專利名稱：：基于AAV載體的高通量miRNA活性檢測方法及其應(yīng)用的制作方法基于AAV載體的高通量miRNA活性檢測方法及其應(yīng)用本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。是我們申請的中國專利”AAV病毒反向感染技術(shù)及AAV病毒陣列(申請?zhí)?00910009059.6)”和”攜帶基于hGluc基因的miRNA傳感器的重組AAV病毒庫及用途(申請?zhí)?00910223723.7)”的延續(xù)和擴展。本發(fā)明具體涉及一種基于AAV(Adeno-associatedvirus)載體的高通量miRNA活性檢測方法miRNAAsensorArray(miRNAsensorbasedAAVvectorArray，基于AAV載體的、用于miRNA活性檢測的生物傳感器)及其在細胞miRNA活性譜檢測、不同細胞特征miRNA活性譜檢測和外界因素(如藥物、轉(zhuǎn)基因)對細胞miRNA活性譜的影響等方面的應(yīng)用。miRNAAsensorArray由不攜帶miRNA祀序列的controlAsensor和多種攜帶miRNA祀序列的miRNAAsensor按照一定順序排列組成。ControlAsensor和miRNAAsensor均包含Gluc(GaussiaIuciferase)和Fluc(fireflyluciferase)兩個獨立的表達單元，其中Gluc用于miRNA活性檢測，F(xiàn)luc用于計算miRNAAsensor的轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)，校正不同miRNAAsensor之間的感染性差異。使用時，將待檢測細胞加入到制備好的miRNAAsensorArray中，一段時間后檢測Gluc表達情況并根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)計算出細胞中miRNA活性譜。該方法為細胞miRNA活性譜的制作及其影響因素研究提供了新的選擇。背景miRNA(microRNA)是生物體內(nèi)源的長度為1825個核苷酸的非編碼RNA(BartelDP.MiRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，andfunction.Cell，2004，116(2)281-297.)o目前，在人類中已發(fā)現(xiàn)1000多種miRNA(參見www.mirbase.org數(shù)據(jù)庫)。在體內(nèi)，miRNA與AGO等蛋白形成RISC(RNAInducedSilencingComplex)，識別并結(jié)合mRNA3’UTR的靶序列，降低mRNA的穩(wěn)定性和抑制翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控(DoenchJG,SharpPA.SpecificityofmicroRNAtargetselectionintranslationrepression.GenesDev，2004，18(5):504-511.)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與人類大約三分之一基因的表達調(diào)控(LewisBP,BurgeCB,BartelDP.Conservedseedpairing,oftenflankedbyadenosines，indicatesthatthousandsofhumangenesaremicroRNAtargets.Cell，2005，120(I):15-20.)，在細胞分裂(CaretonM，ClearyMA,LinsleyPS.MicroRNAsandcellcycleregulation.CellCycle，2007，6(17):2127-2132.)、分化(IovinoN，PaneA，GaulU.miR-184hasmultiplerolesinDrosophilafemalegermlinedevelopment.DevCell，2009，17(I)123-133.)、死亡(AmbrosV.MicroRNApathwaysinfliesandwormsgrowth,death，fat，stress，andtiming[ErratumCell，2003,114(2):269].Cell，2003，113(6):673-676.)、凋亡(JovanovicM,HenqartnerMO.miRNAsandapoptosisRNAstodiefor.Oncogene，2007，25(46):6176-6187.)、新陳代謝(DangCV,LeA，GaoP.MYC-inducedcancercellenergymetabolismandtherapeuticopportunities.ClinCancerRes，2009，15(21);6479_6483.)