單層云母片及其納米孔電子器件的制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種單層云母片及其納米孔電子器件的制備方法和應(yīng)用。首先制備超薄的云母單層，將其涂布在合適的支撐基底上，利用高能聚焦電子束或離子束在單層云母片上制備1～5nm納米孔，得到基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件。使單鏈核酸或蛋白質(zhì)分子在電場驅(qū)動(dòng)下穿過該電子器件的納米孔，通過實(shí)時(shí)檢測過孔電流的變化，識別過孔單鏈核酸上的堿基或單鏈蛋白質(zhì)上的氨基酸。本發(fā)明的電子器件可制備成高通量平行的分子器件，實(shí)現(xiàn)快速且超低成本的核酸/蛋白質(zhì)測序。
【專利說明】
單層云母片及其納米孔電子器件的制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種單層納米云母片和云母片納米孔的制備方法，并制備生物傳感器，可用于單分子核酸/蛋白質(zhì)等生物大分子的測序、蛋白結(jié)構(gòu)域、蛋白修飾和蛋白互作等領(lǐng)域。該發(fā)明屬于第三代測序器件。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸測序技術(shù)是近代生命科學(xué)發(fā)展的重要里程碑之一。隨著低成本、高通量核酸測序技術(shù)的出現(xiàn)，生命遺傳密碼的徹底破譯將成為可能，遺傳信息大數(shù)據(jù)的普及將惠及到人類社會(huì)每一個(gè)普通成員的生存和健康。
[0003]目前大量使用的第二代高通量測序技術(shù)，通過對被測核酸進(jìn)行平行擴(kuò)增，構(gòu)建測序文庫，克隆出上百萬固相化單鏈核酸模板片段，進(jìn)行高通量并行序列測定，但存在一些問題:制備測序文庫需要大量的分子生物學(xué)操作，制備時(shí)間長，成本高;通過核酸生物合成反應(yīng)在核酸測序模板上進(jìn)行逐個(gè)堿基閱讀，一次生化反應(yīng)僅能閱讀一個(gè)堿基且讀長較短。這也是測序速度和通量難以提升的瓶頸。
[0004]因此第三代測序技術(shù)是目前國際學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界追捧的對象。第三代測序技術(shù)有如下三個(gè)特點(diǎn):(I)實(shí)現(xiàn)單分子測序，無需對測序?qū)ο筮M(jìn)行擴(kuò)增，能夠克服由基因擴(kuò)增引起的測序偏向性；(2)實(shí)現(xiàn)連續(xù)測序，也就是核酸鏈上堿基的閱讀是不間斷的，這一特性不僅能夠大幅度提高測序速度，也會(huì)使核酸的讀長大幅度增加；(3)更低的測序成本，在生化反應(yīng)中無需不斷加入生化試劑，測序沒有試劑成本。由此看出，第三代測序技術(shù)的實(shí)現(xiàn)將會(huì)是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的又一里程碑，幫助人們隨時(shí)隨地、實(shí)時(shí)、低成本地獲取人體、環(huán)境各種各樣的核酸信息，隨時(shí)掌控生命體中遺傳與變異、表達(dá)與調(diào)控、感染和防衛(wèi)等事件，真正促進(jìn)4P和精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)現(xiàn)。
[0005]第三代測序中納米孔測序法是目前研究最多的。納米孔測序方法是單鏈核酸分子在電場驅(qū)動(dòng)下穿過納米尺度的微孔，通過實(shí)時(shí)檢測過孔電流的變化，識別過孔單鏈核酸上的堿基。制備納米孔的材料可以采用天然的或經(jīng)改造的蛋白質(zhì)分子，如α溶血素、Msp蛋白，也可以使用微納加工制備的固態(tài)納米孔，如氮化硅、石墨烯等。生物納米孔在單鏈核酸分子堿基的準(zhǔn)確識別方面還存在技術(shù)瓶頸。固態(tài)納米孔由于孔徑的可控性和穩(wěn)定性、納米孔長度、單鏈過孔速度等因素，尚未實(shí)現(xiàn)核酸鏈單個(gè)堿基的識別。
