達(dá)成功，陶亦敏等將Kringle5基因擴(kuò)增后與載體pPIC9K相連，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115得到穩(wěn)定表達(dá)的工程菌。Cao等人利用PRC/CMV質(zhì)粒為載體，在小鼠T241成纖維肉瘤細(xì)胞中表達(dá)了重組小鼠血管抑素。張菊等將K1-4基因插入BactoBac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，表達(dá)血管抑素。吳景文等構(gòu)建血管抑素Kl-3的真核表達(dá)載體pcDNA-SAK(1-3)，將其轉(zhuǎn)染入SHG44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)。而利用大腸桿菌表達(dá)的例子很多，原因在于大腸桿菌具有繁殖快，營養(yǎng)要求低，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，對(duì)于勿需糖基化，磷酸化等修飾即呈現(xiàn)生物活性的蛋白來說，是首選表達(dá)系統(tǒng)。真核基因與原核基因融合，使轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始由正常的大腸桿菌核苷酸控制，有利于真核基因的表達(dá)和產(chǎn)物的穩(wěn)定。載體選擇必須要求載體可在受體細(xì)胞內(nèi)具有DNA獨(dú)立復(fù)制的能力；分子量盡可能小，易于純化；包含有多種限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，在切點(diǎn)內(nèi)可與外源DNA重組；載體內(nèi)有不影響其復(fù)制，生長(zhǎng)的非必要區(qū)域；具有多種選擇性標(biāo)記。天然載體需要經(jīng)過一系列的改造才能達(dá)到作為克隆載體的要求。PET32a是一原核融合型高效表達(dá)載體，有5900bp，表達(dá)效率很高。同時(shí)在酶切時(shí)使用雙酶切可以避免單酶切產(chǎn)生的DNA扭轉(zhuǎn)，是翻譯不能正常進(jìn)行，從而保證了表達(dá)的準(zhǔn)確性。重組產(chǎn)物形成包涵體，易于純化。下一步將對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性，純化和血管生成抑制活性測(cè)定。在本次實(shí)驗(yàn)所選的方法中，如下實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在質(zhì)粒提取時(shí)RNA消化完全很重要，它直接影響到雙酶切的效果；在加入純乙醇后靜置時(shí)間應(yīng)盡可能長(zhǎng)，使質(zhì)粒完全沉淀。在加入70%乙醇時(shí)應(yīng)貼壁緩慢加入，否則會(huì)使質(zhì)粒隨乙醇倒掉而流失。DNA凝膠回收時(shí)應(yīng)勿將其長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外燈下，為提高效率洗脫液可加熱至60°C。在雙酶切時(shí)由于NcoI和EcoRI所需條件不同，而NcoI更依賴于反應(yīng)條件，所以選擇NcoI所需條件。感受態(tài)細(xì)胞的制備關(guān)鍵在于低溫操作，以保證感受態(tài)細(xì)胞的生物學(xué)活性。同時(shí)各種酶的催化活性均有最適溫度，要嚴(yán)格控制溫度。在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，應(yīng)在對(duì)數(shù)期收獲，以獲得最高活性和細(xì)胞量。Angiostatin作用的靶細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞，它不具有細(xì)胞那種高度不穩(wěn)定性，因此不易對(duì)Angiostatin產(chǎn)生抗藥性。內(nèi)皮細(xì)胞壽命很長(zhǎng)，而且腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖速度較正常組織內(nèi)皮細(xì)胞增殖速度高50倍。因此對(duì)于腫瘤患者來說，在一定時(shí)間內(nèi)使用Angiostatin，并不會(huì)對(duì)正常組織內(nèi)的血管造成明顯影響。Angiostatin為戰(zhàn)勝腫瘤帶來了希望，雖仍然需要通過臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)檢驗(yàn)，但是可以預(yù)見Angiostatin與現(xiàn)有的化療方法聯(lián)合應(yīng)用，會(huì)在腫瘤治療方面取得重大突破。一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5非融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法，Kringle5是目前發(fā)現(xiàn)的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的活性最強(qiáng)的纖溶酶原片段，特異性高而毒副作用小。在腫瘤的治療方面具潛在的巨大價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的K5基因的序列圖譜設(shè)計(jì)PCR引物，通過TD-PCR從已有的克隆載體擴(kuò)增出人纖維蛋白溶酶原的K5部分基因，在Afco/和歷/^///兩酶切位點(diǎn)分別對(duì)K5和pET28a(+)基因序列雙酶切，再將二者相連，成功構(gòu)建pET28a(+)-K5基因的非融合表達(dá)載體。為K5基因在大腸桿菌中的非融合表達(dá)的研究奠定了基礎(chǔ)。