專利名稱：從植物黃花蒿中分離化合物東莨菪亭的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從植物黃花蒿(Artemisia annua)和其它植物科中分離用作氧化氮合成抑制劑的化合物東莨菪亭的方法。東莨菪亭屬于香豆素類化合物。東莨菪亭(7-羥基-6-甲氧基香豆素)是苯并-α-吡喃酮香豆素的一種衍生物，已發(fā)現(xiàn)它在植物中以游離狀態(tài)和苷類兩種形式存在。
天然香豆素類對活的生物體具有不同的和顯著的作用。香豆素類具有許多藥理和生理活性如抗菌、血管舒張和利尿作用、抗凝血特性、保護(hù)肝臟和呼吸興奮。東莨菪亭顯示出了非常好的生長抑制特性(Shilling D G和Yoshikawa F,Amerchem.Soc.Symp Series,330:335-342)。最近據(jù)報導(dǎo)東莨菪亭在鼠的巨噬細(xì)胞中顯示出了對氧化氮(NO)合成的抑制作用。巨噬細(xì)胞在最終防御感染和腫瘤發(fā)展方面起重要作用，并且這種活性是通過產(chǎn)生幾種中間物來調(diào)節(jié)的。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生氧化氮能夠調(diào)節(jié)殺死腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌、真菌和寄生蟲或其生長抑制劑。所以開發(fā)一種有效并經(jīng)濟(jì)的東莨菪亭的來源、iNOs的抑制劑對將來進(jìn)行有效治療和商業(yè)應(yīng)用是有價值的(Tai-Hyun Kang等東莨菪亭來自矮蒿中的一種可誘發(fā)NO合成抑制性活性組份，P1anta Media,65:400-403,1999；來自Ttraxinus rhynchobhyeli的體外可誘發(fā)NO合成抑制性活性成分，PlantMedia,65:656-658,1999)。
東莨菪亭廣泛分布于植物王國中并可從植物的不同部位(根、果、葉、莖等)中分離得到，但發(fā)現(xiàn)幾種相關(guān)成分經(jīng)常的共存從而使得分離困難。通常，香豆素類的分離最初取決于用極性遞增的溶劑對干燥植物進(jìn)行的連續(xù)提取，常用的溶劑為石油醚(pet ether)、苯、乙醚、丙酮或甲醇。
用于分離香豆素類的常規(guī)方法是用95％甲醇/乙醇提取干燥的粉狀物質(zhì)并用10％堿性溶液處理濃縮過的提取液。用乙醚提取堿性溶液以除去脂肪物質(zhì)。酸化含水溶液并用乙醚或氯仿提取得到粗的香豆素類。通過硅膠或礬土的柱層析法進(jìn)一步純化得到純的香豆素類。用升華方法能夠從植物組織中分離到特定的香豆素類(如umbilliferon、東莨菪亭)(Abu-Mustafa,E.A.；E1-Tawil,B.A.H.和M.B.E.Fayez；Phytochemistry,3,701(1964))。
盡管如此，通過酸堿處理分離香豆素的方法還是不理想的，這是因為幾乎不能防止某些香豆素類的降解，從而導(dǎo)致分離出的是人工產(chǎn)物而不是原始的化合物或者造成化合物損失。在另外一種方法中，通過升華進(jìn)行的純化包括形成人工產(chǎn)物的熱降解?？偦厥樟肯陆?。因此未曾報道過用于商業(yè)開發(fā)的高東莨菪亭含量的植物和任何大規(guī)模分離東莨菪亭的方法。
本發(fā)明的一個目的是開發(fā)具有高東莨菪亭含量的新植物/植物部位。
本發(fā)明的另一目的是選擇用于選擇性提取東莨菪亭的溶劑。
本發(fā)明的又一目的是開發(fā)一種分離純東莨菪亭的經(jīng)濟(jì)的方法。
因比，本發(fā)明提供了一種從植物黃花蒿和其他植物科中分離氧化氮合成抑制劑化合物東莨菪亭的方法，它包括用含水乙腈溶劑提取粉狀植物部位，用氯化溶劑分配，在蒸發(fā)溶劑、殘余物層物和結(jié)晶之后得到純東莨菪亭。方法的新穎性1．選擇提取東莨菪亭的植物部位，提高了產(chǎn)量并減少了工藝成本。
