專利名稱：用于檢測作為傳染性海綿狀腦病指示的朊病毒蛋白的單克隆抗體和抗體混合物的制作方法
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及作為傳染性海綿狀腦病(TSE)指示的朊病毒蛋白(也表示為PrP-Sc蛋白)的檢測。具體地說，本發(fā)明涉及(a)特異結合朊病毒蛋白保守表位的單克隆抗體，和(b)所述單克隆抗體與特異結合朊病毒蛋白的第二保守表位的第二單克隆抗體組合的混合物。所述新的抗體和抗體混合物可用于免疫測定以檢測反芻動物和自然發(fā)生TSE的其它物種或潛在暴露于TSE的相關物種中的朊病毒蛋白。
2.領域描述傳染性海綿狀腦病(TSE)是在人類、食草反芻動物、貂和貓中發(fā)生的一類異種致死性神經(jīng)變性疾病。綿羊搔癢病是這一類的典型。TSE的特征是在受感染個體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中感染性形式的蛋白-朊病毒蛋白(也表示為PrP-搔癢病或PrP-Sc)的沉積。已經(jīng)定義朊病毒為小的蛋白性感染性顆粒，它抵抗通過修飾核酸的方法引起的失活?！半貌《尽币辉~是“蛋白質”和“感染”兩詞的縮寫，而且朊病毒如果不是僅由PrP基因編碼的PrP-Sc分子組成，則也是主要由其組成。因為受感染動物腦的死后顯微鏡下外觀或組織病理學外觀上，在皮層和小腦中有大空泡，所以朊病毒病經(jīng)常稱為海綿狀腦病。朊病毒蛋白是正常哺乳動物糖蛋白(PrP-細胞的或PrP-C)的翻譯后修飾作用所產(chǎn)生的不溶性、蛋白酶抗性糖蛋白，而PrP-C唾液酸糖蛋白的異常同種型PrP-Sc蛋白沉積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是TSE感染的可靠的標志。
在食用家畜中最廣泛研究的TSE包括綿羊和山羊的搔癢病、牛的牛海綿狀腦病(BSE)(也稱為“瘋?！辈?以及黑尾鹿和馬鹿的慢性消耗性疾病(CWD)。動物中的其它TSE包括貂的傳染性貂腦病(TME)和家貓和非家貓的貓海綿狀腦病(FSE)。最近，報道了法國動物園中非人類靈長類中的TSE；這種疾病可能源自BSE(Bons等人，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 964046-4051(1999))。也已經(jīng)鑒定了人類的朊病毒疾病。這些包括克-雅病(CJD)；Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合征(GSS)；致死性家族失眠癥(FFI)和庫魯病。
這些疾病的感染性因子仍在爭論之中。然而，如上所述，哺乳動物唾液酸糖蛋白(PrP-細胞或PrP-C)的不溶性同種型(朊病毒或PrP-Sc)是感染性物質中的主要成分?？磥黼貌《镜鞍椎纳ΠW病同種型(PrP-Sc)是動物和人類傳播性神經(jīng)變性疾病的傳播和發(fā)病所必需的(參見S.B.Prusiner，Science 2521515-1522(1999)和S.B.Prusiner，Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America9513363-13383(1998))。主導的假設是朊病毒疾病是由于成核現(xiàn)象或聚合作用，PrP-C轉換為PrP-Sc的結果。
在英國和歐洲的牛中和在美國部分地區(qū)的黑尾鹿和馬鹿中發(fā)生新的傳染性海綿狀腦病，已經(jīng)加強了對可靠診斷測試的需求。而且，牛流行的TSE以及它與人類克-雅病新變種的假定關系(M.E.Bruce等人，Nature 389498-501(1997)和A.F.Hill等人，Nature 389448-450(1997))已經(jīng)增強了公眾和科學界對這些相對罕見疾病的認識，并且已經(jīng)突出了臨床前檢測TSE的需要。盡管在美國沒有檢測到BSE的病例，但是靈敏的免疫組織化學技術和臨床前檢測方法是檢測、監(jiān)視和控制TSE的基礎。
朊病毒病可以有長的潛伏期。例如，在綿羊中從動物受感染時到首次呈現(xiàn)病征為止可以經(jīng)歷3-5年。牛海綿狀腦病(BSE)從動物受感染時到首次呈現(xiàn)病征為止可以經(jīng)歷2-8年。受感染的動物和人類既沒有疾病特異性免疫應答，也沒有生物化學、血液學以及總體病理學的異常。因此，傳染性海綿狀腦病的早期診斷可能依賴于臨床體征、腦電圖或采用腦活組織檢查的侵入性方法。通過對可疑病例腦組織的死后顯微鏡檢查或組織學檢查完成TSE的證實。反芻動物TSE的死后組織病理學診斷基于神經(jīng)元空泡化、海綿狀變化、神經(jīng)膠質增生和星形細胞增生的出現(xiàn)。然而，根據(jù)宿主物種、個體、宿主遺傳學、疾病期和傳染源，這些可以在強度上和解剖學位置上有所不同。因此，在早期病例中僅通過組織病理學診斷可能不明確，而且在自溶的組織中通常是不可能的。
朊病毒蛋白(PrP-Sc)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的沉積是TSE的可靠標志。因此免疫組織化學檢測PrP-Sc是診斷、監(jiān)視和控制TSE的組織病理學的重要的附加手段。單克隆抗體263K 3F4(美國專利號4,806,627)檢測倉鼠和人類的PrP-Sc，并已經(jīng)在人類TSE的診斷測定和發(fā)病機理研究方面得到廣泛應用。主要的缺點是它不能與來自綿羊和牛的PrP反應(R.J.Kascsak等人，Immunological lnvestigations 26259-268(1997))。與反芻動物PrP-Sc反應的兔抗血清所具有的缺點是由于數(shù)量和特異性的限制，它不能標準化以廣泛應用。因為單克隆抗體在數(shù)量上不受限制，而且其特異性可以準確地限定在單一表位的水平上，所以單克隆抗體優(yōu)于兔抗血清。然而，這種特異性對于含有多態(tài)PrP基因的物種可能是缺點。導致表位中一個氨基酸置換的單個堿基變化可以消除抗體結合。人類PrP基因至少含有18種導致遺傳性朊病毒疾病的致病突變(J.Collinge等人，Philos.Trans.Royal Soc.Lond.[Biol.]343371-378(1994))，而且含有許多非致病突變，其中的一種(密碼子129)與醫(yī)源性CJD、散發(fā)性CJD和變異性CJD的素因有關(J.Collinge等人，Lancet 3371441-1442(1991)；M.S.Palmer等人，Nature352340-342(1991)；M.Zeidler等人，Lancet 350668(1997))。M.Horiuchi等人(Journal of General Virology 762583-2587(1995))描述了一組合成肽，所述合成肽產(chǎn)生在所選擇的綿羊組織和牛組織的免疫印跡中與PrP-細胞(非疾病相關蛋白)反應的單克隆抗體和多克隆抗體。他們沒有報道對于檢測疾病相關的同種型PrP-Sc的有效性。另外，他們沒有報道對于檢測福爾馬林固定的組織中PrP-C或PrP-Sc的有效性。
