專利名稱：多西環(huán)素在制備治療上皮性卵巢癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是多西環(huán)素用于制備治療上皮性卵巢癌藥物的新用途。
背景技術(shù)：
多西環(huán)素是一種四環(huán)素族廣譜抗生素，通常用于感染性疾病的治療，其抗菌譜除常見的致病菌外，立克次體屬、支原體屬、衣原體屬，非典型的分枝桿菌對多西環(huán)素均敏感。多西環(huán)素對肺炎球菌有較強(qiáng)的抗菌作用，對杜克嗜血桿菌、布魯菌屬、霍亂弧菌和耶爾森菌屬的抗菌作用較好，70%的厭氧菌對多西環(huán)素敏感。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素可以抑制大腸癌、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，也可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞系、骨肉瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞凋亡。但至今未見多西環(huán)素用于治療上皮性卵巢癌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為多西環(huán)素提供了用于制備治療上皮性卵巢癌藥物的新用途。經(jīng)過動物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證實(shí)多西環(huán)素可以抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖，防止上皮性卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的凋亡，還可以抑制裸鼠腫瘤模型的上皮性卵巢癌增長及惡性腹水的形成，因此，多西環(huán)素可用于制備治療上皮性卵巢癌的藥物。本發(fā)明為多西環(huán)素提供了一種新用途，在治療上皮性卵巢癌方面，與其他化療藥相比，多西環(huán)素具有給藥方便，副作用小等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是多西環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用其中，A為上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3, B為其順鉬耐藥株SK0V3/DDP (下同)。圖2是多西環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用。圖3是多西環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。圖4是多西環(huán)素對裸鼠卵巢癌模型中癌組織生長及惡性腹水的抑制作用。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例1、多西環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制作用實(shí)驗(yàn)多西環(huán)素，Sigma公司產(chǎn)品，分子式為(C22H24N208 · HCl) 2 · C2H60 · H20，分子量為 1025. 89。(下同)卵巢癌細(xì)胞SK0V3及其耐藥株SK0V3/DDP，購于ATCC (美國模式培養(yǎng)物集存庫)。(下同)制備多西環(huán)素溶液將多西環(huán)素粉末用無菌注射用水配制成初濃度為5mg/ml的溶液，置于_20°C冰箱凍存?zhèn)溆?。制備?xì)胞懸液將卵巢癌細(xì)胞SKOV3和卵巢癌細(xì)胞耐藥株SK0V3/DDP分別用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基配制成細(xì)胞濃度為5 X IO4個(gè)/ml細(xì)胞懸液備用。實(shí)驗(yàn)分A、B兩組，A組為卵巢癌細(xì)胞SKOV3, B組為卵巢癌細(xì)胞耐藥株SK0V3/DDP。1、接種細(xì)胞懸液將上述配制的A、B組細(xì)胞懸液分別按常規(guī)以每孔100 μ I接種于96孔板，每組9 個(gè)孔，每孔再設(shè)2個(gè)復(fù)孔，亦即Α、B組各設(shè)平行的3個(gè)組Al、Α2、A3和B1、Β2、Β3 ;2、加入多西環(huán)素溶液將上述濃度為5mg/ml的多西環(huán)素溶液，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基配制成不同濃度的多西環(huán)素溶液后，分別加入到上述接種細(xì)胞懸液的各孔中，使Al、A2、A3三個(gè)平行組的多西環(huán)素終濃度依次為O, 2. 5，5，7. 5，10，20，40，80，100 μ g/ml，Β1、Β2、Β3三個(gè)平行組的多西環(huán)素終濃度依次為O,1. 25，2. 