專利名稱：檢測(cè)單細(xì)胞和群細(xì)胞行為的多尺度集成細(xì)胞阻抗傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于細(xì)胞的檢測(cè)的領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)細(xì)胞行為的阻抗傳感器。
背景技術(shù)：
生物電子學(xué)的興起為傳統(tǒng)的檢測(cè)細(xì)胞和生物大分子生物學(xué)行為提供了新的有效 的方法。傳統(tǒng)生物檢測(cè)方法包括一些生化和免疫學(xué)的方法，例如用熒光染料標(biāo)記，可以檢測(cè) 多種特征蛋白。用MTT/XTT比色法測(cè)定利用代謝正常細(xì)胞的線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可將 四唑鹽類物質(zhì)(如MTT、XTT、WST-1等)還原為紫色的結(jié)晶狀的物質(zhì)的原理來(lái)反映細(xì)胞的活 性。細(xì)胞活性和增殖能力越強(qiáng)紫色結(jié)晶的物質(zhì)越多，然后通過酶標(biāo)儀讀取0D值完成測(cè)試。 然而這類生物化學(xué)和免疫方法都是終點(diǎn)測(cè)試，不能連續(xù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，需要進(jìn)行標(biāo)記，無(wú)法動(dòng) 態(tài)反應(yīng)細(xì)胞的中間過程狀態(tài)。生物電子學(xué)的方法能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生理狀態(tài)，為實(shí)驗(yàn)提供 了更豐富的信息。 一種典型的應(yīng)用是將細(xì)胞培養(yǎng)在微電極上，并測(cè)量細(xì)胞狀態(tài)及外部剌激 對(duì)細(xì)胞的影響。 群體細(xì)胞所反映出的群體行為是眾多單個(gè)細(xì)胞行為的平均， 一方面，群體細(xì)胞信 號(hào)更能準(zhǔn)確反映真實(shí)的群體行為，能夠一定程度抑制群體細(xì)胞培養(yǎng)中異質(zhì)性造成的影響， 使信號(hào)更為穩(wěn)定；另一方面，群體細(xì)胞無(wú)法精確反映單個(gè)細(xì)胞行為，尤其當(dāng)群體細(xì)胞中存 在某些有特殊價(jià)值的細(xì)胞個(gè)體，對(duì)單細(xì)胞測(cè)試需要排除來(lái)自細(xì)胞之間相互影響所產(chǎn)生的信 號(hào)。因此，需要對(duì)個(gè)體細(xì)胞以及群體細(xì)胞多種參數(shù)同時(shí)測(cè)試才能更好的將細(xì)胞行為與外在 剌激及胞內(nèi)變化關(guān)聯(lián)起來(lái)。 國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于利用生物電阻抗技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)群體培養(yǎng)的細(xì)胞行為研究的描 述。例如，在2005年10月12日公開的公開號(hào)為CN1681938的中國(guó)專利里，以及在該專利 里包含的相關(guān)報(bào)道所描述的多種利用定位于絕緣基底的電極陣列來(lái)檢測(cè)電極表面的細(xì)胞 或分子的裝置，它能反映整個(gè)培養(yǎng)腔內(nèi)的整體細(xì)胞響應(yīng)，但無(wú)法精確測(cè)量某個(gè)細(xì)胞的行為。 因此急需一種能用于同時(shí)研究群體細(xì)胞以及單個(gè)細(xì)胞行為的細(xì)胞阻抗分析系統(tǒng)，以對(duì)單細(xì) 胞及群體細(xì)胞響應(yīng)差異對(duì)比分析來(lái)更深入了解全面的細(xì)胞行為。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)單細(xì)胞和群細(xì)胞行為的多尺度集成細(xì)胞阻抗傳 感器，可用于同時(shí)檢測(cè)單細(xì)胞和群細(xì)胞行為。 