用組織學測定和免疫組織化學測定對腦組織進行朊病毒疾病的死后診斷。懷疑患有CJD的人的死前測試是通過腦活檢組織的免疫組織化學和組織檢查進行的。另外，患有與暴露于BSE有關的變異性CJD的個體在淋巴組織中PrP-Sc積聚(A.F.Hill等人，Lancet 34999(1997))。淋巴組織中PrP-Sc的存在將變異性CJD與散發(fā)性疾病或家族性疾病區(qū)分。因為在反芻動物中腦活組織檢查是不可行的，另一種基于W.J.Hadlow等人的觀察(The Journal of Infectious Diseases 146657-664(1982))的方法一直是活組織檢查所選擇的淋巴結。Hadlow等人證明，在某些淋巴結(咽后淋巴結、扁桃體、腸系膜淋巴結、肩胛骨前淋巴結、支氣管-縱隔淋巴結和脾淋巴結)和感染搔癢病的綿羊的腸淋巴組織中可檢測到感染性。在發(fā)現(xiàn)朊病毒蛋白之前進行的Hadlow研究，通過小鼠接種檢測到感染性。Race等人(American Journal of VeterinaryReserch 53883-889(1992))，Ikegami等人(Veterinary Recard 128271-275(1991))和van Keulen等人(Journal of Clinical Microbiology341228-1231(1996))采用多克隆抗血清通過對選定淋巴結的蛋白質免疫印跡或免疫組織測定，進行了相似的研究。活組織檢查具有變異性CJD臨床體征的人的扁桃體組織是侵入性比腦活組織檢查小的方法，淋巴組織的免疫測定可以用于診斷變異性CJD并將它與家族性、醫(yī)源性和散發(fā)性的CJD區(qū)分開。然而，在反芻動物牲畜中，扁桃體或淋巴組織取樣的主要缺點包括這些內(nèi)部組織的取樣需要昂貴的侵入性方法，包括具有其伴發(fā)的危險和恢復期的全身麻醉；綿羊淋巴組織經(jīng)常受細菌-假結核棒桿菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)感染，該菌破壞該淋巴結的結構而限制它在這些測定中的應用；和扁桃體組織捕獲環(huán)境抗原，包括真菌抗原，其中一些抗原與PrP-Sc有交叉反應，因而給出不明確或錯誤的陽性免疫組織化學反應，而這些必須通過在技術上苛求的蛋白質印跡測定來解決。最近，O’Rourke等人(TheVeterinary Record，1998年5月2日，第489-491頁)描述了采用瞬膜(第三眼瞼)淋巴組織中臨床前檢測綿羊PrP-Sc的非侵入性診斷測定。
當前美國聯(lián)邦準則要求毀滅感染搔癢病的綿羊，一些州要求毀滅在隨后診斷患有搔癢病的母羊分娩小羔羊后60天內(nèi)出生的羊群中的所有綿羊。這樣的根除方法對該產(chǎn)業(yè)來說很昂貴的。另外，美國綿羊大、多肉而且長得快。許多國家為了遺傳學的目的渴望購買美國綿羊，但是因為存在搔癢病而被阻止這樣做。
在英國和歐共體流行的BSE已經(jīng)致使生產(chǎn)者和消費者由于直接的牲畜損失和間接的牛肉和牛肉副產(chǎn)品包括經(jīng)濟上很重要的藥品的市場損失而蒙受了巨大損失。世界上綿羊和牛肉生產(chǎn)國進行昂貴監(jiān)督和檢疫計劃，以維持它們不發(fā)生BSE的狀況。最重要的是來自幾個科學調(diào)查機構的數(shù)據(jù)已經(jīng)提供了強有力的證據(jù)，證實在英國BES已經(jīng)感染了人類。這種新的疾病的范圍仍需檢測。
所需要的是適合于檢測來自人類、食用家畜、寵物和動物園的非馴養(yǎng)動物的組織中PrP-Sc的實用免疫測定試劑系統(tǒng)。這種測定試劑必須適合于檢測每個物種中PrP基因型不同的個體的PrP-Sc；而且在各種各樣的標準實驗方法中使用時靈敏且具特異性。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及檢測作為傳染性海綿狀腦病指示的朊病毒蛋白或PrP-Sc蛋白的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明包括特異結合朊病毒蛋白上鑒定為Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser的保守表位的單克隆抗體，和采用所述抗體的免疫測定方法，包括免疫組織化學測定和蛋白質印跡法。所述抗體可用于檢測經(jīng)固定或未經(jīng)固定的組織中作為存在TSE感染指示的PrP-Sc。
在第二實施方案中，本發(fā)明包括上述的單克隆抗體與第二單克隆抗體組合的單克隆抗體混合物，所述第二單克隆抗體與朊病毒蛋白上指明為Ile-His-Phe-Gly的第二保守表位特異結合。后一抗體在順序號08/950,271中描述。令人驚奇的是，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，盡管PrP蛋白有種間和種內(nèi)變異，但針對PrP蛋白不重疊的、分離的表位的抗體組合(這里表示為單克隆抗體混合物)仍提供了針對PrP蛋白的高靈敏度、確定的特異性和廣譜反應性的最佳組合。這種混合物中的一種或兩種單克隆抗體可以識別在已經(jīng)報道了自然TSE的所有哺乳動物物種和許多緊密相關的物種中發(fā)現(xiàn)的表位。
本發(fā)明還包括采用第一個實施方案的所述抗體和所述抗體混合物的免疫測定方法，包括免疫組織化學測定、蛋白質印跡和斑點印跡。
第一個實施方案的所述抗體和本發(fā)明的所述抗體混合物可以用于采用第三眼瞼淋巴組織檢測PrP-Sc的非侵入性診斷測定，如順序號08/950,271所描述的那樣。反芻動物的瞬膜或第三眼瞼(瞬膜)由具有淺淋巴濾泡的軟骨片和球表面結膜之下的漿粘液分泌腺組成。包括綿羊、山羊、黑尾鹿、馬鹿和牛在內(nèi)的反芻動物具有第三眼瞼。瞬膜相關的淋巴組織樣品可以通過外翻第三眼瞼而容易收集。一般在更為蒼白的腺組織上可見兩叢淋巴組織。可以只采用局部麻醉進行淋巴結活組織檢查。然后，將收集的組織樣品經(jīng)受能夠檢測朊病毒或PrP-Sc(如果在組織中存在的話)的免疫組織化學方法或其它蛋白檢測方法。因此，第三眼瞼代表了易于從活的動物獲得或在屠宰時從動物中取樣獲得的用于測試組織的樣本。這種檢測方法提供了非常需要的早期檢測PrP-Sc的實用方法，并且提供臨床前診斷TSE的方法。