[0006]在納米孔核酸測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，人們開發(fā)了能夠精確鑒定氨基酸的蛋白單分子測序技術(shù)。研究人員將一對金屬電極分隔在約兩納米的孔洞旁邊，當(dāng)線性多肽穿過這種納米孔的時(shí)候，每一個(gè)氨基酸都會(huì)完成一個(gè)電回路，并發(fā)出相應(yīng)的電信號。而這樣的電信號可以幫助人們判斷，通過納米孔的是哪一個(gè)氨基酸。另外，基于納米孔的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)將會(huì)廣泛用于研究蛋白結(jié)構(gòu)域、蛋白修飾和蛋白互作等領(lǐng)域。
[0007]絹云母是一種天然細(xì)粒白云母，屬白云母的亞種，是層狀結(jié)構(gòu)的硅酸鹽，結(jié)構(gòu)由兩層硅氧四面體夾著一層鋁氧八面體構(gòu)成的復(fù)式硅氧層。解理完全，可劈成極薄片狀，片厚可達(dá)IMi以下(理論上可解理成0.Snm單層)，徑厚比大；與白云母相比，絹云母具有天然粒徑小，易加工超細(xì)的特點(diǎn)。因此利用超薄的云母單層，控制納米孔長度在0.8nm左右，而已知雙螺旋堿基之間螺距為0.34nm，即云母單層允許2個(gè)堿基同時(shí)通過，通過比較不同雙堿基通過的電化學(xué)信號，即可實(shí)現(xiàn)核酸單個(gè)堿基的識別。但到目前為止，還沒有云母片應(yīng)用于納米孔測序的報(bào)道。
[0008]云母層帶有負(fù)電，層間吸附大量鉀離子，層間鉀離子被云母層牢牢吸引，難以交換，因此云母具有很低的離子交換能，同時(shí)這些鉀離子強(qiáng)烈地吸引著云母層，使其難以剝離。最早剝離云母的方法是尖銳工具切割法、膠帶粘撕法，這些方法只能剝離大顆粒的云母，且效率非常低、云母片較厚。介質(zhì)研磨法也是剝離云母的方法之一，但這方法不能完全破壞云母層間較強(qiáng)的作用力，因此制得的云母片厚度往往大于I微米，不屬于納米材料的范疇。中國專利申請公開說明書CN104445235A(【公開日】2015.03.25)公開了一種二維納米白云母的制備方法，中國專利申請公開說明書0附04743562六(【公開日】2015.07.01)公開了一種絹云母納米微片的制備方法，都是利用鈉、鋰等活潑性更高的離子替代云母層間的鉀離子，云母微片厚度可達(dá)到1nm左右，但均無法實(shí)現(xiàn)單層云母的制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的提供一種單層云母的制備方法，并將單層云母涂布在合適的基底上，利用高能聚焦電子束(TEM)或離子束，制備孔徑在I?5nm的納米孔，當(dāng)單鏈核酸或蛋白質(zhì)分子等在電場驅(qū)動(dòng)下穿過納米孔，通過實(shí)時(shí)檢測過孔電流的變化，即可識別過孔單鏈核酸上的堿基或者蛋白質(zhì)鏈上的氨基酸，發(fā)展一種低成本、快速核酸/蛋白測序器件，可廣泛應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)域、蛋白修飾和蛋白互作等領(lǐng)域。
[0010]為了能夠?qū)﹂L片段單鏈核酸或蛋白質(zhì)模板進(jìn)行快速、低成本測序的方法，首先需要制備超薄的云母單層，控制云母厚度在0.8nm左右。
[0011]本發(fā)明提供的絹云母單層的制備方法包括以下步驟:
[0012]I)將絹云母粉加入含有堿金屬氫氧化物的有機(jī)溶劑中，在200?300°C攪拌72?96h；
[0013]2)利用50?10Hz，1000?2000W的微波輻射處理步驟I)的溶液5?8min，8000?12000rpm離心3?1min沉淀云母片；
[0014]3)將云母片重懸于I?5%鹽酸溶液中，超聲處理7?10h，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗，直到pH值6.5?7.5;
[0015]4)進(jìn)行密度梯度離心，首先1000?2000rpm離心3?1min，棄沉淀;接下來5000?8000rpm離心3?lOmin，棄上清，沉淀重懸于去離子水中，得到單層云母懸液。
[0016]上述步驟I)中，絹云母粉的加入量優(yōu)選為每mL溶液中加入0.1g;所述堿金屬的氫氧化物例如氫氧化鉀、氫氧化鈉和氫氧化鋰等，其濃度優(yōu)選在0.05?lg/mL;所述有機(jī)溶劑優(yōu)先選自下列溶劑中的一種或多種:四氫呋喃(THF)、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、苯類溶劑(例如苯、甲苯、二甲苯)等。
[0017]上述步驟2)中的離心速度優(yōu)選為I OOOOrpm，離心時(shí)間5min。
[0018]上述步驟4)中，梯度離心的第一次離心去掉未完全解離的云母顆粒，第二次離心去掉云母碎片，重懸于去離子水中的即為單層云母片。