以及干細胞的分化(XuN，PapagiannakopoulosT，PanGJ，etal.MicroRNA-145regulates0CT4，S0X2，andKLF4andrepressespluripotencyinhumanembryonicstemcells.Cell，2009，137(4):647-658.)、腫瘤的發(fā)生(SchichelR，BoyerinasB，ParkSM，etal.MicroRNAskeyplayersintheimmunesystem,differentiation,tumorigenesisandcelldeath.Oncogene,2008,27(45):5959-5974.)等諸多生理病理過程中發(fā)揮重要作用。目前已建立Northernblot、QRT-PCR>microarray和Deepsequencing等多種miRNA表達水平檢測方法。按照檢測原理的不同，這些方法可分為基于雜交的Northernblot和microarray、基于擴增的QRT-PCR和基于測序的Deepsequencing三大類。雖然這些方法可以簡單、快捷和高通量地檢測細胞內(nèi)的miRNA表達水平，但是由于這些方法均需要提取細胞內(nèi)RNA，因此不僅操作繁瑣，還不能對同一細胞進行長期持續(xù)地監(jiān)測。更為重要的是，已有的研究表明，細胞內(nèi)miRNA的活性，即細胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)的miRNA，不僅與細胞內(nèi)miRNA的表達水平相關(guān)，還受到miRNA在細胞內(nèi)的定位、miRNA的穩(wěn)定性以及miRNA形成的miRISC中其他蛋白因子的影響(KrolJ,LoedigeI,Fillipowiczff.ThewidespreadregulationofmicroRNAbiogenesis,functionanddecay.NatureReviewsGenetics,2010,11:597-610.)。因此為了了解細胞內(nèi)miRNA活性，需要建立一種檢測細胞內(nèi)miRNA活性的方法?，F(xiàn)有的miRNA活性檢測方法基于miRNA抑制細胞內(nèi)基因表達的原理，選擇常用的報告基因(Flue、EGFP,RFP、Gluc和Mluc等)，在其3’UTR區(qū)插入某種miRNA的靶序列(如和成熟miRNA完全互補的序列)，同時以3’UTR區(qū)不含miRNA靶序列的報告基因作為對照，然后將攜帶和不攜帶miRNA靶序列的報告基因分別導(dǎo)入檢測細胞中，一定時間后比較報告基因的表達情況，推測細胞內(nèi)miRNA的活性。報告基因的表達情況比較結(jié)果分為兩種其一，攜帶miRNA靶序列的報告基因表達量小于不攜帶miRNA靶序列的報告基因的表達量，表明細胞內(nèi)該種miRNA活性較高；其二，攜帶miRNA靶序列的報告基因表達量不小于不攜帶miRNA靶序列的報告基因的表達量，表明細胞內(nèi)該種miRNA活性較低。從miRNA活性檢測的原理可知，報告基因的選擇和報告基因高效地導(dǎo)入細胞是單個miRNA活性檢測方法需要解決的兩個主要問題。Huang等(HuangPC,ChenCY,YangFY,etal.AmultisamplingreportersystemformonitoringmicroRNAactivityinthesamepopulationofcells.JournalofBiomedicineandBiotechnology,2009.doi10.1155/2009/104716)報道了一種以分泌型突光素酶Mluc(Metridialuciferase)為報告基因的質(zhì)粒型miRNA活性檢測載體，利用該方法可以連續(xù)監(jiān)測同一細胞的miRNA活性。Lee等(LeeJY,KimS，HwangDff,etal.DevelopmentofaDual-LuciferaserepotersystemforinvivovisualizationofmicroRNAbiogenesisandposttranscriptionalregulation.JNuclMed，2008，49:285-294.)報道了一種以Gluc(Gaussialuciferase)為報告基因的質(zhì)粒型miRNA活性檢測載體，相比于Mluc，Gluc靈敏度更高，檢測更加方便,為miRNA活性檢測提供了一種新的選擇。但是，現(xiàn)在仍然缺乏一種高通量的miRNA活性檢測方法。這是因為高通量的miRNA活性檢測方法的建立不僅需要選擇適當?shù)膱蟾婊蚝秃啽愕耐庠椿蜣D(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，還需要克服多種不同miRNA活性檢測載體之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異。