按照這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一個目的是提供識別朊病毒蛋白保守表位的單克隆抗體和一種泛特異性(pan-specific)抗體混合物，所述泛特異性抗體混合物包含針對自然發(fā)生TSE的物種(人類、牛、綿羊、山羊、鹿、馬鹿、貂、家貓和非家貓、幾種非家畜反芻動物和動物園中的許多非人類靈長類動物)和潛在暴露于TSE感染的其它密切相關物種中的朊病毒蛋白上不重疊、分離的表位的單克隆抗體。所述抗體檢測經(jīng)固定、處理的組織中作為存在TSE感染指示的PrP-Sc，提供了診斷TSE的靈敏的試劑混合物。這些針對PrP-Sc上保守表位的單克隆抗體試劑提供了特異性的、可靠而靈活的準確診斷TSE的工具。所述抗體的應用包括作為用于標準化診斷測試的試劑和用于比較病理學研究的試劑。
本發(fā)明的再一個目的是提供檢測作為TSE標志的朊病毒或PrP-Sc的方法，包括受感染活動物的臨床前檢測和死后檢測方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供基于第三眼瞼淋巴組織活組織檢查和PrP-Sc原位檢測的作為早期檢測PrP-Sc的實用方法的非侵入性診斷測定。
又一個目的包括可用于反芻動物和人類TSE診斷研究和發(fā)病機理研究以及可用于檢測、監(jiān)督和控制TSE的免疫測定方法。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將在接著的描述中變得顯而易見。
發(fā)明詳述在第一實施方案中，本發(fā)明包括特異結合朊病毒蛋白上鑒定為Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser的保守羧基表位的單克隆抗體。所述單克隆抗體與已經(jīng)過處理以暴露PrP-Sc表位而且消除相應PrP-C表位的可及性的經(jīng)固定或冷凍組織中PrP蛋白上的表位結合。為了本發(fā)明的目的，詞語朊病毒或PrP-Sc定義為作為TSE標志的疾病相關蛋白。因為所述抗體可檢測經(jīng)固定、處理的組織中或用蛋白酶K預處理以降解PrP-C的冷凍組織中作為存在TSE感染指示的PrP-Sc，所以它們提供了診斷TSE的靈敏試劑。
如以下實施例2中描述的方法獲取本發(fā)明的抗體。簡單地說，合成代表羊殘基217-233(牛殘基225-241)Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala的肽，將其與馬來酰亞胺活化的KLH偶聯(lián)以用作免疫原。篩選與重組綿羊PrP具有反應性的來自接種小鼠的抗血清和單克隆抗體，以選擇交叉反應性抗體。隨后表明這些抗體具有與綿羊、黑尾鹿和馬鹿、牛的福爾馬林固定的、水合高壓滅菌的組織中PrP-Sc的反應性。
為了本發(fā)明的目的，本發(fā)明所包括的特異結合PrP-Sc所述保守表位的單克隆抗體，是對于PrP基因產(chǎn)物的所述表位(包括肽Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser)具特異性的那些抗體，并可檢測冷凍的、未經(jīng)處理組織中的PrP-C和經(jīng)固定的或冷凍的、處理組織中的PrP-Sc。在經(jīng)固定或未經(jīng)固定的、處理組織中結合這種保守表位的單克隆抗體的例子是單克隆抗體F99/97.6.1。所述抗體的同種型是IgG1。
本發(fā)明也包括采用所述抗體的免疫測定方法，包括免疫組織化學測定和蛋白質印跡。所述抗體可用于檢測經(jīng)固定或未經(jīng)固定的組織中作為存在TSE感染指示的PrP-Sc。
在第二個實施方案中，本發(fā)明包括上述的單克隆抗體與特異結合綿羊、黑尾鹿、馬鹿和牛中指明為Ile-His-Phe-Gly的PrP基因產(chǎn)物的第二保守表位的第二單克隆抗體組合的單克隆抗體混合物。這些單克隆抗體在順序號08/950,271中詳述，其內(nèi)容通過引用全部結合到本文中。這種表位還被鑒定為包含所述羊(綿羊)PrP基因產(chǎn)物的氨基酸142-145，所述氨基酸與鹿(黑尾鹿和落磯山鹿)PrP基因產(chǎn)物的氨基酸142-145和牛PrP基因產(chǎn)物的氨基酸150-153相同。所述抗體還有這樣的特性，即它們檢測固定的或冷凍的組織中PrP-Sc蛋白的暴露的表位，因此它們可用作在自然發(fā)生TSE的綿羊、山羊、牛、黑尾鹿和馬鹿中診斷TSE的試劑。PrP-Sc的存在指示受搔癢病、牛腦病或慢性消耗性疾病感染的動物。
與經(jīng)固定的或冷凍的、處理的反芻動物組織中PrP-Sc保守表位Ile-His-Phe-Gly結合的所述單克隆抗體的例子是單克隆抗體F89/160.1.5。這種抗體的同種型是IgG1。單克隆抗體F89/160.1.5的免疫組織化學染色模式與搔癢病侵襲的綿羊的腦中采用針對綿羊或倉鼠PrP的多克隆兔抗血清描述的模式相似。特異結合單克隆抗體F89/160.1.5所針對的表位的另一種單克隆抗體的例子是單克隆抗體F89/193.1.5。
已經(jīng)報道了山羊中單克隆抗體F89/160.1.5和F89/193.1.5的所述表位中一個氨基酸殘基的遺傳變異(密碼子142中Ile變?yōu)镸et)(W.Goldmann等人，Journal of General Virology 772885-2891(1996))和所述表位側翼的綿羊基因密碼子141中的一個突變(Phe變?yōu)長eu)(A.Bossers等人，Journal of General Virology 772669-2673(1996))。盡管這些變異只在這些物種的小亞群中發(fā)生，但是存在所述變異或尚未鑒定的其它變異可能阻止這些單克隆抗體與朊病毒蛋白結合的可能性，因此用于檢測、監(jiān)視和控制TSE包括遺傳變異體的靈敏的免疫組織化學方法和臨床前檢測方法是重要的。
令人驚奇的是，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，盡管PrP蛋白有種間和種內(nèi)變異，但針對這兩種不重疊的、分離的表位的抗體組合(這里表示為單克隆抗體混合物)提供了針對PrP蛋白的高靈敏度、確定的特異性和廣譜反應性的最佳組合。本發(fā)明的所述單克隆抗體混合物似乎檢測自然發(fā)生TSE的所有物種和所有已知的變異。所述抗體檢測未經(jīng)固定或經(jīng)固定、處理的組織中作為TSE存在指示的PrP-Sc，并提供用于診斷TSE的靈敏的試劑混合物。對存儲在GenBank中的PrP序列(表1)的檢查表明，所述抗體混合物將檢測綿羊、牛、人類、鹿、馬鹿、貂、家貓和56種非家畜反芻動物和非人類靈長動物的PrP基因產(chǎn)物上的表位。所述抗體結合福爾馬林固定的組織中不重疊的表位，而將任一種抗體濃度加倍的靈敏度比所述抗體以相同的濃度組合的靈敏度小。針對每種表位的抗體和所述抗體混合物可檢測經(jīng)固定或冷凍、處理組織中作為存在TSE感染指示的PrP-Sc，提供用于診斷TSE的靈敏試劑?？捎糜跍y試PrP-Sc的組織樣品包括第三眼瞼相關的淋巴組織、腦尸體剖檢組織、淋巴結活組織檢查組織或尸體剖檢組織、或脾活組織檢查組織或尸體剖檢組織。所述單克隆抗體形成抗原-抗體復合體，而通過免疫學方法如酶聯(lián)免疫吸附測定、蛋白質印跡測定、斑點印跡測定、免疫裝飾(immunodecoration)和免疫細胞化學來檢測結合的抗體。