[0019]利用本發(fā)明制備的單層云母片可制備一種基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件，該電子器件包括支撐基底和單層云母片，其中:所述支撐基底帶有孔洞，所述單層云母片位于孔洞之上，由支撐基底支撐;在該孔洞上的單層云母片部位具有一孔徑在I?5nm的納米孔。
[0020]在上述基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件的兩邊注入緩沖液，兩邊的緩沖液僅通過單層云母片上的納米孔連通，當(dāng)單鏈核酸或蛋白質(zhì)分子在電場驅(qū)動(dòng)下穿過單層云母片上的納米孔時(shí)，通過實(shí)時(shí)檢測過孔電流的變化，識別過孔核酸單鏈上的堿基或蛋白質(zhì)單鏈上的氨基酸，實(shí)現(xiàn)核酸或蛋白質(zhì)測序。
[0021]上述支撐基底可以是Si/Si02基片或石墨烯等薄膜材料，通過微納加工手段在其上形成孔徑在10?50nm的孔洞。所述單層云母片優(yōu)選本發(fā)明方法制備的絹云母單層。
[0022]本發(fā)明基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件可通過下述方法制備:
[0023]I)在支撐基底上制備孔徑在10?50nm的孔洞；
[0024]2)制備單層云母片懸液，將其滴在帶孔洞的支撐基底上，然后在支撐基底下抽真空，自然風(fēng)干，使單層云母片吸附在支撐基底上；
[0025]3)在單層云母片上位于所述孔洞的部位，利用高能聚焦電子束或離子束制備出直徑I?5nm的納米孔。
[0026]本發(fā)明利用云母單層只有0.Snm厚度的特點(diǎn)，將單層云母通過物理吸附的方式固定在基底上，利用高能聚焦電子束(TEM)或離子束，制備l-5nm納米孔，單鏈核酸或蛋白質(zhì)分子在電場驅(qū)動(dòng)下穿過納米孔，通過實(shí)時(shí)檢測過孔電流的變化，識別過孔單鏈核酸上的堿基或單鏈蛋白質(zhì)上的氨基酸，實(shí)現(xiàn)核酸單鏈上堿基序列或蛋白質(zhì)單鏈上氨基酸序列的檢測。
[0027]具體的，本發(fā)明還提供了一種核酸或蛋白質(zhì)測序裝置，包括上述基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件，以及微型溶液槽、驅(qū)動(dòng)電極和過孔電流監(jiān)測系統(tǒng)，其中:所述固態(tài)納米孔電子器件封裝在微型溶液槽中，并將微型溶液槽分隔成僅通過納米孔連通的兩部分，這兩部分裝有緩沖液，并分別放置一個(gè)驅(qū)動(dòng)電極，通過驅(qū)動(dòng)電極施加電場可驅(qū)動(dòng)納米孔一側(cè)的單鏈核酸或蛋白質(zhì)分子穿過納米孔到另一側(cè)，而過孔電流監(jiān)測系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測過孔電流的變化。
[0028]所述驅(qū)動(dòng)電極通常是銀/氯化銀電極;所述過孔電流監(jiān)測系統(tǒng)優(yōu)選膜片鉗測試系統(tǒng)，也可以使用電化學(xué)工作站。
[0029]有益效果:
[0030]本發(fā)明作為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ牡谌鷾y序方法，采用單層云母納米孔結(jié)構(gòu)的電子器件具備如下優(yōu)點(diǎn):無需制備特殊的測序文庫，無需對核酸/蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，可進(jìn)行超長、連續(xù)、快速、精準(zhǔn)的堿基閱讀，可制備成高通量平行的分子器件，可實(shí)現(xiàn)超低成本的核酸/蛋白質(zhì)測序等，具體描述如下:
[0031](I)本發(fā)明提出的單層云母制備方法，通過改進(jìn)的解理方法，可實(shí)現(xiàn)真正意義上單層解理效果；
[0032](2)本發(fā)明提出的單層云母，相較于其它報(bào)道的固態(tài)納米孔材料，如氮化硅等，厚度更薄，納米孔長度在0.Snm左右，只允許2個(gè)堿基同時(shí)通過，通過比較不同雙堿基通過的電化學(xué)信號，即可實(shí)現(xiàn)核酸單個(gè)堿基的識別；
[0033](3)本發(fā)明提出的單層云母固態(tài)納米孔，相較于其它報(bào)道的固態(tài)納米孔，如氮化硅等，孔的穩(wěn)定性更強(qiáng)，有效避免了縮孔效應(yīng)；