雖然熒光蛋白基因在miRNA活性檢測中也常作為報告基因(JuliusBrennecke,AlexanderStark,RobertB.Russell,etal.PrinciplesofMicroRNA-TargetRecognition.PLoSBiology,2005，3(3)，404-418，e85.)，但其主要應(yīng)用于miRNA活性的定性檢測。在miRNA活性的定量檢測中，則通常選擇熒光素酶基因為報告基因，如Fluc(ChristineEsau,XiaolinKang,EigenPeralta,etal.MicroRNA-143RegulatesAdipocyteDifferentiation.TheJournalofBiologicalChemistry,2004,279,52361-52365.YongZhao,EvaSamalandDeepakSrivastava.Serumresponsefactorregulatesamuscle-specificmicroRNAthattargetsHand2duringcardiogenesis.Nature，2005，436，214-220.)、Gluc(LeeJY,KimS，HwangDW,etal.DevelopmentofaDual-LuciferaserepotersystemforinvivovisualizationofmicroRNAbiogenesisandposttranscriptionalregulation.JNuclMed，2008，49:285-294.)、Rluc(MargaretSEbert，JoelRNeilsonandPhillipASharp.MicroRNAspongescompetitiveinhibitorsofsmallRNAsinmammaliancells.NatureMethods，2007，4，721-726.VincentBoissonneault，IsabellePlante，SergeRivest,etal.MicroRNA-298andMicroRNA-328RegulateExpressionofMouse&-AmyloidPrecursorProtein-convertingEnzymeI.TheJournalofBiologicalChemistry,2009，284，1971-1981.)和Mluc(HuangPC，ChenCY,YangFY,etal.AmultisamplingreportersystemformonitoringmicroRNAactivityinthesamepopulationofcells.JournalofBiomedicineandBiotechnology,2009.doi10.1155/2009/104716)等，因為熒光素酶基因可以方便地實現(xiàn)其表達量的定量檢測。同時，熒光素基因還具有靈敏度高的特點。新一代的熒光素酶基因Gluc不僅靈敏度高，還易分泌、檢測時不依賴ATP、檢測方便等特點，可作為miRNA活性檢測時選擇報告基因。攜帶和不攜帶miRNA革E序列的報告基因常通過質(zhì)粒(Miranda，K.C.，Huynh,T.，Tay,Y.etal.APattern-BasedMethodfortheIdentificationofMicroRNABindingSiteandTheirCorrespondingHeteroduplexes.2006.Cell，126，1203-1217.)和病毒載體(BrownBD,VenneriMA,ZingaleA，etal.EndogenousmicroRNAregulationsuppressestransgeneexpressioninhematopoieticlineagesandenablesstablegenetransfer.Naturemedicine，2006，12(5)，585-591.)等方式導(dǎo)入細胞內(nèi)。質(zhì)粒載體制備方便，但對某些細胞轉(zhuǎn)染效率低下，不能用于這些細胞中的miRNA活性檢測。BrownBD等報道了一種利用慢病毒載體檢測細胞內(nèi)miRNA活性的方法(BrownBD,VenneriMA,ZingaleA,etal.EndogenousmicroRNAregulationsuppressestransgeneexpressioninhematopoieticlineagesandenablesstablegenetransfer.Naturemedicine，2006，12(5)，585-591.)。慢病毒載體能高效轉(zhuǎn)染多種細胞，但其需要在溶液保存，不方便于運輸，且穩(wěn)定性不好，尤其因自身病毒特性，慢病毒干燥后保存在固體附著物上時的穩(wěn)定性很不好。