試劑及生產(chǎn)廠家如下-限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、高保真Taq酶均購自大連寶生物技術(shù)工程有限公司，Taq酶購自MBI;DNA凝膠回收試劑盒購自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。試驗(yàn)所用的菌株及質(zhì)粒(1)大腸桿菌BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存(2)質(zhì)粒pET28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存主要儀器及生產(chǎn)廠家如下J-25型高速冷凍離心機(jī)Backman公司(美國)GTL-16A臺(tái)式離心機(jī)南京新校園技術(shù)研究所(中國)PB2002-E型電子天平Metier公司(德國)TY-90S型脫色搖床南京大學(xué)(中國)PTC-150型PCR擴(kuò)增儀MJ公司(美國)垂直平板電泳槽及電泳儀北京六一儀器廠2.2.1LB培養(yǎng)基胰蛋白凍10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，加水至1000ml。121.3。C滅菌20分鐘。瓊脂培養(yǎng)基胰蛋白凍10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂粉15g，加水至1000ml。121.3'C滅菌20分鐘。1、K5基因上、下游引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已報(bào)道的K5基因全序列設(shè)計(jì)其編碼區(qū)的上下游引物，引物中設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基。上游引物為5，CATGCCATGGCAGCTCCCGGATGTAG3，下劃線部分為y^o/酶切位點(diǎn)下游引物為5，CCCMGCTTTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，下劃線部分為ffi/rfffl酶切位點(diǎn)引物為上海生物工程有限公司合成。2、K5基因的TD-PCR擴(kuò)增TD-PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage40</image>_4。C保存_3、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳3.1制膠稱取0.40g的瓊脂糖，置專用三角瓶，加入50ml的蒸餾水，加熱至沸騰；待冷卻后，加入少許溴化乙錠貯存液，混勻后倒入事先插好梳子的電泳槽中，待其冷卻凝固后加入適量的電泳緩沖液，小心取出梳子。(加樣孔的一端靠近陰極。)小心操作，千萬不要讓溴化乙錠接觸自己或污染環(huán)境。3.2上樣用微量移液槍吸取10x的loadingbuffer3W，置于標(biāo)簽紙背面，再吸取PCR產(chǎn)物6W，混勻之后加入到加樣孔中。在旁邊的加樣孔中加入DNAMarker做對(duì)照。注意槍頭不要戳破凝膠。3.3電泳接通電泳池的電源調(diào)節(jié)電壓至100v，待樣品完全進(jìn)入凝膠中調(diào)節(jié)電壓為80v進(jìn)行電泳。根據(jù)電泳檢測(cè)的需要，待溴酚藍(lán)指示劑泳至適當(dāng)位置后調(diào)小并切斷電變性退火延伸14cycles72。C7min延伸源。3.4分析:在凝膠成像儀下觀察。4、pET28a+質(zhì)粒DNA的小量制備4.1試劑溶液I:每瓶(100ml)含50mmol/L的葡萄糖，25mmol/L的Tris-HCL(PH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)，6.895X104Pa滅菌15分鐘后存儲(chǔ)于4。C。溶液II:0.2mmol/LNa0H,1%SDS.(現(xiàn)用現(xiàn)配)。溶液III:配成100ml含5mol/Lkac60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml，6.895X104Pa滅菌20分鐘后存儲(chǔ)于4°C。(以上試劑均為國產(chǎn)分析純)4.2操作在無菌操作臺(tái)中將3ml含有l(wèi)OOPg/mlAmp的LB培養(yǎng)基加入到容量為15ml的試管中，接入pET28a+菌液30W，于37"C激烈振蕩培養(yǎng)過夜。吸取1.5ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g離心30秒，吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥，剩余培養(yǎng)物貯存于4"C。在含有沉淀的試管中加入的溶液I(預(yù)冷)，劇烈振蕩使沉淀完全分散；再加入200W新配制的溶液n,蓋緊管口，快速顛倒5次，以混勻內(nèi)容物，將離心管置于冰上；再加入i5ow預(yù)冷的溶液ni，蓋緊管口，溫和振蕩IO秒使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻之后置于冰上5分鐘加入Rnase于60。C水浴20分鐘，12000g離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入另一加有200W苯酚和2001Ltl24:1的氯仿/異戊醇溶液的離心管中，振蕩混合是雙鏈DNA沉淀，室溫下放置2分鐘，在12000g離心3分鐘。小心吸取上清液于另一離心管中。用800W純乙醇洗滌雙鏈DNA，70%的冰預(yù)冷的乙醇，12000g離心5min，盡量除去上清放置于37t:烘箱烘干，用無菌水重新溶解核酸，振蕩搖勻，取做1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余儲(chǔ)存于-2(TC。