[0034](4)本發(fā)明提出的單層云母固態(tài)納米孔器件，通過捕捉過孔電流的變化，實(shí)現(xiàn)核苷、氨基酸等底物生化反應(yīng)過程的監(jiān)測，無需對測序?qū)ο筮M(jìn)行擴(kuò)增和放大，即可直接完成分子測序，能夠克服由基因擴(kuò)增引起的測序偏向性；
[0035](5)本發(fā)明提出的單層云母固態(tài)納米孔器件，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)、不間斷的測序，這一特性不僅能夠大幅度提高測序速度，也會(huì)使讀長大幅度增加；
[0036](6)本發(fā)明提出的單層云母固態(tài)納米孔器件，在測序過程中除了核酸/蛋白質(zhì)溶液夕卜，無需加入其他生化試劑，在測序過程中無試劑成本。
【附圖說明】
[0037]圖1是實(shí)施例中制備的單層云母片的透射電子顯微鏡(TEM)照片。
[0038]圖2是實(shí)施例中單層云母片上納米孔透射電子顯微鏡(TEM)照片。
[0039]圖3是本發(fā)明一種基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件的結(jié)構(gòu)及檢測電路示意圖。
[0040]圖中:1-硅基底，2-二氧化硅懸空膜，3-緩沖液，4-單層云母，5-銀/氯化銀電極，6_預(yù)檢測的核酸/蛋白質(zhì)分子。
【具體實(shí)施方式】
[0041]下面結(jié)合附圖，通過實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行說明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0042]實(shí)施例:
[0043](I)單層云母的制備:配制5g氫氧化鉀(KOH)溶于50mL有機(jī)溶劑四氫呋喃(THF)中，室溫?cái)嚢?4h;將Ig絹云母粉加入到上述溶液中，置于不銹鋼鍋中，250°C處理72h，其間用磁力攪拌子攪拌;利用微波福射處理溶液(60Hz，1000W)5-8min，1000rpm離心5min沉淀云母片；云母片重懸于1%鹽酸(HCl)溶液中，超聲處理7-10h，用蒸餾水反復(fù)沖洗，直到pH值7.0;進(jìn)行密度梯度離心，首先2000rpm離心5min，棄沉淀，去掉未完全解離的云母顆粒，接下來6000rpm離心5min，棄上清，去掉云母碎片，沉淀重懸于去離子水中，得到單層云母懸液。
[0044](2)支撐基底的制備:利用光刻、干法刻蝕、濕法刻蝕、反應(yīng)離子束刻蝕等一系列微納加工手段制備Si/Si02懸空膜結(jié)構(gòu)的支撐基底，如圖3中所示。其中，厚度為30納米的S12懸空膜2作為絕緣緩沖層，起到支撐云母單層、減少電學(xué)測量中電容效應(yīng)的作用，S12懸空膜2上制備出孔徑為10?50nm的孔洞;Si基底I主要起支撐S12的作用。
[0045](3)單層云母在支撐基底上的吸附結(jié)合:吸取步驟(I)制得的單層云母懸液10微升至步驟(2)制得的支撐基底上，支撐基底下方用空氣栗抽真空，等待自然風(fēng)干，使單層云母4吸附在支撐基底上，參見圖3。
[0046](4)基底上單層云母的表征和打孔:利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察支撐基底表面，確認(rèn)是否有單層云母片存在，如圖1所示。然后通過300kV透射電子顯微鏡(TEM)的電子束，在孔洞處的單層云母片上加工出直徑小于5nm的納米孔，如圖2所示，得到單層云母納米孔芯片。
[0047](5)將單層云母納米孔芯片，如圖3所示，封裝于一個(gè)微型溶液槽中，溶液槽被芯片分隔成兩部分，向這兩部分分別順序注入3mL無水乙醇、3mL超純水進(jìn)行清洗，然后注入3mL氯化鉀緩沖液(IM)，通過芯片中間的納米孔將分隔的溶液槽兩部分連通，在芯片兩邊的緩沖液3中分別放置一個(gè)銀/氯化銀電極5，構(gòu)建納米孔通道的縱向電學(xué)回路。
[0048](6)利用膜片鉗測試系統(tǒng)(Axon 700B)通過銀/氯化銀電極5施加電壓，監(jiān)測過孔電流。過孔電流大小在納安量級，電流的波動(dòng)值在0.1納安級。
[0049](7)從施加負(fù)電壓的一端溶液加入適量的單鏈核酸/蛋白質(zhì)，監(jiān)測整套裝置兩端電流信號變化。電流的波動(dòng)值與持續(xù)時(shí)間表示通過納米孔的堿基/氨基酸種類，用于鑒別對應(yīng)合成的堿基/氨基酸。