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是該檢測(cè)單細(xì)胞和群細(xì)胞行為的 多尺度集成細(xì)胞阻抗傳感器主要包括PCB板、絕緣基片、四個(gè)叉指電極陣列、連接墊、微電 極、培養(yǎng)容器和頂蓋，所述四個(gè)叉指電極陣列對(duì)稱地分布在絕緣基片上，在絕緣基片的邊緣 位置分布有連接墊，每個(gè)叉指電極陣列的總線分別通過引線與相應(yīng)的連接墊連接，所述微 電極相應(yīng)地分布在各叉指電極陣列的總線的至少一個(gè)開口處，各微電極通過引線與相應(yīng)的 連接墊連接；所述培養(yǎng)容器設(shè)有分別與四個(gè)叉指電極陣列所在的區(qū)域相匹配的四個(gè)培養(yǎng) 腔；頂蓋設(shè)有分別與四個(gè)培養(yǎng)腔相匹配的四個(gè)腔蓋；所述絕緣基片上的連接墊與PCB板連接，培養(yǎng)容器的四個(gè)培養(yǎng)腔分別對(duì)應(yīng)地固定在四個(gè)叉指電極陣列所在的區(qū)域上，四個(gè)腔蓋 分別對(duì)應(yīng)地置于四個(gè)培養(yǎng)腔內(nèi)。 進(jìn)一步地，本發(fā)明所述絕緣基片呈矩形，各叉指電極陣列的總線的一個(gè)開口與所 述矩形的絕緣基片的相應(yīng)直角相對(duì)。 進(jìn)一步地，本發(fā)明所述微電極僅分布在各叉指電極陣列的總線的與所述矩形的絕 緣基片的相應(yīng)直角相對(duì)的開口處。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)是利用兼具群體細(xì)胞阻抗測(cè)試功能的叉指 電極作為參考電極，創(chuàng)造性的解決了單細(xì)胞阻抗檢測(cè)中的參考電極集成問題，提高了傳感 器的集成程度，使之能用于同時(shí)、無(wú)損、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)群體細(xì)胞和單細(xì)胞的行為。該傳感器 在檢測(cè)群體細(xì)胞對(duì)外部剌激作用下的群體平均行為的同時(shí)，具有單細(xì)胞分辨率的微電極能 在排除細(xì)胞之間相互作用干擾下深入揭示單細(xì)胞的行為。


下面結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1是本發(fā)明絕緣基片上的電極分布示意圖；
圖2是本發(fā)明傳感器結(jié)構(gòu)分解示意圖； 圖3是用于連接絕緣基片和PCB板的金屬夾子的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，圖3中的右圖 是左圖的右視圖； 圖4(a)是單細(xì)胞在微電極上的阻抗模型；
圖4(b)是多細(xì)胞在叉指電極上的阻抗模型； 圖5是群細(xì)胞在本發(fā)明的叉指電極表面貼附前后測(cè)得的阻抗和相位曲線圖；
圖6是單個(gè)細(xì)胞在本發(fā)明的微電極表面貼附前后所測(cè)得的阻抗和相位曲線圖；
圖7是本發(fā)明傳感器的叉指電極連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)貼附過程的細(xì)胞阻抗變 化曲線圖； 圖8是本發(fā)明傳感器的微電極連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)貼附過程的細(xì)胞阻抗變化 曲線圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種多尺度集成細(xì)胞阻抗傳感器，通過同時(shí)測(cè)量由單細(xì)胞導(dǎo)致的阻 抗變化和群體細(xì)胞的平均行為來(lái)檢測(cè)電極表面的細(xì)胞。該傳感器包括PCB板11、絕緣基片 1、四個(gè)叉指電極陣列4、連接墊2、微電極5、培養(yǎng)容器10和頂蓋9，四個(gè)叉指電極陣列4對(duì) 稱地分布在絕緣基片1上，在絕緣基片1的邊緣位置分布有連接墊2，每個(gè)叉指電極陣列的 總線3分別通過相應(yīng)的引線7與相應(yīng)的連接墊2連接，微電極5相應(yīng)地分布在各叉指電極 陣列4的總線的至少一個(gè)開口 8處，各微電極通過相應(yīng)的引線7與相應(yīng)的連接墊2連接；培 養(yǎng)容器10設(shè)有分別與四個(gè)叉指電極陣列所在的區(qū)域6相匹配的四個(gè)培養(yǎng)腔101 ;頂蓋9設(shè) 有分別與四個(gè)培養(yǎng)腔101相匹配的四個(gè)腔蓋91 ;絕緣基片1的連接墊2與PCB板連接，培 養(yǎng)容器10的四個(gè)培養(yǎng)腔101分別對(duì)應(yīng)地固定在四個(gè)叉指電極陣列所在的區(qū)域6上，四個(gè)腔 蓋91分別對(duì)應(yīng)地置于四個(gè)培養(yǎng)腔101內(nèi)。 