2．用含水乙腈提取該植物部位比使用其他極性溶劑如甲醇或乙醇更經(jīng)濟(jì)并具有更優(yōu)的東莨菪亭產(chǎn)量。
3．在該方法中，通過避免任何酸堿處理來分離東莨菪亭從而提高產(chǎn)量。
4．將東莨菪亭選擇性地從含水提取液轉(zhuǎn)到鹵化的非極性相中，從而易于純化和分離純的東莨菪亭。
5．在層析前純化粗提取物得到50％的東莨菪亭結(jié)晶。
6．該方法可以重復(fù)使用溶劑和硅膠。
7．這些優(yōu)點是對大規(guī)模生產(chǎn)東莨菪亭來說具有顯著的經(jīng)濟(jì)價值。
本發(fā)明提供了一種從黃花蒿和其他植物科中分離用作氧化氮合成抑制劑的化合物東莨菪亭的方法，該方法包括a)以1∶5的比例用含水乙腈溶劑提取不同植物部位的干燥粉狀物6-8小時，b)真空濃縮提取過的溶劑到其原始提取液的30％，c)用鹵化溶劑分配濃縮的提取液從而把東莨菪亭轉(zhuǎn)入非極性鹵化溶劑中，d)在無水硫酸鈉上把鹵化溶劑干燥并蒸發(fā)溶劑，e)在甲醇中將殘余物結(jié)晶并過濾晶體，f)濃縮濾液并在硅膠上進(jìn)行層析，g)在氯仿甲醇混合液中洗脫東莨菪亭，結(jié)晶含有東莨菪亭的級分得到純的東莨菪亭化合物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，選用黃花蒿植物來分離東莨菪亭。據(jù)報導(dǎo)西班牙的黃花蒿的ariel部位含有0.02％東莨菪亭而英國的(cult)含有0.034％東莨菪亭。據(jù)報導(dǎo)中國的整株植物都有東莨菪亭(Brown,G.D.源于黃花蒿的兩種新化合物J.Nat.Prod.58,300(1992)；Marco,J.A.；Sawz,J.F.；Bea,J.F.；Barber,O.黃花蒿中的酚類組份Pharmazie 45,382-383(1990)；Liu,H.M.；Li,G.L.,Wu,H.Z.青蒿成分的研究藥學(xué)學(xué)報，37,129-143(1979))。
在印度CIMAP,Lucknow已經(jīng)開發(fā)了一種產(chǎn)生高含量青蒿素和生物量(莖和葉)的新種黃花蒿“Jeevan raksha”。據(jù)報導(dǎo)青蒿素及其衍生物可以作為對氯喹等多種藥物耐受的和嚴(yán)重的復(fù)雜瘧疾的有效藥。黃花蒿植物是青蒿素的唯一來源。
采用HPLC對新種黃花蒿植物的所有三個主要部位的東莨菪亭含量進(jìn)行篩選。在不同部位得到的東莨菪亭的含量為葉0.2％、莖0.3％和根0.004％。東莨菪亭的產(chǎn)量比其他報道的植物的高很多。植物黃花蒿的莖由于不含青蒿素而被視為廢物。植物莖部分的生物量是葉的五倍多。所以，我們已經(jīng)選擇植物花黃蒿的莖部位分離東莨菪亭。也發(fā)現(xiàn)莖的莖髓部分含有較少的有色和脂肪物質(zhì)，這使分離和純化東莨菪亭變得容易。
在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用非極性溶劑提取植物原料，會導(dǎo)致香豆素類回收量減少。而且，用于提取香豆素類的極性溶劑(甲醇和乙醇)會得到更多量的具有較多有色和脂肪物質(zhì)的總提取物。分離脂肪和有色物質(zhì)是一件困難的工作。在本發(fā)明中，我們選擇了含水乙腈溶劑來提取，從而得到更多量的含有較少有色和脂肪物質(zhì)的東莨菪亭。同時也使得從乙腈中分離水來回收純的溶劑用于重復(fù)利用變得非常容易。
在現(xiàn)有技術(shù)中，從粗提取物中通過酸堿處理或者通過升華方法純化東莨菪亭，由于它的重排和熱分解的原因?qū)е铝藮|莨菪亭產(chǎn)量的減少。在本發(fā)明改良的方法中，通過用氯化溶劑(四氯化碳、二氯甲烷、氯仿)分配含水相選擇性地將香豆素類從含水提取液轉(zhuǎn)入非極性相中。采用該步驟，把大多數(shù)有色和脂肪物質(zhì)留在了極性相中，從而在非極性相中富集了在粗提取液中自身容易結(jié)晶(50-60％)的東莨菪亭。結(jié)晶后留在母液中的東莨菪亭只以1∶10的比例經(jīng)過硅膠柱層析法來完成純東莨菪亭的分離。把東莨菪亭從含水提取液中分配到非極性溶劑減少了60-70％的粗提取液的容積，從而減少了該方法中硅膠和溶劑的用量。