[0050](8)記錄通過單層云母片的固態(tài)納米孔器件電流波動(dòng)譜，分析核酸/蛋白質(zhì)模板序列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種絹云母單層的制備方法，包括以下步驟: 1)將絹云母粉加入含有堿金屬氫氧化物的有機(jī)溶劑中，在200?300°C攪拌72?96h; 2)利用50?10Hz，1000?2000W的微波輻射處理步驟I)的溶液5?8min，8000?12000rpm離心3?1min沉淀云母片； 3)將云母片重懸于I?5%鹽酸溶液中，超聲處理7?1h，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗，直到pH值6.5?7.5; 4)進(jìn)行密度梯度離心，首先1000?2000印111離心3?10111；[11，棄沉淀；接下來5000?8000rpm離心3?lOmin，棄上清，沉淀重懸于去離子水中，得到單層云母懸液。2.如權(quán)利要求1所述的絹云母單層的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述堿金屬的氫氧化物是氫氧化鉀、氫氧化鈉和/或氫氧化鋰，其在所述有機(jī)溶劑中的濃度為0.05?lg/mL。3.如權(quán)利要求1所述的絹云母單層的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述有機(jī)溶劑選自下列溶劑中的一種或多種:四氫呋喃、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺和苯類溶劑。4.一種基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件，包括支撐基底和單層云母片，其中:所述支撐基底帶有孔洞，所述單層云母片位于孔洞之上，由支撐基底支撐;在該孔洞上的單層云母片部位具有一孔徑在I?5nm的納米孔。5.如權(quán)利要求4所述的固態(tài)納米孔電子器件，其特征在于，所述支撐基底是Si/Si02基片或石墨稀薄膜，所述孔洞直徑為10?50nm;所述單層云母片的厚度為0.8nm。6.—種基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件的制備方法，包括以下步驟: 1)在支撐基底上制備孔徑在10?50nm的孔洞； 2)制備單層云母片懸液，將其滴在帶孔洞的支撐基底上，然后在支撐基底下抽真空，自然風(fēng)干，使單層云母片吸附在支撐基底上； 3)在單層云母片上位于所述孔洞的部位，利用高能聚焦電子束或離子束制備出直徑I?5nm的納米孔。7.如權(quán)利要求6所述的固態(tài)納米孔電子器件的制備方法，其特征在于，步驟I)中所述支撐基底是SVS12基片或石墨烯薄膜，通過微納加工手段在其上形成孔徑在10?50nm的孔洞。8.如權(quán)利要求6所述的固態(tài)納米孔電子器件的制備方法，其特征在于，通過權(quán)利要求1?3任一所述的絹云母單層的制備方法制備步驟2)中所述的單層云母片懸液。9.權(quán)利要求4或5所述的基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件在核酸或蛋白質(zhì)測序中的應(yīng)用，在所述固態(tài)納米孔電子器件的兩邊注入緩沖液，兩邊的緩沖液僅通過單層云母片上的納米孔連通，使單鏈核酸或蛋白質(zhì)分子在電場驅(qū)動(dòng)下穿過納米孔，通過實(shí)時(shí)檢測過孔電流的變化，識別過孔單鏈核酸上的堿基或單鏈蛋白質(zhì)上的氨基酸。10.—種核酸或蛋白質(zhì)測序裝置，包括權(quán)利要求4或5所述的基于單層云母片的固態(tài)納米孔電子器件，以及微型溶液槽、驅(qū)動(dòng)電極和過孔電流監(jiān)測系統(tǒng)，其中:所述固態(tài)納米孔電子器件封裝在微型溶液槽中，并將微型溶液槽分隔成僅通過納米孔連通的兩部分，這兩部分裝有緩沖液，并分別放置一個(gè)驅(qū)動(dòng)電極，施加電場驅(qū)動(dòng)單鏈核酸或蛋白質(zhì)分子穿過納米孔，而過孔電流監(jiān)測系統(tǒng)用于實(shí)時(shí)檢測過孔電流的變化。
【文檔編號】G01N27/00GK105883838SQ201610195641
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年3月31日
【發(fā)明人】陸祖宏, 李清寧, 魏穎穎, 丁韜力, 嚴(yán)勇, 萬成, 孫利, 李成強(qiáng), 孫杰, 王磊
【申請人】北京大學(xué), 北京普若博升生物科技有限公司