相反，另一種常用的病毒載體AAV病毒載體的穩(wěn)定性就非常好，這是由于AAV病毒是一種無包膜的納米級顆粒(直徑約20mn)，正二十面體對稱，結(jié)構(gòu)比較”剛性”，對pH值、溫度、鹽濃度變化及有機溶劑(如氯仿、乙醚、乙醇等)均有很強的耐受性，因此AAV病毒載體具有很高的穩(wěn)定性。同時，在體外AAV2病毒(AAV病毒的一種血清亞型)對多種細胞具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。利用AAV2病毒載體的這些特點，我們建立了一種AAV2病毒的反向感染陣列(DongX,TianW，WangG，etal.EstablishmentofanAAVreverseinfection-basedarray.PLoSONE，2010，5(10):el3479.)，而且我們申請了相應(yīng)的專利AAV病毒反向感染技術(shù)及AAV病毒陣列(申請?zhí)?00910009059.6)。該專利和技術(shù)的特點是，區(qū)別于傳統(tǒng)的正向感染，反向感染陣列先將病毒反向包被于各種型號的細胞培養(yǎng)板上，并在操作工作臺中無菌晾干后2-8°C保存，使用時，將待檢測細胞加入已制備好的病毒反向感染陣列中，放入細胞培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)一定時間后檢測相應(yīng)的檢測標志(如報告基因)即可。我們的研究發(fā)現(xiàn)，該方法建立的AAV2病毒反向感染陣列可以在2-8°C保存一年以上而感染活性無明顯降低。因為使用陣列這種”高通量”設(shè)計模式，所以，AAV2病毒反向感染陣列能夠簡單、方便地實現(xiàn)外源基因的高通量體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，為需要體外外源基因的高通量轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了新的選擇。利用AAV2病毒反向感染陣列的方法，我們進一步建立了一種高通量的miRNA活性檢測方法(申請?zhí)?00910223723.7)，該案所申請的發(fā)明正是在上述發(fā)明專利申請的基礎(chǔ)上技術(shù)進一步地延伸和擴展。高通量miRNA活性檢測的另外一個主要障礙是，多種不同miRNA活性生物傳感器(Sensors)之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異和誤差，將導(dǎo)致檢測結(jié)果與真實結(jié)果出現(xiàn)的偏差較大。即，不同的miRNA生物傳感器是預(yù)先包被在同一個96孔板的不同的孔里，這些不同的孔里所預(yù)先包被的包含有不同的miRNA生物傳感器的AAV病毒在制備和生產(chǎn)過程中無法達到完全一致，它們的質(zhì)量和病毒滴度總會有差異，而這些差異會帶來后續(xù)·的結(jié)果和數(shù)據(jù)的不可信。為了克服因包含有不同的miRNA生物傳感器的AAV病毒之間的差異導(dǎo)致的測量誤差，我們的方法是，利用不同miRNA生物傳感器的結(jié)構(gòu)中預(yù)先設(shè)計好的、組成比例相對穩(wěn)定的物質(zhì)，或測量這種差異來校正不同miRNA生物傳感器之間的差異。由于miRNA活性生物傳感器的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通常受到多種因素的影響，例如，以質(zhì)粒為載體的miRNA活性生物傳感器受到質(zhì)粒的質(zhì)量、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量等因素的影響，而以病毒為載體的miRNA活性生物傳感器則受到病毒載體的質(zhì)量、病毒載體的感染劑量等因素的影響，因此，不容易找到一種相對穩(wěn)定的標記來指示轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，因此需要引入一種外源標志來指示不同miRNA活性生物傳感器受間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并且用這種外源標志校正轉(zhuǎn)染效率的差異。miRNA不僅在諸多生理病理過程中發(fā)揮重要作用，而且還能夠作為一種有效的分子標記用于指示特定的生理病理過程。例如，miRNA可作為癌癥的一種檢測標記，用于癌癥的檢測、分類和預(yù)后判斷(CalinGA,CroceCM.MicroRNAsignaturesinhumancancers.NatureReviewsCancer,2006,6,857-866.)。而且不同種類的細胞具有特異性的miRNA表達譜，可用于細胞種類的指不。