5，5，10，20，40，80，100 μ g/ml ；3、培養(yǎng)將培養(yǎng)板置于37°C孵箱中孵育48小時(shí)，此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)貼壁，加入MTT孵育4小時(shí)；4、檢測細(xì)胞活力吸除培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)基，每孔加入100 μ I DMSO,震蕩10分鐘后將培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀中測OD值，測得的OD值代表細(xì)胞活力；5、作圖分別取A組3個(gè)平行組Α1、Α2、Α3的OD值的平均值和B組3個(gè)平行組Β1、Β2、Β3的OD值的平均值，分別以多西環(huán)素濃度為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞活力的相對百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。由圖1可見，多西環(huán)素可以顯著抑制兩株細(xì)胞的增殖，其效應(yīng)呈劑量依耐性。用0rigin7軟件計(jì)算得出，多西環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的半數(shù)致死量為16. 63μ g/ml，對卵巢癌耐藥株SK0V3/DDP的半數(shù)致死量為8. 53 μ g/ml,而且當(dāng)多西環(huán)素濃度僅為1. 25 μ g/ml時(shí)已顯示對卵巢耐藥株SK0V3/DDP的增殖有抑制作用，表明卵巢癌耐藥株SK0V3/DDP對多西環(huán)素更為敏感，這對臨床上較難治的鉬類耐藥性卵巢癌的治療非常有利，具有很好的臨床應(yīng)用前景。實(shí)施例2、多西環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用的是Transwell小室(購于BD生物技術(shù)有限公司)，其與普通培養(yǎng)板不同，分上室和下室，下室相當(dāng)于24孔培養(yǎng)板上的一個(gè)個(gè)孔，只是孔徑比較大，上室為置于下室內(nèi)的小室，每個(gè)下室的孔中配有一個(gè)小室，該小室又被稱之為上室，小室底部為一層具有6-8 μ m孔徑小孔的纖維聚酯薄膜，稱為基底膜，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，貼壁于上室底部基底膜的細(xì)胞可以穿過小孔，由基底膜的上表面進(jìn)入下室貼壁于基底膜的下表面。在做癌細(xì)胞的侵襲能力實(shí)驗(yàn)時(shí)，先在上室的基底膜上涂一層BD膠，以封閉基底膜上的小孔，BD膠為一種相當(dāng)于人細(xì)胞外基質(zhì)成分的膠，癌細(xì)胞可以釋放分解此膠的物質(zhì)，從而暴露基底膜上的小孔，貼壁于上室基底膜的細(xì)胞就可穿過小孔轉(zhuǎn)移至下室并貼壁于基底膜的下表面，以此模擬人體中癌細(xì)胞的侵襲能力。通常由穿越基底膜貼壁于基底膜下表面的細(xì)胞量觀察癌細(xì)胞的侵襲能力。
實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1、配制多西環(huán)素溶液將上述初濃度為5mg/ml多西環(huán)素溶液用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基及無血清1640培養(yǎng)基分別配制成終濃度為10 μ g/ml的含10%胎牛血清的多西環(huán)素溶液(下稱含血清多西環(huán)素溶液)和不含血清的多西環(huán)素溶液(下稱無血清多西環(huán)素溶液);2、制備細(xì)胞懸液將卵巢癌細(xì)胞SKOV3及其耐藥株細(xì)胞SK0V3/DDP按常規(guī)用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶中37°C培養(yǎng)36小時(shí)，此時(shí)細(xì)胞生長處于對數(shù)期，用胰酶消化后用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，制成細(xì)胞懸液，密度約2 X IO6個(gè)/ml ；
3、接種細(xì)胞懸液及加入多西環(huán)素溶液實(shí)驗(yàn)分為A、B兩組，A組為卵巢癌細(xì)胞51(0￥3，8組為卵巢癌耐藥株細(xì)胞31(0￥3/1)0 ，每組在Transwell小室平板上各占四個(gè)室,作為a、b、c、d四個(gè)小組,其中a、b兩組上室和下室加的都為無血清培養(yǎng)基，不同處在于a組的上下室都加入多西環(huán)素，b組的上下室均不加多西環(huán)素，a、b兩組對照，比較多西環(huán)素在10 μ g/ml濃度下作用細(xì)胞30小時(shí)對卵巢癌細(xì)胞SKOV3或卵巢癌耐藥株細(xì)胞SK0V3/DDP的存活細(xì)胞數(shù)的影響；c、d兩組上室都為無血清培養(yǎng)基，下室都為含血清培養(yǎng)基，不同處在于c組的上下室均加多西環(huán)素，d組的上下室均不加多西環(huán)素，c、d兩組對照，以說明多西環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞SKOV3或卵巢癌耐藥株細(xì)胞SKOV3/DDP侵襲能力的影響；a、b兩組與C、d兩組的不同處在于a、b兩組的下室都為不含血清的培養(yǎng)基，c、d兩組的下室都為含血清的培養(yǎng)基，以比較血清作為趨化因子對癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的誘導(dǎo)作用。