專利名稱：一種水溶性碳納米顆粒的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及碳納米材料中的碳納米顆粒(carbon nanoparticles)的制備方法及 其具有高猝滅性能的應(yīng)用，屬于納米技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
碳納米顆粒(CNPs)是最近興起的一種新型的碳納米材料，Sim等人于2006年首次 在美國化學(xué)協(xié)會(JACS)上報道了僅有5nm左右的發(fā)光碳納米顆粒，他們沒有確定出這種發(fā) 光碳納米顆粒的結(jié)構(gòu)，但從拉曼結(jié)果來看，碳顆粒中可能同時存在金剛石結(jié)構(gòu)和石墨結(jié)構(gòu)。 這一研究成果已經(jīng)激起了人們對發(fā)光碳納米顆粒的研究，因為這種發(fā)光碳納米顆粒不僅無 毒、具有良好的生物相容性，而且它的發(fā)光強(qiáng)度可以和硅量子點發(fā)光相媲美，其發(fā)光穩(wěn)定， 沒有光猝熄現(xiàn)象，在生物標(biāo)記以及生命科學(xué)里面具有重要的應(yīng)用價值。最近，Liu等人在德 國“應(yīng)用化學(xué)”雜志上報道了回流酸煮蠟燭灰制備發(fā)光碳納米晶的簡易方法。該方法獲得 的碳納米顆粒的尺寸不到2nm，可以同樣發(fā)出多色可見光，但是碳納米顆粒發(fā)光量子效率非 常低，僅有0. 8-1. 9%。到目前為止，對碳納米顆粒發(fā)光只是進(jìn)行初步的研究，但是還沒有清 楚知道碳納米顆粒的結(jié)構(gòu)以及細(xì)小碳納米顆粒發(fā)光的原因。碳納米顆粒的生物分析應(yīng)用從 目前文獻(xiàn)報道來看，主要基于碳量子點本身的發(fā)光性質(zhì)用于生物成像，Sim等人利用碳量子 點進(jìn)行了活體成像及多光子成像。由于制備出的發(fā)光碳納米顆粒量子產(chǎn)率低，半峰寬比較 寬，因而對其應(yīng)用受到很大的限制，目前基于碳納米顆粒性能的研究，研究了具有更小尺寸 的碳納米顆粒(碳量子點)的光學(xué)性質(zhì)的研究，而基于碳納米顆粒的性能研究還很少。由于碳納米顆粒同時具有碳材料性質(zhì)和納米尺寸效應(yīng)，與具有平面結(jié)構(gòu)的染料分 子作用較強(qiáng)，并且可以通過電子轉(zhuǎn)移或能量轉(zhuǎn)移等過程引起熒光猝滅，因此利用碳納米顆 粒作為納米猝滅劑，將為生物分子熒光識別提供潛在平臺。Mao等人通過燃燒蠟燭的方法 得到蠟燭灰，然后再通過酸化處理以后得到了大小不同的碳納米顆粒，一是發(fā)熒光的碳量 子點(小于2nm)，另外是比較大的不發(fā)熒光的碳納米顆粒(20-200nm)；它們只對碳量子點 進(jìn)行了深入的研究，而隨后基于碳量子點的修飾和應(yīng)用的報道(主要是細(xì)胞成像方面)也 出現(xiàn)很多，而關(guān)于大尺寸的碳納米顆粒報道較少，2009年S. C. Ray等對碳納米顆粒進(jìn)行了 比較詳細(xì)的表征分析。Mao和S. C. Ray都是利用燃燒收集的蠟燭灰，然后在水溶液中加入 濃硝酸再加熱到100°C進(jìn)行回流(大于12h)。但是此方法需要的溫度較高，再加上濃硝酸 在100°C時可能已經(jīng)分解成NO2，減弱了其的酸化功能，從而很難得到分散性很好的碳納米 顆粒，不利于碳納米顆粒的發(fā)展和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種水溶性碳納米顆粒的制 備方法及應(yīng)用，所述方法可以利用價格低廉的原料和簡單的制備工藝過程，得到良好水溶 性的碳納米顆粒，所制備的碳納米顆?？捎米鰧y5，Rox, FAM, Cy5_DNA，Rox-DNA, FAM-DNA 進(jìn)行熒光猝滅的高猝滅劑。