HoubaviyHB等(HoubaviyHB,MurrayMF,SharpPA.Embryonicstemcell-specificmicroRNAs.DevelopmentalCell,2003,5,351-358.)研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細胞呈現(xiàn)出獨特的miRNA表達譜，且這些獨特的miRNA在胚胎干細胞的分化和多能性的維持中發(fā)揮重要作用。這提示miRNA可能作為一種分子標記用于鑒定胚胎干細胞。此外，某些miRNA特異性地在特定的組織和組織來源細胞中高表達，如miR122主要在肝臟和肝臟來源細胞中高表達(Lagos-QuintanaM,RauhutR,YalcinA,etal.Identificationoftissue-specificmicroRNAsfrommouse.CurrentBiology,2002,12:735-739.；SempereLF,FreemantleS,Pitha-RoweI,etal.ExpressionprofilingofmammalianmicroRNAsuncoversasubsetofbrain-expressedmicroRNAswithpossiblerolesinmurineandhumanneuronaldifferentiation.GenomeBiol,2004,5,R13.)，miR142_3p則主要在造血干細胞系來源細胞中高表達(ChenCZ,LiL,LodishHF,etal.MicroRNAsmodulatehematopoieticlineagedifferentiation.Science,2004,303(5654):83-86.)，miR206、miR133a和miRl主要在肌肉及其來源細胞中高表達(SempereLF,FreemantleS,Pitha-RoweI,etal.ExpressionprofilingofmammalianmicroRNAsuncoversasubsetofbrain-expressedmicroRNAswithpossiblerolesinmurineandhumanneuronaldifferentiation.GenomeBiol,2004,5，R13.)。這表明miRNA可能成為一種分子標記用于鑒定細胞的來源。為了體現(xiàn)本發(fā)明與我們之前申請的中國專利”AAV病毒反向感染技術(shù)及AAV病毒陣列(申請?zhí)?00910009059.6)”和”攜帶基于hGluc基因的miRNA傳感器的重組AAV病毒庫及用途(申請?zhí)?00910223723.7)”等原案申請的相關(guān)、連續(xù)性及充分公開的要求，原案申請中的實施例也都被以背景資料進行詳述。以下為我們之前申請的發(fā)明專利的背景介紹，是關(guān)于”AAV病毒反向感染技術(shù)及AAV病毒陣列(申請?zhí)?200910009059.6)”的。申請?zhí)枮?00910009059.6的申請專利具體涉及AAV病毒反向感染技術(shù)及AAV病毒陣列，將制備好的攜帶外源基因和基因調(diào)控元件的重組腺相關(guān)病毒(AAV)有序地包被在細胞培養(yǎng)支持物(如96孔板)上，在無菌條件下制成可以長期存放的重組AAV病毒陣列。將活細胞懸液加入布置了重組AAV病毒陣列的細胞培養(yǎng)孔板中(如96孔板)，預(yù)先包被的重組AAV病毒能夠有效地感染所加入的細胞，并將重組AAV病毒攜帶的外源基因(如報告基因)和/或基因元件帶入細胞中發(fā)揮作用。申請?zhí)枮?00910009059.6的申請專利的背景將外源基因和/或基因元件導(dǎo)入細胞、使其在細胞中表達或阻斷其它基因的表達，是分子生物學中常用的技術(shù)方法，稱之為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。這個過程往往需要載體(vector)和導(dǎo)入系統(tǒng)(deliverysystem)來介導(dǎo)?；蜉d體通常分為病毒載體和非病毒載體兩類。非病毒載體通常是借助人工制備或合成的材料如脂質(zhì)體、殼聚糖、多聚陽離子化合物等將DNA質(zhì)粒”包裹”成復(fù)合物導(dǎo)入細胞中，這個過程通常被稱為”轉(zhuǎn)染”(transfection)。而病毒載體則借助病毒天然的感染能力將”搭載”的外源基因和元件序列導(dǎo)入細胞中，這個過程和病毒感染過程相似，也被稱為”感o無論是轉(zhuǎn)染方式還是感染方式，通常的基因?qū)敕椒ǘ际窍葘⒓毎伻肱囵B(yǎng)板中、再加入DNA復(fù)合物或病毒進行”轉(zhuǎn)染”或”感染”；與常規(guī)方法在操作順序上有所不同的是，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法是先將所使用的重組病毒預(yù)先包被在孔板中，之后再加入細胞來實現(xiàn)感染，因此這樣的方法可稱作”反向感染”(reverseinfection)。