5、雙酶切PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒DNA反應(yīng)體系200810150873VolumeNocI114HindIII11410XMBufferDNA或PCR產(chǎn)物艦無菌水upto2014酶切溫度為37t:，時(shí)間為3.5h。6、DNA片斷的瓊脂糖凝膠檢測(cè)以及膠回收。6.l試劑(DNA凝膠回收試劑盒)BufferDE-A:凝膠融化劑(含DNA保護(hù)劑)BufferDE-B:DNA結(jié)合溶液BufferWl:洗滌液BufferW2:脫鹽液(使用前按試劑瓶上指定體積加入無水乙醇)Eluent:2.5mMTris-HCl，pH8.5，DNA洗脫溶液6.2操作(1)首先在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用至今錫金凝膠表面液體。盡量減小凝膠體積，大體積的凝膠塊需切成小塊，以縮短步驟4中凝膠融化的時(shí)間。(2)稱量凝膠重量，以lmg^ia換算凝膠體積。根據(jù)凝膠濃度，按表所提供的參數(shù)加BufferDE-A:凝膠濃度BufferDE—A體積3個(gè)凝膠體積本實(shí)驗(yàn)需要回收的是雙酶切pET28a+和K5片段，使用的膠都是0.8%，所以加人3個(gè)凝膠體積的BufferDE—A。(3)懸浮均勻后于75""C加熱，每隔2—3分鐘混合一次，直至凝膠塊完全融化(約6—8分鐘)。(4)按BufferDE~~A體積的50%加入BufferDE—B混合均勻。當(dāng)回收的DNA片段小于500bp時(shí)，添加異丙醇，使異丙醇的終濃度為20%。(5)將DNA-pr印Tube置于2mlMicrofugeTube中，將步驟5中的混合液移入DNA-pr印Tube中，5500rpm離心1分鐘。(6)棄濾液，將DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入500ul已加無水乙醇的BufferWl，5500rpm離心1分鐘(7)棄濾液，將DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入700ul已加無水乙醇的BufferW2，5500rpm離心1分鐘，以同樣的方法再用700ulBufferW2洗滌一次。(8)將DNA-pr印Tube置于1.5ml離心管中，12000Xg離心1分鐘。(9)將DNA-pr印Tube置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在silica膜中央加入25—30ulEluent或去離子水，室溫靜置1分鐘。12000Xg離心1分鐘洗脫DNA。7、重組載體pET28a+/K5的制備反應(yīng)體系入下表Volume回收的pET28a+質(zhì)粒10W回收K5片段51410XT4DNALigaseBuffer21410XT4DNALigase1.5W無菌水to251^1叩16-C保溫過夜，一2(TC保存?zhèn)溆谩?、感受態(tài)細(xì)胞的制備8.1試劑(1)CaClv溶液(冰冷)0.lmol/LCaCl2溶液，使用一次性濾器過濾除菌后，_4匸冰箱存儲(chǔ)備用。(2)0.lmol/LCaCir^油溶液25%的甘油+0.lMCaCL2。使用一次性濾器過濾除菌后，-4。C冰箱保存?zhèn)溆?.2操作(1)無菌條件下接種大腸桿菌BL21菌株單菌落入5mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。第二天，倒入250ml的LB液體培養(yǎng)基中，37"C振蕩3.5h-4.0h(600=0.40.6)，停止培養(yǎng)。(2)將培養(yǎng)液分裝到8個(gè)25ml預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上置5-10分鐘，然后4。C，8000rmp離心8min。(3)細(xì)胞沉淀用10ml冰冷的CaC12溶液重懸，4°C6000rmp離心5分鐘。(4))棄上清后，加入10ml冰冷的CaC12溶液重懸細(xì)胞，冰浴半小時(shí)后，4°C，6000rmp離心5分鐘。(5)棄上清后，加入2ml冰冷的CaC12溶液重懸細(xì)胞，按每管200ul量分裝于預(yù)冷的0.5ml離心管中，立即凍存于-75X:冰柜中備用。9、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及保存(1)將10uL連接產(chǎn)物加到200uL感受態(tài)細(xì)胞懸液中，混勻，冰浴30-40分鐘，42'C水浴保溫90秒，立即置冰上l-2分鐘，然后轉(zhuǎn)移到加有抗生素氨芐的培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)照培養(yǎng)。(2)將轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基，進(jìn)行純化擴(kuò)增培養(yǎng)，37t:劇烈振搖過夜。吸取過夜搖床培養(yǎng)的培養(yǎng)物500ul加入1.5ml的離心管中，再加40%的甘油500ul混合均勻后于-20或-70'C保藏，定期進(jìn)行活化重保藏，以防菌種退化或質(zhì)粒丟失。10、重組質(zhì)粒的提取方法于3.4的方法一樣。11、重組質(zhì)粒的PCR檢測(cè)所用程序和反應(yīng)體系與3.2中所用一致，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)觀察。結(jié)果分析1目的片段的TD-PCR擴(kuò)增我們從已有的克隆載體中通過TD-PCR擴(kuò)增出目的片段的全基因，包含有保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)。圖6是PCR產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳在紫外凝膠成像儀下的照片。