如圖1所示，交替排列的多個(gè)電極分別與兩根總線3相連形成叉指電極陣列4，兩根總線3互不相連，兩根總線的端部之間相應(yīng)地形成兩個(gè)開口 8。四個(gè)叉指電極陣列4對(duì)稱 地分布在絕緣基片1上。叉指電極陣列4的單個(gè)電極的寬度以及相鄰兩個(gè)電極的間距會(huì)影 響測(cè)試的靈敏度和一致性。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，選取叉指電極陣列4中的各 電極的寬度為40微米，相鄰兩個(gè)電極間距為40微米，既能提高阻抗檢測(cè)靈敏度，又能使細(xì) 胞阻抗變化的響應(yīng)頻段處于較低頻。如圖5所示，細(xì)胞貼附后阻抗變化最明顯的頻段一般 在500kHz頻率以下，降低了對(duì)測(cè)試系統(tǒng)的頻率范圍要求。 微電極5的大小與細(xì)胞大小相當(dāng)，用于測(cè)試貼附在其表面的單個(gè)細(xì)胞阻抗。在圖 l所示的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，有八個(gè)微電極，其中包括四個(gè)大小相同的直徑為50微米的 微電極和另四個(gè)大小相同的直徑為20微米的微電極，均分布于叉指電極陣列4的總線3的 其中一個(gè)開口 8處。作為本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，也可以同時(shí)在叉指電極陣列4的總線 3的另一個(gè)開口 8處分布有微電極。每個(gè)微電極5分別通過相應(yīng)的引線7與分布在絕緣基 片1的邊緣位置的一個(gè)連接墊2相連，并且各引線7之間互不交錯(cuò)。在所述的實(shí)施方式中， 兩種不同大小的微電極5可用于不同種類的細(xì)胞研究，并且該布局可最大程度減小微電極 5的引線7的長(zhǎng)度，從而減小了引線帶來(lái)的阻抗和干擾。并且該設(shè)計(jì)中，利用叉指電極作為 參考電極，去除了傳統(tǒng)的大面積的參考電極，大大提高了傳感器的集成程度，并且叉指電極 能減小細(xì)胞或溶液對(duì)參考電極的影響，提高了作為參考電極的穩(wěn)定性。
在培養(yǎng)容器10內(nèi)設(shè)有四個(gè)通孔作為培養(yǎng)腔101，培養(yǎng)容器10垂直粘結(jié)在絕緣基片 1上，使四個(gè)培養(yǎng)腔101的底部正好與叉指電極陣列4所在的區(qū)域6重合，由此形成4個(gè)不 漏液的彼此獨(dú)立的培養(yǎng)腔101。每個(gè)叉指電極陣列4所在的區(qū)域6包含該叉指電極陣列4 和位于該叉指電極陣列4的總線3的開口 8處的微電極5。在一個(gè)優(yōu)選的方式中，培養(yǎng)容器 10采用Teflon材料。頂蓋9上設(shè)有四個(gè)凸起作為四個(gè)培養(yǎng)腔101的腔蓋，該四個(gè)腔蓋91 分別與四個(gè)培養(yǎng)腔101相匹配，使得當(dāng)四個(gè)腔蓋91分別對(duì)應(yīng)地置于四個(gè)培養(yǎng)腔101內(nèi)時(shí)可 防止測(cè)試過程中細(xì)菌污染和溶液蒸發(fā)。 如圖l所示，連接墊2用于使絕緣基片l上的各電極與外部測(cè)試系統(tǒng)連接，每個(gè)連 接墊2可用一個(gè)如圖3所示的金屬夾子的咬合端13咬合，該金屬夾子的另一端焊接于PCB 電路板11上，從而與外部測(cè)試系統(tǒng)相連。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，連接墊2的長(zhǎng)度與寬 度須與金屬夾子大小匹配，并且金屬夾子的咬合端13的口徑須略小于絕緣基片1的厚度， 在本實(shí)施方式中，絕緣基片1的厚度為500微米，金屬夾子的咬合端13的口徑為450微米。
傳感器的外部測(cè)試系統(tǒng)包括一個(gè)多通道阻抗分析儀，它們分別與PCB電路板11的 全部或多個(gè)焊盤12相連，從而監(jiān)測(cè)叉指電極陣列4和微電極5上的阻抗變化。
