單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。該構(gòu)建方法包括以下步驟：從單細胞中制備cDNA樣品；對cDNA樣品進行片段化文庫構(gòu)建，得到單細胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫；其中，片段化文庫構(gòu)建步驟中采用物理破碎的方式對cDNA樣品進行片段化，且對片段化的cDNA樣品無需進行純化的步驟。本發(fā)明通過采用物理破碎的方式對單細胞樣品進行片段化，使破碎片段較小且相對均勻，進而使得所構(gòu)建的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的峰寬較為集中；且片段化后的樣品不經(jīng)純化步驟減少了樣品損失不僅能夠?qū)崿F(xiàn)微量樣品的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建，而且還能增加數(shù)據(jù)量產(chǎn)出的穩(wěn)定性，從而提高了大規(guī)模單細胞轉(zhuǎn)錄組文庫高通量測序的可靠性。
【專利說明】單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高通量測序【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著現(xiàn)代生物學的發(fā)展，細胞群體的研究已不再能滿足科研的需求，單細胞研究不僅能解決組織細胞所不能解決的細胞異質(zhì)性問題，而且還為解析單細胞的行為、機制以及與機體的關(guān)系提供了新的研究方向。目前，將高通量測序運用于單細胞研究的單細胞測序成為時下單細胞研究的一種新途徑，主要包括單細胞全基因組測序及單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。
[0003]對于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序來說，轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建是主要的難點，因為單細胞中mRNA含量低至10pg，無法通過常規(guī)的RNA轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建方法來構(gòu)建。因此，目前市場上能夠利用如此少量的mRNA進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建的產(chǎn)品只有Illumina公司的 DNA 文庫構(gòu)建試劑盒(iIlumina Nextera XT DNA sample preparat1n kit)。
[0004]Illumina公司的該試劑盒是采用化學方法對樣品進行片段化，即用轉(zhuǎn)座酶對cDNA進行打斷的方式建庫。其具體流程圖1所示，單細胞經(jīng)裂解后，mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后對cDNA進行預擴增后，采用轉(zhuǎn)座酶打斷的方式對cDNA進行片段化處理。于此同時，轉(zhuǎn)座酶在打斷后同時會在破碎片段的兩端加上接頭，然后再經(jīng)PCR對片段進行富集，該步驟中PCR的引物會在破碎片段的兩端帶上標簽序列(index)，加標簽序列的目的是給不同的樣品帶上不同的標簽，以便從得到的混合測序數(shù)據(jù)中分離出各樣品所對應(yīng)的測序數(shù)據(jù)。
[0005]Illumina公司的上述DNA文庫構(gòu)建試劑盒具有能從低至Ing的樣品起始量進行文庫構(gòu)建的巨大優(yōu)勢，但也存在文庫上機定量的不準，數(shù)據(jù)量產(chǎn)出不穩(wěn)定的問題。因為如果是數(shù)據(jù)產(chǎn)出過量，浪費成本；如果產(chǎn)量不足，還需要后期額外加測，耽誤項目周期。
[0006]因此，仍需要對現(xiàn)有的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建方法進行改進，以使所構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組測序文庫能夠滿足數(shù)據(jù)量產(chǎn)出穩(wěn)定的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在提供一種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，以提高文庫的數(shù)據(jù)量的產(chǎn)出穩(wěn)定性。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種單細胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步驟:從單細胞中制備cDNA樣品；對cDNA樣品進行片段化文庫構(gòu)建，得到單細胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫；其中，片段化文庫構(gòu)建步驟中采用物理破碎的方式對cDNA樣品進行片段化，且對片段化的產(chǎn)物無需進行純化的步驟。