該方法由下列操作組成1．在陰暗處干燥和研碎黃花蒿的莖。2．通過冷滲法用含水乙腈溶劑提取粉狀黃花蒿莖。3．真空濃縮總提取液。4．用鹵化溶劑分配含水乙腈相。5．從總鹵化提取液中除去水分。6．蒸餾鹵化溶劑得到殘余提取液。7．從殘余提取液中結(jié)晶東莨菪亭。8．過濾并濃縮母液。9．在硅膠柱上層析母液獲得純東莨菪亭。
本發(fā)明提供了一種從植物黃花蒿中提取和分離東莨菪亭的方法以克服現(xiàn)存方法的缺陷。本發(fā)明更具體地提供了一種從天然原料中獲得更為便宜和更高產(chǎn)量的氧化氮合成抑制劑化合物東莨菪亭的方法。
所以，本發(fā)明提供了一種從黃花蒿中提取和分離東莨菪亭的方法，該方法包括以1∶5的比例用含水乙腈溶劑提取植物部位，優(yōu)選為黃花蒿的干燥莖粉；真空濃縮提取液，用非極性鹵化溶劑分配經(jīng)濃縮的提取液，蒸發(fā)鹵化溶劑，在甲醇中結(jié)晶殘留物，過濾東莨菪亭，濃縮母液并在硅膠上層析得到純東莨菪亭。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用于提取的溶劑選自1∶9到9∶1的不同比例的乙腈∶水。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，用于分配的鹵化溶劑選自二氯甲烷、四氯化碳、氯仿等。在本發(fā)明的又一個實施方案中，提取東莨菪亭的植物部分選自莖、葉、根等。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，在硅膠上分離東莨菪亭，其粗提取液與硅膠之比選自1∶5到1∶20，優(yōu)選為1∶5,1∶10或1∶20。
下列實施例中所提供的本發(fā)明的細(xì)節(jié)只是用于詳細(xì)說明而不是為了限定本本發(fā)明的又一個實施方案中，從植物科如傘形科、蕓香科、菊科、豆科、?？?、石竹科等提取和分離東莨菪亭。
在本發(fā)明又一實施方案中，東莨菪亭是在選自氯仿、丙酮、甲醇及其混合物的溶劑中結(jié)晶的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，從黃花蒿不同部位分離的東莨菪亭是莖中0.25-0.30％，葉中0.16-0.20％和根中0.003-0.004％。
實施例-1選擇提取的植物部位對黃花蒿不同部位(葉、莖、根)中東莨菪亭含量進(jìn)行了對比研究。用甲醇提取0.1gm的干粉樣品。過濾提取液并將溶劑蒸干。把提取物溶于1ml的甲醇中。在下列操作條件下采用配有光二極管陣列檢測器的LC8A Shimadzu HPLC對每個樣品中東莨菪亭的含量進(jìn)行評估流動相乙腈水(30∶70)；流動速率0.8ml/min，在230nm處檢測，柱-C18 Lichrosorb,10um Merck德國。用配制成1mg/5ml甲醇的標(biāo)準(zhǔn)東莨菪亭溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。在不同植物部位中評估的東莨菪亭含量如下葉(0.16)，莖(0.2)和根(0.003)。
實施例-2選擇提取溶劑用10ml的不同溶劑(二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水、甲醇∶水(9∶1)、乙醇∶水(9∶1)和乙腈∶水(9∶1))提取黃花蒿的莖粉狀樣品(0.1gm),冷滲24小時。過濾各提取液并真空蒸發(fā)。將各提取物溶于1ml的HPLC級的甲醇中并用實施例-1中所述的HPLC方法評估東莨宕亭的含量。在不同溶劑中記錄的黃花蒿莖中的東莨菪亭含量如下二氯甲烷(0.016％)、氯仿(0.16％)、乙酸乙酯(0.09％)、甲醇(0.2％)、乙醇(0.24％)、乙腈(0.22％)、水(0.28％)、甲醇∶水(9∶1；0.16％)、乙醇∶水(9∶1；0.23％)和乙腈∶水(9∶1；0.30％)。