單細(xì)胞與多細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果通過基于圖4的阻抗等效電路，可以得出細(xì)胞貼附時(shí)間 隙阻抗、細(xì)胞連接以及細(xì)胞膜阻抗。 本發(fā)明是在利用微加工技術(shù)制作的器件上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在絕緣基片1的相應(yīng)電 極上施加一個(gè)微弱的正弦激勵(lì)，細(xì)胞貼附對(duì)電極表面電場(chǎng)會(huì)有阻礙作用，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂 增殖、凋亡以及受到藥物作用引起相應(yīng)的形態(tài)變化時(shí)，經(jīng)過細(xì)胞調(diào)制的微弱的正弦激勵(lì)便 可以間接反映細(xì)胞的生物變化。單細(xì)胞貼附在微電極上，使電極與溶液無(wú)直接接觸，則電極 的阻抗變化大部分反應(yīng)了細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)部狀態(tài)的改變，比如，對(duì)細(xì)胞基因的改變從而改 變細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞形態(tài)的變化，又如，線粒體酶活性改變引起細(xì)胞代謝水平 的改變也同樣能反應(yīng)在細(xì)胞阻抗的變化上；另外，當(dāng)細(xì)胞之間相互作用形成特定連接時(shí)，它們的性質(zhì)會(huì)隨之改變，利用叉指電極可以有效的研究群體細(xì)胞的行為特征。本發(fā)明傳感器 的制備方法 選擇4英寸Co皿ing 7740玻璃作絕緣基底1，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)工藝清洗甩干。采用磁控 濺射的方法，首先沉積20nm厚的黏附層，用于該目的的優(yōu)選材料包括鎳、鉻、ITO、鎢、鈦以 及這些金屬的合金。然后采用真空蒸發(fā)或磁控濺射的方法，正面沉積300nm厚的電極層，該 優(yōu)選材料的例子包括金、鉬、鉑黑、鈀和銀。并用保護(hù)膜(抗光蝕劑PR)覆蓋在金層上。然 后，利用照相平版印刷術(shù)將保護(hù)膜光刻出圖案，然后利用保護(hù)膜作為金層掩膜濕法腐蝕要 求的電極圖案。采用PECVD方法沉積100nm/500nm/100nm厚的Si3N4/Si02/Si3N4作為絕緣 層。然后，利用照相平版印刷術(shù)將保護(hù)膜光刻出圖案，然后利用保護(hù)膜作為絕緣層掩膜反 應(yīng)離子刻蝕法(RIE)刻蝕出要求的絕緣層圖案。最后將保護(hù)膜洗去，劃片得到獨(dú)立的傳感 器芯片。用無(wú)毒的環(huán)氧樹脂將具有四個(gè)獨(dú)立腔室的有機(jī)玻璃10對(duì)應(yīng)電極區(qū)域6粘到傳感 器芯片上，形成四個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞生長(zhǎng)空間，然后將金屬夾子對(duì)應(yīng)傳感器芯片邊緣的連接墊2 嚙合并把另一端焊接于一塊電路板10上完成最后的制作。
本發(fā)明傳感器對(duì)細(xì)胞行為的測(cè)試
(1)阻抗和相位測(cè)試 將封裝好的傳感器用酒精浸泡半個(gè)小時(shí)，然后用去離子水清洗干凈，用氮?dú)獯蹈伞?向每個(gè)培養(yǎng)腔101中加入100 ii L細(xì)胞培養(yǎng)液，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置5分鐘，然后開始進(jìn) 行頻譜掃描測(cè)試，測(cè)試頻率范圍為從lkHz到lMHz，每十倍頻取5個(gè)頻率點(diǎn)，正弦交流電壓 幅值為峰峰值50mV.單次頻率掃描可在五分鐘內(nèi)完成.對(duì)未加入細(xì)胞的芯片進(jìn)行頻率掃描 的結(jié)果記為Z。.然后加入100 ii L密度為2萬(wàn)/mL 3T3細(xì)胞懸液，將傳感器置于培養(yǎng)箱培養(yǎng) 10小時(shí)后，取出再次進(jìn)行頻譜掃描.圖5和圖6分別為相同條件下測(cè)得的群細(xì)胞和單細(xì)胞 的阻抗和相位曲線圖，它們具有不同的特征，結(jié)合圖4所示的模型可以綜合分析出細(xì)胞膜 和膜間阻抗以及細(xì)胞內(nèi)部生理狀況的改變。