本發(fā)明的技術(shù)方案之一是，所述水溶性碳納米顆粒的制備方法包括(a)采用燃燒蠟燭的方法收集蠟燭灰把燒杯放在燃燒的蠟燭上空收集黑煙，經(jīng) 過一段時間燒杯里面沉積一層黑色固體后，從燒杯表面刮下該黑色固體；將這些黑色固體 放在真空干燥箱內(nèi)烘干，去掉因為燃燒而產(chǎn)生的水份，得干燥的碳灰，儲存在干燥環(huán)境中待 用；(b)碳納米顆粒的酸化稱取3. 5mg-4. 5mg干燥的碳灰放于IOmL的圓底燒瓶中， 加入2mL的濃硝酸(HHNO3)和2mL的DMF (N，N- 二甲基甲酰胺)或者DMSO (二甲基亞砜)， 在50°C-60°C油浴鍋中加熱回流11. 5小時-12. 5小時，得反應(yīng)液；然后把反應(yīng)液倒入5mL離 心管內(nèi)離心，離心后分成兩層，上層是黃褐色液體，下層是黑色固體，去掉上層液體后再加 入二次水，混勻再離心去掉上層液體，如此反復(fù)5次(目的是盡量去掉反應(yīng)中殘留的硝酸， 以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)，即得酸化的碳納米顆粒溶液，溶液中含有水溶性的碳納米顆粒。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是，所述水溶性碳納米顆粒作為熒光猝滅劑的應(yīng)用為在 Tris-HCl緩沖溶液中加入所述酸化的碳納米顆粒溶液，使緩沖溶液中的染料或標(biāo)記上染料 的DNA產(chǎn)生熒光猝滅；所述染料或標(biāo)記上染料的DNA為以下所列的任意一種染料:RB,Cy3, Rox，F(xiàn)AM，Py, TPP ；標(biāo)記上染料的 DNA :Cy3-DNA, Rox-DNA, FAM-DNA, Py-DNA, TPP-DNA0以下對本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。本發(fā)明的水溶性碳納米顆粒作為熒光猝滅劑應(yīng)用時，所用Tris-HCl緩沖溶液為 含 IOmM Mg2+、50mM K+，pH = 7. 4 的緩沖溶液；在一定量的Tris-HCl緩沖溶液(IOmM Mg2+，50mMK+，pH = 7. 4)中，加入濃度為 60nM的染料溶液，再依次加入不同體積的碳納米顆粒(總體積小于30 μ L)，搖勻、放置 lOmin，對不同染料采用不同的激發(fā)波長，測量染料的熒光發(fā)射光譜，記錄加碳納米顆粒前 后熒光強(qiáng)度變化情況，計算碳納米顆粒對熒光的猝滅效率。由以上可知，本發(fā)明為一種水溶性碳納米顆粒的制備方法及應(yīng)用，它對原有的制 備方法進(jìn)行了顯著的改進(jìn)，在較低的溫度(僅為50°C -60°C )下，得到了水溶性很好的碳納 米顆粒；并且，所制備的碳納米顆?？梢宰鳛橐环N高猝滅劑，對羅丹明B(RB)，芘(Py)，卟啉 (TPP)，花青素 3 (Cy3)，Rox,熒光素(FAM)，Cy3_DNA，Rox-DNA, FAM-DNA, Py-DNA, TPP-DNA 具 有熒光猝滅效應(yīng)，猝滅率高。


圖1-1為實施例1中制得的酸化和未酸化的碳納米顆粒掃描電鏡圖，其中A為未 酸化的碳納米顆粒，B為酸化的碳納米顆粒；圖1-2為實施例1中制得的酸化和未酸化的碳納米顆粒紅外圖譜；圖2為實施例2中酸化的碳納米顆粒對Cy3的熒光強(qiáng)度的猝滅圖；圖3為實施例3中為酸化的碳納米顆粒對FAM的熒光強(qiáng)度的猝滅圖；圖4為實施例4中為酸化的碳納米顆粒對Py的熒光強(qiáng)度的猝滅；圖5為實施例5中酸化的碳納米顆粒對RB的熒光強(qiáng)度的猝滅圖；圖6為實施例6中酸化的碳納米顆粒對TPP的熒光強(qiáng)度的猝滅圖7為實施例7中酸化的碳納米顆粒對Cy3_DNA的熒光強(qiáng)度的猝滅圖；圖8為實施例8中酸化的碳納米顆粒對FAM-DNA的熒光強(qiáng)度的猝滅圖；圖9為實例9中為酸化的碳納米顆粒對ROX-DNA的熒光強(qiáng)度的猝滅圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前 提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述實施例。實施例1 把燒杯放在燃燒的蠟燭上空收集黑煙，經(jīng)過一段時間燒杯里面沉積一 層黑色固體后，從燒杯表面刮下該黑色固體；將這些黑色固體放在真空干燥箱內(nèi)烘干，去掉 因為燃燒而產(chǎn)生的水份，得干燥的碳灰，儲存在干燥環(huán)境中待用；稱取4mg干燥的碳灰于 IOmL的圓底燒瓶中，加入2mL的濃硝酸和2mL的DMF，在60°C油浴鍋中加熱回流12小時；回 流結(jié)束后把反應(yīng)液倒入5mL離心管內(nèi)離心，離心后分成兩層，上層是黃褐色液體，下層是黑 色固體；去掉上層液體后再加入二次水，混勻再離心去掉上層液體，如此反復(fù)5次(目的是 盡量去掉反應(yīng)中殘留的硝酸，以免干擾后續(xù)的應(yīng)用)后，加入2ml 二次水而配成濃度為2mg/ ml的酸化碳納米顆粒溶液，以便后續(xù)使用。