為了便于區(qū)別，我們把常規(guī)方法進行的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法稱為”正向轉(zhuǎn)染”或”正向感染”。實際上，”微陣列”(MiCToarray)技術(shù)已經(jīng)廣泛用于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。其中最為常見的是DNAArray(基因芯片)。DNA分子因具有很好的理化穩(wěn)定性和獨特的堿基配對結(jié)構(gòu)，而成為理想陣列材料。比如將多種合成的寡核苷酸(單鏈DNA)作為探針有序地排列固定在表面經(jīng)過處理的玻片上制成”微陣列”(芯片)，而將待檢測的樣品提取核酸，用地高辛標記的隨機引物進行擴增和標記后與芯片上的探針雜交，最后顯色獲得雜交信號。根據(jù)信號所在的探針位置來判斷樣品中有與該探針序列互補的序列。除了DNA外，多肽和蛋白(包括抗體)也被成功地用來制成陣列，用于蛋白檢測。陣列(Array)技術(shù)的優(yōu)勢是具備高通量的特點，即一次檢測能同時獲得樣品與多個探針作用的信息。傳統(tǒng)的Southern雜交、Northern雜交和Western雜交都是將樣品經(jīng)過電泳分離后轉(zhuǎn)印到膜上,而用標記的探針來進行檢測。如果把這樣的操順序稱為”正向”方式，那么，陣列技術(shù)是將已知信息的物質(zhì)(探針)排布成點陣，而加入被檢測的對象進行檢測就可稱為”反向”方式。microRNA(miRNA)是長度在1825個核苷酸左右的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。miRNA在進化上高度保守，具有轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控功能。它由基因組DNA編碼，在RNA聚合酶II的作用下被轉(zhuǎn)錄。這些小分子通過RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)祀向到達mRNA,進而行使阻遏翻譯或引導(dǎo)酶切的功能。最近有研究表明，miRNA具有多種生物學功能，如調(diào)節(jié)細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等。有研究人員發(fā)現(xiàn)線蟲體內(nèi)的異時性基因lin-4編碼的小RNA與lin-14反義互補。據(jù)估計，脊椎動物基因組編碼多達1000種不同的miRNA，研究人員推測，這些miRNA可能調(diào)控至少30%的基因的表達。盡管研究人員目前已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)超過530種miRNA，但仍需進一步研究以了解這些分子的確切的細胞學功能，及其在疾病發(fā)生中所扮演的角色。有研究報道，miRNA具有腫瘤抑制因子及癌基因的作用。那些在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的miRNA被稱作oncogenicmiRNA,即oncomiR。oncomiR的失調(diào)與基因突變或表觀遺傳變異有關(guān)，這些變異包括缺失突變、擴增突變、點突變及DNA異常甲基化等。下表羅列出部分microRNA的表達與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、預(yù)后的關(guān)系權(quán)利要求1.一種基于AAV載體的、用于高通量地檢測活細胞的miRNA活性的miRNA活性檢測陣列的檢測技術(shù)方法。2.根據(jù)權(quán)利要求1，miRNA活性檢測陣列的檢測技術(shù)方法中所使用的miRNAAsensor，其特征在于，其基因組中包含F(xiàn)luc和Gluc兩個獨立的表達框，且表達框間被絕緣子序列分隔，其中Fluc表達框用于校正不同miRNAAsensor間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異，Gluc表達框用于探測細胞內(nèi)miRNA活性。3.根據(jù)權(quán)利要求2，miRNA活性檢測陣列的檢測技術(shù)方法中，病毒感染校正單元中的Fluc的表達水平與Gluc的表達水平有平行線性關(guān)系，miRNA活性檢測單元中的Gluc的表達水平與miRNA活性有平行線性關(guān)系。4.