一種在室溫下制備卵巢癌靶向納米四氧化三鐵顆粒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在室溫下制備卵巢癌靶向納米四氧化三鐵顆粒的方法。將鐵鹽、亞鐵鹽及多肽均勻分散于鹽酸溶液中，堿分散于水中，在室溫下將二者混合，通過液相沉淀法并利用多肽的礦化作用，制備出分散好、直徑分布在20-50nm、生物相容性好且具有靶向卵巢癌細胞(SK-OV-3)的四氧化三鐵納米顆粒。本發(fā)明具有操作簡單易行及環(huán)境友好等特點。
【專利說明】一種在室溫下制備卵巢癌靶向納米四氧化三鐵顆粒的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種在室溫下利用合成多肽輔助制備卵巢癌靶向納米四氧化三鐵顆粒的方法。
【背景技術】 [0002]由于四氧化三鐵納米顆粒具有較大的表面積、超順磁性以及其他良好的物理、化學、生物等性質，因此在磁共振成像(MRI)、靶向給藥、細胞分離篩選以及腫瘤治療(熱療)等領域具有極大的應用潛力。然而，最近一些研究報道四氧化三鐵納米顆粒能使諸如人巨噬細胞、成纖維細胞、上皮細胞系、平滑肌細胞、臍靜脈血管內皮細胞、癌細胞等細胞活力降低、形態(tài)發(fā)生變化，細胞毒性較大，且其穩(wěn)定性差(易被氧化)、無靶向性等缺點限制了臨床應用。四氧化三鐵納米顆粒經(jīng)過表面修飾(接枝多肽、核酸、蛋白質和聚合物等)后，在保留其本身性質的同時能顯著增強其生物相容性且具有其他的特殊性能。因此，通過使用不同的合成方法和反應參數(shù)，進而控制納米材料的尺寸和形狀，制備具有優(yōu)良生物相容性能的四氧化三鐵納米材料是目前研究熱點。
[0003]制備四氧化三鐵納米顆粒的方法有很多，常見的且應用較多的有:氧化還原法、共沉淀法、化學氣相沉積、電化學沉積等方法。然而這些方法多數(shù)需要特定的合成條件:高溫、高壓、強氧化劑以及復雜的模板等，因此制備四氧化三鐵納米顆粒成本較高、條件苛刻，且在高溫等條件下使納米粒子無法獲得生物活性表面成分和結構，另外在表面改性(接枝靶向多肽)過程中諸如上述條件會對多肽的生物活性造成嚴重的破壞，故而使得制備出的四氧化三鐵納米顆粒在生物醫(yī)學領域中無法廣泛的應用。常用的四氧化三鐵納米顆粒的表面改性手段是化學接枝，如果引進生物活性物質(葉酸、多肽、蛋白等)，在接枝過程中化學試劑對生物活性分子的結構等造成破壞，進而影響生物分子的生物活性，另外在接枝過程中不可避免會造成納米粒子粒徑發(fā)生變化；因此開發(fā)一種低溫簡便、環(huán)境友好、具有生物相容性、腫瘤靶向的四氧化三鐵納米顆粒制備方法是非常有必要的。
[0004]專利申請公開N0.201110458312報道了一種能特異性靶向卵巢癌細胞的多肽WSGPGVWGASVK(簡寫WSG)，該多肽分子量小，組織穿透性好，無免疫原性，不僅能靶向結合卵巢癌細胞，而且還能抑制卵巢癌細胞黏附、遷移以及存活率，多肽能通過結合的細胞表面受體介導有效地進入細胞，有助于對藥物及基因于細胞內的傳遞，是一種卵巢癌的靶向傳遞系統(tǒng)中的理想配體?；诖碎_發(fā)體內腫瘤靶向造影劑、熱療劑具有巨大的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供了一種在溫和條件下簡單制備具有生物相容性、卵巢癌細胞靶向的四氧化三鐵納米顆粒的方法。
[0006]目前為止，制備具有靶向性質的四氧化三鐵納米粒子的方法都是得到四氧化三鐵納米粒子之后再經(jīng)過化學改性后接枝靶向基團，制備過程繁瑣復雜，且接枝率較低，產(chǎn)品純度低，靶向性質差。但是本發(fā)明注意到，在制備四氧化三鐵過程中利用合適的鐵鹽、溶劑，即使不經(jīng)過復雜的化學接枝過程也能將靶向多肽連接于四氧化三鐵納米顆粒上。因此在本發(fā)明提出一種新的技術方案。其中，利用多肽輔助礦化性能、鐵鹽自氧化作用，通過簡單沉淀法制備多肽-納米四氧化三鐵材料，該方法包括以下步驟:a)將六水合氯化鐵、四水合氯化亞鐵以及多肽溶解于鹽酸溶液中，形成均勻分散液；b)將氫氧化鈉水溶液與上述六水合氯化鐵、四水合氯化亞鐵以及多肽溶液混合，經(jīng)反應后轉變?yōu)槎嚯?四氧化三鐵納米顆粒；c)將反應后的混合液靜置陳化。