[0009]進一步地，上述對cDNA樣品進行片段化文庫構(gòu)建的步驟包括:步驟SI，對cDNA樣品采用物理破碎的方式進行片段化，得到片段化樣品；步驟S2，對片段化樣品不經(jīng)過純化直接進行末端修復，同時添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，得到修復后樣品；步驟S3，對修復后樣品進行接頭連接，得到帶接頭樣品；步驟S4，對帶接頭樣品進行擴增，得到單細胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫。
[0010]進一步地，上述物理破碎的方式為采用自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對cDNA樣品進行片段化；優(yōu)選自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對cDNA樣品進行片段化時的參數(shù)設(shè)置為:循環(huán)數(shù)8%~12%，峰值入射功率170~180瓦；循環(huán)數(shù)/爆發(fā)200~220個；時間300~360s ;溫度4~8°C。
[0011]進一步地，自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對cDNA樣品進行片段化后得到的片段化樣品的長度為150~200bp。
[0012]進一步地，在得到片段化樣品之后，以及對片段化樣品進行末端修復的步驟之前，還包括對片段化樣品進行濃縮的步驟；優(yōu)選采用Thermo Scientific公司的ThermoScientific DNA SpeedlllV 離心濃縮系統(tǒng)。
[0013]進一步地，在所述步驟S2中采用NEB公司的末端修復酶試劑組合對所述片段化樣品不經(jīng)純化直接進行末端修復，同時添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，所述末端修復酶試劑組合包括10 X的NEBNext末端修復反應(yīng)緩沖液和NEBNext末端制備酶混合物；在所述步驟S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端連接酶混合物和NEBNext接頭對所述修復后樣品進行接頭連接；在所述步驟S4中采用KAPA B1公司的2 X的KaPA HiFi反應(yīng)混合物對所述接頭樣品進行擴增。
[0014]進一步地，當片段化樣品的量低至3ng時，在步驟S3中，對接頭進行稀釋后再進行接頭連接；優(yōu)選將接頭稀釋至1.0~2.0 μ M ;更優(yōu)選稀釋至1.5 μ Μ。 [0015]進一步地，在步驟S4中，擴增采用其中一條上帶有標簽序列的擴增引物進行擴增，優(yōu)選標簽序列為擴增引物上的一段6~10個按特定順序排列的堿基序列；更優(yōu)選擴增引物的序列為帶有標簽序列的SEQ ID N0.1:
[0016]5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’和不帶有標簽序列的SEQ ID N0.2:
[0017]5，-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3，。
[0018]進一步地，在步驟S4中，擴增的循環(huán)次數(shù)為10~15次，優(yōu)選13次。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種上述任一種構(gòu)建方法在研究細胞異質(zhì)性方面的應(yīng)用。
[0020]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過采用物理破碎的方式對單細胞樣品進行片段化，使破碎片段大小較小且相對均勻，使得所構(gòu)建的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的峰寬較為集中；且片段化后的樣品不經(jīng)過純化步驟減少了樣品的損失使得本發(fā)明的構(gòu)建方法不僅能夠?qū)崿F(xiàn)微量樣品的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建，而且還能增加數(shù)據(jù)量產(chǎn)出的穩(wěn)定性，從而提高了大規(guī)模單細胞轉(zhuǎn)錄組文庫高通量測序的可靠性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中:
[0022]圖1示出了現(xiàn)有技術(shù)的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建流程；[0023]圖2示出了采用現(xiàn)有技術(shù)所構(gòu)建的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的插入片段大小及峰寬；