從圖7上可得知1號(hào)泳道的樣品含有較多的目的片斷DNA，是比較理想的，可以用來作為酶切的底物，3號(hào)泳道目的片斷比較少，不適合作為酶切底物。2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的結(jié)果重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后在加有抗生素氨芐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且用未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞和空白做對(duì)照。結(jié)果顯示在對(duì)照中沒有菌落的生長(zhǎng)，而在做過轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基中能夠長(zhǎng)出菌落。表達(dá)載體pET28a+中含抗氨芐的選擇標(biāo)記基因，而原始的BL21菌種不含有這種選擇標(biāo)記基因，能夠在加有抗生素氨芐的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出菌落表明轉(zhuǎn)化是成功的。3抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行目的片斷的PCR檢測(cè)將轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌進(jìn)行純化擴(kuò)增培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖6從圖6上可見目的片斷擴(kuò)增效果比較好，條帶單一且明亮。這初步證明了重組載體的構(gòu)建是成功的。結(jié)果需要進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳以及DNA測(cè)序的進(jìn)一步鑒定.TD-PCR在本次試驗(yàn)中的運(yùn)用是成功的。TD-PCf^代表了一種完全不同的PCR優(yōu)化方法。它不是用很多的反應(yīng)管和每管用不同的試劑濃度和循環(huán)參數(shù)，而是用一個(gè)反應(yīng)管或者用以小組反應(yīng)管在適合于擴(kuò)增目的產(chǎn)物而不得到人為產(chǎn)物或者引物二聚體的循環(huán)條件下反應(yīng)。設(shè)計(jì)多循環(huán)的程序以使相連循環(huán)的退火溫度越來越低。這個(gè)策略有利于第一個(gè)引物一模板雜交事件發(fā)生在最互補(bǔ)的反應(yīng)物之間，即那些產(chǎn)生目的擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間，是一種潛在的一步法找到最佳擴(kuò)增條件的方法。在本次試驗(yàn)中所用的PCR都是TD-PCR，效果是比較好的，對(duì)本次試驗(yàn)的順利完成起了很重要的作用。4權(quán)利要求1、一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法，其特征在于包含以下步驟1]、ThioA/L15/7和E.coliPET32(載體)質(zhì)粒DNA的制備(1)質(zhì)粒提取試劑溶液I每瓶約100毫升，含50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCL(PH8.0)，10mmol/LEDTA(PH8.0，)在6.895*104Pa滅菌15min，儲(chǔ)存于4℃；溶液II0.2mol/LNaOH(臨用前貯存液現(xiàn)用現(xiàn)配)i％SDS；溶液III配成100ml含5mol/Lkac60ml冰醋酸，11.5ml，水28.5ml；溶液I，溶液III于150kg/cm2，滅菌20分鐘；以上試劑均為國產(chǎn)分析純；(2)操作在超凈工作臺(tái)中將2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基加入到容量為15ml試管中，接入ThioA/L15/7單菌落，于37℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜，吸取1.5ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g離心30秒，吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥，剩余貯存于4℃。含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基在上述沉淀中加入100ul用冰預(yù)冷的溶液I，劇烈振蕩使沉淀完全分散；在加入200ul新配制的溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混勻內(nèi)容物，將離心管置于冰上；在加入150ul用冰預(yù)冷的溶液III，蓋緊管口，溫和振蕩10秒，使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后置于冰上5min，加入RNAase3ul，于60℃水浴20min，12000g離心5min，將上清轉(zhuǎn)入另一加入200ul苯酚和200ul24∶1的氯仿/異戊醇溶液的離心管中，振蕩混合使雙鏈DNA沉淀，室溫下放置2min，在于12000g離心3min，吸取上清液于另一離心管中，用800ul純乙醇洗滌雙鏈DNA，搖勻，在冰箱冷凍區(qū)靜置兩小時(shí)，12000g離心5min，除去上清，貼壁緩慢加入70％冰預(yù)冷的乙醇，12000g離心5min，盡量除去上清放置于37℃烘箱烘干，用25ul無菌水重新溶解核酸，振蕩搖勻，取5ul做1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余儲(chǔ)存于-20℃；載體pET32a質(zhì)粒DNA制備同上；2]、目的基因Kringle5的PCR(1)試劑引物序列上游引物5’GCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG3’NcoI25bp下游引物3’GGAATTCTTACGGGGCCGCACACTGAGG3’EcoRI28bpTaq-DNApolyase是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有依賴于聚合作用的5’→3’外切核酸酶活性，最佳作用溫度為75℃--80℃，需要在低于最適溫度的條件下起始聚合反應(yīng)，以免引物從模板上解離，Taq-DNApolyase作用時(shí)需要Mg2+.