[0007]在本發(fā)明的方法中，所述多肽WSG濃度為0.05-1.5mg / mL，優(yōu)選為0.1-1.0mg /mL。所述多肽濃度過低不足以起到礦化成核作用，也無法滿足后續(xù)靶向性質，濃度過高則會與鐵鹽溶液形成配合物，導致氧化沉淀反應無法順利進行。
[0008]在本發(fā)明的方法中，所述氫氧化鈉溶液濃度為:1.0-2.0M，優(yōu)選為:1.5-3.0M ;濃度過高則反應體系pH值無法控制，且對多肽的生物活性有所損害；濃度過低則無法完全反應。在緩慢攪拌條件下逐滴將所述堿液加入到所述鐵鹽溶液中，繼續(xù)攪拌1-2小時。
[0009]在本發(fā)明的方法中，為得到純凈的分離產(chǎn)物，在步驟c)中需要洗滌和分離操作。采用的方法很多，在本發(fā)明中優(yōu)選為離心法，離心速度優(yōu)選為4000-6000轉/分鐘，離心時間優(yōu)選為0.5-2小時，離心次數(shù)為5次。用于洗滌沉淀的試劑為二次水和乙醇，洗滌次數(shù)為5次，前三次為二次水洗滌，后兩次為乙醇洗滌。分離純化后的四氧化三鐵納米顆粒為干態(tài)儲存。且干態(tài)儲存之前的烘干溫度優(yōu)選為20-37°C.。
[0010]根據(jù)本發(fā)明方法可以在室溫下制備得到表面修飾有多肽WSG的四氧化三鐵納米材料。本發(fā)明方法具有簡單易行，產(chǎn)物環(huán)境友好等優(yōu)點。由于納米顆粒表面修飾有多肽，且多肽被證明具有靶向卵巢癌腫瘤血管內皮細胞性質，因此在提高納米顆粒的生物相容性的同時也賦予了納米四氧化三鐵靶向卵巢癌的性質。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]結合附圖對本發(fā)明作進一步說明，其中，
[0012]圖1是制備WSG-四氧化三鐵納米顆粒的示例性步驟。
[0013]圖2示出WSG-四氧化三鐵納米顆粒的透射電子顯微鏡照片。
[0014]圖3示出WSG-四氧化三鐵納米顆粒在卵巢癌細胞內分布的透射電子顯微鏡照片。
【具體實施方式】
[0015]下面將結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，這些實施例只是為了更好地理解本發(fā)明，并且在任何情況下都不應該將其解釋為限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附的權利要求書所限定。
[0016]本發(fā)明中多肽-四氧化三鐵納米顆粒的制備是在室溫下的液相沉淀法實現(xiàn)的。
[0017]本發(fā)明提供的制備納米四氧化三鐵材料的方法對于設備、試劑無特殊的要求，因此易于量產(chǎn)。以下是本發(fā)明的示例性的具體實施方案，通過這些實施方案可以更充分地理解本發(fā)明的上述優(yōu)點。
[0018]實施例1
[0019]將5.3g六水氯化鐵和1.98g四水氯化亞鐵溶解于25ml鹽酸溶液中，用磁力攪拌器攪拌混合欲處理15分鐘，再將5mg多肽溶液加入上述溶液，繼續(xù)攪拌30分鐘，將分散液裝入具塞錐形瓶中，常溫放置24小時。將15g氫氧化鈉分散于250mL 二次水中，攪拌混合均勻。在溫度為25°C.，攪拌速度為300轉/分鐘的條件下，向鐵鹽、多肽溶液中逐滴加入上述氫氧化鈉水溶液250mL。繼續(xù)在300轉/分鐘的速度下攪拌2_6小時，以利于溶液反應的充分進行。之后將混合體系在室溫下靜置2天，以利于四氧化三鐵納米顆粒的成核生長。最后產(chǎn)物通過洗滌和離心獲得。在離心過程中，反應產(chǎn)物以4000轉/分鐘速度離心20分鐘，沉底物用去離子水洗滌后，再次離心2-3次，且轉速逐次增加到6000轉/分鐘，離心時間每次加長20分鐘，最后用無水乙醇洗滌后得到較純凈產(chǎn)物。最后在37°C.以下空氣氣氛下烘干24小時。