具體操作如下分別在a、b、C、d各組上室基底膜上涂一層BD膠，室溫下自然風(fēng)干，細(xì)胞吹打均勻后將細(xì)胞懸液接種于上室，接種量為每孔100 μ 1，置于37°C孵箱孵育4小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，吸除培養(yǎng)基，然后分別作如下處理I)在a小組的上室中加入無血清多西環(huán)素溶液100 μ I,下室中加入無血清多西環(huán)素溶液500 μ I ；2)在b小組的上室中加入無血清培養(yǎng)基100μ 1，下室中加入無血清培養(yǎng)基500 μ I ；3)在c小組的上室中加入無血清多西環(huán)素溶液100 μ 1，下室中加入含血清多西環(huán)素溶液500 μ I ；4)在d小組的上室中加入無血清培養(yǎng)基100μ 1，下室中加入含血清培養(yǎng)基500 μ I。4、培養(yǎng)、染色和照相將Transwell小室放入37°C孵箱中孵育30小時(shí)后，取出上室置于無水乙醇15分鐘以固定細(xì)胞，用棉簽分別輕輕拭去附著在a、b兩小組基底膜下面的細(xì)胞以及附著在C、d兩小組的基底膜上面的細(xì)胞，再用O. 1%結(jié)晶紫染色15分鐘，自然風(fēng)干后分別將基底膜用鑷子輕輕取下置于載玻片上，甘油封片后置于正置顯微鏡上拍照。結(jié)果如圖2所示，其中A圖表示SKOV3, B圖表示SK0V3/DDP，a表示加多西環(huán)素作用30小時(shí)后基底膜上表面的存活細(xì)胞數(shù)；b表示沒加多西環(huán)素的基底膜上表面的存活細(xì)胞數(shù)；c表示多西環(huán)素作用30小時(shí)后基底膜下表面的存活細(xì)胞數(shù)，亦即由基底膜上表面穿過基底膜轉(zhuǎn)移到基底膜下表面的存活細(xì)胞數(shù)；d表示的是沒加多西環(huán)素時(shí)由基底膜上表面穿過基底膜轉(zhuǎn)移到基底膜下表面的存活細(xì)胞數(shù)。加多西環(huán)素作用30小時(shí)后基底膜下表面的存活細(xì)胞數(shù)c與多西環(huán)素作用30小時(shí)后基底膜上表面的存活細(xì)胞數(shù)a之比c/a反映出多西環(huán)素作用下癌細(xì)胞的侵襲能力；沒加多西環(huán)素作用時(shí)穿過基底膜至下表面的存活細(xì)胞數(shù)d與沒加多西環(huán)素時(shí)基底膜上表面的存活細(xì)胞數(shù)b之比d/b，反映出無多西環(huán)素作用時(shí)癌細(xì)胞的侵襲能力。由圖2可見，A組的a/c比值為11%，d/b比值為38%，B組的a/c比值為27%，d/b比值為54%，兩組的a/c比值均分別小于d/b比值，說明在多西環(huán)素作用下癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低。實(shí)施例3、多西環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為A、B兩大組，A組為卵巢癌細(xì)胞SKOV3, B組為卵巢癌耐藥株細(xì)胞SKOV3/DDP0每組各設(shè)5個(gè)小組，分別為兩個(gè)空白對照組，3個(gè)多西環(huán)素組，藥物濃度分別為5、10、20 μ g/ml，無復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1、將上述初濃度為5mg/ml多西環(huán)素溶液分別用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基配制成濃度為5、10、20μ g/ml多西環(huán)素溶液；2、將卵巢癌細(xì)胞SKOV3及其耐藥株細(xì)胞SK0V3/DDP按常規(guī)分別用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶中37°C培養(yǎng)36小時(shí)，此時(shí)細(xì)胞生長處于對數(shù)期，用胰酶消化后制成密度為I X IO6個(gè)/ml細(xì)胞懸液，A組和B組每組各接種于一塊6孔板，每塊板共接種5孔，每孔1. 5ml，37°C孵箱中培養(yǎng)12小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，吸除培養(yǎng)基，兩個(gè)空白對照組每孔加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基1. 5ml (不含多西環(huán)素)，3個(gè)多西環(huán)素組每孔分別加入濃度為5、10、20 μ g/ml多西環(huán)素溶液1. 5ml，置于37°C培養(yǎng)6小時(shí)。3、采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡程度細(xì)胞凋亡試劑盒購于BD生物技術(shù)有限公司。按常規(guī)用不含EDTA的胰酶消化后分別用離心管收集各組細(xì)胞，2000rpm離心5min后，棄上清，每管加入PBS 2ml洗漆細(xì)胞(2000rpm離心5min),加入100 μ L的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；每管加入5 μ LAnnexin V-FITC (購于BD公司，是一種特異性標(biāo)記物,可與凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜上某種物質(zhì)結(jié)合，用于特異性標(biāo)記凋亡的細(xì)胞)混勻后置室溫、避光、反應(yīng)15min，再次每管用PBS 2ml洗滌細(xì)胞I次，加入PI (購于BD公司，是一種特異性標(biāo)記物，可與壞死細(xì)胞的細(xì)胞核中的某種物質(zhì)結(jié)合，用于特異性標(biāo)記壞死的細(xì)胞)標(biāo)記后置于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果如圖3所示，圖3中右下象限的數(shù)字代表卵巢癌細(xì)胞凋亡數(shù)目的百分比，結(jié)果顯示隨著多西環(huán)素濃度的提高，其凋亡細(xì)胞數(shù)目的百分比不斷增加，其中在耐藥株SK0V3/DDP細(xì)胞中最高達(dá)19. 