保藏聲明。根據(jù)布達佩斯條約，產(chǎn)生和分泌單克隆抗體F99/97.6.1的連續(xù)細胞系(雜交瘤)于1999年4月6日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209 USA，并且已經(jīng)指定保藏號為ATCC HB-12696。根據(jù)布達佩斯條約，產(chǎn)生和分泌單克隆抗體F89/160.1.5的連續(xù)細胞系(雜交瘤)于1997年9月24日保藏于ATCC，并且已經(jīng)指定保藏號為ATCC HB-12403。根據(jù)布達佩斯條約，產(chǎn)生和分泌單克隆抗體F89/193.1.5的連續(xù)細胞系(雜交瘤)于1999年5月25日保藏于ATCC，并且已經(jīng)指定保藏號為PTA-114。表1PrP基因產(chǎn)物包含表位Ile-His-Phe-Gly和/或Gln-Tyr-Gln-Arg-Gln-Ser的物種旋角羚(Addax nasomaculatus)大猩猩(Gorilla gorilla)非洲矮小山羊叉角羚(Antilocapra americana) 貂羚(Hippotragus niger)夜猴(Aotus trivirgatus)Homo sapiens(人)，所有報道的變異體黑掌蛛猴(Ateles geoffroyi) 白掌長臂猿(Hylobates lar)紅臉蛛猴(Ateles paniscus)x褐頭蛛猴 馬來亞長臂猿(Hylobates syndactylus)(ateles fusciceps)歐洲野牛(Bison bonasus)短尾猴(Macaca arctoides)爪哇野牛(Bos javanicus)食蟹猴(Macaca fascicularis)原始牛(Bos primigenius)日本猴(Macaca fuscata)原牛(Bos Taurus)(牛) 獼猴(Macaca mulatta)羚羊(Budorcas taxicolor) 豚尾猴(Macaca nemestrina)暗黑伶猴(Callicebus moloch)叟猴(Macaca sylvanus)狨(Callithrix jacchus) Mandrillus sphinx單峰駝(Camelus dromedarius)長爪沙鼠(Meriones unguiculatus)家犬(Canis familiaris) 小家鼠(Mus musculus)家山羊(Capra hircus)(山羊)，兩種報道 Mustela spp(貂)的變異體努比亞北山羊(Capra ibex nubiana) 林鼬(Mustela putorius)卷尾猴(Cebus apella) Odocoileus hemionus hemionus(黑尾鹿)Cercocebus aterrimus Odocoileus virginianus(弗吉尼亞鹿)白領白眉猴(Cercocebus torquatus atys) 穴兔(Oryctolagus cuniculus)黛安娜長尾猴(Cercopithecus diana) 麝牛(Ovibos moschatus)加納長尾猴(Cercopithecus mona) 土耳其盤羊(Ovis aries)(家綿羊)，所有報道的德氏長尾猴(Cercopithecus neglectus)黑猩猩(Pan troglodytes)Cercopithecus patas埃及狒狒(Papio Hamadryas)Cervus elaphus spp(馬鹿) 猩猩(Pongo pygmaeus)梅花鹿(Cervus Nippon dybowskii)黑葉猴(Presbytis francoisi)Chlorocebus aethiops 松鼠猴(Saimiri sciureus)東黑白疣猴(Colobus guereza)茶腹棉鼠(Sigmodon fulviventer)野馬(Equus caballus) Sigmodon hispiedisEquus przewalskii 野豬(Sus serofa)Felis catus獅尾狒(Theropithecus gelada)鵝喉羚(Gazella subgutturosa) 扭角林羚(Tragelaphus strepsiceros)長頸鹿(Giraffa camelopardalis) 帚尾袋貂(Trichosurus vulpecula)采用所述抗體的免疫測定方法也包括于本發(fā)明中。簡單地說，為了檢測PrP-Sc，從被試者獲取組織樣品；固定所述組織，例如，通過本領域熟知的在福爾馬林或多聚甲醛中保存。接著，處理所固定的組織切片，以暴露PrP-Sc的表位并消除在正常動物的組織中表達的PrP-細胞相應表位的可及性。這可以通過以下步驟方便地進行(a)水合高壓滅菌，例如通過將在水或緩沖液中水合的切片于121℃，20-30分鐘進行高壓滅菌，然后冷卻；(b)用95-99％的甲酸處理5-30分鐘，之后進行或不進行水合高壓滅菌，或(c)用胰蛋白酶消化(例如在tris HCL緩沖液pH 7.6中0.1％的胰蛋白酶，37℃處理20分鐘)。使經(jīng)固定、處理的組織與一定量本發(fā)明的所述單克隆抗體或單克隆抗體混合物在有效結合PrP-Sc蛋白(如果組織中存在PrP-Sc)的條件下接觸。如實施例中所指出的，組織樣品與約3-5μg/ml的任一種所述單克隆抗體或與每種單克隆抗體約3-5μg/ml的混合物在合適的緩沖液中溫育30分鐘，使所述抗體結合于所述保守的PrP-Sc表位上。通過本領域熟知的方法檢測所結合的抗體。在一個方面，如下檢測結合于組織上的所述單克隆抗體通過將它與可檢測標記的(酶、放射性或熒光檢測分子或生物素分子)抗小鼠免疫球蛋白(例如IgG1)試劑在使得標記的抗小鼠免疫球蛋白試劑與所述單克隆抗體結合的條件下接觸，并且隨后可以通過酶標記、放射性標記或熒光標記的活性或通過將生物素標記與用酶分子、放射性分子或熒光分子標記的抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素分子的結合，來檢測結合于組織上的所述單克隆抗體。在優(yōu)選的實施方案中，通過抗小鼠免疫球蛋白試劑如生物素化抗小鼠IgG和辣根過氧化酶標記的鏈霉抗生物素試劑的順序溫育，以及在緩沖液如Tris-HCL-Tween20中間插洗滌，而進行檢測。加入指示劑色原體如AEC以檢測結合的抗體。
或者，在去垢劑中將冷凍的組織勻漿，用蛋白酶K處理以消除35KPrP-C條帶并顯露蛋白酶K抗性PrP-Sc片段的特征性多個28-32K條帶。在聚丙烯酰胺凝膠上分離所處理的蛋白并將其轉移到濾膜上。讓濾膜與一定量的本發(fā)明單克隆抗體或本發(fā)明的所述單克隆抗體混合物在有效結合PrP-Sc蛋白(如果組織中存在PrP-Sc)的條件下接觸。如上所述檢測所述抗體或抗體混合物，只是優(yōu)選的最后檢測步驟包含化學發(fā)光底物。