[0024]圖3示出了本發(fā)明的實施例中所采用的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建流程；
[0025]圖4示出了本發(fā)明的實施例中單細胞的RNA樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的全長cDNA的大??；
[0026]圖5示出了本發(fā)明的實施例中所構(gòu)建的豬卵細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的插入片段大小及峰寬；
[0027]圖6示出了本發(fā)明的實施例中所構(gòu)建的豬卵細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫中堿基含量及堿基分布情況；以及
[0028]圖7示出了本發(fā)明的實施例中所構(gòu)建的豬卵細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫上機測序后實際所得的片段化樣品的大小分布。
【具體實施方式】
[0029]需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0030]在本發(fā)明中的術(shù)語“單細胞”是指單一類型細胞的單個細胞；“微量樣品”是指起始量在3~20ng的cDNA樣品。
[0031]正如背景技 術(shù)部分提到的，Illumina公司的DNA文庫構(gòu)建試劑盒中所提供的文庫構(gòu)建方法是采用轉(zhuǎn)座酶隨機打斷的方式進行片段化，且片段化和連接頭在同一步驟中完成，減少了單獨片段化和加接頭步步驟后對各自產(chǎn)物進行純化的步驟，有效降低了樣品的損失，具有起始樣品量低(通常為2~15ng，最低可達Ing)的極大優(yōu)勢而倍受推崇。然而，本發(fā)明的發(fā)明人通過對上述試劑盒的使用和研究發(fā)現(xiàn)，采用上述試劑盒所構(gòu)建的測序文庫存在插入峰很寬的問題,大約在300bp~100bp之間，如圖2所示。文庫峰寬的寬窄會對上機定量的準確性產(chǎn)生影響，進而影響上機量和產(chǎn)出。文庫峰寬越寬，定量的偏差就越大，在上機成簇過程中擴增效果會受到影響，優(yōu)先擴增小片段，使得小片段過量擴增而相對較大的片段擴增量相對較少。因此，導致數(shù)據(jù)產(chǎn)出偏差較大，穩(wěn)定性差。
[0032]為了改善上述缺陷，本發(fā)明的發(fā)明人對單細胞測序文庫構(gòu)建方法進行了大量的研究和實驗，提出了一種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步驟:從單細胞中制備cDNA樣品；對cDNA樣品進行片段化文庫構(gòu)建，得到單細胞的測序文庫；其中，片段化文庫構(gòu)建步驟中采用物理破碎的方式對cDNA樣品進行片段化，且對片段化的cDNA樣品無需進行純化的步驟。
[0033]本發(fā)明的上述構(gòu)建方法，通過采用物理破碎的方式對單細胞的cDNA樣品進行片段化，使破碎片段大小較小，使得所構(gòu)建的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的峰寬較為集中，且對片段化的樣品不經(jīng)純化進行文庫構(gòu)建，減少了樣品損失，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)微量樣品的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建，而且還能提高文庫上機定量的準確性，使得下機數(shù)據(jù)量產(chǎn)出穩(wěn)定，從而提高了大規(guī)模單細胞轉(zhuǎn)錄組文庫高通量測序的可靠性。
[0034]在本發(fā)明的構(gòu)建方法的cDNA樣品，是在單細胞樣品裂解后，直接將細胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄的步驟通常包括:由細胞樣品進行反轉(zhuǎn)錄，得到第一鏈cDNA ;對第一鏈cDNA進行擴增，得到雙鏈的cDNA。[0035]對上述得到的第一鏈cDNA和雙鏈cDNA最好都經(jīng)過純化的步驟，純化的步驟能夠使得樣品的純度更高，提高后續(xù)構(gòu)建所得到文庫的質(zhì)量。該步驟中可以采用市售的純化試劑盒進行相應(yīng)的純化步驟，在本發(fā)明中，優(yōu)選使用Clontech公司的APRI Ampure XP磁珠進行純化，該純化方法純化效率高，純化速度快，且操作更方便。
[0036]在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施例中，對cDNA樣品進行片段化文庫構(gòu)建的步驟包括:步驟SI，對DNA樣品或cDNA樣品采用物理破碎的方式進行片段化，得到片段化樣品；步驟S2，對片段化樣品不經(jīng)過純化直接進行末端修復和添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，得到修復后樣品；步驟S3，對修復后樣品進行接頭連接，得到帶接頭樣品；步驟S4，對帶接頭樣品進行擴增，得到單細胞轉(zhuǎn)錄組的測序文庫。