由于引物模板雜交體的解鏈和退火溫度受二價(jià)陽離子的影響，需考慮擴(kuò)增反應(yīng)的最佳Mg2+濃度。磷酸鹽緩沖液抑制Taq-DNApolyase活性，擴(kuò)增反應(yīng)通常在Tris緩沖液中進(jìn)行，該緩沖液在室溫下pH為8.3；(2)操作200ul離心管中加入10×Buffer5ul，dNTP4ul，引物P12ul，P22ul，模板質(zhì)粒2ul，Taq-DNApolyase0.5ul，無菌水34.5ul，使反應(yīng)體系總體積為50ul，最后用少量液體石蠟密封，在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)；取5ulPCR反應(yīng)產(chǎn)物和1ulmarker進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定產(chǎn)物大小。3]、PCR產(chǎn)物的抽提純化(1)試劑TE(Ph＝8.0)10mmol/LTris-Hcl(PH＝8.0)+1mmol/LEDTA(PH＝8.0)(2)操作將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，加入TE(PH8.0)補(bǔ)足140ul，加入苯酚和24∶1的氯仿/異戊醇溶液各70ul，振搖，于15000g離心10min，取上清并向其中加入24∶1的氯仿/異戊醇溶液140ul，振搖，于15000g離心10min，取上清并向其中加入14ul3MNaAc及420ul(3倍體積)無水乙醇，在-70℃冰箱中靜置2小時(shí)，取出后于15000g離心15min。加入1ml70％乙醇洗滌，于15000g離心15min，放入烘箱干燥，取5ul進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。4]、雙酶切PCR產(chǎn)物以及載體質(zhì)粒DNA(1)試劑NcoI酶切位點(diǎn)5’..id="icf0002"file="A2008101508730004C1.tif"wi="7"he="4"top="139"left="81"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>ATGG..3’3’..GGTAC▲C..5’熱失活性65℃，20minEcoRI酶切位點(diǎn)5’..id="icf0003"file="A2008101508730004C2.tif"wi="7"he="4"top="156"left="83"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>ATTC..3’3’..CTTAA▲G..3’熱失活性65℃，20min(2)操作向離心管中加入10×Buffer2ul，0.1％BSA2ul，PCR產(chǎn)物14ul，NcoI1.2ul，EcoRI0.8ul，總反應(yīng)體積為20ul，向離心管中加入10×Buffer2ul，0.1％BSA2ul，載體質(zhì)粒DNA12ul，NcoI1.2ul，EcoRI0.8ul，無菌水2ul，總反應(yīng)體積為20ul，將上述兩離心管于36℃±水浴過夜，將酶切產(chǎn)物全部進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳；5]、DNA凝膠回收(1)試劑DNA凝膠回收試劑盒包括DE-A凝膠融化劑(含DNA保護(hù)劑)DE-B高離液序列溶液(使大于100bp的DNA片段選擇性的結(jié)合到DNA制備膜上)W1洗滌液W2洗滌液洗脫液2.5mMTris-Hcl，Ph＝8.5(2)操作首先紫外燈下切下含有目的DNA的凝膠，用紙巾吸干并切碎，腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子K(5)DNA凝膠重0.08g，載體DNA凝膠重0.11g，分別作為一個(gè)凝膠體積.分別向其中加入5個(gè)凝膠體積的DE-A溶液，混和均勻后于75℃加熱，間斷混合，直至凝膠完全融化.加入0.5個(gè)DE-A體積的DE-B溶液，混合均勻，由于腫瘤血管生長(zhǎng)抑制因子K(5)DNA分子量為300bp，向其中再加入異丙醇至終濃度為20％.分別吸取上述混合物，轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，放置于2ml離心管中，于3600rpm離心1min，如有殘留，提速再離心1min，棄濾液。將制備管置回離心管，加0.5mlW1溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。重復(fù)一次將制備管置回離心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。將制備管置回離心管，最高速離心1min。將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25ul洗脫液，室溫靜置1min。最高速離心1min洗脫DNA，分別得到目的基因Kringle5的雙酶切片段和載體pET32a的雙酶切片段；6]、制備重組載體pET32/kringle5(1)試劑T4ligase可催化雙鏈DNA或RNA中的5’-磷酸和3’-羥基間形成磷酸二酯鍵，可連接兩個(gè)平末端，可修復(fù)dsDNA，dsRNA，RNA/DNA的缺刻。