(2)細(xì)胞動(dòng)態(tài)貼附監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn) 于傳感器的培養(yǎng)腔101中加入100 ii L細(xì)胞培養(yǎng)液，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置5分 鐘，然后分別加入100ii L濃度為2萬(wàn)/mL、1萬(wàn)/mL、5000/mL、2500/mL的細(xì)胞懸液于細(xì)胞的 培養(yǎng)腔101中，在頻率為500kHz、幅值為峰峰值50mV的正弦激勵(lì)下對(duì)芯片阻抗進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程 監(jiān)測(cè)。圖7和圖8分別為相同條件下測(cè)得的群細(xì)胞和單細(xì)胞的動(dòng)態(tài)貼附過程。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)單細(xì)胞和群細(xì)胞行為的多尺度集成細(xì)胞阻抗傳感器，其特征是包括PCB板(11)、絕緣基片(1)、四個(gè)叉指電極陣列(4)、連接墊(2)、微電極(5)、培養(yǎng)容器(10)和頂蓋(9)，所述四個(gè)叉指電極陣列(4)對(duì)稱地分布在絕緣基片(1)上，在絕緣基片(1)的邊緣位置分布有連接墊(2)，每個(gè)叉指電極陣列的總線(3)分別通過引線與相應(yīng)的連接墊(2)連接，所述微電極(5)相應(yīng)地分布在各叉指電極陣列(4)的總線的至少一個(gè)開口(8)處，各微電極(5)通過引線與相應(yīng)的連接墊(2)連接；所述培養(yǎng)容器(10)設(shè)有分別與四個(gè)叉指電極陣列所在的區(qū)域(6)相匹配的四個(gè)培養(yǎng)腔(101)；頂蓋(9)設(shè)有分別與四個(gè)培養(yǎng)腔(101)相匹配的四個(gè)腔蓋(91)；所述絕緣基片(1)上的連接墊(2)與PCB板(11)連接，培養(yǎng)容器(10)的四個(gè)培養(yǎng)腔(101)分別對(duì)應(yīng)地固定在四個(gè)叉指電極陣列所在的區(qū)域(6)上，四個(gè)腔蓋(91)分別對(duì)應(yīng)地置于四個(gè)培養(yǎng)腔(101)內(nèi)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)單細(xì)胞和群細(xì)胞行為的多尺度集成細(xì)胞阻抗傳感器，其特征是所述絕緣基片(1)呈矩形，各叉指電極陣列(4)的總線的一個(gè)開口 (8)與所述矩形的絕緣基片(1)的相應(yīng)直角相對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)單細(xì)胞和群細(xì)胞行為的多尺度集成細(xì)胞阻抗傳感器，其特征是所述微電極(5)僅分布在各叉指電極陣列(4)的總線的與所述矩形的絕緣基片(1)的相應(yīng)直角相對(duì)的開口 (8)處。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)單細(xì)胞和群細(xì)胞行為的多尺度集成細(xì)胞阻抗傳感器，它有四個(gè)叉指電極陣列對(duì)稱地分布在絕緣基片上，在絕緣基片的邊緣位置分布有連接墊，每個(gè)叉指電極陣列的總線分別通過引線與相應(yīng)的連接墊連接，微電極相應(yīng)地分布在各叉指電極陣列的總線的至少一個(gè)開口處，各微電極通過引線與相應(yīng)的連接墊連接；培養(yǎng)容器設(shè)有分別與四個(gè)叉指電極陣列所在的區(qū)域相匹配的四個(gè)培養(yǎng)腔；頂蓋設(shè)有分別與四個(gè)培養(yǎng)腔相匹配的四個(gè)腔蓋；絕緣基片上的連接墊與PCB板連接，培養(yǎng)容器的四個(gè)培養(yǎng)腔分別對(duì)應(yīng)地固定在四個(gè)叉指電極陣列所在的區(qū)域上，四個(gè)腔蓋分別對(duì)應(yīng)地置于四個(gè)培養(yǎng)腔內(nèi)。該傳感器不僅提高了集成程度，且能同時(shí)檢測(cè)群體細(xì)胞和單細(xì)胞的行為。
文檔編號(hào)G01N27/02GK101712925SQ200910154679
公開日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者劉清君, 吳成雄, 王平, 胡朝穎, 蔡華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)