濃度為2mg/ml的酸化碳納米顆粒溶液，即每毫 升酸化碳納米顆粒溶液中含有2mg碳納米顆粒。紅外譜圖分析從圖1-2的酸化與未酸化碳納米顆粒的紅外譜圖中可以看出，碳 納米顆粒被酸化后，在1720CHT1處出現(xiàn)一個C = O的伸縮振動峰，并且1250CHT1處的峰增強(qiáng) 很多，是由于C-O伸縮振動引起的，3400CHT1處O-H的伸縮振動峰也明顯增強(qiáng)；綜合以上紅 外譜圖，可以確定碳納米顆粒表面經(jīng)過酸化后，表面出現(xiàn)了 -C00H。實施例2 取 Tris-HCl 緩沖溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 積為800 μ L的熒光池中，加入染料Cy3到該熒光池中，使染料Cy3的濃度為60nM ；測試其 熒光強(qiáng)度，接著加入10 μ L的酸化碳納米顆粒溶液(該酸化碳納米顆粒溶液的濃讀為每毫 升溶液含酸化碳納米顆粒2mg，即濃度為2mg/ml，后同)，搖勻、放置lOmin，再測試并記錄其 熒光強(qiáng)度，計算得到碳納米顆粒對熒光的猝滅效率為96. 28% ；如圖2。實施例3 取 Tris-HCl 緩沖溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 積為800 μ L的熒光池中，加入染料FAM于熒光池中，使染料FAM的濃度為60ηΜ，測試其熒光 強(qiáng)度；接著加入IOyL的酸化碳納米顆粒溶液(2mg/ml)，搖勻、放置lOmin，再測試并記錄其 熒光強(qiáng)度，計算得到碳納米顆粒對熒光的猝滅效率70. 85%，如圖3。實施例4 取 Tris-HCl 緩沖溶液(IOmM Mg2+，50mMK+，pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 積為800 μ L的熒光池中，加入染料Py于熒光池中，使染料Py的濃度為60ηΜ，測試其熒光強(qiáng) 度；接著加入IOyL的酸化碳納米顆粒溶液(2mg/ml)，搖勻、放置lOmin，再測試并記錄其熒 光強(qiáng)度，計算得到碳納米顆粒對熒光的猝滅效率為92. 67%，如圖4。實施例5 取 Tris-HCl 緩沖溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 積為800 μ L的熒光池中，加入染料RB于熒光池中，使染料RB的濃度為60ηΜ，測試其熒光強(qiáng) 度；接著加入IOyL的酸化碳納米顆粒溶液(2mg/ml)，搖勻、放置lOmin，再測試并記錄其熒 光強(qiáng)度，計算得到碳納米顆粒對熒光的猝滅效率為98. 57%，如圖5。實施例6 取 Tris-HCl 緩沖溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 積為800 μ L的熒光池中，加入染料Pul in于熒光池中，使染料Pul in的濃度為60nM，測試其熒光強(qiáng)度；接著加入IOyL的酸化碳納米顆粒溶液(2mg/ml)，搖勻、放置lOmin，再測試并記 錄其熒光強(qiáng)度，計算得到碳納米顆粒對熒光的猝滅效率94. 91 %，如圖6。實施例7 取 Tris-HCl 緩沖溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 積為800 μ L的熒光池中，加入染料Cy3-DNA于熒光池中，使染料Cy3_DNA的濃度為60nM，測 試其熒光強(qiáng)度；接著加入5μ L的酸化碳納米顆粒溶液(2mg/ml)，搖勻、放置lOmin，再測試 并記錄其熒光強(qiáng)度，計算得到碳納米顆粒對熒光的猝滅效率97. 9 %，如圖7。實施例8 取 Tris-HCl 緩沖溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 積為800 μ L的熒光池中，加入染料FAM-DNA于熒光池中，使染料FAM-DNA的濃度為60ηΜ，測 試其熒光強(qiáng)度；接著加入5μ L的酸化碳納米顆粒溶液(2mg/ml)，搖勻、放置lOmin，再測試 并記錄其熒光強(qiáng)度，計算得到碳納米顆粒對熒光的猝滅效率99. 