熱失活性65℃，10min，(2)操作10×Buffer1ul，Kringle5的雙酶切片段4ul，載體pET32a的雙酶切片段2ul，T4ligase1ul，H2O2ul.總反應(yīng)體積為10ul.16℃恒溫過夜酶連；7]、感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)試劑0.1mol/LCacl2溶液0.1mol/LCaCl2-甘油溶液25％甘油+0.1MCaCl2(2)操作從37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)的BL21新鮮平板上挑取一個(gè)直徑2-3mm的單菌落，轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有50ml培養(yǎng)基的1升燒瓶中，37℃300轉(zhuǎn)/min振蕩3小時(shí)，在超凈臺(tái)中，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯管中，繼續(xù)在冰上放置10分鐘。于4℃4000rpm離心10min回收細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘使殘留培養(yǎng)液流盡，用10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCacl2重懸沉淀，放置于冰上，于4℃4000rpm離心10min，倒出培養(yǎng)液，倒置1min，使殘留培養(yǎng)液流盡。每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2-甘油重懸每份細(xì)胞沉淀，將此溶液分成200ul/每管，若做轉(zhuǎn)化，直接使用，若保存，則每管中加入7ulDMSO(二甲基亞砜)，冰上放置15min，加7ulDMSO，直接放置于-70℃冰箱中，或直接加水于-70℃保存；8]、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化從-70℃冰箱中取出一管200ul的感受態(tài)細(xì)胞BL21，手中握化放置到冰上，每管中加入2ml重組載體pET32/kringle5，輕輕旋轉(zhuǎn)，在冰上放置30mim，將管放到42℃水浴中慢慢振搖90s，快速轉(zhuǎn)至冰浴中冷卻2min，另取5ml小試管，每管加500ul未加抗生素的LB培養(yǎng)基，用水浴加溫至37℃，將上面已經(jīng)轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞BL21加入其中，放置于37℃搖床上220rpm以下溫浴45分鐘，使轉(zhuǎn)化了的BL21復(fù)蘇并且表達(dá)重組載體pET32/kringle5氨卞抗性標(biāo)記基因，將上述1ml溫浴的培養(yǎng)液5000rpm離心5分鐘，吸去上面的500ul，下面的200ul用于鋪板，在超凈工作臺(tái)上，將此200ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到事先放于37℃烘箱中含有100ug/ml氨卞的LB瓊脂培養(yǎng)基上，平板倒置于37℃下培養(yǎng)14小時(shí)左右可出現(xiàn)菌落；9]、小型發(fā)酵及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(1)試劑誘導(dǎo)劑IPTG，0.1MTris-HCl(PH8.0)，1mg/ml溶菌酶SDS-PAGE的制備分離膠現(xiàn)配成5ml其中H2O1.434ml，30％丙烯酰胺2.166ml，1.5mol/LTris(Ph8.8)1.3ml，10％SDS0.05ml，10％(NH4)2S2O80.05ml，TEMED(凝固劑)0.002ml.濃縮膠現(xiàn)配成2ml其中H2O1.434ml，30％丙烯酰胺0.33ml，1.0mol/LTris(Ph6.5)0.25ml，10％SDS0.02ml，10％(NH4)2S2O80.02ml，TEMED(凝固劑)0.002ml.(2)操作挑取上述轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)出的單菌落至含有7ml培養(yǎng)液的試管中，37℃300rpm振蕩過夜，吸取200ul培養(yǎng)物以1∶30接種于含100ug/ml氨卞的LB培養(yǎng)基中，37℃300rpm振蕩3小時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度為1mmol/ml，再于37℃300rpm振蕩3小時(shí)，取1.5ml誘導(dǎo)菌，離心收集菌體，用200ul0.1MTris-HCl(PH8.0)重懸菌體并洗滌，于5000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入100ul0.1MTris-HCl(PH8.0)重懸菌體，再加入50ul1mg/ml溶菌酶，于-70℃冰箱放置半小時(shí)，37℃水浴5分鐘，再放入-70℃冰箱5分鐘，反復(fù)凍融五次后，于12000rpm離心10分鐘，收集上清(為細(xì)胞質(zhì)部分)，沉淀為包涵體部分，上清與沉淀以及未加誘導(dǎo)的對(duì)照菌體分別做SDS-PAGE，染色，脫色，成像；10]、培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定挑取轉(zhuǎn)化后的BL21單菌落于2ml含有100ug/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基中，按照1.2.1提取質(zhì)粒，按照1.2.4進(jìn)行雙酶切后，2