如上所討論的，本發(fā)明的抗體可用于TSE的診斷和發(fā)病機理研究。
實施例下面的實施例只想進一步說明本發(fā)明，而不是想限制權利要求中確定的本發(fā)明的范圍。
實施例1以下的實施例描述采用本發(fā)明的所述混合物對羊淋巴組織進行的PrP-Sc檢測測定。
所測試的動物。通過瞬膜淋巴組織的活組織檢查，從來自無已知暴露于搔癢病感染的母羊的羊群的27頭薩?？搜蚧蛴H緣黑臉品種取樣。從來自暴露于搔癢病的羊群的47頭綿羊中尸體剖檢取樣；至少收集腦、咽后淋巴結和扁桃體。通過免疫組織化學檢測，所有組織均為PrP-Sc陰性，并且沒有一個表現(xiàn)出搔癢病特征性的病變。對45頭綿羊在其活著時取樣，然后在尸體剖檢時再次取樣，或只在觀察到搔癢病的臨床體征后安樂死的時候取樣。至少收集腦和瞬膜淋巴組織。來自全部45頭綿羊的腦樣品為腦中PrP-Sc積聚陽性，并診斷為患有如National Veterinary Services Laboratoties，Ames IA所定義的搔癢病。
簡單地說，采用常規(guī)組織病理學方法制備來自瞬膜和/或咽后淋巴結的淋巴組織，只是在包埋之前用甲酸(99％1小時)凈化大部分組織。將三個顯微切片固定在玻片上。將所述切片編碼，并提交給三個實驗室進行免疫染色。為所有實驗室提供終濃度為每種抗體0.5mg/ml的單克隆抗體F89/160.1.5和F99/97.6.1的混合物。樣品也在Department ofAgriculture、Agricultural Research Servies、Animal Disease Research Unit(USDA、ARS、ADRU)重測試。采用Ventana Medical Systems，Inc.的自動免疫染色儀和廠家推薦用于辣根過氧化酶/AEC檢測(ADRU)或堿性磷酸酶/固紅檢測(實驗室1)的試劑，測定ADRU和實驗室1的樣品。實驗室2用DAKO試劑包采用DAKO自動免疫染色儀對切片進行染色，實驗室3用先前描述的試劑(J.M.Miller等人，Journal ofVeterinary Diagnosis Investigation 6366-368(1994))采用自動毛細管間隙免疫染色儀(capillary gap immunostainer)染色。結果在ADRU制成表格。
在無已知暴露于搔癢病的27頭綿羊中，26個樣品被所有實驗室記錄為陰性；一個樣品被一個實驗室(實驗室3)記錄為陽性。在暴露搔癢病、但在ADRU采用免疫染色測定在腦或淋巴結中沒有顯示PrP-Sc跡象的47頭綿羊中，42個樣品被所有三個實驗室記錄為陰性。5個樣品被實驗室3記錄為陽性。在患有搔癢病、診斷為腦PrP-Sc免疫染色陽性的45頭綿羊中，44個樣品在ADRU重測試時為陽性，43個樣品在實驗室2和3為陽性。
總的來說，這項研究說明，單克隆抗體F89/160.1.5和單克隆抗體F99/97.6.1的混合物在多種常規(guī)實驗條件下可檢測綿羊的淋巴組織中的PrP-Sc。第三眼瞼淋巴組織免疫組織化學測定是靈敏(93％)且特異性(100％)的羊瘙病診斷測試。大約在潛伏期的1/3時可以鑒別受感染的綿羊。所述測定也可用于遺傳易感性、傳播途徑和發(fā)病機理的研究。單克隆抗體F89/160.1.5和F99/97.6.1的廣譜物種反應性使這種試劑混合物適宜用于來自自然發(fā)生TSE的所有物種的神經(jīng)組織和周圍神經(jīng)組織的免疫組織化學和免疫印跡測定，并且適宜用于監(jiān)視在野外環(huán)境下和動物園中暴露于TSE的相關物種。
實施例2下面的實施例描述特異結合反芻動物和其它動物以及人類中PrP-Sc的保守表位的單克隆抗體的制備及其表征。
簡單地說，用代表羊PrP基因產(chǎn)物的氨基酸217-233(牛PrP基因產(chǎn)物的氨基酸225-241)的KLH綴合合成肽免疫5只小鼠。如順序號08/950,271所描述，采用重組綿羊PrP融合蛋白為抗原，通過ELISA篩選抗血清和雜交瘤上清液。細胞系99/97產(chǎn)生ELISA反應性抗體，并被選擇用于通過有限稀釋進行兩輪克隆。將來自兩度克隆的系(F99/97.6.1)的雜交瘤細胞轉移到體外人工毛細管細胞培養(yǎng)生產(chǎn)系統(tǒng)。含濃度為2-4mg/ml的單克隆抗體F99/97.6.1(IgG1)的組織培養(yǎng)上清液通過表位作圖、免疫印跡分析和免疫組織化學進一步鑒定。
抗原制備和單克隆抗體生產(chǎn)。合成代表牛朊病毒基因(Horiuchi等人)的殘基225-241的肽NH2-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala-COOH，并將其與馬來酰亞胺活化的匙孔血藍蛋白(KLH)(Pierce Chemical Company)偶聯(lián)。采用在200μl弗氏完全佐劑中乳化的總共10μg的綴合肽在兩處皮下接種5只6周齡BALB/c小鼠。以14天的間隔，給予兩次在200μl弗氏不完全佐劑中乳化的10μg的綴合肽加強接種。采用重組羊PrP-C為抗原，通過ELISA測定經(jīng)尾靜脈靜脈穿刺收集的血清(見下述)。在細胞融合前三天，采用不含佐劑的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的10μg綴合肽靜脈內(nèi)免疫小鼠。按照標準方案通過有限稀釋進行細胞融合和克隆(W.M.Yokoyama，載于J.E.Coligan(編輯)，Current Protocols in Immunology，Wiley intersciences，紐約，第2.2.1-2.5.17頁(1994))。通過重組羊PrP-C ELISA，篩選原代雜交瘤和克隆雜交瘤的上清液。選擇來自細胞系F99/97的克隆6.1，并將其轉移到人工毛細管細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(CellMax，CellCoLnc.)中，用于體外生產(chǎn)單克隆抗體上清液。每天收集并且合并上清液。通過ELISA鑒別重鏈同種型，并通過免疫擴散測定單克隆抗體濃度。
在大腸桿菌中生產(chǎn)重組綿羊PrP-C。從薩?？搜虻耐庵苎獑魏思毎蟹蛛x基因組DNA。用經(jīng)修飾以加入EcoRI限制位點的側翼引物擴增PrP可讀框(D.Westaway等人，Genes Devel.8959-969(1994))正向引物5’-ATCGAATTCAAGAAGCGACCAAAAC-3’