6 %，如圖8。實施例9 取 Tris-HCl 緩沖溶液(IOmM Mg2+，50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 積為800 μ L的熒光池中，加入染料ROX-DNA于熒光池中，使染料ROX-DNA的濃度為60ηΜ，測 試其熒光強(qiáng)度；接著加入5μ L的酸化碳納米顆粒溶液(2mg/ml)，搖勻、放置lOmin，再測試 并記錄其熒光強(qiáng)度，計算得到碳納米顆粒對熒光的猝滅效率99. 92 %，如圖9。實施例10 取 Tris-HCl 緩沖溶液(IOmM Mg2+, 50mMK+, pH = 7. 4) 400 μ L 加入到容 積為800 μ L的熒光池中，加入染料于熒光池中，使染料的濃度為60ηΜ，測試其熒光強(qiáng)度；接 著加入5μ L的酸化碳納米顆粒溶液(2mg/ml)，搖勻、放置lOmin，再測試并記錄其熒光強(qiáng) 度，計算得到碳納米顆粒對熒光的猝滅效率，如表1。表一為實例10中為酸化的碳納米顆粒對幾種染料和標(biāo)記上染料的DNA的熒光強(qiáng) 度的猝滅的比較。表一
權(quán)利要求
一種水溶性碳納米顆粒的制備方法，其特征是，它包括(a)采用燃燒蠟燭的方法收集蠟燭灰把燒杯放在燃燒的蠟燭上空收集黑煙，經(jīng)過一段時間燒杯里面沉積一層黑色固體后，從燒杯表面刮下該黑色固體；將這些黑色固體放在真空干燥箱內(nèi)烘干，去掉因為燃燒而產(chǎn)生的水份，得干燥的碳灰，儲存在干燥環(huán)境中待用；(b)碳納米顆粒的酸化稱取3.5mg 4.5mg干燥的碳灰放于10mL的圓底燒瓶中，加入2mL的濃硝酸和2mL的DMF或者DMSO，在50℃ 60℃油浴鍋中加熱回流11.5小時 12.5小時，得反應(yīng)液；然后把反應(yīng)液倒入5mL離心管內(nèi)離心，離心后分成兩層，上層是黃褐色液體，下層是黑色固體，去掉上層液體后再加入二次水，混勻再離心去掉上層液體，如此反復(fù)5次，即得酸化的碳納米顆粒溶液。
2.權(quán)利要求1所述水溶性碳納米顆粒作為熒光猝滅劑的應(yīng)用，其特征是，在Tris-HCl 緩沖溶液中加入所述酸化的碳納米顆粒溶液，使緩沖溶液中的染料或標(biāo)記上染料的DNA產(chǎn) 生熒光猝滅；所述染料或標(biāo)記上染料的DNA為以下所列的任意一種染料RB，Cy3, Rox, FAM, Py, TPP ；標(biāo)記上染料的 DNA :Cy3_DNA，Rox-DNA, FAM-DNA, Py-DNA，TPP-DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述水溶性碳納米顆粒作為熒光猝滅劑的應(yīng)用，其特征是，所述 Tris-HCl緩沖溶液是含IOOmM K+、5mM Mg2+,pH = 7.4的緩沖溶液；所用染料溶液的濃度為 60nM,酸化的碳納米顆粒溶液的濃度為2mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述水溶性碳納米顆粒作為熒光猝滅劑的應(yīng)用，其特征是， Tris-HCl緩沖溶液的用量是400 μ L，酸化的碳納米顆粒溶液的用量是5 μ L-IO μ L。全文摘要
一種水溶性碳納米顆粒的制備方法及應(yīng)用，方法包括采用燃燒蠟燭的方法收集蠟燭灰；將蠟燭灰放于圓底燒瓶中，加入濃硝酸和DMF，在50℃-60℃油浴鍋中加熱回流約12小時，得反應(yīng)液；把反應(yīng)液倒入離心管內(nèi)離心后取黑色固體，去掉上層液體后再加入二次水，混勻再離心去掉上層液體，如此反復(fù)5次，即得酸化的碳納米顆粒溶液；應(yīng)用是在Tris-HCl緩沖溶液中加入所述酸化的碳納米顆粒溶液，使緩沖溶液中的染料或標(biāo)記上染料的DNA產(chǎn)生熒光猝滅。所述方法可以利用價格低廉的原料和簡單的制備工藝過程，得到良好水溶性的碳納米顆粒，所制備的碳納米顆粒可用做對相關(guān)染料進(jìn)行熒光猝滅的高猝滅劑。
文檔編號C01B31/02GK101935033SQ20101027460
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者劉金華, 李繼山, 楊榮華 申請人:湖南大學(xué)