實施例-3從莖中提取和分離東莨菪亭把黃花蒿莖研成粉狀。用10％的含水乙腈(5×500ml)在滲濾器中提取粉狀物質(zhì)(100gm)6-8小時。把總提取液真空濃縮到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配濃縮過的含水提取液。在無水硫酸鈉上干燥氯仿提取液并蒸發(fā)溶劑得到殘余物2.0gm。把殘余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小時結(jié)晶。過濾晶體化合物并干燥得到純東莨菪亭。結(jié)晶步驟重復(fù)兩次得到60％的純化合物。以(1∶20)的比例硅膠柱色譜法分離濾液中的剩余東莨菪亭，采用4％的甲醇氯仿溶液洗脫。蒸發(fā)含有東莨菪亭的級分并結(jié)晶得到純東莨菪亭。從100gm含有0.3％東莨菪亭含量的莖粉中得到85％的純東莨菪亭。用mp,IR,1H,13C NMR和質(zhì)譜數(shù)據(jù)來鑒別該東莨菪亭，如文獻(xiàn)中報道的那樣。
實施例-4從莖中提取和分離東莨菪亭把黃花蒿莖研成粉狀。在滲濾器中用30％的含水乙腈(5×500ml)對粉狀物質(zhì)(100gm)提取6-8小時。把總提取液真空濃縮到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配濃縮過的含水提取液。在無水硫酸鈉上干燥氯仿提取液并蒸發(fā)溶劑得到2.1gm。把殘余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小時結(jié)晶。過濾晶體化合物并干燥得到純東莨菪亭。結(jié)晶步驟重復(fù)兩次得到50％的純化合物。用(1∶10)的比例硅膠柱色譜法分離濾液中的剩余東莨菪亭，用2％的甲醇氯仿溶液洗脫。蒸發(fā)含有東莨菪亭的級分并結(jié)晶得到純東莨菪亭。從100gm含有0.3％東莨菪亭含量的莖粉中分離得到82％的純東莨菪亭。
實施例-5從莖中提取和分離東莨菪亭把黃花蒿莖研成粉狀。在滲濾器中用70％的含水乙腈(5×500ml)對粉狀物質(zhì)(100gm)進(jìn)行提取6-8小時。把總提取液真空濃縮到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配濃縮過的含水提取液。在無水硫酸鈉上干燥氯仿提取液并蒸發(fā)溶劑得到殘余物2.30gm。把殘余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小時結(jié)晶。過濾晶體化合物并干燥得到純東莨菪亭。結(jié)晶步驟重復(fù)兩次得到40％的純化合物。以(1∶5)的比例硅膠柱色譜法分離濾液中的剩余東莨菪亭，用氯仿洗脫東莨菪亭。蒸發(fā)含有東莨菪亭的級分并結(jié)晶得到純東莨菪亭。從100gm含有0.3％東莨菪亭含量的莖粉中分離得到80％純東莨菪亭。
實施例-6從葉中提取和分離東莨菪亭把黃花蒿葉研成粉狀。用己烷(5×400ml)給粉狀物質(zhì)(100gm)脫脂。給葉脫脂后，再在滲濾器中用70％含水乙腈(5×500ml)對剩余的殘渣提取6-8小時。把總提取液真空濃縮到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配濃縮過的含水提取液。在無水硫酸鈉上干燥氯仿提取液并蒸發(fā)溶劑得到殘余物2.0gm。把殘余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小時結(jié)晶。過濾晶體化合物并干燥得到純東莨菪亭。結(jié)晶步驟重復(fù)兩次得到30％的純化合物。以(1∶20)的比例的硅膠柱色譜法分離濾液中的剩余東莨菪亭，用4％的甲醇氯仿溶液洗脫。蒸發(fā)含有東莨菪亭的級分并結(jié)晶得到純東莨菪亭。從100gm含有0.23％東莨菪亭含量的葉粉中得到80％的純東莨菪亭。