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2、一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5非融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法，其特征在于包含以下步驟l]、根據(jù)K5基因全序列設(shè)計(jì)其編碼區(qū)的上下游引物，引物中設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)以及保護(hù)堿基，上游引物為5，CATGCCATGGCAGCTCCCGGATGTAG3，下劃線部分為lo/酶切位點(diǎn)，下游引物為5，CCCMGCTTTTACGGGGCCGCACACTGAGG3，下劃線部分為歷/7rfffl酶切位點(diǎn)，引物為上海生物工程有限公司合成。2]、K5基因的TD-PCR擴(kuò)增TD-PCR反應(yīng)體系Volume10XBufferdNTP(lOmM)MgCl2引物模板(c麗)Taq酶無菌水54各2<image>imageseeoriginaldocumentpage8</image><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3]、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳(1)制膠稱取0.40g的瓊脂糖，置專用三角瓶，加入50ml的蒸餾水，加熱至沸騰；待冷卻后，加入少許溴化乙錠貯存液，混勻后倒入事先插好梳子的電泳槽中，待其冷卻凝固后加入適量的電泳緩沖液，小心取出梳子。(加樣孔的一端靠近陰極。)小心操作，千萬不要讓溴化乙錠接觸自己或污染環(huán)境。(2)上樣用微量移液槍吸取10x的loadingbuffer3W，置于標(biāo)簽紙背面，再吸取PCR產(chǎn)物6W,混勻之后加入到加樣孔中。在旁邊的加樣孔中加入DNAMarker做對(duì)照。注意槍頭不要戳破凝膠。(3)電泳接通電泳池的電源調(diào)節(jié)電壓至100v，待樣品完全進(jìn)入凝膠中調(diào)節(jié)電壓為80v進(jìn)行電泳。根據(jù)電泳檢測(cè)的需要，待溴酚藍(lán)指示劑泳至適當(dāng)位置后調(diào)小并切斷電源。(4)分析:在凝膠成像儀下觀察。4]、pET28a+質(zhì)粒DNA的小量制備(1)試劑溶液I:每瓶(100ml)含50mmol/L的葡萄糖，25mmol/L的Tris-HCL(PH8.0)10咖ol/LEDTA(pH8.0)，6.895X104Pa滅菌15分鐘后存儲(chǔ)于4°C，溶液II:0.2mmol/LNaOH,1%SDS.(現(xiàn)用現(xiàn)配)，溶液III:配成100ml含5mol/Lkac60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml，6.895X104Pa滅菌20分鐘后存儲(chǔ)于4°C。以上試劑均為國產(chǎn)分析純(2)操作在無菌操作臺(tái)中將3ml含有100Pg/mlAmp的LB培養(yǎng)基加入到容量為15ml的試管中，接入pET28a+菌液3(H4，于37"C激烈振蕩培養(yǎng)過夜。吸取1.5ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g離心30秒，吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥，剩余培養(yǎng)物貯存于4"C，在含有沉淀的試管中加入的溶液I(預(yù)冷)，劇烈振蕩使沉淀完全分散；再加入200W新配制的溶液n，蓋緊管口，快速顛倒5次，以混勻內(nèi)容物，將離心管置于冰上；再加入150J4預(yù)冷的溶液III，蓋緊管口，溫和振蕩io秒使溶液m在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻之后置于冰上5分鐘加入Rnase3W于60。C水浴20分鐘，12000g離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入另一加有200)4苯酚和200W24:1的氯仿/異戊醇溶液的離心管中，振蕩混合是雙鏈DNA沉淀，室溫下放置2分鐘，在12000g離心3分鐘。小心吸取上清液于另一離心管中，用800)4純乙醇洗滌雙鏈DNA，70%的冰預(yù)冷的乙醇，12000g離心5min，盡量除去上清放置于37X:烘箱烘干，用無菌水重新溶解核酸，振蕩搖勻，取5^做1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余儲(chǔ)存于-20°C;5]、雙酶切PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒DNA反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>6]、DNA片斷的瓊脂糖凝膠檢測(cè)以及膠回收。(1)試劑(DNA凝膠回收試劑盒)BufferDE-A:凝膠融化劑(含DNA保護(hù)劑)BufferDE-B:DNA結(jié)合溶液BufferWl:洗滌液BufferW2:脫鹽液(使用前按試劑瓶上指定體積加入無水乙醇)Eluent:2.5mMTris-HCl，pH8.5，DNA洗脫溶液(2)操作(2.1)首先在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用至今錫金凝膠表面液體。盡量減小凝膠體積，大體積的凝膠塊需切成小塊，以縮短步驟4中凝膠融化的時(shí)間。(2.2)稱量凝膠重量，以lmg^ul換算凝膠體積。根據(jù)凝膠濃度，按表所提供的參數(shù)加BufferDE-A:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本實(shí)驗(yàn)需要回收的是雙酶切pET28a+和K5片段，使用的膠都是0.8%，所以加人3個(gè)凝膠體積的BufferDE—A。