[0037]在上述實施例中，采用物理破碎的方式進行片段化，相比化學破碎的方式(轉(zhuǎn)座酶隨機打斷的方式)，物理破碎的方式對單細胞樣品進行片段化具有使破碎得到的片段大小的較小，且能使破碎片段大小較為集中，片段大小相對均勻，使得后續(xù)對文庫定量檢測的準確度大大提高，進而使得上機擴增成簇步驟中各插入片段的擴增效率相對均等，減少了偏差擴增現(xiàn)象，使數(shù)據(jù)量產(chǎn)出更穩(wěn)定，進而避免因為數(shù)據(jù)量產(chǎn)出不足需要額外加測而耽誤項目周期或者數(shù)據(jù)量產(chǎn)出過多浪費成本。且對上述片段化樣品不經(jīng)過純化直接進行后續(xù)步驟，能減少樣品損失，使本發(fā)明的上述構(gòu)建方法能夠適用于單細胞轉(zhuǎn)錄組的文庫構(gòu)建。
[0038]對樣品進行物理破碎的方式通常米用超聲破碎，適用于本發(fā)明的超聲破碎儀包括DNA切割超聲破碎儀Q800R或自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220。物理破碎方式具有重復性好，得到的片段較小，使所構(gòu)建的文庫的峰寬較窄的優(yōu)點。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施例中，采用自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對樣品進行片段化。更優(yōu)選自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對樣品進行片段化時的參數(shù)設(shè)置為:循環(huán)數(shù)8~12%，峰值入射功率170~180瓦；循環(huán)數(shù)/爆發(fā)200~220個；時間300~360s ;溫度4~8°C。
[0039]在上述自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對cDNA樣品進行片段化的步驟中，得到的片段化樣品的長度為150~200bp。發(fā)明人通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，當設(shè)置CovarisS220的參數(shù)在上述范圍內(nèi)時，通常可得到長度為150~200bp的片段化樣品，這使得所構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組測序文庫的峰寬集中在270~320bp，提高文庫定量的準確性，從而提高了產(chǎn)出數(shù)據(jù)量的穩(wěn)定性。
[0040]在上述采用物理破碎方式得到片段化樣品后，通常還需要經(jīng)過磁珠純化或過吸附柱純化的方法對片段化的樣品進行純化濃縮。但在本發(fā)明中，當片段化樣品的體積大于末端修復酶反應(yīng)體系所要求的最小體積時，在進行末端修復的步驟之前，還包括對片段化樣品進行濃縮的步驟。此處的濃縮不是用磁珠純化或者過柱子的濃縮方法，而是采用濃縮儀濃縮的方法，能夠更大程度地既避免片段化的樣品損失。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施例中，采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNA SpeedlllV離心濃縮系統(tǒng)。通過濃縮步驟使片段化樣品的濃度得到相對提高，并且符合文庫構(gòu)建試劑盒的體系要求。當片段化樣品的體積小于反應(yīng)體系所需的最小體積時，可通過加高純水稀釋至所需的最小體積。
[0041]在上述所說的文庫構(gòu)建中，在上述步驟S2中采用NEB公司的末端修復酶試劑組合，其末端修復酶試劑組合包括1X的NEBNext末端修復反應(yīng)緩沖液(1XNEBNext EndRepair React1n Buffer)和 NEBNext 末端制備酶混合物(NEBNext End Prep Enzyme Mix)；經(jīng)發(fā)明人的大量實驗驗證，上述末端修復酶試劑組合在一步反應(yīng)中完成修復與加A的步驟，方便快捷，減少出錯幾率。在上述步驟S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端連接酶混合物(Blunt/TA Ligase Master Mix)和NEBNext接頭進行接頭連接的步驟,該連接酶混合物對接頭的連接效率較高，利于增加最終的文庫產(chǎn)量。在步驟S4中采用2XΚΑΡΑ.B1公司的KaPA HiFi反應(yīng)混合物進行擴增，采用這種聚合酶擴增穩(wěn)定性好，保真性更高，且對于高GC含量模板的擴增一樣有效。上述各步驟中所用到的試劑并不僅限于上述幾種，只要能夠達與上述幾種效果相當或更好的市售試劑或自配制試劑同樣適用于本發(fā)明。