9%，而空白對照分別O. 628%及O. 443%，相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見，多西環(huán)素可以促進(jìn)上皮性卵巢癌尤其是耐藥性上皮性卵巢癌細(xì)胞的凋亡，這一結(jié)果與增殖抑制實(shí)驗(yàn)(圖1)結(jié)果相一致。進(jìn)一步表明多西環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞尤其是鉬類耐藥性卵巢癌細(xì)胞的抑制作用非常顯著，所以多西環(huán)素可用于制備治療上皮性卵巢癌藥物。實(shí)施例4、多西環(huán)素抑制裸鼠卵巢癌組織生長的動物實(shí)驗(yàn)無胸腺裸鼠，由第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供，鼠齡為4周。取無胸腺裸鼠18只，雌性，隨機(jī)分為3組，正常對照組，模型對照組和多西環(huán)素治療組，每組6只。
將卵巢癌細(xì)胞SK0V3_ip (由上海市第一人民醫(yī)院提供)用無血清培養(yǎng)基制備成密度為5 X IO6個(gè)/ml細(xì)胞懸液備用。將模型對照組和多西環(huán)素治療組裸鼠每只腹腔注射400 μ I卵巢癌細(xì)胞SK0V3_ip細(xì)胞懸液，正常對照組注射等體積無血清1640培養(yǎng)基。第14天，多西環(huán)素治療組裸鼠腹腔注射多西環(huán)素，3mg/只/天，正常對照組和模型對照組注射等體積無血清1640培養(yǎng)基，連續(xù)注射7天，第8天，對各組裸鼠分別稱重后處死，先在正常對照組、模型對照組和多西環(huán)素治療組裸鼠腹腔打開前照相，再將腹腔打開，分別取模型對照組和多西環(huán)素治療組裸鼠的腹水及腫瘤組織并進(jìn)行比較。結(jié)果如圖4所示Aa、Ab、Ac依次為正常對照組、模型對照組和多西環(huán)素治療組裸鼠。由圖4可見，腹腔打開前模型對照組裸鼠較其他兩組裸鼠腹部明顯膨??；將腹腔打開后，發(fā)現(xiàn)正常對照組裸鼠的腸系 膜無瘤組織覆蓋(Ba)，模型對照組裸鼠的腸系膜中有大量板油狀癌組織覆蓋，腸壁壞死，伴大量腹水(Bb)，而多西環(huán)素治療組裸鼠的腸系膜中僅有少量癌組織覆蓋，且沒有腸壁壞死，腹水量也很少(Be)。將癌組織剔除下來進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素治療組中癌組織直徑為O. 57cm明顯小于模型對照組1. 17cm，腹水量O. 05ml，也較模型對照組0.7ml明顯減少(C、D)，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F、G);三組裸鼠的體重相比，正常對照組裸鼠平均體重為18. 7g ;模型對照組裸鼠的體重明顯偏低，平均僅為16. 4g ;多西環(huán)素治療組裸鼠平均體重為18. 15g，與正常對照組相當(dāng)。由此可見，多西環(huán)素可抑制卵巢癌組織的生長及腹水的形成。綜上所述，多西環(huán)素能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲，防止上皮性卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的凋亡，對卵巢癌細(xì)胞尤其是鉬類耐藥性卵巢癌細(xì)胞有顯著的抑制作用，還可抑制卵巢癌組織的生長及腹水的形成，因此，多西環(huán)素可用于制備治療上皮性卵巢癌藥物。
權(quán)利要求
1.多西環(huán)素在制備治療上皮性卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是多西環(huán)素用于制備治療上皮性卵巢癌藥物的新用途。經(jīng)過動物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證實(shí)多西環(huán)素能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲，防止上皮性卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的凋亡，對卵巢癌細(xì)胞尤其是鉑類耐藥性卵巢癌細(xì)胞有顯著的抑制作用，還可抑制卵巢癌組織的生長及腹水的形成，因此，多西環(huán)素可用于制備治療上皮性卵巢癌藥物。本發(fā)明為多西環(huán)素提供了一種新用途，在治療上皮性卵巢癌方面，與其他化療藥相比，多西環(huán)素具有給藥方便，副作用小的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61P35/00GK103006675SQ201210470538
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者徐明娟, 吳薇, 馬蓓, 管睿, 蔡圣蕓, 王麗婭 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)