反向引物5’-ATCGAATTCAGACACCACCACT-3’。用EcoRI消化700bp PCR產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠上純化，并連接到pMal-cRI載體中。按照常規(guī)技術轉化大腸桿菌菌株。通過采用克隆引物對菌落小量制備物進行PCR，篩選轉化子。選擇一種陽性克隆(shPrP-pMal-1)用于大規(guī)模融合蛋白表達。通過在直鏈淀粉樹脂柱上親和層析從細菌溶菌液中分離融合產(chǎn)物ShPrP-MBP，并用10mM麥芽糖洗脫。采用針對PrP肽NH2-Gly-Gln-Gly-Gly-Gly-Thr-His-Asn-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-Ser-Lys-COOH(R2843)(K.I.O’Rourke等人，J Gen.virol.751511-1514(1994))的兔抗血清，通過蛋白質免疫印跡篩選流分。
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。用在50μl 0.05M碳酸鹽緩沖液pH9.6中的6.25μg/孔的重組ShPrP-MBP融化蛋白包被Immulon 2平板，在4℃過夜。用1∶15稀釋的市售的基于牛奶的封閉劑(KPL，Gaithersburg，MD)封閉所述平板1小時。在室溫下，將50μl抗血清或雜交瘤上清液在每個孔板中溫育30分鐘。平板用山羊抗小鼠辣根過氧化酶和2，2’-連氮-雙-[3-乙基-苯并噻唑啉磺酸]顯色(R.Fatzer等人，Zentralbl.Veterinarmed.A.4323-29(1996))(ABTS)(KPL，Gaithersburg，MD)。在405nm讀取光密度。陰性對照包括未接種小鼠的血清，不相關特異性的同種型匹配的單克隆抗體的上清液或調(diào)節(jié)為15％胎牛血清的組織培養(yǎng)基。陽性對照孔與兔抗PrP肽抗血清(R2843)一起溫育，并用山羊抗兔-HRPO和ABTS顯色。陽性孔的OD405高于4個陰性對照孔的平均值之上的兩個標準偏差。
單克隆抗體F99/97.6.1所結合表位的確定。采用本領域熟知的常規(guī)技術(Sigma-Genosys)，在膜支持體上合成跨越Val-Glu-Gln-Met-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala-Ser-Val-Ile-Leu-Phe的一組重疊的肽，每種肽含有6個氨基酸。在與抗小鼠-IgG-辣根過氧化酶和化學發(fā)光底物一起溫育并將濾膜對KodakX-omat膠片曝光之后，目測單克隆抗體F99/197.6.1結合各種肽的能力。
自然發(fā)生TSE的食草反芻動物的來源以及PrP基因序列。通過免疫組織化學，測試來自34頭具有搔癢病組織病理學損害的綿羊的腦組織與單克隆抗體F99/97.6.1的反應性。已經(jīng)采用兔抗倉鼠PrP多克隆抗血清在這些樣品的20個樣品中經(jīng)免疫組織化學檢測到PrP-Sc，而通過免疫印跡在這20個樣品的6個樣品中檢測到PrP-Sc(J.M.Miller，Diagn Invent.5309-316(1993))。將無搔癢病組織損害且在蛋白質印跡分析中沒有檢測到PrP-Sc的三頭綿羊用作陰性對照。這些組織由獸醫(yī)藥學院(veterinary medical colleges)和國家診斷實驗室(state diagnosticlaboratories)的病理學者或由USDA Animal and Plant Health InspectionService的人員提供。自然發(fā)生CWD的10頭黑尾鹿(Odocoileus hemioushemionus)和4頭馬鹿(Cervus elaphus nelsoni)的腦樣品由科羅拉多州診斷實驗室(Colorado State Diagnostic Laboratory)和科羅拉多州野生動物局(Colorado Division of Wildlife)提供。來自10頭患有BSE的牛和5頭BSE陰性牛的未經(jīng)染色的切片由the Pathobiology Laboratory，NationalVeterinary Services Laboratories，USDA-APHIS，Ames，IA提供。這些切片的石蠟封閉物來源是英國的Gerald Wells博士，農(nóng)業(yè)、漁業(yè)和食品部中心獸醫(yī)實驗室(Ministry of Agiculture，F(xiàn)ishers and Food，CentralVeterinary Laboratory)，New Haw、Surrey，United Kingdom。
用于PrP基因型分析的冷凍腦組織可從34頭搔癢病陽性綿羊中的12頭、全部10頭患有CWD的黑尾鹿和42頭CED侵襲的馬鹿中獲得。血樣也可從150頭健康的黑尾鹿和244頭健康的馬鹿中獲得。通過上述的聚合酶鏈反應，擴增所述綿羊的PrP基因可讀框，并通過自動熒光染色標記的雙脫氧鏈終止法，在兩條鏈上對密碼子112-240的多態(tài)區(qū)測序(K.I.O’Rourke等人，Anim.Biotech.715-162(1996))。采用種特異性引物正向5’CTGCAAGAAGCGACCAAAACC反向5’CACAGGAGGGGAGGAGAAGAGGAT在標準條件下(只是將Mg+2的濃度提高到2.5mM)對100-800ng黑尾鹿或馬鹿的基因組DNA進行擴增。采用通常產(chǎn)生密碼子106-224信息的正向引物5’GGCTATCCACCTCAGGGAG反向引物5’TCACACTTGCCCCCTCTTTGGT在兩條鏈上對PCR產(chǎn)物測序。
免疫印跡分析。如Race等人所描述的(參見上文)，通過從Sarkosyl緩沖液差速離心，從具有搔癢病臨床體征的綿羊的腦中分離PrP-Sc。通常，采用超聲處理將0.3g腦在50mM Tris-HCl、5mM MgCl2，pH7.4中勻漿。將勻漿調(diào)至80μg/ml的核糖核酸酶和20μg/ml的脫氧核糖核酸酶，并在37℃溫育1小時。加入等體積的20％(w/v)的Sarkosyl，并在室溫下溫育1.5小時。在20℃下經(jīng)過2,000xg離心30分鐘后，取出上清液并在20℃下200,000xg離心2.5小時。沉淀的材料在300μl50mM的Tris-HCl，pH7.4中通過超聲處理重懸浮。在37℃下將懸浮液調(diào)至10μg/ml的蛋白酶K達1小時，以水解PrP-C。加入Pefaloc(Boerhinger Mannheim)終止酶活性后，在20℃下將所述懸浮液于200,000xg離心1小時。所述沉淀在300μlSDS樣品緩沖液中煮沸用于免疫印跡分析。在15％的聚丙烯酰胺凝膠上分離不同的量并將其轉移到PVDF膜(Millipore)上。所述膜用3μg/ml的F99/97.6.1、同種型的對照單克隆抗體或用100倍摩爾濃度的過量的肽Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala預吸附以特異性消除單克隆抗體反應性的3μg/ml的F99/97.6.1顯色。用辣根過氧化酶綴合山羊抗小鼠IgG1(Caltag Laboratores)檢測結合的抗體，并用化學發(fā)光底物(ECL，Amersham)顯現(xiàn)結合的抗體。將濾膜對膠片(AmershamHyperfilm)曝光20-120分鐘。