本發(fā)明的主題提取和分離東莨菪亭的方法具有許多優(yōu)點。1．在該方法中避免使用會減少東莨菪亭含量的現(xiàn)有技術(shù)中分離總香豆素類所用的酸堿處理。2．用含水乙腈溶劑提取比用其他極性溶劑如甲醇、乙醇和水的提取更經(jīng)濟(jì)并且東莨菪亭的產(chǎn)量更高。3．由于在層析前50％的東莨菪亭結(jié)晶，所以硅膠量已經(jīng)減少。4．該方法可以使溶劑重復(fù)使用。5．選擇植物莖進(jìn)行提取提高了東莨菪亭的產(chǎn)量并減少了生產(chǎn)成本，這是因為黃花蒿莖中不含青蒿素，因而它是一種廢物。6．莖中東莨菪亭的含量高，在蒿屬植物中莖生物量是葉的五倍并且在莖部位中含有較少的有色物質(zhì)，使純化簡單。7．該優(yōu)點對從黃花蒿中大規(guī)模生產(chǎn)東莨菪亭來說具有顯著經(jīng)濟(jì)價值。
權(quán)利要求
1.一種從黃花蒿和其他植物科中分離用作氧化氮合成抑制劑的化合物東莨菪亭的方法，該方法包括a)以1∶5的比例用含水乙腈溶劑提取不同植物部位的干燥粉狀物6-8小時，b)真空濃縮提取過的溶劑到其原始提取液的30％，c)用鹵化溶劑分配濃縮的提取液從而把東莨菪亭轉(zhuǎn)入非極性鹵化溶劑中，d)在無水硫酸鈉上把鹵化溶劑干燥并蒸發(fā)溶劑，e)在甲醇中將殘余物結(jié)晶并過濾晶體，f)濃縮濾液并在硅膠上進(jìn)行層析，g)在氯仿甲醇混合液中洗脫東莨菪亭，結(jié)晶含有東莨菪亭的級分得到純的東莨菪亭化合物。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中其他植物科為傘形科、蕓香科、菊科、豆科、桑科、石竹科等。
3．按照權(quán)利要求1的方法，其中用于提取的植物部位選自莖、葉、根等。
4．按照權(quán)利要求1的方法，其中乙腈-水溶劑比為9∶1到1∶9。
5．按照權(quán)利要求1的方法，其中鹵化溶劑選自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等。
6．按照權(quán)利要求1的方法，其中在選自氯仿、丙酮、甲醇及其混合物的溶劑中結(jié)晶東莨菪亭。
7．按照權(quán)利要求1的方法，其中通過硅膠柱層析法從母液中得到東莨菪亭，其中粗提取液與硅膠的比的范圍為1∶5到1∶20，優(yōu)選為1∶5、1∶10或1∶20。
8．按照權(quán)利要求1的方法，其中從黃花蒿不同部位分離的東莨菪亭的范圍為莖中0.25-0.30％，葉中0.16-0.20％和根中0.003-0.004％。
全文摘要
從黃花蒿和其他植物科中分離用作氧化氮合成抑制劑的化合物東莨菪亭的方法,包括用含水乙腈溶劑以1∶5的比例提取不同植物部位的干燥粉狀物6—8小時,真空濃縮所提取的溶劑到原始提取液的30%,用鹵化溶劑分配濃縮的提取液從而把東莨菪亭轉(zhuǎn)入非極性鹵化溶劑中,在無水硫酸鈉上把鹵化溶劑干燥并蒸發(fā)溶劑,在甲醇中將殘余物結(jié)晶并過濾晶體,濃縮濾液并在硅膠上層析,用氯仿甲醇混合液洗脫東莨菪亭,結(jié)晶含有東莨菪亭的級分得到純的東莨菪亭化合物。
文檔編號C07D311/16GK1315324SQ00108330
公開日2001年10月3日 申請日期2000年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月30日
發(fā)明者D·C·杰恩, N·潘特, M·M·谷普塔, R·S·布哈庫尼, R·K·威馬, S·坦多恩, S·K·谷普塔, A·特瓦里, A·P·卡霍爾, S·庫馬 申請人:科學(xué)與工業(yè)研究會