[0020]實施例2
[0021]將5mg多肽、5.3g六水氯化鐵和1.98g四水氯化亞鐵溶解于25ml鹽酸溶液中，用磁力攪拌器攪拌混合欲處理15分鐘；將15g氫氧化鈉分散于250mL 二次水中，攪拌混合均勻。在室溫條件下將上述鐵鹽溶液和堿液逐滴加入錐形瓶中，繼續(xù)在300轉/分鐘的速度下攪拌2-6小時，以利于溶液反應的充分進行。后續(xù)洗滌和離心過程與實施例1中相同。
[0022]實施例3WSG_Fe304粒子的細胞毒性研究
[0023]細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至80%覆蓋，吸除培養(yǎng)基。加入用完全培養(yǎng)基稀釋的不同濃度多肽_Fe304粒子懸浮液，200 μ L /孔，培養(yǎng)24h、48h、72h。每個實驗組4_6個平行，進行2-3次重復實驗，以多肽-Fe3O4粒子濃度為O組作為對照。在檢測時間點加入MTT溶液，20 μ L /孔(注意避光)，37°C培養(yǎng)箱中孵育24h。吸取每孔中液體，加入150 μ L /孔二甲基亞砜(DMSO)，37°C孵育30min。490nm下酶標儀測定其吸光度值。
[0024]實施例4多肽-Fe3O4粒子與細胞孵育后細胞的超微結構檢測
[0025]將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至覆蓋80%以上。更換培養(yǎng)基為含有0.1mg / mL濃度多肽_Fe304粒子懸浮液(完全培養(yǎng)基+WSG-Fe3O4粒子)，培養(yǎng)24h。WSG-Fe3O4粒子濃度為O組作為對照。去掉培養(yǎng)基，PBS洗滌2-3遍；消化細胞后，用0.9%的生理鹽水洗滌，2，OOOrpm離心15min。重復洗漆3次,將細胞轉入微量離心管中，2，OOOrpm離心15min。棄上清，緩慢滴加0.5%戊二醛，4°C靜置30min。13，OOOrpm離心15min，棄上清。在PE管中加入ImL的3%戊二醛，保存于4°C冰箱中。I %四氧化鋨后固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋。超薄切片機切片40-50nm， 用醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染后收集于銅網(wǎng)，透鏡觀察。
【權利要求】
1.一種在室溫下制備卵巢癌靶向納米四氧化三鐵顆粒的方法，該方法包括以下步驟: a)將六水合氯化鐵、四水合氯化亞鐵以及多肽溶解于鹽酸溶液中，形成均勻分散液，其中多肽WSG濃度為:0.05-1.5mg / mL，六水合氯化鐵濃度為:0.5-1.0M,四水合氯化亞鐵濃度為0.2-0.6M，鹽酸濃度為:0.3-0.6M ； b)將濃度為1.0-2.0M氫氧化鈉水溶液與上述六水合氯化鐵、四水合氯化亞鐵以及多肽溶液混合，其中，混合溶液與氫氧化鈉水溶液體積比為1:1~10，然后繼續(xù)攪拌2小時，經(jīng)反應后轉變?yōu)樗难趸F納米顆粒； c)將反應后的混合液靜置陳化，然后`離心分離，并洗滌3-5次，干燥得樣品。
【文檔編號】C01G49/08GK103663570SQ201310593633
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權日:2013年11月15日
【發(fā)明者】魏延, 黃棣, 胡銀春, 王曉君, 韓志軍 申請人:太原理工大學