免疫組織化學。通過浸入和包埋于石蠟中，將腦于10％的緩沖福爾馬林中固定。用蘇木精和曙紅對每個組織塊的一個切片染色，用于常規(guī)組織病理學分析。將另外的組織切片固定在硅烷處理的玻片上，用于免疫組織化學分析。將切片脫蠟并水合。將切片在99％的甲酸中溫育5分鐘，然后沖洗，用0.1M Tris-HCl，pH7.6中和。在高壓滅菌器或高壓鍋于改良的檸檬酸鹽緩沖液pH6.1(DAKO TR緩沖液)中在121℃熱處理切片20分鐘。將玻片順序在以下物質中溫育過氧化氫緩沖液，以封閉內(nèi)源辣根過氧化酶；單克隆抗體混合物F89/160.1.5和F99/97.6.1，在Tris-casein稀釋液中每種3μg/ml(37℃，32分鐘)；生物素化山羊抗小鼠IgG(37℃，8分鐘)；鏈霉抗生物素-辣根過氧化酶(37℃，8分鐘)；AEC/過氧化氫(37℃，8分鐘)；然后用蘇木精復染。將組織固定在水性固定介質中以加上蓋玻片。陰性對照包括(1)用相似濃度的相同同種型(IgG1)的不相關單克隆抗體代替所述單克隆抗體混合物，和(2)如組織病理學和蛋白質印跡分析中所指出的，將所述單克隆抗體與無搔癢病的綿羊的腦和淋病組織一起溫育。
黑尾鹿和馬鹿PrP基因序列。鑒定出所述黑尾鹿PrP序列的三個等位基因。等位基因138S2(GenBank登記號AF009180)和138N1(登記號U97331)在密碼子138編碼Ser和Asn。等位基因S1(登記號AF009181)與等位基因S2的不同之處是一個沉默突變。發(fā)現(xiàn)馬鹿PrP基因的兩個等位基因(GenBank AF016227、AF016228)，它們在密碼子132編碼M→N的取代。結果表位作圖和序列測定。采用一組重疊肽，將單克隆抗體F99/97.6.1所識別的表位作圖。發(fā)現(xiàn)殘基220-225(Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser)足以滿足抗體結合。這種序列在牛、黑尾鹿、馬鹿、山羊、人類和綿羊以及在具有患TSE風險的32種物種中的等位基因的推斷的氨基酸序列是保守的。在F89/160.1.5的結合部位具有多態(tài)性的變異的土耳其盤羊(山羊)等位基因(GenBank X91999)和緊接F89/160.1.5的表位之前具有多態(tài)性的變異的土耳其盤羊(綿羊)等位基因上發(fā)現(xiàn)所述表位(在A.Bossers等人，Archives of Virology 144829-834(1999)中有引述)。
與來自TSE-侵襲的綿羊的PrP-Sc的免疫印跡反應性。通過蛋白質印跡分析來自患有自然搔癢病的綿羊以及正常綿羊的PrP-Sc制備物，評價單克隆抗體F99/97.6.1的特異性。在搔癢病侵襲的綿羊腦的提取物中檢測到表觀分子量在28-35K之間的肽條帶。在正常綿羊腦的提取物中或當使用同種型匹配的對照單克隆抗體時或當F99/97.61被包含其結合表位的所述肽吸附時，不能檢測到條帶。
來自正常反芻動物和TSE侵襲的反芻動物的組織的免疫組織化學。通過免疫組織化學，進一步評價單克隆抗體F99/97.6.1對按常規(guī)加工用于組織病理學檢測的福爾馬林固定的石蠟包埋腦組織的反應性。所有TSE侵襲的動物在所選擇的腦干和中腦核中有神經(jīng)纖維網(wǎng)海綿形成、神經(jīng)元內(nèi)空泡和神經(jīng)膠質增生，這些是TSE的診斷性損害。至少選擇中腦(在吻丘水平)和末腦(在閂腦水平)用于免疫組織化學檢測。需要通過高壓滅菌熱處理以暴露結合單克隆抗體F99/97.6.1的PrP-Sc表位。
檢測患有自然搔癢病的綿羊、患有CWD的黑尾鹿和馬鹿以及患有BES的牛的腦中的陽性染色。反應性限制在中腦和腦干中的灰質，集中在受侵襲的核中，并且存在于神經(jīng)纖維網(wǎng)中和神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞內(nèi)。大多數(shù)免疫染色由神經(jīng)灰質神經(jīng)纖維網(wǎng)中的致密顆?；螂S機的斑組成。PrP-Sc經(jīng)常聚集在鄰近神經(jīng)膠質細胞核的地方，并在組織病理學上鑒定為小膠質細胞(沒有可識別的細胞質的小的、橢圓形至有角的含染色質多的核)的神經(jīng)膠質細胞周圍以分支模式積聚。PrP-Sc偶爾在血管周圍和室管膜下形成邊狀，暗示有星形膠質細胞足突。神經(jīng)元反應性包括在神經(jīng)元胞體中的點狀免疫染色、或在神經(jīng)元膜中或者在血管周圍的神經(jīng)膠質細胞突起中PrP-Sc給神經(jīng)元細胞明顯裝邊。有和沒有神經(jīng)元內(nèi)空泡的神經(jīng)元都具有PrP-Sc反應性。在用所述單克隆抗體F99/97.6.1免疫染色的未受侵襲的綿羊、鹿、馬鹿或牛的腦中或在用同種型對照單克隆抗體免疫染色的受搔癢病侵襲的綿羊或BSE陽性的牛的腦中，沒有檢測到反應性。
人們理解，給出前面的描述只是為了說明，可以在不偏離于本發(fā)明的精神和范圍的情況下作出多種修改和改變。
序 列 表<110>O’Rourke.Katherine I.<120>用于檢測作為傳染性海綿狀腦病指示的朊病毒蛋白的單克隆抗體和抗體混合物<130>ORourke<140>09/353,348<141>1999-07-15<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6<212>PRT<213>Ovis aries<400>1Gln Tyr Gln Arg Glu Ser15<210>2<211>4<212>PRT<213>Bos taurus<400>2Ile His Phe Gly1<210>3<211>17<212>PRT<213>Ovis aries<400>3Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly15 10 15Ala<210>4<211>25<212>DNA<213>Ovis aries<400>4atcgaattca agaagcgacc aaaac 25<210>5<211>22<212>DNA<213>Ovis aries<400>5atcgaattca gacaccacca ct22<210>6<211>15<212>PRT<213>Mesocricetus auratus<400>6Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys15 