根據(jù)權(quán)利要求I，為校正miRNAAsensor間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異，我們以Fluc的表達水平來表示miRNAAsensor的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的高低,提出了轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)(Transductioncoefficient,TC)的概念，用轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)表示miRNAAsensor間的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的高低，這樣，可以有效地量化miRNAAsensor轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的高低,校正因不同miRNAAsensor轉(zhuǎn)導(dǎo)效率差異而導(dǎo)致的miRNAAsensorArray測量誤差。5.根據(jù)權(quán)利要求1，miRNA活性檢測陣列的檢測技術(shù)方法中所使用的miRNAAsensorArray,其特征在于,其組成miRNAAsensor分為攜帶miRNA祀序列的和不攜帶miRNA革巴序列的兩類，在進行miRNA活性檢測時,通過檢測比較這兩類miRNAAsensor報告基因Gluc的表達的差異得出miRNA活性。6.根據(jù)權(quán)利要求I,miRNA活性檢測陣列的檢測技術(shù)方法中所使用的miRNAAsensorArray，其特征在于，由于其標準化的制備過程，同一批次制備的組成相同的miRNAAsensorArray具有相同的轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)，因此應(yīng)用其檢測細胞內(nèi)miRNA活性時只需檢測Gluc表達活性即可，不必每次檢測均測定轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)。7.根據(jù)權(quán)利要求l，miRNA活性檢測陣列的檢測技術(shù)方法中，用于攜帶miRNA活性檢測單元的AAV病毒包括AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及其任意兩種型別的嵌合病毒。8.根據(jù)權(quán)利要求l，miRNA活性檢測陣列的檢測技術(shù)方法中，可用于檢測全部明確成熟序列的miRNA的活性，miRNA包括天然的和人工設(shè)計的且無物種限制。9.根據(jù)權(quán)利要求l，miRNA活性檢測陣列的檢測技術(shù)方法中，通過檢測細胞miRNA活性譜，篩選獲得細胞特定時空條件下的特征miRNA活性譜，利用特征miRNA活性譜推測細胞的一系列特征(如來源、種類、生理特征等)或評價外界因素(如藥物、轉(zhuǎn)基因、環(huán)境變化等)對細胞的作用效果。全文摘要本發(fā)明具體涉及一種基于AAV(Adeno-associatedvirus)載體的高通量miRNA活性檢測方法miRNAAsensorArray(miRNAsensorbasedAAVvectorArray，基于AAV載體的、用于miRNA活性檢測的生物傳感器)及其在細胞miRNA活性譜檢測、不同細胞特征miRNA活性譜檢測和外界因素(如藥物、轉(zhuǎn)基因)對細胞miRNA活性譜的影響等方面的應(yīng)用。miRNAAsensorArray由不攜帶miRNA靶序列的controlAsensor和多種攜帶miRNA靶序列的miRNAAsensor按照一定順序排列組成。ControlAsensor和miRNAAsensor均包含Gluc(Gaussialuciferase)和Fluc(fireflyluciferase)兩個獨立的表達單元，其中Gluc用于miRNA活性檢測，F(xiàn)luc用于計算miRNAAsensor的轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)，校正不同miRNAAsensor之間的感染性差異。使用時，將待檢測細胞加入到制備好的miRNAAsensorArray中，一段時間后檢測Gluc表達情況并根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)系數(shù)計算出細胞中miRNA活性譜。該方法為細胞miRNA活性譜的制作及其影響因素研究提供了新的選擇。文檔編號C40B40/02GK102719556SQ20111007614公開日2012年10月10日申請日期2011年3月29日優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日發(fā)明者吳小兵,田文洪,董哲岳,董小巖申請人:北京五加和分子醫(yī)學研究所有限公司