(2.3)懸浮均勻后于75。C加熱，每隔2—3分鐘混合一次，直至凝膠塊完全融化(約6—8分鐘)。(2.4)按BufferDE—A體積的50%加入BufferDE—B混合均勻。當(dāng)回收的DNA片段小于500bp時(shí)，添加異丙醇，使異丙醇的終濃度為20%。(2.5)將DNA-pr印Tube置于2mlMicrofugeTube中，將步驟5中的混合液移入DNA-pr印Tube中，5500rpm離心1分鐘。(2.6)棄濾液，將DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入500ul已加無水乙醇的BufferWl，5500rpm離心1分鐘(2.7)棄濾液，將DNA-pr印Tube置回到2mlMicrofugeTube中，加入700ul已加無水乙醇的BufferW2，5500rpm離心1分鐘，以同樣的方法再用700ulBufferW2洗滌一次。(2.8)將DNA-pr印Tube置于1.5ml離心管中，12000Xg離心1分鐘。(2.9)將DNA-pr印Tube置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在silica膜中央加入25—30ulEl腦t或去離子水，室溫靜置1分鐘。12000Xg離心1分鐘洗脫DNA。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>16i:保溫過夜，一2(TC保存?zhèn)溆茫?]、感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)試劑(1.1)CaCl2溶液(冰冷)`0.lmol/LCaCl2溶液，使用一次性濾器過濾除菌后，-41:冰箱存儲(chǔ)備用，(1.2)0.lmol/ECaCl2甘油溶液25%的甘油+0.1MCaCL2。使用一次性濾器過濾除菌后，-4"冰箱保存?zhèn)溆?2)操作(2.1)無菌條件下接種大腸桿菌BL21菌株單菌落入5mlLB液體培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)過夜。第二天，倒入250ml的LB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩`3.5h-4.0h(600=0.4~0.6)，停止培養(yǎng)，(2.2)將培養(yǎng)液分裝到8個(gè)25ml預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上置5-10分鐘，然后4。C，8000rmp離心8min，(2.3)細(xì)胞沉淀用10ml冰冷的CaC12溶液重懸，4°C6000rmp離心5分鐘，(2.4))棄上清后，加入10ml冰冷的CaC12溶液重懸細(xì)胞，冰浴半小時(shí)后，4°C，6000rmp離心5分鐘，(2.5)棄上清后，加入2ml冰冷的CaC12溶液重懸細(xì)胞，按每管200ul量分裝于預(yù)冷的0.5ml離心管中，立即凍存于-75。C冰柜中備用，9]、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及保存(1)將10uL連接產(chǎn)物加到200uL感受態(tài)細(xì)胞懸液中，混勻，冰浴30-40分鐘，42X:水浴保溫90秒，立即置冰上l-2分鐘，然后轉(zhuǎn)移到加有抗生素氨芐的培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)照培養(yǎng)，(2)將轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基，進(jìn)行純化擴(kuò)增培養(yǎng)，37"C劇烈振搖過夜。吸取過夜搖床培養(yǎng)的培養(yǎng)物500ul加入1.5ml的離心管中，再加40%的甘油500ul混合均勻后于-20或-7(TC保藏，定期進(jìn)行活化重保藏，以防菌種退化或質(zhì)粒丟失。10]、重組質(zhì)粒的提取方法同前，11]、重組質(zhì)粒的PCR檢測(cè)所用程序和反應(yīng)體系與3.2中所用一致，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)觀察。全文摘要本發(fā)明涉及一種血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle5融合和非融合基因的克隆、鑒定和表達(dá)方法。包括以下步驟1.ThioA/L15/7和E.coliPET32(載體)質(zhì)粒DNA的制備；2.目的基因Kringle5的PCR；3.PCR產(chǎn)物的抽提純化；4.雙酶切PCR產(chǎn)物以及載體質(zhì)粒DNA；5.DNA凝膠回收；6.制備重組載體pET32/kringle5；7.感受態(tài)細(xì)胞的制備；8.感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；9.小型發(fā)酵及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；10.培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。成功構(gòu)建pET28a(+)-K5基因的非融合表達(dá)載體。為K5基因在大腸桿菌中的非融合表達(dá)的研究奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C07K14/47GK101671675SQ20081015087公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2008年9月9日優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日發(fā)明者萱馮,楊曉燕,邊六交,超陳申請(qǐng)人:陜西北美基因股份有限公司