10 15<210>7<211>26<212>PRT<213>Ovis aries<400>7Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser Gln Ala Tyr15 10 15Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe20 25<210>8<211>21<212>DNA<213>Odocoileus hemionus hemionus<400>8ctgcaagaag cgaccaaaac c 21<210>9<211>24<212>DNA<213>Odocoileus hemionus hemionus<400>9cacaggaggg gaggagaaga ggat24<210>10<211>19<212>DNA<213>Odocoileus hemionus hemionus<400>10ggctatccac ctcagggag 19<210>11<211>22<212>DNA<213>Odocoileus hemionus hemionus<400>11tcacacttgc cccctctttg gt 2權利要求
1.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體特異結合朊病毒蛋白的指明為Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser的保守表位，并且能夠結合已經(jīng)過處理以暴露PrP-Sc蛋白中的所述表位并消除PrP-細胞相應表位的可及性的經(jīng)固定或未經(jīng)固定組織中的PrP-Sc蛋白。
2.權利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體與單克隆抗體F99/97.6.1所針對的表位結合。
3.權利要求2的單克隆抗體，所述單克隆抗體指明為F99/97.6.1。
4.一種雜交瘤細胞系ATCC HB-12696，所述雜交瘤細胞系產(chǎn)生并分泌單克隆抗體F99/97.6.1，所述單克隆抗體特異結合朊病毒蛋白的指明為Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser的保守表位，而且結合已經(jīng)過處理以暴露PrP-Sc蛋白中的所述表位并消除PrP-細胞相應表位的可及性的經(jīng)固定或未經(jīng)固定組織中的PrP-Sc蛋白。
5.一種單克隆抗體混合物，所述單克隆抗體混合物包含包括權利要求1的單克隆抗體的第一單克隆抗體與包括特異結合朊病毒蛋白的指明為Ilr-His-Phe-Gly的第二保守表位的第二單克隆抗體的組合，并且能夠結合已經(jīng)過處理以暴露PrP-Sc蛋白中的所述表位并消除PrP-細胞相應表位的可及性的經(jīng)固定或未經(jīng)固定組織中的PrP-Sc蛋白。
6.權利要求5的單克隆抗體混合物，其中所述第一單克隆抗體與單克隆抗體F99/97.6.1所針對的表位結合。
7.權利要求5的單克隆抗體混合物，其中所述第二單克隆抗體與單克隆抗體F89/160.1.5所針對的表位結合。
8.權利要求5的單克隆抗體混合物，其中所述第一單克隆抗體是F99/97.6.1，而所述第二單克隆抗體是F89/160.1.5或F89/193.1.5。
9.一種用于檢測動物或人類中的PrP-Sc蛋白的免疫檢測方法，所述方法包括(1)從被測試的動物或人中獲取組織；(2)固定或冷凍所述組織；(3)處理所述經(jīng)固定或冷凍的組織，以暴露針對PrP-Sc的表位并消除PrP-細胞相應表位的可及性。(4)在如果PrP-Sc蛋白存在于所述組織中則可使包括(a)權利要求1的單克隆抗體或(b)權利要求5的單克隆抗體混合物的單克隆抗體結合PrP-Sc蛋白的條件下，將所述經(jīng)處理的組織與所述抗體接觸，和(5)檢測所述結合抗體的存在。
10.權利要求9的方法，其中所述組織是經(jīng)固定的組織，而且所述處理選自(a)水合高壓滅菌；(b)用甲酸處理，之后進行或不進行水合高壓滅菌；和(c)用胰蛋白酶消化。
11.權利要求9的方法，其中所述組織是冷凍組織，而且所述處理包括用蛋白酶K處理，以消除35K PrP-Sc條帶并顯露蛋白酶K抗性PrP-Sc的特征性多個28-32K條帶。
12.權利要求9的方法，其中所述單克隆抗體與單克隆抗體F99/97.6.1所針對的表位結合。
13.權利要求9的方法，其中所述單克隆抗體是F99/97.6.1。
14.權利要求9的方法，其中所述抗體混合物包括與單克隆抗體F99/97.6.1所針對的表位結合的第一單克隆抗體和與單克隆抗體F89/160.1.5所針對的表位結合的第二單克隆抗體。
15.權利要求9的方法，其中所述第一單克隆抗體是F99/97.6.1，而所述第二單克隆抗體是F89/160.1.5或F89/193.1.5。
16.權利要求9的方法，其中所述檢測包括在使得可檢測標記的抗小鼠免疫球蛋白試劑與所述抗體結合的條件下將所述抗體與所述試劑接觸，并且檢測所述結合的試劑。
17.權利要求9的方法，其中所述檢測包括(a)在使得可檢測標記的抗小鼠免疫球蛋白試劑與所述抗體結合的條件下，將所述抗體與所述試劑接觸；(b)將所述試劑與酶-配體復合體接觸，使得所述復合體與所述試劑上的所述標記結合；和(c)用顯色底物檢測所述酶-配體復合體。
18.權利要求9的方法，其中所述動物選自反芻動物牲畜、貓、貂和非人類靈長動物。
19.權利要求18的方法，其中所述反芻動物牲畜選自綿羊、山羊、牛、黑尾鹿和馬鹿。
20.權利要求9的方法，其中所述組織是第三眼瞼相關的淋巴組織、腦尸體解剖組織、淋巴結活組織檢查組織或尸體解剖組織、或者脾活組織檢查組織或尸體解剖組織。
全文摘要
描述了檢測作為傳染性海綿狀腦病(TSE)指示的朊病毒蛋白或PrP－Sc蛋白的方法。一方面，本發(fā)明涉及特異結合朊病毒蛋白保守表位的單克隆抗體和使用所述抗體于免疫測定，以檢測經(jīng)固定或未經(jīng)固定組織中作為存在TSE感染指示的PrP－Sc。在另一方面，本發(fā)明涉及所述單克隆抗體與第二單克隆抗體組合的單克隆抗體混合物，所述第二單克隆抗體特異結合朊病毒蛋白的第二保守表位。所述混合物中的一種或兩種單克隆抗體可以識別已經(jīng)報道有自然TSE的所有哺乳動物物種和許多密切相關的物種中發(fā)現(xiàn)的表位。因此，盡管PrP蛋白在物種如反芻動物牲畜、貓、貂、人類和非人類靈長動物中有種間和種內(nèi)變異，但所述抗體混合物提供了針對PrP蛋白的高靈敏度、確定的特異性和廣譜反應性。
文檔編號C07K16/18GK1450909SQ00812776
公開日2003年10月22日 申請日期2000年7月14日 優(yōu)先權日1999年7月15日
發(fā)明者奧洛克 K·I 申請人:美國政府農(nóng)業(yè)部