[0042]在上述轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建的過程中，根據(jù)所得到片段化樣品的總量適當調(diào)整接頭的用量。根據(jù)發(fā)明人大量實驗所得的經(jīng)驗，當片段化樣品的量在低至3ng時，在進行接頭連接的步驟中，先對接頭進行稀釋至1.0~2.0 μ M ;優(yōu)選稀釋至1.5 μ M后再進行接頭連接。將上述接頭濃度稀釋至上述濃度范圍時，既能與建庫起始量低相匹配，又能減少接頭使用量，還可以避免接頭污染。這樣，本發(fā)明的這種方法也能夠由相對較低的起始量實現(xiàn)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建。
[0043]在本發(fā)明的上述構(gòu)建方法的擴增步驟中，擴增引物采用發(fā)明人自己設(shè)計的單端帶有標簽序列的擴增引物進行擴增。單端帶有標簽序列的擴增引物是指兩條擴增引物中的其中一條上帶有標簽序列。自己設(shè)計可以根據(jù)所欲混合測序的樣品數(shù)量的多少，設(shè)計6~10個按特定順序排列的堿基序列作為標簽序列。利用發(fā)明人自己合成的單端帶有標簽序的引物序列，這使得本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組測序文庫能夠與其他單端帶有標簽序列的文庫樣品進行混合測序，提高通道(lane)及測序儀的有效利用率，減少資源的浪費。
[0044]在本發(fā)明一種優(yōu)選的實施例中，擴增引物序列采用帶有標簽序列的SEQ ID N0.1:
[0045]5， -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’和不帶有標簽序列的SEQ ID N0.2:
[0046]5，-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3，。本發(fā)明的上述帶有標簽序列的引物中的標簽序列為CGTGAT。
[0047]由于Illumina公司的DNA文庫構(gòu)建試劑盒采用雙標簽序列(index),當有多個樣品需要上機時，無法與其他樣品混合在一個通道(lane)中進行測序，而需要單獨占用一個通道來進行測序，這樣造成測序儀器空間的浪費和測序成本的增高。而本發(fā)明通過使用單端帶有標簽序列的引物進行擴增，使得所構(gòu)建的文庫能夠與其他具有單端標簽序列的樣品的文庫進行混合測序，從而減少資源浪費，降低成本。
[0048]在本發(fā)明的上述擴增步驟中，一般擴增循環(huán)次數(shù)為10次，在此基礎(chǔ)上，在不同的樣品測序文庫的實際構(gòu)建過程中，可根據(jù)片段化樣品的起始量的多少對循環(huán)次數(shù)進行調(diào)整。在本發(fā)明中優(yōu)選上述擴增循環(huán)次數(shù)為10~15次，更優(yōu)選13次。將擴增次數(shù)控制在上述范圍內(nèi)，既能實現(xiàn)對片段化樣品的有效擴增，使其滿足上機測序濃度的要求；又不至于造成片段化樣品的過度擴增，造成非特異性擴增從而減少測序數(shù)據(jù)的實際有效量。
[0049]由于本發(fā)明的上述構(gòu)建方法能夠有效提高單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫的測序質(zhì)量，提高所測數(shù)據(jù)的有效量，這為單細胞生物學的研究提供了一種新的研究手段。因此，本發(fā)明的上述單細胞轉(zhuǎn)錄組測 序文庫的構(gòu)建方法能夠應(yīng)用于細胞異質(zhì)性的研究。
[0050]下面將結(jié)合實施例來進一步說明本發(fā)明的有益效果。
[0051]下列實施例是參照附圖3，以豬卵細胞樣品進行詳細說明本發(fā)明的構(gòu)建方法。下列實施例中所涉及的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，前期反轉(zhuǎn)和預擴增所用的試劑來自Clontech公司；2XKaPA HiFi反應(yīng)混合物(Master Mix)購自美國ΚΑΡΑ.B1公司；其他試劑如無特別說明均為NEB公司的產(chǎn)品；所有水為超純水。
[0052]實驗一、第一鏈cDNA的合成(在潔凈工作室)
[0053]I)配制細胞裂解液:裂解液(Triton-Χ-ΙΟΟ溶液)19 μ L
[0054]RNA酶抑制劑I μ L
[0055]總體積20 μ L。
[0056]2)單細胞樣品制備:取I μ L含單個豬卵細胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至含有2.5 μ L細胞裂解液的無RNA酶的200 μ L PCR管中，然后立即置于干冰上。
[0057]3)將單細胞樣品放置在經(jīng)-20°C預冷的PCR管架上，向其中加入3’SMART⑶S引物II A (12 μ M) I μ I。混勻各組份，然后瞬時離心，將反應(yīng)管放在PCR儀中，72°C，孵育3min。然后將反應(yīng)管放回預冷的PCR架中。
[0058]與此同時，在室溫中混勻以下試劑:
