專利名稱：一種基于高通量測(cè)序的免疫組庫(kù)構(gòu)建方法
一種基于高通量測(cè)序的免疫組庫(kù)構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng) 域本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及免疫學(xué)及高通量測(cè)序方面。
背景技術(shù)：
T細(xì)胞受體(T cell antigen receptor,TCR)是機(jī)體免疫系統(tǒng)特異識(shí)別和捕獲特異性抗原性異物的關(guān)鍵分子。T細(xì)胞抗原受體是由alpha和beta兩條多肽鏈組成，每條多肽鏈也象免疫球蛋白Fab片段的多肽鏈一樣，折疊成兩個(gè)功能區(qū)-可變區(qū)和恒定區(qū)，鑲嵌在 T細(xì)胞膜內(nèi)，T細(xì)胞通過(guò)它來(lái)識(shí)別和捕獲各種抗原物質(zhì)。據(jù)檢測(cè)95%成熟T細(xì)胞表面的抗原受體與免疫球蛋白輕鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)相類似， 由alphibeta兩條肽鏈組成異二聚體，每條肽鏈上均有V區(qū)(可變區(qū))和C區(qū)(恒定區(qū))。T細(xì)胞受體的胚系基因由多個(gè)分隔的基因片段組成，它們?cè)诨蛑嘏胚^(guò)程中的隨機(jī)組合為多樣性的產(chǎn)生提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)?；蛑嘏畔狄浑S機(jī)過(guò)程，不同的T細(xì)胞克隆經(jīng)基因重排、發(fā)生不同基因片段的連接，產(chǎn)生特定的基因。V區(qū)基因重排時(shí)，特定的V、D或J 片段(連接區(qū))在發(fā)生DJ、VDJ或VJ連接時(shí)，由于讀碼框的機(jī)動(dòng)性或不精確性，在VDJ連接處可發(fā)生一定的變異(偏移)導(dǎo)致核苷酸缺失，引起核苷酸序列、密碼子的改變，最后導(dǎo)致 V區(qū)氨基酸組成的變化，從而改變T細(xì)胞受體的特異性，增加了其多樣性。本發(fā)明利用多重引物并結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建外周血中特定T細(xì)胞亞群的免疫組庫(kù)。是一種基于高通量測(cè)序的免疫組庫(kù)構(gòu)建方法。適用于免疫組學(xué)的生物醫(yī)學(xué)研究或基礎(chǔ)生物學(xué)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)T細(xì)胞受體beta鏈基因重排的規(guī)律，設(shè)計(jì)多重引物對(duì)核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，利用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，從而找到了一種可行的測(cè)定免疫組庫(kù)的方法。其實(shí)施步驟如下，見(jiàn)

圖1 步驟一從外周血中分離T細(xì)胞亞群。步驟二 提取信使核糖核酸。步驟三利用多重引物擴(kuò)增目的片斷。步驟四利用測(cè)序引物進(jìn)行高通量測(cè)序。步驟五測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行VDJ比對(duì)。步驟六分析⑶R3(即VDJ的結(jié)合處)序列，得到一個(gè)完整的免疫組庫(kù)。本方法的特征本發(fā)明根據(jù)T細(xì)胞受體beta鏈基因重排的規(guī)律，設(shè)計(jì)多重引物對(duì)核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，利用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，從而找到了一種可行的測(cè)定免疫組庫(kù)的方法。在創(chuàng)新性方面，其特征在于我們的方法引入了多重引物設(shè)計(jì)方法，以及高通量測(cè)序方法，結(jié)果更加全面，有利于建立一個(gè)完整的可靠的免疫組庫(kù)。
具體實(shí)施例方式下面以人的⑶4、⑶8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞為例，做進(jìn)一步的說(shuō)明步驟一從人外周血中用磁珠法分離⑶4、⑶8的T細(xì)胞亞群。步驟二 提取信使核糖核酸。步驟三利用多重引物擴(kuò)增目的片斷。所有引物序列見(jiàn)圖2。步驟四利用測(cè)序引物進(jìn)行高通量測(cè)序。步驟五將序列利用blast 比對(duì)工具(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)向 V、D片段比對(duì)。步驟六根據(jù)比對(duì)的結(jié)果，從測(cè)序數(shù)據(jù)中重構(gòu)CDR3序列。最終，得到一個(gè)完整的免
疫組庫(kù)。以上是對(duì)本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實(shí)施方式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明根據(jù)τ細(xì)胞受體B鏈基因重排的規(guī)律，設(shè)計(jì)多重引物對(duì)核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，利用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，從而找到了一種可行的測(cè)定免疫組庫(kù)的方法。 本發(fā)明主要包括如下流程步驟1 從外周血中分離T細(xì)胞亞群；步驟2 提取信使核糖核酸；步驟3 利用多重引物擴(kuò)增目的片斷；步驟4 利用測(cè)序引物進(jìn)行高通量測(cè)序；步驟5 測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行VDJ比對(duì)；步驟6 分析⑶R3序列。得到一個(gè)完整的免疫組庫(kù)。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)T細(xì)胞受體B鏈基因重排的規(guī)律，設(shè)計(jì)多重引物對(duì)核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，利用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，從而找到了一種可行的測(cè)定免疫組庫(kù)的方法。本發(fā)明主要包括如下流程步驟1從外周血中分離T細(xì)胞亞群；步驟2提取信使核糖核酸；步驟3利用多重引物擴(kuò)增目的片斷；步驟4利用測(cè)序引物進(jìn)行高通量測(cè)序；步驟5測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行VDJ比對(duì)；步驟6分析CDR3序列。最終，得到一個(gè)完整的免疫組庫(kù)。本發(fā)明利用多重引物并結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建外周血中特定T細(xì)胞亞群的免疫組庫(kù)。是一種基于高通量測(cè)序的免疫組庫(kù)構(gòu)建方法。適用于免疫組學(xué)的生物醫(yī)學(xué)研究或基礎(chǔ)生物學(xué)研究。
文檔編號(hào)C40B40/08GK102212888SQ20111006519
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者靳海峰 申請(qǐng)人:靳海峰