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種單細胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以下步驟: 從單細胞中制備CDNA樣品； 對所述cDNA樣品進行片段化文庫構(gòu)建，得到所述單細胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫； 其中，所述片段化文庫構(gòu)建步驟中采用物理破碎的方式對所述cDNA樣品進行片段化，且對片段化的產(chǎn)物無需進行純化的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，對所述cDNA樣品進行片段化文庫構(gòu)建的步驟包括: 步驟SI，對所述cDNA樣品采用物理破碎的方式進行片段化，得到片段化樣品； 步驟S2，對所述片段化樣品不經(jīng)過純化直接進行末端修復，同時添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，得到修復后樣品； 步驟S3，對所述修復后樣品進行接頭連接，得到帶接頭樣品； 步驟S4，對所述帶 接頭樣品進行擴增，得到所述單細胞的轉(zhuǎn)錄組測序文庫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述物理破碎的方式為采用自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對所述cDNA樣品進行片段化；優(yōu)選所述自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對所述cDNA樣品進行片段化時的參數(shù)設(shè)置為:循環(huán)數(shù)8%~12%，峰值入射功率170~180瓦；循環(huán)數(shù)/爆發(fā)200~220個；時間300~360s ;溫度4~8V。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述自動聚焦聲波樣本處理儀Covaris S220對所述cDNA樣品進行片段化后得到的所述片段化樣品的長度為150~200bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在得到所述片段化樣品之后，以及對所述片段化樣品進行所述末端修復的步驟之前，還包括對所述片段化樣品進行濃縮的步驟；優(yōu)選米用 Thermo Scientific 公司的 Thermo Scientific DNA SpeedlllV 離心濃縮系統(tǒng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于， 在所述步驟S2中采用NEB公司的末端修復酶試劑組合對所述片段化樣品不經(jīng)純化直接進行末端修復，同時添加腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，所述末端修復酶試劑組合包括1X的NEBNext末端修復反應(yīng)緩沖液和NEBNext末端制備酶混合物； 在所述步驟S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端連接酶混合物和NEBNext接頭對所述修復后樣品進行接頭連接； 在所述步驟S4中采用KAPA B1公司的2X的KaPA HiFi反應(yīng)混合物對所述接頭樣品進行擴增。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，當所述片段化樣品的量低至3ng時，在所述步驟S3中，對所述接頭進行稀釋后再進行接頭連接；優(yōu)選將所述接頭稀釋至1.0~2.0 μ M ;更優(yōu)選稀釋至1.5 μ Mo
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在所述步驟S4中，所述擴增采用其中一條上帶有標簽序列的擴增引物進行擴增，優(yōu)選所述標簽序列為所述擴增引物上的一段6~10個按特定順序排列的堿基序列；更優(yōu)選所述擴增引物的序列為帶有標簽序列的SEQID N0.1:5’ -CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT CTTCCGATCT-3 ’ 和不帶有標簽序列的SEQ ID N0.2:
5’ -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT CT-3’。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，其特征在于，在所述步驟S4中，所述擴增的循環(huán)次數(shù)為10~15次，優(yōu)選13次。
10.權(quán)利要求1 至9中任一項所述的構(gòu)建方法在研究細胞異質(zhì)性方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C40B50/06GK104032377SQ201410308023
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】王大偉, 王苗英, 王棪, 曹志生, 劉運超, 朱海浩 申請人:北京諾禾致源生物信息科技有限公司